Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје ФАРМАЦЕВТСКИ ФАКУЛТЕТ ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ - практична настава - Доц. д-р Катерина Брезовска Доц. д-р. Јелена Ацевска Доц. д-р. Наталија Наков Проф. д-р Зоран Кавраковски Проф. д-р Анета Димитровска Скопје, 2015 година ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 Вовед Ултравиолетовата/видливата (UV/VIS) спектроскопија има големо квалитативната и квантитативната анализа на голем број соединенија. значење во Принцип При поминување на електромагнетно зрачење од UV/VIS спектралното подрачје низ раствор на одредени соединенија, интензитетот на пропуштеното зрачење се намалува како резултат на апсорпција на дел од зрачењето од страна на примерокот. При апсорпција на зрачење доаѓа до побудување на електроните вклучени во молекулските врски и нивно преминување во повисоко енергетско ниво. Колку послабо се врзани електроните во врските на молекулата, толку е поголема брановата должина (а помала енергијата) на апсорбираното зрачење. Слика 1.1. Шематски приказ на намалување на интензитетот на електромагнетно зрачење ( = 200 - 380 nm) како резултат на апсорпција од електроните во раствор. Делот од молекулот (атомски групи) што условува апсорпција на зрачење во ултравиолетовото и видливото спектрално подрачје се нарекува хромофор. Хромофорна група претставува атомска група (функционална група во молекулите) што содржи валентни електрони ( и n електрони) што лесно може да се побудат од зрачење од ултравиолетовиот или видливиот дел од електромагнетниот спектар. Пример: -C=C-, C=O, C=N-, -N=N-, -(C=C)n-. Молекули што не содржат хромофори (вода, алкани, алкохоли) се идеални растворувачи за UV/VIS спектроскопија, бидејќи не покажуваат или покажуваат многу слаба апсорција во ова спектрално подрачје. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 3 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 Апаратура UV/VIS спектрометрите мерат апсорбанција или транспаренција во подрачје на бранови должини од 800 - 200 nm и се составени од следните делови: извори на зрачење (деутериумова лампа за ултравиолетовото и волфрамова лампа за видливото подрачје), селектори на бранова должина (филтри, монохроматор), контејнери за примерок (кварцни или пластични кивети), конвертори на зрачењето во електричен сигнал, процесори на сигналот и читачи. Слика 1.2. Шематски приказ на UV/VIS спектрофотометар со единечен сноп Слика 1.3. Шематски приказ на UV/VIS спектрофотометар со два снопа Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 4 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 Слика 1.4. Шематски приказ на UV/VIS спектрофотометар со Diode array детектор Апсорпционен спектар и апсорпционен максимум Апсорпциониот спектар претставува графичко претставување на апсорбанцијата или транпсаренцијата во функција на брановата должина, фреквенцијата или брановиот број. Апсорпционен максимум или пик претставува најголема вредност на апсорпција, односно најмала вредност најниска вредност на транспаренција. Брановата должина која во спектарот на соединението одговара на најголемата вредност за апсорбанцијата (апсорпциониот максимум или пик), се означува како бранова должина на максимум апсорпција ( max). Апсорпциониот спектар е карактеристичен за дадено соединение при дефинирани услови (растворувач, pH) и служи за негова идентификација. Поместување на брановата должина на максимум апсорпција во насока кон: поголеми - батохромен ефект помали - хипсохромен ефект зголемување на интензитет на апсорпција -хиперхромен ефект намалување на интензитет на апсорпција - хипохромен ефект Слика 1.5 Поместување на брановата должина на максимум апсорпција Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 5 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 Реагенси и опрема кофеин парацетамол ацетон 2-пропанол метил оранж калиум дихромат дестилирана вода волуметриски садови (2 х 20 mL и 3 х 1000 mL) пипети (1 mL) 1 cm кварцна кивета Постапка Подготви ги следните раствори: 5,0 mg кофеин во 1000,0 mL дестилирана вода 5,0 mg парацетамол во 1000,0 mL дестилирана вода 5,0 mg метил оранж во 1000,0 mL дестилирана вода 5,0 mg калиум дихромат во 1000,0 mL дестилирана вода 0,1 mL ацетон во 20,0 mL дестилирана вода 0,1 mL 2-пропанол во 20,0 mL дестилирана вода Се мери спектарот на подготвените раствори во подрачје од 190 - 700 nm, со примена на вода како слепа проба. Резултати Внеси ги вредностите на брановите должини и абсорбанциите на апсорпционите максимуми на кофеин, парацетамол, ацетон, 2-пропанол, метил оранж и калиум дихромат во табелата. Пресметај ги вредностите за транспаренција [%T], ако A=2 - logT[%] Соединение max [nm] Абсорбанција [AU] Транспаренција [%T] кофеин парацетамол ацетон 2-пропанол метил оранж калиум дихромат Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 6 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 2. Влијание на растворувачот врз положбата на апсорпциониот максимум Хромофорите даваат карактеристични апсорпциони ленти. Промена во околината на хромофорот предизвикува промена во неговите енергетски нивоа, кои пак влијаат на брановата должина и на интензитетот на апсорпцијата. Промената на растворувач може исто така да влијае на положбата и интензитетот на апсорпциониот максимум, но под услов супстанцијата која апсорбира да содржи поларен хромофор! Реагенси и опрема ацетон n-хексан метанол ацетонитрил дестилирана вода волуметриски садови (4 х 25 mL) микропипетор (10-100 µl) 1 cm кварцна кивета Постапка Подготви ги следните раствори: 40 µl ацетон се префрлаат во одмерна тиквица надополнува до марката со дестилирана вода 40 µl ацетон се префрлаат во одмерна тиквица надополнува до марката со метанол 40 µl ацетон се префрлаат во одмерна тиквица надополнува до марката со ацетонитрил 40 µl ацетон се префрлаат во одмерна тиквица надополнува до марката со n-хексан од 25 mL и тиквицата се од 25 mL и тиквицата се од 25 mL и тиквицата се од 25 mL и тиквицата се Сними го UV/VIS спектарот на растворите за анализа во опсег од 200 до 400 nm, користејќи ги соодветните растворувачи како слепи проби. Резултати Внеси ја брановата должина на апсорпциониот максимум на ацетонот растворен во различни растворувачи, во табелата подолу: Растворувач max [nm] Партиционен коефициент октанол-вода (logP) n-хексан 3,868 ацетонитрил -0,394 метанол -0,764 вода -1,380 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 7 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 Прашања од вежбата 1. Во согласност со добиените резултати, одговори во која насока се поместува брановата должина на максимум апсорпција на ацетонот кога се менува растворувачот од неполарен (хексан) кон поларен (вода) и како се нарекува тоа поместување? 2. Која хромофорна група во молекулот на ацетонот дава апсорпциона лента во неговите спектри? 3. Кој електронски премин е одговорен за појава на апсорпционата лента во спектрите на ацетонот? 3. Влијание на pH врз положбата на апсорпциониот максимум Апсорпциониот спектар на едно соединение е поврзан со неговата молекулска/електронска структура. Промени во условите на околината на соединението може да доведат до промени во неговата молекулска /електронска структура. Промената на pH вредноста има влијание на хемиската рамнотежа и може да доведе до промена на апсорпциониот спектар на даден раствор. Во случаи кога постои pH зависно поместување на UV спектарот, можно е да се определи pKa на јонизирачките групи, кои се одговорни за ова поместување. Ефектот на pH врз хемиската рамнотежа е добро познат и често се користи за да се промени положбата на хемиската рамнотежа. Хемиската рамнотежа меѓу хроматите и дихроматите е pH-зависна. Во кисела средина рамнотежата се поместува кон формирање на дихромати (кон лево), а во базна средина доминантни се хроматите (поместување на рамнотежата кон десно): Cr2 O72 H 2O 2CrO42 2H pH зависноста на калиум дихромат/хромат рамнотежата има практично значење, бидејќи калиум дихроматот се користи како стандарден раствор за проверка на фотометриската точност на спектрометрите. Реагенси и опрема калиум дихромат 0,1 M калиум хидроксид 0,1 M хлороводородна киселина дестилирана вода волуметриски садови (1 х 100 mL) епрувети (2) пипети (2 х 1 mL, 2 х 10 mL) 1 cm кварцна кивета Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 8 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 Постапка Подготви основен раствор што содржи 6 mg калиум дихромат во 100 mL дестилирана вода. Подготви ги растворите за анализа на 9 mL од основниот раствор на калиум дихромат додади 1 mL калиум хидроксид 0,1 M. на 9 mL од основниот раствор на калиум дихромат додади 1 mL хлороводородна киселина 0,1 M. Сними го UV/VIS спектарот на растворите за анализа во опсег од 230 до 500 nm, користејќи дестилирана вода како слепа проба. Резултати Определи ги брановите должини на апсорпционите максимуми на калиум дихроматот растворен во кисел и базен раствор и внеси ги вредностите во следната табела: K2Cr2O7 растворен во max1 [nm] Abs max1 [AU] max2 [nm] Abs max2 [AU] Базен раствор pH 9.0 Кисел раствор pH 2.0 Прашања од вежбата 1. При премин од кисела во базна средина доаѓа до поместување на брановите должини на апсорпционите максимуми на калиум дихромат. Во која насока е поместувањето и како се нарекува? 2. За каков ефект станува збор ако поради влијание на некој фактор на супстанцијата која апсорбира, дојде до намалување на интензитетот на нејзиниот апсорпционен максимум? Освоени бодови: Асистент: Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 9 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 Прилог 1 на вежба бр.1 Апсорпционен спектар и апсорпционен максимум Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 10 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје Вежба бр.1 11 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје Вежба бр.1 12 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 Прилог 2 на вежба бр.1 Влијание на растворувачот врз положбата на апсорпциониот максимум Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 13 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Апсорпционен спектар Апсорпционен максимум Влијание на pH и типот на растворувач врз апсорпциониот максимум Вежба бр.1 Прилог 3 на вежба бр.1 Влијание на растворувачот врз положбата на апсорпциониот максимум Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 14 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Квантитативна UV/VIS спектроскопија Lambert-Beer-ов закон Статисткичка обработка на резултатите Вежба бр.2 Вовед UV/VIS спектроскопијата има широка примена во квантитативната анлиза на голем број соединенија кои апсорбираат зрачење од UV или видливиот дел на спектарот. Квантитативната анализа во UV/VIS спектроскопијата се заснова на Lambert-Beer-овиот закон, кој гласи: за монохроматско зрачење, апсорбанцијата е право пропорционална со должината на патот b на зрачењето низ медиумот (должина на оптичкиот пат) и со концентрацијата на испитуваната супстанција. A= bc A - апсорбанцијата, b - должината на оптичкиот пат (ширината на киветата) во cm, c - концентрацијата на испитуваната супстанција во mol/L и - моларен апсорпционен коефициент (моларната апсорптивност): апсорбанција на 1М раствор од испитуваната супстанција измерена во кивета од 1 cm и се изразува во L·mol-1·cm-1. Моларната апсорптивност може да се пресмета од нагибот на регресионата права во баждарниот дијаграм (каде на апцисата е нанесена концентрацијата, а на ординатата апсорбанцијата), доколку при мерењето е користена кивета со ширина од 1 cm, а концентрацијата е изразена во mol/L, т.е tgα = нагиб = Во одредени случаи не е позната молекулската маса на испитуваната супстанција, а исто така во фармацевтските препарати, концентрациите и количините почесто се изразуваат во g или mg, отколку во молови. За таа цел Lambert-Beer-овиот закон се пишува во следната форма: % A A11cm b c A - апсорбанцијата, b - должината на оптичкиот пат (ширината на киветата) во cm, c - концентрацијата на испитуваната супстанција во g/100mL и 1% A1cm - специфичен апсорпционен коефициент: апсорбанција на 1% (1g/100mL) раствор измерена во кивета од 1 cm. Моларниот апсорпционен коефициент ( ) и специфичниот апсорпционен коефициент 1% ( A1cm ) се константни вредности и се карактеристични за дадена супстанција, бранова должина и растворувач. