UNIVERSIDAD DE LAS FUERZAS ARMADAS “ESPE”
DEPARTAMENTO DE CIENCIAS DE LA VIDA
CARRERA DE BIOTECNOLOGÍA
Docente: Dr. Renato Inca
Tema: Ultrafiltración para proteasas queratinolíticas.
NRC: 9564
Curso: Sexto
Paralelo: “Único”
Integrantes: Michilena Leslie
Montesdeoca Francis
Moreno Alisson
Proaño Ana
GENERALIDADES
La viabilidad de una aplicación industrial de las queratinasas reside
inicialmente en la obtención de la enzima a partir de una fuente
viable.
Brasil es un importante productor de
carne de aves a nivel mundial, generando
toneladas de desechos orgánicos.
Se han estudiado varias técnicas para
purificar las queratinasas microbianas.
Una alternativa para reciclar estos
materiales
queratinosos
es
la
bioconversión en productos de mayor
valor añadido por microorganismos
específicos productores de proteasas
queratolíticas.
Precipitación con sulfato de amonio
Precipitación con disolvente
Ultrafiltración
Cromatografía de intercambio iónico
Cromatografía de filtración en gel
Cromatografía de interacción
hidrófoba
Cromatografía con hidroxiapatita
Una bacteria productora de queratinasa,
Bacillus sp. P45, fue aislado del
intestino del pez de la cuenca del
Amazonas Piaractus mesopotamicus
Se evaluó el uso de una técnica de
aplicación industrial para la purificación
de la queratinasa obtenida a partir de
Bacillus sp.
La enzima se concentró y purificó por
ultrafiltración. Este enfoque permite
obtener una queratinasa purificada en un
solo paso.
Este tipo de enzima ha ganado interés
biotecnológico para su uso en diferentes
industrias.
Ultrafiltración
La principal ventaja de los procesos
de ultrafiltración sobre los procesos
de bioseparación convencionales es
el alto rendimiento del producto.
Sin embargo, a pesar del uso
generalizado de la ultrafiltración
en procesos como la diafiltración
y la concentración.
Las
técnicas
convencionales, limitan los
niveles de producción de
proteínas.
Debido a su menor complejidad
en comparación con las técnicas
de purificación mencionadas
anteriormente.
El potencial de su uso en el
fraccionamiento de proteínas no
se ha explotado en la industria
biotecnológica.
Los costos de producción
son relativamente bajos en
comparación
con
las
técnicas convencionales..
Se
ha
utilizado
ampliamente
para
la
concentración y separación
de proteínas.
Sin embargo, hay estudios que
muestran que la ultrafiltración se
puede aplicar a la purificación de
enzimas.
Obteniendo al mismo
tiempo
altos
rendimientos y pureza
del producto.
Preparación de microorganismos e
inóculos
Preparación de microorganismos
Se mantuvo a la bacteria Bacillus a 4 °C
en placas de agar de infusión de cerebro
y corazón rico en nutrientes.
Para la preparación del inóculo de
Bacillus
Se inoculó la cepa P45 en placas de infusión
de cerebro y corazón a 30 °C durante 24 h.
Los cultivos se añadieron a una solución
esteril de NaCl (8,5 g/l) y se mezclaron hasta
obtener una suspensión homogénea con una
densidad óptica de 0,5 a 600 nm.
Cultivo Sumergido
Medio de cultivo compuesto por
Harina de plumas 50 g
Cloruro de amonio (NH4Cl ) 5,25 g
Preparado de medio mineral
-
Cloruro de sodio (NaCl) 0,5 g
Fosfato dipotásico (K2HPO4) 0,3 g
Fosfato monopotásico (KH2PO4) 0.4g
Los cultivos se iniciaron con
inóculo al 1%.
Las condiciones de crecimiento fueron
30°C y 125 rpm durante 48 h.
Al final del cultivo, el sobrenadante se
separó por centrifugación, obteniéndose
el extracto enzimático crudo.
Ultrafiltración
Se realizó en una unidad de ultrafiltración sin
salida con un volumen de trabajo de 160 ml
agitado por una barra magnética suspendida
hasta 5 mm de la membrana.
El sistema fue presurizado con nitrógeno
comprimido a una temperatura de 15°C para
evitar la desnaturalización de la enzima.
Se usó una membrana nueva para cada
experimento y se usaron dos tamaños diferentes
con un límite de peso molecular de 10 kDa y 30
kDa.
Se adicionó un volumen de 40 mL de
extracto crudo enzimático y se detuvo el
proceso cuando el factor de concentración
volumétrica alcanzó el valor de 4.
Proceso de ultrafiltración para la purificación de proteasas queratinasas
Evaluación de la concentración y purificación de queratinasa por ultrafiltración
Se analizó la influencia de la presión de funcionamiento, el pH del extracto enzimático y el peso molecular de corte
(MWCO). La eficacia del proceso de concentración y purificación de la enzima queratinasa por ultrafiltración se evaluó
mediante el factor de recuperación y factor de purificación
Ensayo enzimático
La actividad queratinasa se controló utilizando el sustrato soluble azocaseína
Determinación de la proteína total
Se determina por el método de Lowry et al., utilizando albúmina sérica bovina (BSA) como patrón.
RESULTADOS
La ultrafiltración se ha aplicado en la purificación de queratinasas con la única intención de
concentrar la enzima.
Radha & Gunasekaran, (2009), produjeron
una queratinasa mediante un Bacillus
megaterium recombinante.
Lin, (1992), purificó y caracterizó una
queratinasa aislada de un medio de cultivo
degradante de plumas inoculado con Bacillus
licheniformis PWD-1.
La etapa de ultrafiltración (MWCO de 10
kDa) logró un factor de purificación de 2,3
veces con una recuperación del 73,5%.
La etapa de ultrafiltración (MWCO de 10
kDa) logró un factor de purificación de 1,8
veces y una recuperación del 69,3%.
La recuperación
de la enzima
queratinasa
estuvo en el
rango de 41,3 a
87,8% y un
factor de
purificación
entre 1,9 y 4,1
veces.
Se desarrolló un proceso de ultrafiltración en
la purificación de queratinasa de Bacillus sp.
P45 en un solo paso.
Se reducen los pasos de purificación
optimizando así para la purificación de la
enzima.
Un sistema con una presión operativa de 0,147 MPa, un MWCO de
membrana de 10 kDa y un pH de 8,0 proporcionó un factor de
purificación de 4 veces sin pérdidas de recuperación importantes.
Una alternativa interesante es la purificación de queratinasas, utilizada
en la degradación de materiales resistentes en efluentes o para
productos
de
limpieza
industrial.
La enzima queratinasa para producción de hidrolizados de proteínas.
¡GRACIAS POR SU ATENCIÓN!
BIBLIOGRAFÍA