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 15 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Квантитативна UV/VIS спектроскопија Lambert-Beer-ов закон Статисткичка обработка на резултатите Вежба бр.2 Со мерење на апсорбанција на раствор на испитуваниот примерок може да се определи концентрацијата на испитуваниот раствор на повеќе начини: 1. Метод на баждарен дијаграм - се подготвува серија на стандардни раствори (најмалку пет) со позната концентрација на испитуваната супстанција, во концентрационо подрачје на линеарна зависност на концетрација во однос на апсорбанцијата. Се мерат апсорбанциите на стандардните раствори и на растворот со непозната концентрација и се конструира баждарен дијаграм од концентрациите во функција на апсорбанциите. Со обработка на баждарниот дијаграм со метод на најмали квадрати се добива регресионата равенка од која може да се пресмета концентрацијата на примерокот. Од измерената апсорбанција на растворот со непозната концентрација, од баждарниот дијаграм со екстраполација се одредува концентрацијата. 2. Метод на определување преку споредба со стандардна супстанција Овoј метод може да се примени само кога концентрацијата на анализираниот и стандардниот раствор не се разликуваат многу и се наоѓаат во концентрационо подрачје на линеарна зависност на апсорпцијата од концентрацијата. Равенката за пресметување на концентрацијата се изведува од Lambert-Beer-овиот закон. За стандардниот раствор: As = b cs As - апсорбанција на стандардниот раствор cs - концентрација на стандарден раствор За растворот со непозната концентрација: Ax = b cx Ax - апсорбанција на испитуваниот раствор cx - концентрација на испитуваниот раствор производот l е ист за двата раствора, Ax cx Од тука: cx As cs Ax c s As 3. Метод на определување преку специфичниот апсорпционен коефициент Ако е познат специфичниот апсорпционен коефициент, со мерење на апсорбанцијата на испитуваниот раствор, при константни услови, температура, растворувач, дебелина на слој (1 cm) и бранова должина, може да се одреди концентрацијата на испитуваниот раствор. c A 1% A1cm Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 16 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Квантитативна UV/VIS спектроскопија Lambert-Beer-ов закон Статисткичка обработка на резултатите Вежба бр.2 Практичен дел Определување на концетрацијата на раствор на парацетамол со примена на метод на баждарен дијаграм N-(4-hydroxyphenyl)ethanamide Формула: C8H9NO2 Mr = 151,17 g/mol Реагенси и опрема парацетамол дестилирана вода волуметриски садови (6 х 10 mL; 5 х 25 mL и 1 х 200 mL) пипети (7 x 1,0 mL; 1 x 2,0 mL; 3x 5 mL; 1 x 5,0 mL) 1 cm кварцна кивета Постапка Основен стандарден раствор на парацетамол: 10,0 mg парацетамол, стандардна супстанција, се раствора и се дополнува до 200 mL со дестилирана вода. Работни стандардни раствори: Се подготвуваат 5 работни стандардни раствори на парацетамол во вода, така што во 5 одделни одмерни тиквички од 25 mL се става соодветно 1, 2, 3, 4 и 5 mL од основниот стандарден раствор, а потоа тиквичките се надополнуваат до марката со вода и се протресуваат. Пробен раствор: 1 mL од анализата се разредува до 10,0 mL со дестилирана вода. Се подготвуваат 6 пробни раствори. Се снима апсорпциониот спектар на парацетамол во опсег од 200 - 400 nm. Се избира погодна бранова должина за мерење на апсорбанциите на работните стандардни раствори и на растворот на анализата. Се мери апсорбанцијата на работните стандардни раствори и на пробните ратвори. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 17 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Квантитативна UV/VIS спектроскопија Lambert-Beer-ов закон Статисткичка обработка на резултатите Вежба бр.2 Резултати и пресметки Бранова должина на која се мерат апсорбанциите на работните стандардни раствори на парацетамол и на растворот на анализа, : = nm Во следната табела внеси ги измерените вредности за апсорбанциите за секоја концентрација соодветно: c [ g/mL] A [AU] Конструирај баждарен дијаграм од измерените вредности за апсорбанцијата во функција од концентрацијата: Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 18 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Квантитативна UV/VIS спектроскопија Lambert-Beer-ов закон Статисткичка обработка на резултатите Вежба бр.2 Пресметај ја линеарната регресија 1 2 3 4 ∑ 5 x·y x2 y2 n x x1 x b x2 x3 ...... x n n x b (нагиб) ( x y) n x y x2 n x2 n xi i 1 y n x2 y1 y2 y2 y y a (y – отсечка) a y b x r i 1 n x2 xy y2 r (коефициент на корелација) n ( x y) x y n Равенка на регресиона права yX a b x yi y 3 ...... y n n x2 x 2 n y2 y 2 yx = Дали постои линерна зависност помеѓу измерените вредности за апсорбанцијата и концентрацијата?____________________________________ Регресиски ~y ~ y1 a b x1 ~ y2 a b x2 ~ y3 a b x3 ~ y 4 a b x4 ~ y5 a b x5 a + b · xn + + + + + · · · · · ~ yn = = = = = Внеси ги добиените вредности за ~y во баждарниот дијаграм (со друга боја) и спореди ги измерените вредности за y со пресметаните вреднсоти за ~y . Според измерената вредност за апсорпција на пробниот раствор, определи ја концентрацијата на анализата. Пресметај ја концентрацијата на анализата со примена на регресионата равенка. c (пробен раствор) = c (анализа) = Од регресиона равенка c (пробен раствор) [ g/mL] = c (анализа) [ g/mL] = Од баждарен дијаграм c (пробен раствор) [ g/mL] = c (анализа) [ g/mL] = Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 19 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Квантитативна UV/VIS спектроскопија Lambert-Beer-ов закон Статисткичка обработка на резултатите Вежба бр.2 Пресметај ги моларниот апсорпционен коефициент и специфичниот апсорпционен коефициент c (mol/l)= [l mol-1 cm-1]= 1% c (g/100 mL)= = A1cm (c = концетрација на пробен раствор, а не на анализа) Пресметај аналитички принос на добиените резултати, аритметичка средина ( x ), стандардна девијација (S) и релативнаа стандардна девијација (RSD %) на добиените резултати за аналитичкиот принос од мерењата на два различни аналитичари: Аналитички принос Cx 100 % = 50 g/mL (вистинска вредност за концентрација на анализа) ( xi S x) 2 RSD(%) n 1 S 100 % x Аналитичар 1 Анал.1 Cанализа Аналитички принос (%) xi x xi x 2 1 2 3 4 5 6 S RSD x= xi 2 x = RSD(%) = Аналитички принос ( x ) = Аналитичар 2 Анал.2 Cанализа Аналитички принос (%) xi x xi 1 2 3 4 5 6 x 2 S RSD x= xi 2 x = RSD(%) = Аналитички принос ( x ) = Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 20 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Квантитативна UV/VIS спектроскопија Lambert-Beer-ов закон Статисткичка обработка на резултатите Вежба бр.2 Одговори на следните прашања: 1. Кој аналитичар добил поточен резултат во мерењата и зошто? _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 2. Кој аналитичар добил попрецизни резултати во мерењето и зошто? _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ Пресметки: Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 21 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Квантитативна UV/VIS спектроскопија Lambert-Beer-ов закон Статисткичка обработка на резултатите Вежба бр.2 Вежбата се признава Освоени бодови Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 22 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Определување непозната концентрација со метод на стандардни додатоци (UV/VIS спектрофотометриски) Вежба бр.3 Вовед Методот на стандардни додатоци (често познат како „спајкување“ на примерокот) во инструменталните анализи се користи за определување на концентрација на супстанција што претставува дел од сложен матрикс. Матриксот може да содржи компоненти што може да интерферираат со сигналот на аналитот и притоа да доведат до грешки при определување на концентрацијата. Според овој метод, еднакви волумени (аликвоти), Vx, од растворот на аналитот со непозната концентрација cx, се пренесуваат во волуметриски садови со еднаков волумен Vt. Првиот сад се разредува до волуменот со пропишаниот растворувач. Во останатите садови се додаваат последователно растечки волумени Vs од стандардниот раствор на аналитот со позната концентрација cs. Потоа, доколку е потребно се додаваат соодветни реагенси и волуметриските садови се дополнуваат до декларираниот волумен Vt со пропишаниот растворувач. 1. Додај Vx од раствор со Cx во сите волуметриски садови 2. Додај различен Vs од стандарден раствор со Cs во волуметриските садови 2, 3 и 4 3. Дополни до ознаката со растворувач CxVx/Vt CxVx/Vt + CsVs/Vt Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 23 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Определување непозната концентрација со метод на стандардни додатоци (UV/VIS спектрофотометриски) Вежба бр.3 На крај, се мерат одговорите на иснтрументот (аналитички сигнали, S) на подготвените раствори. Од измерените вредности, се конструира баждарен дијаграм од одговорот на инструментот (S) во функција од додадениот стандарден волумен. Потоа се пресметува линеарната регресија и со примена на добиените вредности за нагибот на регресионата права (b) и y-интерсептот (a) се пресметува концентрацијата на аналитот во примерокот. Ако одговорот на инструментот е пропорционален со концентрацијата на аналитот, како што всушност мора да биде ако се употребува методот на стандардни додатоци, може да се напише: k Vs cs k Vx c x S Vt Vt каде k е константа на пропорционалност. Зависноста на S од Vs е линеарна и може да се прикаже со равенката на права: S b Vs a каде b k cs / Vt , преставува нагибот на правата, а a k Vx cx / Vt е y-отсечката. Со примена на методот на најмали квадрати може да се пресметаат вредностите за a и b, а потоа и за cx: a k Vx cx / Vt Vx cx b k cs / Vt cs односно, a cs cx b Vx Ако регресионата права започнува од вредноста на сигналот еднаква на нула, волуменот на стандардот од таа точка до точката на првиот раствор на регресионата права (x=0) содржи иста количина на аналит како и примерокот. k Vs cs k Vx c x S 0 Vt Vt k Vx c x k Vs cs Vt Vt Vs cs cx Vx Со екстраполација на правата од баждарниот дијаграм до негативниот дел од апцисата да се отчита вредноста за Vs и од таа вредност може да се пресмета концентрациајта на аналитот. Бидејќи баждарниот дијаграм на стандардните додатоци е конструиран за одреден примерок, истиот не може да се искористи за определување содржина на друг примерок со ист аналит. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 24 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Определување непозната концентрација со метод на стандардни додатоци (UV/VIS спектрофотометриски) Вежба бр.3 Практичен дел Определување на концентрација на раствор на парацетамол во анализата со примена на метод на стандардни додатоци. Реагенси и опрема парацетамол дестилирана вода волуметриски садови (4 х 25 mL и 1 х 200 mL) пипети (трбушеста 1,0 mL, трбушеста 2,0 mL, трбушеста 3,0 mL) 1 cm кварцна кивета Постапка 1. Во четири одмерни тиквици од 25 mL се ставаат еднакви волумени (Vx) од растворот на парацетамол за анализа (Vx = 1 mL); 2. Се подготвува стандарден раствор на парацетамол со концентрација (0,05 mg/mL); 3. Во три од четирите тиквици се додаваат растечки волумени (V s1, Vs2, Vs3) на стандарден раствор на парацетамол, соодветно; 4. Во четвртата тиквица не се додава од стандардниот раствор; 5. На крај се надополнуваат тиквиците до марката (Vt = 25 mL) со дестилирана вода и добро се промешуваат; 6. Се избира погодна бранова должина за мерење на апсорбанцијата на стандардизираните раствори и растворот за анализа; 7. Се мерат апсорбанциите на подготвените раствори и се забележуваат вредностите за апсорбанцијата; 8. Се пресметува концентрацијата на парацетамолот во анализираниот раствор од конструираниот баждарен дијаграм и со помош на математичка формула. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 25 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Определување непозната концентрација со метод на стандардни додатоци (UV/VIS спектрофотометриски) Вежба бр.3 Резултати и пресметки Тиквица бр. Волумен на анализа (Vx, mL) Волумен на стандард (Vs, mL) Вкупен волумен (Vt, mL) Cs (стандарден раствор) = Тиквица бр. Волумен на додаден стандарден раствор (Vs, mL) 1 1 0 25 2 1 1 25 3 1 2 25 4 1 3 25 1 2 3 4 mg/mL Апсорбанција (AU) Конструирај баждарен дијаграм од измерените вредности за апсорбанцијата (AU) во функција од волуменот на додадениот стандарден раствор (Vs, mL): Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 26 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Определување непозната концентрација со метод на стандардни додатоци (UV/VIS спектрофотометриски) Вежба бр.3 Пресметај ја линеарната регресија 1 2 X X2 3 4 X·Y X2 Y2 X b (нагиб) a (y – отсечка) Равенка на регресиона права ~ Регресиски Y ~ Y1 ~ Y2 ~ Y3 ~ Y4 Y Y2 Y r (коефициент на корелација) Yx = a a b X1 a b X2 a b X3 a b X4 + + + + + b · Xn · · · · ~ Yn = = = = Пресметај ја концентрацијата на анализата со примена на регресионата равенка. Според математичка формула Cx (парацетамол) [mg/mL] Од баждарен дијаграм x-отсечка (Vs) [mL] Cx (парацетамол) [mg/mL] Вежбата се признава Освоени бодови Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 27 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 28 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Проучување на IR спектар на непозната органска супстанција Вежба бр.4 Вовед Инфрацрвената спектроскопија е еден од најмоќните методи за идентификација на чисти органски и неоргански супстанции. Се заснова на апсорпција на зрачење од инфрацрвениот дел на спектарот од страна на молекулите. Ова зрачење предизвикува вибрациони премини во молекулите кои апсорбираат. Брановата должина на апсорбираното зрачење е карактеристична за хемиската врска која го апсорбира. Секоја супстанција поседува единствен IR апсорпционен спектар, при што одредени функционални групи апсорбираат на исти бранови должини дури и во различни молекули. IR апсорпционите спектри претставуваат “отисоци на прсти” за молекулите со ковалентни врски. Исто така, IR спектарот овозможува брза проверка на присуство на определена функционална група во молекулот (на пример, карбонилна група). Освен хиралните молекули во кристална состојба, сите молекулски врсти имаат единствен инфрацрвен апсорпционен спектар. Оттука, примерокот може недвосмислено да се идентификува ако неговиот спектар точно се сложува со спектарот на примерокот со позната структура. Поделба на IR област Врз основа на видовите на енергетски премини кои се побудуваат со апсорпцијата на зрачење, IR спектрална област (Слика 4.1) е поделена на три дела: 1. Блиска IR област (13000 - 4000 cm-1) - област на овертонови и комбинации од основни валентни вибрации; лентите се со слаб интензитет и често се преклопуваат (понепогодни за квалитативна анализа, за разлика од средната IR област). 2. Средна IR област (4000 - 400 cm-1). Поделена е на: a) Област на валентни вибрации на X-H (4000 - 2500 cm-1) - основни валентни вибрации на O-H, C-H и N-H групите. b) Област на тројна врска (2500 - 2000 cm-1) - основни валентни вибрации на групите: C≡C (дава лента со слаб интензитет) и C≡N (дава лента со среден интензитет). c) Област на двојна врска (2000 - 1500 cm-1) - основни валентни вибрации на групите: C=C (дава лента со слаб интензитет), C=O (дава лента со јак интензитет) и C=N (дава лента обично со јак интензитет). d) Област на “отисоци на прсти” (1500 - 600 cm-1) - содржи најголем број ленти карактеристични за едно соединение. 3. Далечна IR област (400 - 100 cm-1) - вибрационо-ротациони премини; вибрации на молекули кои содржат тешки атоми, молекули кои содржат халогени атоми, органометални соединенија, вибрации во кристална решетка. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 29 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Проучување на IR спектар на непозната органска супстанција Вежба бр.4 Слика 4.1. Шематски приказ на поделбата на IR спектралната област Апаратура Инструментот за инфрацрвена спектрометрија (Слика 4.2) се состои од: 1. Извор на инфацрвено зрачење; - “Nernst”- ов извор (оксиди на циркониум, ториум и цериум) - “Globar” - ов извор (силициум карбид) - извор на вжарена жица - извор на живин лак - волфрамова ламба - ласерски извори 2. Монохроматор - оптички призми и решетки; - призми: NaCl (4000 - 650 cm-1) и други неоргански халогениди (KBr, LiF, CAF2, смеса ThBr/ThJ и CsJ) - решетки: воедначено разложување 3. Оддел за примерок - гасови (кивети за снимање на гасовити примероци) - течности (капиларен филм помеѓу плочки пропустливи за IR зрачење: NaCl, KBr, CaF2, CsBr, CsJ, AgCl, AgBr) - цврсти супстанции (KBr пилула) - суспензии или пасти (разредени со парафинско масло, нанесени како капиларен течен филм, исто како за течности) 4. Инфрацрвен детектор (трансдуктор): термички, пироелектрични, фотоспроводливи детектори 5. Компјутерски систем за обработка на податоците. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 30 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Проучување на IR спектар на непозната органска супстанција Вежба бр.4 Слика 4.2. Шематски приказ на инфрацрвен спектрометар IR спектар Графичкиот приказ на зависноста меѓу транспаренцијата (Т) и брановиот број (ν) или брановата должина (λ) на зрачењето се нарекува IR спектар (Слика 4.3). Анализата на инфрацрвениот спектар (IR спектар) на органските молекули се базира на примена на концептот за групови вибрации, според кој одредена функционална група во органската молекула апсорбира IR зрачење со определена фреквенција (односно бранова должина). Слика 4.3. IR спектар Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 31 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Проучување на IR спектар на непозната органска супстанција Вежба бр.4 Основни правила за идентификација на непозната супстанција користејќи го нејзиниот спектар во средната IR област (4000 - 400 cm-1) Најпрво се разгледува крајот на спектарот со големи вредности за брановиот број (> 1500 cm-1) и се забележуваат лентите со најголем интензитет. За секоја лента се прави “краток список” на можни групови вибрации. Крајот на спектарот со мали вредности за брановиот број се користи за потврда или елаборација на можните структурните елементи. Не е неопходно да се изврши асигнација на сите ленти во спектарот. Каде е возможно, се прави поврзано проверување на спектарот на непознатата супстанција. За идентификација на изворот на апсорпциона лента, важни се: - интензитетот: слаб (w-weak), среден (m-medium), јак (s-strong), а во одредени случаи, може да варира за една иста група (v-variable); - обликот: заоблен (b-broad) или остар (sh-sharp); - позицијата (cm-1) во спектарот. Мора да се внимава на промените во спектарот во делот со мали вредности за брановиот број. Промените може да бидат предизвикани од агрегатната состојба на примерокот при снимањето на неговиот IR спектар (дали бил во цврста, течна состојба или пак во раствор); Доколку супстанцијата била растворена во раствор при снимањето на нејзиниот IR спектар, потребно е спектарот на растворувачот да се одземе од снимениот спектар на супстанцијата. Важно е да се знае дека отсуство на апсорпциска лента некогаш дава повеќе информации за структурата на компонентата, отколку присуство на лента. Не треба да се фокусира внимението само на избраните ленти, а да се занемарат сите други. Се бараат следните апсорпциски ленти, наредени според важност: 1. C-H апсорпција(и) помеѓу 3100 и 2850 cm-1. Апсорпција над 3000 cm-1 укажува на C=C, или алкен или ароматично јадро. Ароматичното јадро се потврдува со наоѓање на пикови на 1600 и 1500 cm-1, а C-H свиткувачка вибрација вон рамнина кои укажуваат на супституција дава лента под 900 cm-1. Алкените се потврдуваат со апсорпција на 1680 - 1640cm-1. C-H апсорпција помеѓу 3000 и 2850 cm-1 се должи на алифатични јаглероди. 2. Карбонилната (C=O) апсорпција се јавува помеѓу 1760 - 1690cm-1. Оваа интензивна лента укажува на алдехид, кетон, карбоксилна киселина, естер, амид, анхидрид или ацил халид. Алдехид се потврдува со C-H апсорпција од 2840 до 2720 cm-1. 3. O-H или N-H апсорпции се наоѓаат помеѓу 3600 и 3200 cm-1. Овие ленти се заоблени и укажуваат на етер, алкохол или карбоксилна киселина, амин или амид (кои содржат N-H врска). За -NH2, се забележувa дублет. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 32 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Проучување на IR спектар на непозната органска супстанција Вежба бр.4 4. C-O апсорпција помеѓу 1300 и 1080 cm-1. Овие ленти обично се заоблени, како и лентите од O-H и N-H опишани под 3, и се јасно видливи. Карбоксилни киселини, естри, етри, алкохоли и анхидриди ја содржат оваа лента. 5. C C и C N тројните врски апсорбираат на 2260 - 2100cm-1 и даваат ленти кои се мали, но изразени. 6. Метил групата може да се идентификува преку C-H апсорпција на 1380 cm-1. Оваа лента е поделена (дублет) доколку станува збор за изопропил (gem-диметил) групи. 7. Структурата на ароматичните компоненти може да се потврди и преку слаб овертон во комбинација со шумови ленти помеѓу 2000 и 1600 cm-1. Карактеристични IR ленти за органските соединенија -1 Бранов број (cm ) 2960 2930 2870 2850 1470 1465 1380 1305 1300 720 3100-3000 1680-1600 1400 1000-600 -1 Асигнација Алкани C-H симетр. валентна виб. (-CH3) C-H асиметр. валентна виб. (-CH2-) C-H асиметр. валентна виб. (-CH3) C-H симетр. валентна виб. (-CH2-) C-H асиметр. деформац. виб. (-CH3) -CH2- сечење (деформациона виб.) C-H симетр. деформац. виб. (-CH3) -CH2- нишање (деформ. виб.) Бранов број (cm ) -CH2- свиткување (деформ. виб.) -CH2- лулање (деформ. виб.) 3550-3500 Алкени =C-H валентна вибрација C=C валентна вибрација =C-H деформациона виб. (во рамнина) =C-H деформациона виб. (вон рамнина) 3100-3000 2000-1700 1600-1430 1270-1000 900-690 3300-3250 =C-H валентна вибрација 2260-2100 700-600 C=C валентна вибрација =C-H деформациона вибр. C-H валентна вибрација овертон и комбинирани ленти C=C валентна вибрација C-H деформациона вибр. (во рамнина) C-H деформациона вибр. (вон рамнина) Алкохоли и феноли 3600 1300-1000 алкохолна O-H валентна вибрација фенолна O-H валентна вибрација C-O валентна вибрација 1100 Етери C-O-C валентна вибрација Алдехиди и кетони 2900-2700 1740-1720 Алкини Асигнација Ароматични соединенија 1730-1700 1720-1680 1700-1680 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје алдехидна C-H валентна вибрација C=O валентна вибрација на алифатичен алдехид C=O валентна вибрација на алифатичен кетон C=O валентна вибрација на ароматичен алдехид C=O валентна вибрација на ароматичен кетон 33 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ -1 Бранов број (cm ) 1750-1730 1730-1705 1310-1250 1300-1100 Проучување на IR спектар на непозната органска супстанција Асигнација Естри алифатична C=O валентна вибрација ароматична C=O валентна вибрација ароматична C-O валентна вибрација алифатична C-O валентна вибрација -1 Бранов број (cm ) 3360-3340 3300-3250 3190-3170 3100-3060 1680-1660 Карбоксилни киселини 1680-1640 3300-2500 O-H валентна вибрација 1650-1620 1700 C=O валентна вибрација 1560-1530 1430 1240 930 C-O-H деформациона вибрација (во рамнина) C-O валентна вибрација C-O-H деформациона вибрација (вон рамнина) 750-650 Анхидриди 2240-2220 1840-1800 C=O валентна вибрација 2180-2110 1780-1740 C=O валентна вибрација 2160-2120 1300-1100 C-O валентна вибрација 2130-2100 1690-1620 Амини N-H валентна вибрација (дублет за примарен и синглет за секундарен амин) 1680-1650 2780 N-CH2 валентна вибрација 1615-1565 1615 NH2 сечење (деформ. виб.), N-H деформациона вибр. 1560-1530 1360-1250 ароматична C-N валентна вибрација 1540-1500 1220-1020 алифатична C-N валентна вибрација 1450-1400 850-750 NH2 нишање и свиткување (деформациона вибрација) 1390-1370 715 N-H нишање (деформациона вибрација) 1370-1330 1660-1620 1300-1270 1300-1000 800-400 Органски халогени соединенија C-F валентна вибрација C-X валентна вибрација (X = F, Cl, Br или I) Асигнација Амиди NH2 асиметрична валентна вибр. на примарен амид N-H валентна вибрација на секундарен амид NH2 симетрична валентна вибр. на примарен амид овертон на секундарен амид C=O валентна вибрација на примарен амид C=O валентна вибрација на секундарен амид NH2 деформациона вибрација на примарен амид N-H дефор. вибр.; C-N валент. вибр. на секундарен амид N-H нишање (дефор. вибр.) на секундарен амид Соединенија на азот 2260-2240 3335 Вежба бр.4 C≡N валентна вибрација на алифатичен нитрил C≡N валентна вибрација на ароматичен нитрил -N≡C валентна вибрација на алифатичен изонитрил N≡N валентна вибрација на азид -N≡C валентна вибрација на ароматичен изонитрил C=N-OH валентна вибрација на оксим N=O валентна вибрација на нитрит NO2 асиметрична валентна вибрација на нитрат пиридинска C=N валентна вибр., C=C валентна. вибр. NO2 асиметрична валентна вибрација на алифатично нитро соединение NO2 асиметрична валентна вибрација на ароматично нитро соединение N=N валентна вибрација на азо соединение NO2 симетрична валентна вибрација на алифатично нитро соединение NO2 симетрична валентна вибрација на ароматично нитро соединение NO2 симетрична валентна вибрација на нитрат 965-930 N-O валентна вибрација на оксим 870-840 N-O валентна вибрација на нитрат NO2 деформациона вибрација на нитрат 710-690 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 34 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Проучување на IR спектар на непозната органска супстанција Вежба бр.4 IR спектар на етанол IR спектар на толуен Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 35 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Проучување на IR спектар на непозната органска супстанција Вежба бр.4 Практична работа Асигнирај ги апсорпционите ленти во инфрацрвените (IR) спектри на непознатите супстанции 1 и 2, користејќи ги табелите за карактеристичните IR ленти на органските соединенија. За кои супстанции станува збор? Непозната супстанција 1 IR спектар на Бранов број на лентата (cm1 ) непознатата Врска која вибрира супстанција 1 (С9 Можна функционална група (предлог) Непознатата супстанција 1 е __________________________________________ Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 36 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Проучување на IR спектар на непозната органска супстанција Вежба бр.4 Непозната супстанција 2 IR спектар на непознатата супстанција 2 (С4Н8О) Бранов број на лентата (cm1 ) Врска која вибрира Можна функционална група (предлог) Непознатата супстанција 2 е _________________________________________ Вежбата се признава Освоени бодови Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 37 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 38 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Потенциометрија. Потенциометриско определување на pH вредност Потенциометриски титрации Вежба бр.5 Вовед Потенциометријата претставува електрохемиски метод што се заснова на мерење на потенцијалот на електрохемиска ќелија во отсуство на струја (I=0). Потенциометриските електрохемиски ќелии се составени од две полуќелии: референтна полуќелија која обезбедува познат референтен потенцијал (содржи референтна електрода) и индикаторска полуќелија (содржи индикаторска електрода) која дава потенцијал зависен од концентрацијата на аналитот во неа. Мерењата во потенциометријата се изведуваат користејќи потенциометар за определување на разликата меѓу потенцијалите на индикаторската (мерна) електрода и референтната (стандардна) електрода. Потенцијалот на индикаторската електрода варира, во зависност од концентрацијата на аналитот, додека потенцијалот кој потекнува од референтната електрода е константен. По договор, референтната електрода се зема како анода, а индикаторската како катода. Типови референтни електроди: - каломелова електрода - сребро/сребро хлорид електрода Hg | Hg2Cl2 (заситен), KCl (xM) Ag | AgCl (заситен), KCl (xM) Типови индикаторски електроди: - метални - мембрански (јон селективни електроди) Потенциометриско определување на pH вредноста Стаклената електрода за определување на pH вредноста е јон селективна електрода (селективна за H+ јоните), а се состои од стаклена индикаторска електрода и референтна сребро/сребро хлорид електрода (Слика 5.1). Индикаторската електрода се состои од тенка стаклена мембрана осетлива на водородни јони, која е сместена на крајот на стаклена цевка со дебели ѕидови или пластична цевка. Во цевката се наоѓа мал волумен на разредена хлороводородна киселина, заситена со сребро хлорид или калиум хлорид. Референтната електрода (сребро/сребро хлорид) преставува сребрена жица, која на едниот крај е поврзана со апаратот за мерење на потенцијалот. Иако внатрешната референтна електрода е дел од стаклената електрода, таа не е осетлива на водородни јони. Принцип на мерење на pH вредноста Електродата се калибрира со потопување во стандарден раствор со позната pH вредност (pHs), при што на површината на стаклената елктрода се формира одреден мембрански потенцијал (Es). Со потопување на електродата во аналитот со непозната pH вредност (pH), промената во концентрацијата на водородните јони предизвикува промена во составот на стаклената мембрана поради процес на размена на јони помеѓу испитуваниот раствор и мембраната, што доведува до промена на мембранскиот потенцијал. Се мери соодветната промена на мембранскиот потенцијал што е пропорционален со pH вредноста. Потенцијалот од референтната електрода е константен. Поточно, со потенциометрите се мери потенцијалната разлика помеѓу мембранскиот потенцијал (варијабилен) и константиот потенцијал на референтната електрода. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 39 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Потенциометрија. Потенциометриско определување на pH вредност Потенциометриски титрации Вежба бр.5 Работна дефиниција за pH вредност: pH = pHs - E - Es K Е - потенцијал на ќелија со испитуваниот раствор, Es - потенцијал на ќелија со р-ор со позната pH (PHs) К - промена на потенцијалот, при промена на pH за една единица (0,0592) Слика 5.1. Стаклена pH електрода (селективна за H+ јоните) Секоја стаклена елeктрода е различна и тешко може да се репродуцира една стаклена мембрана. Поради тоа неопходно е pH метарот и електродата да се стандардизираат со употреба на најмалку два раствори со точно позната pH вредност. Потенциометриски титрации Потенциометриски титрации се волуметриски методи во кои завршната точка (ЗТТ) на титрацијата се определува потенциометриски. Потенциометриското определување на ЗТТ е применливо како за киселинско-базните, комплексирачките, редокс и таложните титрации, така и за титрациите во водени и неводени средини. Потенциометриското определување на ЗТТ се одликува со поголема точност во однос на определувањето на ЗТТ со помош на индикатори. Принципот на потенциометриските титрации се заснова на мерење на потенцијалот на соодветна индикаторска електрода како функција од волуменот на титрантот. Растворот на титрантот се додава внимателно во еднакви волумени и по секое додавање се отчитува потенцијалот на ќелијата (mV или pH единици). Голема промена на потенцијалот на индикаторската електрода укажува на близината на завршната точка на титрацијата. Титрантот се додава се додека не се појават континуирани мали промени на потенцијалот. Завршната точка на титрација се определува по графичко претставување (дијаграм) на потенцијалот во функција од додадениот волумен на титрантот. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 40 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Потенциометрија. Потенциометриско определување на pH вредност Потенциометриски титрации Вежба бр.5 Определување на завршната точка на титрација. Пример. Крива на титрација на раствор на аспирин (2 mmol) со 0,1M раствор на NaOH. V (mL) dV Е(mV) dE dE/dV 14 16 18 19 19,1 19,2 19,3 19,4 19,5 19,6 19,7 19,8 19,9 20 20,1 20,2 20,3 20,4 21 23 2 2 1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1 0,6 2 185 172 151 132 129 126 122 119 113 107 100 89 71 -44 -177 -195 -206 -212 -236 -266 -13 -21 -19 -3 -3 -4 -3 -6 -6 -7 -11 -18 -115 -133 -18 -11 -6 -24 -30 -6,5 -10,5 -19 -30 -30 -40 -30 -60 -60 -70 -110 -180 -1150 -1330 -180 -110 -60 -40 -15 2 d2E dV -8 2 16 0 -1 1 -3 0 -1 -4 -7 -97 -18 115 7 5 -18 -6 4 4 1 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,36 4 2 d E/dV 2 -2 2 1600 0 -100 100 -300 0 -100 -400 -700 -9700 -1800 11500 700 500 -50 -1,5 Кога во координатен систем ќе се нанесе волуменот на титрантот кој се троши при титрирањето (на апсцисата, во mL) наспроти измерениот потенцијал (на ординатата, во mV) се добива титрационата крива на потенциометриската титрација. Волуменот на ЗТТ се определува со екстраполација од средината на стрмниот дел на кривата (најголемата промена на потенцијалот) на x - оската (Слика 5.2а). 250 200 150 100 E (mV) 50 0 -50 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 -100 -150 -200 -250 -300 V (m l) Слика 5.2а. Определување на завршната точка на титрација од крива на титрација [E/V]. Со графички приказ на промената на потенцијалот за единица волумен на титрант Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 41 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Потенциометрија. Потенциометриско определување на pH вредност Потенциометриски титрации Вежба бр.5 (dE/dV), во функција од додадениот волумен (V), се добива крива со максимум, што одговара на најголемата промена на потенцијалот. Волуменот на ЗТТ се определува со екстраполација од максимумот на кривата на x - оската (Слика 5.2б). 0 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 -200 dE/dV (mV/ml) -400 -600 -800 -1000 -1200 -1400 V (m l) Слика 5.2б. Определување на завршната точка на титрација од крива на титрација [(dE/dV)/V]. Со графички приказ на вториот извод од промената не потенцијалот за единица волумен на титрант (d2E/dV2), во функција од додадениот волумен (V), се добива крива на титрација која ја сече x - оската во точка што одговара на најголемата промена на потенцијалот. Интерсептот на кривата со x - оската претсатвува волумен на ЗТТ (Слика 5.2в). 15000 d2E/dV2 (mV/ml 2) 10000 5000 0 18 19 20 21 22 23 -5000 -10000 -15000 V (m l) Слика 5.2в. Определување на завршната точка на титрација од крива на титрација [(d2E/dV2)/V]. Автоматизирани титрации Титрациите може да бидат автоматизирани и контролирани со микропроцесор. Титрантот се додава преку автоматска бирета, а завршната точка се определува потенциометриски со стаклена електрода или друга соодветна јон-селективна електрода. Брзината на додавање на титрант може да се контролира зависно од брзината на промената на потенцијалот, колку е поголема брзината на промена на потенцијалот, титрантот се додава поспоро и обратно. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 42 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Потенциометрија. Потенциометриско определување на pH вредност Потенциометриски титрации Вежба бр.5 Практичен дел 1. Потенциометриско определување на pH вредност. Внеси ги измерените pH вредности во следната табела: pH вредност мерење 1 мерење 2 мерење 3 Средна вредност Анализа 1 Анализа 2 Анализа 3 2. Потенциометриска титрација. Определување на титар на 0,1 M HCl. Реагенси и опрема Tris (hydroxymethyl)-aminomethane [THAM], примарен стандард Mr = 121,14 g/mol, z = 1 дестилирана вода мензура (50 mL) Инструмент: Mettler Toledo DL55 Постапка Се раствораат 50 - 100 mg THAM во 50 mL дестилирана вода. Се титрира со 0,1 M HCl. Волуменот на ЗТТ се определува со автоматизиран потенциометриски титратор. Врз основа на измeрените вредности од спроведената титрација, конструирај ја кривата на титрација, означи ја завршната точка на титрација и отчитај го потрошениот волумен на титрантот во ЗТТ. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 43 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Потенциометрија. Потенциометриско определување на pH вредност Потенциометриски титрации Вежба бр.5 (E/V) Vзтт(NaOH)= (dE/dV)/V Vзтт(NaOH)= Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 44 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Потенциометрија. Потенциометриско определување на pH вредност Потенциометриски титрации Вежба бр.5 (d2E/dV2)/V Vзтт(NaOH)= Пресметај ја концентрацијата на HCl (Cx) за сите 6 определувања и внеси ги вредностите во табелата. Пресметај го титарот (Cx/Ct) на 0,1 M HCl (Ct) за секое определување поединечно и пресметај ја средната вредност од сите шест титрации. Пресметки: Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 45 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Потенциометрија. Потенциометриско определување на pH вредност Потенциометриски титрации Cx 1 2 3 4 5 6 Вежба бр.5 Титар (Cx/Ct) одвага (g) mL (0,1 M HCl) одвага (g) mL (0,1 M HCl) одвага (g) mL (0,1 M HCl) одвага (g) mL (0,1 M HCl) одвага (g) mL (0,1 M HCl) одвага (g) mL (0,1 M HCl) Средна вредност Вежбата се признава Освоени бодови Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 46 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Потенциометрија. Потенциометриско определување на pH вредност Потенциометриски титрации Вежба бр.5 Прилог на Вежба број 5 Табела на измерени вредности од спроведена потенциометриска титрација на THAM во 50 mL дестилирана вода, со 0,1 M HCl. V (mL) 0,0000 1,7140 2,5710 3,0000 3,3000 3,6000 3,9000 4,2000 4,5000 4,8000 5,0500 5,2500 5,3990 5,5070 5,5880 5,6450 5,6980 5,7320 5,7550 5,7750 5,7950 5,8150 5,8350 5,8550 5,8780 dV (mL) 1,7140 0,8570 0,4290 0,3000 0,3000 0,3000 0,3000 0,3000 0,3000 0,2500 0,2000 0,1490 0,1080 0,0810 0,0570 0,0530 0,0340 0,0230 0,0200 0,0200 0,0200 0,0200 0,0200 0,0230 Е (mV) -170,7 -96,4 -80,2 -72,4 -66,8 -61,3 -55,6 -49,4 -42,6 -34,4 -26,0 -17,3 -8,5 -0,1 8,8 16,2 25,8 34,8 42,5 50,3 64,0 81,3 123,2 147,7 163,7 dE (mV) dE/dV (mV/mL) d2E (mV) dV2 (mL2) d2E/dV2 (mV/mL2) 74,3 16,2 7,8 5,6 5,5 5,8 6,1 6,9 8,2 8,4 8,7 8,7 8,5 8,9 7,4 9,6 9,0 7,7 7,8 13,7 17,3 41,9 24,4 16,1 43,4 18,9 18,2 18,5 18,3 19,2 20,5 22,8 27,4 33,6 43,6 58,5 78,4 109,3 129,2 181,7 264,2 334,3 391,0 685,0 865,9 2096,9 1221,3 699,6 -58,1 -8,4 -2,2 -0,1 0,3 0,3 0,8 1,3 0,2 0,3 0,0 -0,2 0,4 -1,5 2,2 -0,6 -1,3 0,1 5,9 3,6 24,6 -17,5 -8,3 -16,1 2,9378 0,7344 0,1840 0,0900 0,0900 0,0900 0,0900 0,0900 0,0900 0,0625 0,0400 0,0222 0,0117 0,0066 0,0032 0,0028 0,0012 0,0005 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0004 0,0005 -19,7767 -11,4371 -11,9539 -1,11111 3,333333 3,333333 8,888889 14,44444 2,222222 4,8 0 -9,0086 34,29355 -228,624 677,1314 -213,599 -1124,57 189,0359 14750 9000 61500 -43750 -20750 -30434,8 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 47 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 48 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Тенкослојна хроматографија (TLC) Вежба бр.6 Вовед Хроматографијата е една од најчесто употребуваните аналитички техники во фармацевтските анализи. Хроматографските анализи се применуваат за разделување, идентификација и квантитативно определување на хемиски соединенија што претставуваат составен дел на сложени смеси. Хроматографијата претставува процес на раздвојување на поедини супстанции од анализираната смеса, што се заснова на различна распределба на компонентите од примерокот помеѓу две фази. Едната фаза е неподвижна и се нарекува стационарна фаза, а другата е подвижна и се нарекува мобилна фаза. Во хроматографскиот процес мобилната фаза континуирано се движи низ стационарната фаза, при што зависно од нивниот афинитет кон мобилната и стационарната фаза супстанциите различно се задржуваат во стационарната фаза. Како резултат на разликите во подвижноста на супстанциите, тие се разделуваат на посебни зони (или ленти) кои може квалитативно или квантитативно да се анализираат. Тенкослојна хроматографија (TLC – Thin-layer Chromatography) Во фармацевтските анализи, тенкослојната хроматографија најчесто се применува за идентификација на супстанции и за определување на онечистувања во активни супстанции или готови фармацевтски производи. Принцип: Според начинот на пакување на стационаранта фаза, тенкослојната хроматографија спаѓа во планарна хроматографија. Во тенкослојната хроматографија, стационарната фаза претставува релативно тенок, воедначен слој на сув, фино пулверизиран материјал, нанесен на стаклена, пластична или метална плоча. Аналитот мигрира низ хроматографската плоча под влијание на мобилната фаза (обично смеса од органски растворувачи), што се движи низ стационарната фаза (најчесто силика гел) под дејство на капиларни сили. Миграционото растојание на аналитот зависи од неговиот релативен афинитет кон стационарната во однос на мобилната фаза. Разделувањето во тенкослојната хроматографија, зависно од видот на стационарна фаза и нејзината подготовка, со употреба на различни растворувачи, може да се постигне врз основа на адсорпција, распределба, или нивна комбинација и јонска-измена. На поларна стационарна фаза (силика гел), пополарен аналит подолго ќе се задржи во стационарната фаза, според тоа пократко ќе биде и неговото миграционо растојание. Лоцирањето (визуелизацијата) на аналитот (или аналитите) на развиениот хроматограм може да се изврши со: реагенс раствори за визуелизација (лоцирање преку хемиска реакција со аналитот - се добива видлив продукт) или со инкорпорирање на флуоресцентен материјал во стационарната фаза (под UV светлина целата плоча флуоресцира, освен местото (дамката) каде се наоѓа аналитот - кое е темно, гледано под UV светлина). Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 49 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Тенкослојна хроматографија (TLC) Вежба бр.6 Апаратура TLC/HPTLC плоча Стационарната фаза на стандардна TLC плоча има големина на честички 10 до 15 µm, додека HPTLC плоча има просечна големина на честички од 5 µm. Најчесто се користат комерцијални плочи, но во одредени случаи, може да се подготват TLC плочи со обложување на стаклени плочи. Уред за апликација За соодветна апликација на растворите за TLC анализа, се препорачува употреба на микропипетори, микрошприцеви и калибрирани капилари за еднократна употреба. Хроматографска комора За развивање на TLC плочите, се употребуваат комори изработени од проѕирен материјал, со рамно дно, капак што добро се затвора и големина соодвтена за плочите (Слика 1). Слика 6.1. Типична комора за развивање на TLC плоча Уреди за трансфер на реагенси на плочата Реагенсите за визуелизација на разделените компоненти се нанесуваат на плочата со распрскување на регенсот, потопување на плочата или изложување на пареи од реагенсот. Извор на UV светлина Уред за документирање на визуелизираните хроматограми Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 50 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Тенкослојна хроматографија (TLC) Вежба бр.6 Идентификација Идентификацијта со примена на TLC може да се постигне преку набљудување на дамките и споредба на вредностите на факторот на задржување (Rf ) на непознат и референтен примерок на иста хроматографска плоча. Фактор на задржување Rf е однос на миграционото растојание на аналитот, b и миграционото растојание на мобилната фаза, a: Rf b a Слика 6.2. TLC хроматограм Вредностите за Rf варираат од 1 за компоненти кои не се задржуват до вредности кои се приближуваат кон 0. Во случај кога дамките не се симетрични, b вредноста се мери врз основа на позицијата на максималниот интензитет на дамката. Полуквантитативно определување Визуелна споредба на големината или интензитетот на добиените дамки на пробен и стандарден раствор, може да полсужи за полуквантитативно определување. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 51 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Тенкослојна хроматографија (TLC) Вежба бр.6 Квантитативно определување Квантитаивно определување се постигнува на два начина: со примена на дензитометри (мерење на абсорбанција или флуоресценција) или дамките кои го содржат аналитот од интерес се отстрануваат внимателно од плочата, аналитите се раствораат во соодветен растворувач и се анализираат спектрофотометриски (слика 6.3). Слика 6.3 TLC хроматограм Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 52 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Тенкослојна хроматографија (TLC) Вежба бр.6 Практичен дел Смеса од обоени супстанции (сина и розева) се разделуваат на TLC плоча, користејќи три различни мобилни фази: n-хексан, етанол, 1-пропанол и смеса од етанол и 1-пропанол (50:50). Реагенси и опрема TLC плоча (силика гел) стаклени капилари за апликација или микропипетор n-хексан етанол 1-пропанол фен мензура (50 mL) комора за развивање на плочите Постапка 1. Апликација на примерокот 1-2 µl од растворот на примерокот постепено се нанесуваат на 1-2 cm од работ на TLC плочата. Ако одеднаш се аплицира повеќе од 1 µl од растворот, ќе дојде до околно проширување на дамката (од растворот) на плочата, што може да доведе до добивање на хроматограми со развлечени петна, што ќе ја отежни споредбата. Дамката треба да се остави да се исуши (или сушењето да се потпомогне со струја од топол воздух - фен) помеѓу секоја апликација на 1 µl од растворот. 2. Развивање на плочата Плочата се става во затворен сад претходно заситен со пареи од мобилната фаза. Едниот крај на плочата (0,5 cm) се потопува во мобилната фаза, при тоа внимавајќи да се избегне директен контакт на мобилната фаза со примерокот. Мобилната фаза патува низ плочата под дејство на капиларни сили, при што го раствора примерокот и го носи низ плочата, а компонентите од примерокот се распределуваат помеѓу мобилната и стационарната фаза. Откако мобилната фаза ќе помине две третини од должината на плочата, плочата се отстранува од комората и се суши. 3. Лоцирање на аналитите на плочата. Бидејќи смесата содржи обоени компоненти, аналитите се лоцираат според добиените дамки, директно, веднаш по сушењето на плочата. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 53 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Тенкослојна хроматографија (TLC) Вежба бр.6 Резултати и пресметки Скицирај ги развиените хроматограми и пресметај ги Rf вредностите на сината и розевата супстанција во сите три хроматограми. Rf (сина) = Rf (сина) = Rf (сина) = Rf (сина) = Rf (розева) = Rf (розева) = Rf (розева) = Rf (розева) = 1. Која од четирите мобилни фази е најпогодна за разделување на обоените супстанции? Објасни зошто! _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 2. Кој од растворувачите искористени за подготовка на мобилните фази во практичните експерименти е понеполарен: етанолот или 1-пропанолот? _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ 3. Која од обоените супстанции е пополарна, розевата или сината? Образложи го својот одговор! _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ Вежбата се признава Освоени бодови Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 54 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 Вовед Хроматографија на колона Стационарната фаза (добро иситнета цврста супстанција или течност која ја покрива цврстата супстанција) е сместена во стаклени или метални цевки наречени колони. Мобилната фаза се движи низ колоната под дејство на земјината тежа или под притисок. Елуциона хроматографија на колона Постапката на движење и промивање на примероците низ колоната со постојано додавање на свеж растворувач се нарекува елуирање. Мобилната фаза со која се врши елуирањето се нарекува елуент, а растворот што излегува од колоната се нарекува елуат. Со континуирано додавање на растворувач се пренесуваат растворените молекули низ колоната во континуирани серии на трансфер помеѓу мобилната и стационарната фаза, при што доаѓа до континуирана распределба на компонентите помеѓу двете фази. Последна ќе се елуира онаа супстанција што има најголем афинитет према стационарната фаза. Течната хроматографија под висок притисок (HPLC - High-pressure Liquid Chromatography) е најчесто употребувана аналитичка техника за квантификација на активните супстанции во фармацевтските препарати. Комбинацијата меѓу течната хроматографија под висок притисок и UV/Vis детекцијата дава точни, прецизни и робустни методи за квантитативна анализа на фармацевтски производи, па поради тоа претставува стандардна индустриска и аналитичка техника за оваа цел. HPLC има примена во мониторирање на стабилноста на чистите активни фармацевтски супстанции и на активните супстанции во фармацевтските препарати, како и за квантитативно определување на нивните деградациони продукти, определување на активните фармацевтски супстанции и нивните метаболити во биолошки течности и определување на партиционите коефициенти и pKa вредностите на активните фармацевтски супстанции. Принцип: течната мобилна фаза се испумпува под висок притисок низ челична колона, која содржи честички на стационарната фаза со дијаметар од 3 до 10 µm. Примерокот се аплицира на почетокот на колоната преку инјекторска јамка (injector loop) и со помош на мобилната фаза се движи низ стационарната фаза. Разделувањето на супстанциите присутни во испитуваниот примерок се постигнува врз основа на нивниот различен афинитет кон стационарната фаза. Мониторирањето на елуатот од колоната се врши со примена на различни детектори. Апаратура Резервоари за растворувачите (што влегуваат во состав на мобилната фаза) и системи за обработка на растворувачите (системи за отстранување на честичките-филтри и системи за отстранување на растворените гасови - дегазери); Пумпа што може да ги испумпа растворувачите под висок притисок. Системи за внесување на примерок - инјектор со јамка (loop) за примерок со константен волумен (5 - 500 µL, микро системи 0,5 - 5 µL) или автоматски инјектори. Оддел за колона со термостат Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 55 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 Колона - најчесто челична цевка, но понекогаш се среќаваат и стаклени колони со дебели зидови. Зависно од пакувањето на колоната, може да се примени различен механизам на разделување: - партициона хроматографија (нормално фазна и реверзно фазна) - адсорпциона хроматографија - јон-изменувачка хроматографија - гел хроматографија Заштитна колона - кратка заштитна колона за продолжување на рокот на употреба на колоната, а дополнително служи и за заситување мобилната фаза со стационарната фаза. Пакувањето треба да биде идентично или слично со пакувањето на аналитичката колона. Детектор - UV/Vis детектор, инфрацрвен детектор, флуоресцентен детектор, електрохемиски детектор, детектор за мерење на рефрактивен индекс, MS детектор и др. Компјутерски систем со соодветен софтвер за снимање и обработка на хроматографските податоци. Слика 7.1. Шематски приказ на систем за течна хроматографија под висок притисок Хроматограм Хроматограм претставува графички приказ на одговорот на детекторот (сигналот од детекторот) наспроти времето на хроматографскиот процес или волуменот на додадена мобилна фаза. Положбата на максимумот на пикот на апцисата се користи за идентификација на аналитот (квалитативна анализа). Површината под пикот или висината на пикот се пропорционални со количеството на аналитот и се користат за квантитативна анализа. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 56 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 Слика 7.2. Хроматограм Ретенционо време tr е времето од инјектирање на примерокот до моментот кога аналитот ќе стигне до детекторот (појава на максимумот на пикот на аналитот). Мртво време tm е потребно време за поминување на молекулот од мобилната фаза, кој не е адсорбиран и поминува без задржување низ колоната. Факторот на ретенција (k’) е мерка за задржување на аналитот и е важен параметар за опишување на брзината на миграција на аналитот на колоната. t t k' r m tm Идеално разделување се постигнува под услови кога факторите на ретенција на компонентите имаат вредности од 2 до 10. Фактор на селективност (α) е однос на факторите на капацитет на два соседни пика (индикатор за перформансите на колоната): tr B tm k B' ' tr A tm kA k’B е фактор на капацитет на подолго задржаниот аналит во колоната (со поголемо ретенционо време), а k’A е фактор на капацитет на пократко задржаниот аналит (со помало ретенционо време). Ефикасност на колоната Ефикасноста на колоната се дефинира како способност на колоната да дава тесни и остри пикови. Ефикасноста на колоната квантитативно се изразува преку висината на теоретските подови (H) и бројот на теоретски подови (N) се кои: L N H каде L е должина на колоната во cm. N t 16 r W 2 или N 5,54 tr W1 / 2 2 каде W и W1/2 се ширина на пикот на основата и на полувисината соодветно (изразена во единици на величината нанесена на апцисата во хроматограмот; тоа е најчесто време, единица: min). Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 57 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 Резолуција на колоната Rs е квантитативна мерка за способноста на колоната да раздвои два различни аналити: 1,18 t r B t r A 2 tr B tr A или Rs Rs WA WB W1 / 2 A W1 / 2 B Фактор на симетрија на пикот (tailing factor, symmetry factor) A s е мерка за симетријата на пикот (колку пикот е посиметричен толку повеќе има изглед на Gauss-овата крива на нормална дистрибуција и вредноста за As се приближува до 1): W5 , 0 As 2 d каде W5,0 е ширина на пикот на 5% од висината на пикот h, d е растојанието од фронтот на пикот (почетокот на пикот) до tr мерено на 5% од висината на пикот. Слика 7.3. Определување на симетрија на пик Квалитативна анализа За идентификацијата на дадена супстанција се користат ретенционите вредности: ретенционо време и ретенционен волумен, при што овие вредности се споредуваат со вредностите добиени од стандардни сусптанции, под иситите хроматографски услови. Квантитативна анализа За квантитативна анализа се употребуваат вредностите на површината или висината на пиковите кои се споредуваат со вредностите добиени од стандардна сустанција, со примена на метод на калибрациона крива со надворешен и внатрешен стандард и метод на нормализација на површините на пиковите. Метод на калибрација со надворешен стандард во една точка: Споредба на површините на пиковите на стандарден раствор (Ast) и пробен раствор (Ax), при што концентрациите на пробниот и стандардниот раствор не треба да се разликуваат и да бидат во интервалот каде постои линеарна зависност меѓу сигналот и концентрацијата. Cx Ax Ast Cst Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 58 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 Практичен дел Да се определи содржина на конзервансите етил-, метил- и пропил-4-хидроксибензоат во пробниот раствор со примена на метод на надворешен стандард. Реагенси и опрема HPLC апарат реверзно-фазна (октадецилсилан - C8) колона со должина: 125 mm, внатрешен дијаметар: 4,6 mm и големина на честичките: 5 µm метанол (HPLC чистота) вода (HPLC чистота) филтри за примерок за еднократна употреба (регенерирана целулоза-RC 0,45 m) волуметриски садови шприцеви со игли за еднократна употреба вијали за апликација на примерок етил-4-хидроксибензоат метил-4-хидроксибензоат пропил-4-хидроксибензоат пипети (трбушеста 1,0 mL; трбушеста 2,0 mL; градуирана 5 mL) Хроматографски услови: Колона: реверзно-фазна (октадецилсилан - C8) колона, со должина: 125 mm, внатрешен дијаметар: 4,6 mm и големина на честичките: 5 µm. Мобилна фаза: метанол : вода = 60 : 40 (v/v) Проток: 1 mL/min Температура на колона: 25ºC Волумен на инјектирање: 20 µL Детекција: UV, = 254 nm Подготовка на раствори за апликација Растворувач: метанол : вода = 60 : 40 (v/v) Стандарден раствор Стандарден раствор 1: Се мери 15,0 mg етил-, метил- и пропил-4-хидроксибензоат и се раствораат во 100,0 mL растворувач. Стандарден раствор 2: 1 mL од стандардниот раствор 1 се разредува до 10,0 mL со растворувачот. Пробен раствор: анализата се филтрира низ филтер од 0,45 µm. Постапка: Стандардниот раствор се инјектира шест пати во хроматографскиот систем, а растворот за анализа еднаш. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 59 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 Резултати: Одвага (mg) Стандардна супстанција Концентрација во стандардниот раствор (mg/mL) етил-4-хидроксибензоат метил-4-хидроксибензоат пропил-4-хидроксибензоат Скицирај го хроматограмот на растворот за анализа Податоци добиени од хроматограмите на стандардниот раствор и растворот за анализа: Внеси ги во табелата вредностите за Rt и AUC од хроматограмите на раствори. метил-4-хидроксибензоат Rt [min] AUC [mAU s] етил-4-хидроксибензоат Rt [min] стандардните пропил-4-хидроксибензоат AUC [mAU s] Rt [min] AUC [mAU s] 1 2 3 4 5 6 Xsr SD RSD[%] Внеси ги во табелата вредностите за Rt и AUC од хроматограмот на пробниот раствор и пресметај ја концентрацијата на аналитите во анализата метил-4-хидроксибензоат Rt [min] AUC [mAU s] етил-4-хидроксибензоат Rt [min] AUC [mAU s] Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје пропил-4-хидроксибензоат Rt [min] AUC [mAU s] 60 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 Пресметки: Cx Ax Cs As Cx - концентрацијата на аналитот во пробниот раствор [mg/mL] Cs - концентрација на аналитот во стандардниот раствор [mg/mL] Ax- површина под пик (AUC) на аналитот во хроматограмот на пробниот раствор As - средна вредност на површините под пик (Xsr (AUC)) на аналитот во хроматограмите на стандардниот раствор Концентрација во растворот за анализа (mg/mL) Супстанција етил-4-хидроксибензоат метил-4-хидроксибензоат пропил-4-хидроксибензоат Да се пресмета факторот на капацитет k’ и бројот на теоретски подови N за секој од пиковите во дадениот хроматограм. Аналит tr [min] Фактор на капацитет (k’) Број теоретски подови (N) етил-4-хидроксибензоат метил-4-хидроксибензоат пропил-4-хидроксибензоат Одговори на следните прашања: 1. Кој од трите пикови најефикасно е раздвоен од колоната? Зошто? ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ ____________________________________________________________________ 2. Колку изнесува резолуцијата на колоната Rs меѓу пиковите, а колку факторот на селективност α запиковите? Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 61 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 3. Да се пресмета факторот на симетрија As на пиковите. Метил парахидроксибензоат Етил парахидроксибензоат Пропил парахидроксибензоат Вежбата се признава Освоени бодови Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 62 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 Прилог на Вежба број 7. Слика 7.3. Хроматограм од стандарден раствор b Табели на измерени вредности: Инј.1 Инј.2 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 63 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Течна хроматографија под висок притисок (HPLC) Вежба бр.7 Инј.3 Инј.4 Инј.5 Инј.6 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 64 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Гасна хроматографија (GC) Метод на внатрешен стандард Вежба бр.8 Принцип: гасовитата мобилна фаза протекува под притисок низ колона која може да биде капиларна (течната стационарна фаза е нанесена на внатрешните ѕидови на колоната) или пакувана (течната стационарна фаза е нанесена на цврсти честички со кои е пакувана колоната). Анализата се внесува во загреан инјектор каде брзо испарува и температурно се фокусира на почетокот од колоната. Поради пониската температура на почетокот на колоната во однос на температурата на инјекторот, по инјектирањето, анализата се кондензира на колоната. Температурата на печката (во која е сместена колоната) или се одржува константна или програмирано, постепено се покачува во текот на времето. Разделувањето на компонентите од анализата, на колоната, настанува како резултат на нивното различно време на престој во стационарната фаза. Детектирањето на разделените компоненти во елуатот може да се изврши со најразлични детектори (FID пламен-јонизациониот детектор, ECD - електрон врзувачки детектор, MS - масен спектрометар), од кои најчесто применуван е пламен-јонизациониот детектор. Апаратура Инструментот за гасна хроматографија се состои од: 1. Боци под притисок за гасовите кои се користат како: мобилна фаза, горивен и оксидирачки гас (за пламен-јонизациониот детектор); 2. Инјектор, во кој анализата може да се внесе мануелно или со помош на автосемплер (автоматизирано инјектирање); 3. Печка во која се сместува колоната и може да се загрее на температури во опсег од собна до околу 400ºC; 4. Колона, која може да биде капиларна или пакувана. Разделувањето на компонентите на колоната се врши со помош на проток на мобилна фаза, која по состав може да биде азот, хелиум или водород и поретко - аргон; 5. Детектор; 6. Компјутерски систем за обработка на податоците. Слика 8.1. Шематски приказ на гасен хроматограф Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 65 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Гасна хроматографија (GC) Метод на внатрешен стандард Вежба бр.8 Метод на внатрешен стандард Подготовката на примерокот често се состои од повеќе различни чекори (на пример, филтрација, дериватизација, екстракција итн.), кои можат да предизвикаат губиток на аналитот при негово определување. Кога постапката за квантитативно определување не може да биде контролирана до тој степен сите стандарди и примероци за анализа да бидат третирани на ист начин, тогаш најмногу ќе трпи точноста и прецизноста на добиените резултати. На пример, ако испитуваната супстанција (аналит) е растворена во испарлив растворувач, нејзината концентрација ќе се зголеми со испарување на растворувачот од растворот. Да претпоставиме дека имаме на располагање примерок за анализа и стандард со иста концентрација на аналитот и исти сигнали. Ако и анализата и стандардот изгубат преку испарување исто количество растворувач и понатаму ќе имаат исти концентрации на аналит и исти сигнали. Но, ако стандардот и анализата, со иста концентрација на аналит, преку испарување изгубат различно количество растворувач, нивните концентрации и сигнали нема повеќе да бидат еднакви. Во овој случај, примена на методи за квантитативно определување, како што се методот на надворешен стандард и методот на стандардни додатоци ќе дадат неточни резултати, поради систематска грешка (промена на концентрациите на аналитот во стандардот и анализите поради испарување на растворувачот). И покрај тоа, сеуште може да се изврши квантитативно определување, ако сигналот на аналитот се определи врз основа на сигналот на друга супстанција која била претходно додадена во иста концентрација во сите раствори за анализа и стандарди. Додадената супстанција, која мора да се разликува од испитуваната (аналитот) се нарекува внатрешен стандард. Внатрешниот стандард треба да ги има следните карактеристики: Добро раздвојување од компонентата која се определува (аналит) и другите компоненти во примерокот; Слична ретенција (к) како и аналитот; Не смее да биде присутен во чистиот примерок; Треба да се однесува како аналит за време на подготовката на примерокот; Може, но не мора да има слични физичко-хемиски особини со аналитот; Да е достапен со висок степен на чистота; Да е стабилен и да не реагира со примерокот или мобилната фаза; Треба да дава одговор на детекторот сличен на аналитот за концентрацијата која се употребува. Бидејќи аналитот и внатрешниот стандард во било кој стандарден раствор и раствор за анализа се подложени на исти услови, односот на нивните сигнали нема да се промени при недостаток на повторливост (репродуцибилност) на постапката за квантитативно определување. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 66 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Гасна хроматографија (GC) Метод на внатрешен стандард Вежба бр.8 Ако растворот содржи аналит со концентрација CA, и внатрешен стандард со концентрација CIS, тогаш сигналот на аналитот SA, и на внатрешниот стандард SIS ќе бидат: SA S IS k AC A k IS C IS каде kA и kIS се фактори на одговорот на инструментот за аналитот и внатрешниот стандард, соодветно. Односот од сигналите на аналитот и внатрешниот стандард, ќе биде еднаков на: SA S IS kA k IS CA C IS K CA C IS каде K е релативниот фактор на одговор на инструментот, за аналитот во однос на внатрешниот стандард. При употреба на методот на внатрешен стандард во една точка, се подготвува само еден стандарден раствор од кој може да се пресмета вредноста за К користејќи ја равенката: K C IS CA SA S IS стандард Штом е стандардизиран методот, концентрацијата на аналитот во примерокот за анализа може да се пресмета по равенката: CA C IS K SA S IS примерок Методот на внатрешен стандард во една точка ги поседува истите ограничувања како и методот на калибрација во една точка. Кај метод на внатрешен стандард, стандардните раствори содржат различна концентрација на компонента која се определува и фиксна концентрација на внатрешниот стандард. За конструирање на калибрациона крива, потребно е да се определи односот помеѓу површините на пикот од испитуваната компонента и внатрешниот стандард, од хроматограмот на стандардните раствори. Таа вредност се нанесува на y-оска, а на х-оската концентрациите на компонентите во стандардните раствори. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 67 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Гасна хроматографија (GC) Метод на внатрешен стандард Вежба бр.8 Практичен дел Со метод на гасна хроматографија раздвоени се активната компонента А од нејзиното онечистување В. Заради варирање на инјекциониот волумен при рачно инјектирање, калибрационата крива за определување на компонентата А е направена со примена на метод на внатрешен стандард (IS), на начин опишан во табелата: Ред.бр. на стандард 1 2 3 4 CA (mg/mL) 5,6 10,3 15,2 20,1 CB (mg/mL) 23,4 23,4 23,4 23,4 CIS Површина на (mg/mL) пик А (SA) 10,0 13,1 10,0 35,0 10,0 23,1 10,0 43,8 Површина Површина на на пик В пик IS (SIS) 31,6 21,4 45,8 31,0 20,5 13,9 29,4 19,9 Направена е серија стандарни раствори (1-4) со растечка концентрација на компонентата А. Секој од овие раствори содржи иста концентрација на компонента В (23,4 mg/mL) и иста концентрација на внатрешен стандард (10,0 mg/mL). Варирањето во инјекциониот волумен е очигледно, со оглед на различните површини на пиковите од супстанциите В и IS. Поради истата причина, површината на пикот А не се зголемува сразмерно на концентрација во инјектираните стандардни раствори, како што се гледа од хроматограмите 1-4. Подготовен е примерок на начин опишан со следниот пропис: 50,0 mL од растворот за испитување се префрла во одмерен сад од 100,0 mL, се додава се 10,0 g внатрешен стандард (IS) и се разредува до 100,0 mL со растворувач. По инјектирање, добиени се следните вредности: Раствор за анализа Површина на пик А (SA) 1 36,1 Површина на пик IS (SIS) 24,9 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 68 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Гасна хроматографија (GC) Метод на внатрешен стандард Вежба бр.8 Задачи: 1. Да се нацрта крива на зависност помеѓу површината на пикот А и концентрацијата А. 2. Да се нацрта крива на зависност помеѓу односот на површините од пиковите А и IS, и концентрацијата А. 3. Да се објасни разликата помеѓу кривите добиени од задачите 1 и 2. _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ _____________________________________________________________________ Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 69 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Гасна хроматографија (GC) Метод на внатрешен стандард Вежба бр.8 4. Да се пресмета равенката на регресионата права. y=_______________________________________________________________ 5. Да се определи непознатата концентрација на компонентата А во примерокот: a) од равенка на крива (добиената вредност да се потврди и графички) х=____________________________________________________________ b) пресметковно Рел. фактор на одговор, К 1 2 3 4 K n 4 CA = Непознатата концентрација на аналитот во растворот за анализа изнесува: CA = __________ mg/mL Вежбата се признава Освоени бодови Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 70 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Грешки во квантитативната анализа Кога се врши мерење на некоја величина, независно од тоа дали се користат едноставни постапки или современи инструментални методи, колку и да се внимава, мерењето никогаш не е идеално точно. Причина за таа појава се бројните фактори кои влијаат врз мерењето. Така, мерењето всушност претставува постапка со која се утврдува колку одредена вредност отстапува од вистинската вредност на мерената величина. Отстапувањето на измерената вредност од вистинската се нарекува грешка во мерењето. Во пракса се стремиме што повеќе да се приближиме до правата (вистинската) вредност, да ги избегнуваме грешките и да ја определиме сигурноста (точноста и исправноста) на добиените резултати. Според карактерот, грешките во квантитативната анализа можат да се поделат во две групи: определени или систематски грешки и неопределени или случајни грешки. Систематски грешки се грешки чија појава може да се предвиди, а нивната вредност може да се измери и да се земе во предвид со воведување на соодветни корекции. Систематски грешки може да бидат предизвикани од: апаратурата и реагенсите (контаминирани и недоволно чисти реагенси, слаба прецизност, лошо калибрирање, грешки при употребата на инструментите, грешки при отчитување на вредностите), лични грешки на аналитичарот (неискуство при мерењето, брзоплетост при мерењето, грешки при запишување на резултатите и грешки при пресметка на резултатите), грешки на методот (недоволна квантитативност на реакцијата, појава на индуктивни или споредни реакции, градење на нестабилни соединенија, испарливост на супстанциите, губиток на аналитот при подготовка на примерокот со испарување или таложење и сл.) Карактеристика на овие грешки е тоа што тие најчесто имаат одреден (ист) правец при повторување на мерењето (тие се постојано или само поголеми или само помали). И по откривањето и отстранувањето на систематските грешки во некоја аналитичка процедура, таа сеуште е подложна на т.н. случајни или неопределени грешки. Случајни грешки се грешки чии причини за појавување не се точно познати, се јавуваат случајно (со подеднаква можност да бидат позитивни или негативни), не можат да се исклучат со воведување на корекција, обично се мали и предизвикуваат меѓусебно отстапување на резултатите добиени од паралелни определувања. Тие се обработуваат статистички. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 71 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Дефиниции на некои основни поими во статистиката Аритметичка средна вредност ( x ) претставува нумеричка вредност која се добива кога збирот од сите измерени вредности на иста мерена величина се подели со бројот на мерења, n. n xi x3 ...... x n i 1 x n n x е пресметана средна вредност од сите резултати на мерењата (позната како средна вредност на примерок) x1 x2 l imx n е вистинска вредност на аритметичката средина, добиена од бесконечно голем број на мерења (позната како популациона средна вредност) Како вредност за се зема: - позната вредност (зададена вредност на стандардот) - однапред зададена вредност - вредност одредена со посебно точен метод - вредност определена од многу голем број анализи (n 100) Апсолутната грешка претставува разлика помеѓу добиената вредност и вистинската вредност (xi - ) и се изразува во исти единици како и величината што се пресметува: A xi Релативната грешка е безимен број и најчесто се изразува во проценти. xi 100 % Имајќи предвид дека вистинската вредност на мерењата никогаш не можеме да ја определиме, останува оваа величина да ја процениме врз основа на многубројни повторени мерења. Отстапувањето на поединечните резултати од аритметичката средина се нарекува апсолутна вредност (или апсолутно отстапување): x каде xi x x е средната вредност на мерењата. Релативната вредност (или релативно отстапување) на поединечниот резултат на определување од средната вреднот се пресметува преку формулата: xi x G 100 x Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 72 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Нормална распределба Во случај кога се вршат поголем број мерења на одредено својство (величина) во една популација и кога добиените резултати се прикажуваатат графички во однос на нивната зачестеност (фреквенција на јавување при мерењето), се добива крива што ја следи нормалната (природна) распределба, позната како Gauss-ова крива на распределба. На тој начин графички се прикажуваат поединечните резултати од мерењата и нивната фрекфенција на јавување (мерењето се повторува голем број пати, а добиените резултати се сврстуваат во групи со блиски вредности), при што бројот на мерења во секоја група (фреквенциите) се нанесуваат на ординатата (y-оска), а измерените вредности на групите на апцисата (x-оска). Слика 1. a) Хистограм (дистрибуција на резултати) б) Gauss-ова крива на распределба на податоците прикажани со хистограмот под (а), (иста средна вредност и иста стандардна девијација) Доколку бројот на мерења биде бесконечен, а резултатите се сврстат во бесконечно тесни (по вредност x) групи се добива кривата на Gauss-ова распределба (крива на нормална распределба). Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 73 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Слика 2. Крива на нормална распределба Основни својства на кривата на нормалната распределба се: a) средината на кривата се наоѓа во средишната точка со најголема фреквенција (максимум); b) постои симетрична распределба на позитивните и негативните отстапувања околу максимумот и c) фреквенцијата на точките кои лежат на кривата експоненцијално се намалува со зголемување на отстапувањето од максимумот. Површината ограничена со Gauss-овата крива и x-оската претсатвува 100 % од добиените резултати. Математички може да се покаже дека: - 68,3 % од сите резултати ќе се најдат во интервалот 1 - 95,5 % од сите резултати во интервалот 2 - 99,7 % од сите резултати во интервалот 3 Со други зборови, доколку постои нормална распределба со сигурност од 68,3 % можеме да тврдиме дека измерениот резултат нема да биде надвор од интервалот на една стандардна девијација ( ); постои 95,5% сигурност дека измерениот резултат ќе се најде во интервалот на две стандардни девијации (2 ), односно речиси е сигурно (поточно 99,7% веројатно) дека резултатот ќе се најде во интервалот на три стандардни девијации (3 ) од аритметичката средина. Вистинската вредност на аритметичката средина ја определува положбата на Gauss-овата крива (по должината на апцисата). Од друга страна, вредноста на стандардната девијација го определува обликот на кривата (дали таа ќе биде потесна и повисока или поширока и пониска). При прецизно изведени мерења, ќе биде помала, а кривата потесна и повисока. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 74 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Слика 3. Крива на нормална распределба со различни стандардни девијации Кривата добиена од бесконечно големиот број на мерења е симетрична околу аритметичката средина (аритметичката средина, x е еднаква со вистинската вредност на аритметичката средина, ). Доколку добиените резултати носат во себе одредена грешка, кривата на нормална распределба не го менува обликот, туку се поместува за одреден износ по должината на апцисната оска налево или надесно (средна вредност е различна од вистинска вредност). Слика 4. Отстапување од вистинската вредност Кривата има две точки на инфлексија. Оддалеченоста на секоја од овие точки од средната вредност е еднаква на стандардната девијација, . Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 75 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Стандардна девијација, варијанса и релативна стандардна девијација Кога измерените вредности се блиски меѓусебно и малку отстапуваат од нивната средна вредност, тогаш велиме дека мерењето е прецизно. Мерка за прецизноста на мерените вредности е стандардната девијација. Колку е помал бројот на мерења толку е поголемо одстапувањето од нормалната распределба. Бидејќи во пракса обично се изведуваат мал број мерења оваа појава е редовен случај и пресметаната стандардна девијација се однесува на стандардната девијација на примерок која се означува со S и се пресметува според равенката: ( xi S2 x) n 1 каде n - 1 е број на степени на слобода, односно S ( xi x) n 1 (n е број на мерења). Степените на слобода се дефинираат како број на независни споредувања кои можат да се извршат помеѓу пооделни членови на низот и средната вредност. Кога бројот на мерењата е голем, во равенката за стандардна девијација, бројот на степени на слобода се заменува со n, а S со σ (стандардна девијација на популација). Со зголемување на бројот на извршени мерења, вредноста на S се доближува до вредноста на (S , x ), а кога бројот е поголем од 25-30, пресметаната S е многу добра апроксимација за . Единиците на стандардната девијација се исти како и кај мерената величина. Квадратот од стандардната девијација S2 се нарекува варијанса. Таа е воведена во статистичката теорија како израз за проценка на прецизноста. Од изнесеното се гледа дека стандардната девијација е апсолутна мерка на дисперзија на добиените резултатии околу средната вредност и не е погодна за споредување на дисперзијата на две групи на резултати со различни аритметички средини (кои имаат различни димензии). Затоа во праксата за такви споредувања се користи релативна стандардната девијација, koja најчесто се изразува во %. RSD S односно RSD(%) x Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје S 100 x 76 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Стандардна девијација на слепа проба Во случаите кога во квантитативната анализа се користи слепа проба, треба да се одреди т.н реална стандардна девијација Sc, во која се вклучени стандардните девијации на испитуваната проба, Sa и на слепата проба, Sb. C=A–B A - количина на нечистотија во пробата B - количина на нечистотија во слепата проба C - вистинска количина на нечистотија во пробата Sc S a2 S b2 Sc е вкупната стандардна девијација за количината на нечистотијата во пробата. Ако девијацијата на пробата е многу поголема од девијацијата на слепата проба S b2 ) тогаш влијанието на слепата проба врз прецизноста на определувањето е ( S a2 незначително. Стандардна девијација на аритметичка средина За низа од примероци (кои припаѓаат на иста популација), од која секој примерок содржи n случајно земени податоци од популацијата, аритметичката средина сî помалку и помалку ќе отстапува од вистинската вредност на аритметичката средина како n се зголемува. Стандардната девијација на секоја аритметичка средина (од вистинската вредност) на примероците е позната како стандардна грешка и се означува како S X . Стандардната девијација ја карактеризира прецизноста на пооделните мерења во серијата. Меѓутоа, прецизноста на аритметичката средина е поголема, бидејќи во неа делумно се компензирани случајните грешки со спротивна насока. Стандардната грешка на аритметичката средина е n -пати помала од стандардната девијација на поединечното мерење: S SX n S X се користи за проценка на граничниот интервал на сигурноста на некој метод. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 77 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Граници на сигурност на аритметичката средина Вистинската вредност за една популација на податоци не може никогаш точно да се одреди, бидејќи за нејзино одредување потребно е да се извршат бесконечн број мерења. Меѓутоа, со помош на статистиката може да се постават граници околу експериментално добиената аритметичка средина x , во кои се очекува да се најде вистинската вредност на аритметичката средина со даден степен на веројатност. Границите добиени на тој начин се нарекуваат граници на сигурност, а интервалот кој го ограничуваат познат е како интервал на сигурност. Често пати сме соочени со ограничено време и ограничена големина на примерок, кои не ни дозволуваат точно да ја одредиме вредноста за стандардната девијација на популацијата . Тогаш, обично, една група истородни вредности мора да ја даде, не само аритметичката средина, туку и мерката за прецизност (девијацијата). Пресметувањето на S од мала група податоци може да биде доста несигурно. Затоа границите на сигурност нужно се пошироки, доколку не е позната вредност за . За да се објасни променливоста на S, се користи статистичкиот параметар t, кој се дефинира како отстапуавње на вредностите од аритметичката средина изразено во единици стандардни девијации, односно: t x S На пример, кога отстапувањето на поединечната вредност од аритметичката средина (x ) е бројно еднаква на стандардната девијација S, вредноста на t изнесува 1 (што значи дека таа вредност отстапува 1 стандардна девијација од аритметичката средина). Параметарот t се нарекува Студентов коефициент, кој го зема во обзир ограничениот број на мерења (т.е. можното одстапување на x од , како и користење на S наместо ). Вредноста за t се отчитува од табела за соодветно ниво на веројатност (P') и за соодветен број степени на слобода . Табела 1. Вредности на Студентовиот коефициент t Вредност на t за избрана веројатност Број на степени на слобода ( ) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 90 % 95 % 99 % 6,314 2,920 2,353 2,132 2,015 1,943 1,895 1,860 1,833 1,812 12,706 4,303 3,182 2,776 2,571 2,447 2,365 2,306 2,262 2,228 63,657 9,925 5,841 4,604 4,032 3,707 3,499 3,355 3,250 3,169 Вредност на t за избрана веројатност Број на степени на слобода ( ) 11 12 13 14 16 18 20 25 30 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 90 % 95 % 99 % 1,796 1,782 1,771 1,761 1,746 1,734 1,725 1,708 1,697 1,645 2,201 2,179 2,160 2,145 2,120 2,101 2,086 2,060 2,042 2,000 3,106 3,055 3,012 2,977 2,921 2,878 2,845 2,787 2,750 2,576 78 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Користејќи ја табеларната вредноста за t за n истородни мерења (n-1, број на степени на слобода) и определено ниво на веројатност P’ (P’=0,05 за 95% веројатност, P’=0,01 за 99% веројатност и сл.), границите на сигурност за средната вредност x може да се пресметаат користејќи ја равенката: t S x n Со други зборови, вистинската вредност на аритметичката средина, за одредено ниво на веројатност, ќе се најде во интервалот: t S t S x x n n Пример: n = 21; x = 10,55 mg; S = 0,256; P' = 0,05 P' = 0,05 t0,05 = 2,086 = 20 Граници на сигурност = 10,55 0,117 Интервал на сигурност = 10,433 - 10, 667 Веројатноста е помала од 5% (P’=0,05) дека вистинската аритметичка средина ќе биде помала од 10,433, односно поголема од 10,667. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 79 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Отфрлување на сомнителни резултати Кога група на резултати (измерени вредности) содржи резултат чија вредност многу се разликува од просечната вредност, тогаш треба да одлучиме дали тој резултат треба да го задржиме или отфрлиме. Во случај кога некој резултат значајно одстапува од останатите заради груба (систематска) грешка тогаш тој се отфрла. Но доколку не се знае причината за одстапување на ваквиот резултат, потребно е да се биде многу критичен во проценката дали да се отфрли или не (особено кога има мал број на мерења, влијанието на овој резултат врз средната вредност е големо). Постојат неколку статистички постапки (меѓу кои е и Q тестот) со кои се одредува критериумот за отфрлање или задржување на сомнителните резултати. Овие тестови подразбираат дека распределбата на резултатите во популацијата е нормална, т.е Gaussова. За жал овој услов не може да се докаже за примероци кои имаат помалку од 50 резултати. Од тука следува дека статистичките правила кои со голема сигурност се користат при нормална распределба на резултатите, треба да се користат со крајно големо внимание кога се применуваат на примероци што содржат само неколку резултати. Q - тест За мал број на мерења (n = 3 - 8), се применува Q - тестот како еден од најсигурните критериуми и претставува едноставен статистички тест кој често се употребува. Апсолутната вредност на разликата меѓу сомнителната вредност и до неа најблиската вредност, поделена со распонот (разликата меѓу најголемата вредност и најмалата вредност од мерењето) на целата група вредности ја дава експерименталната вредност за Q, т.е Qекспериментално. Qeksperimentalno somnitelna vrednost - do nea najbliska vrednost najgolema vrednost - najmala vrednost Добиената Q вредност (Qекспериментално) се споредува со Q вредноста дадена во табела (Qтабела), за даден степен на веројатност и даден број мерења. Ако Qекспериментално > Qтабеларно тогаш резултатот се отфрла. Табела 2. Вредности на коефициентот Q Вредност на Q за избрана веројатност Број на мерења 90% веројатност 95% веројатност 99% веројатност 3 0,941 0,970 0,994 4 0,765 0,829 0,926 5 0,642 0,710 0,821 6 0,560 0,625 0,740 7 0,507 0,568 0,680 8 0,468 0,526 0,634 9 0,437 0,493 0,598 10 0,412 0,466 0,568 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 80 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Споредување на стандардни девијации. F-тест F - тестот се применува за утврдување на постоењето на значителна разлика во прецизноста помеѓу два низа на резултати добиени, на пример, со примена на две различни методи или од два експериментатора. Тестот се заснова на споредување на варијансите на двата низа на резултати: S12 F S 22 При тоа варијансата на групата од резултати која има поголема вредност S12 (резултатите се помалку прецизни) секогаш се става во броителот, а варијансата на другата група резултати, која е помала, (резултатите се попрецизни) се става во именителот на дропката во равенката за F. Пресметаната вредност на F се споредува со вредноста за F дадена во табела, за одредено ниво на веројатност и за даден број степени на слобода, за двата низа на резултати. Ако Fекспериментално > Fтабеларно, постои значителна разлика во прецизноста помеѓу двата низа на резултати. Табела 3. Вредности за F за 95% веројатност (P’ = 0,05) Степени на слобода (именител) 2 3 4 5 6 12 20 Степени на слобода (броител) 2 3 4 5 6 12 20 19,00 9,55 6,94 5,79 5,14 3,89 3,49 3,00 19,16 9,28 6,59 5,41 4,76 3,49 3,10 2,60 19,25 9,12 6,39 5,19 4,53 3,26 2,87 2,37 19,30 9,01 6,26 5,05 4,39 3,11 2,71 2,21 19,33 8,94 6,16 4,95 4,28 3,00 2,60 2,10 19,41 8,74 5,91 4,68 4,00 2,69 2,28 1,75 19,45 8,66 5,80 4,56 3,87 2,54 2,12 1,57 19,50 8,53 5,63 4,36 3,67 2,30 1,84 1,00 Споредување на средни вредности t -тест Студентовата t - распределба се применува за примероци со ограничен (мал) број на резултати (до 50). t - распределбата е зависна само од бројот на резултати и претставува основа на сите тестови за споредување на две средни вредности добиени од мал број мерења. Бидејќи пресметките се вршат на мали примероци, σ се заменува со S, а µ со x . Доколку постои значајна разлика помеѓу стандардните девијации на двете групи на податоци (F-тест), средните вредности не можат да се споредуваат. Студентов t - тест се применува за да се провери со колкава веројатност разликата помеѓу две средни вредности x1 и x2 од два низа на резултати е статистички значајна, или е предзвикана од случајна грешка. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 81 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Пример: споредување на две групи на резултати - добиени со различни аналитички методи, за одредена проба - добиени од разни експериментатори - добиени во разни лаборатории а) споредување на две групи на примероци со ист број на резултати, n1=n2=n x1 x 2 t ; = 2n - 2; t2n-2, се чита од табела S12 S 22 n 1 b) споредување на две групи на примероци со различен број на резултати, n1 n2 x1 x 2 t 2 S1 n1 S 22 n2 n1 n2 n1 n2 2 n1 n2 = n1 + n2 -2; t n1 n2 2 , се чита од табела c) споредување на средната вредност на една група резултати за одреден примерок со вистинската вреднсот ( ) за тој примерок - определување на точноста на методот, на пример, со користење на стандарден раствор од примерокот. x ; = n -1; tn-1 , се чита од табела t S n Ако tекспериментално < tтабеларно тогаш не постои статистички значајна разлика помеѓу средните вредности на двете групи на резултати, а за случај c) разликата помеѓу x и не е значајна т.е методот е точен. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 82 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Регресиона и корелациона анализа Регресионата и корелационата анализа се статистички методи кои ја утврдуваат врската помеѓу две или повеќе статистички променливи. Регресионата анализа најчесто опфаќа две променливи и зборува во каков однос стои едната променлива во однос на другата (за повеќе променливи - мултипна регресија). Регресионата анализа се изведува со примена на регресионата равенка: Yx = a + bX Y e непозната променлива која се пресметува на основа на вредностите на познатата променлива X. Регресионата равенка е равенка на права, што значи дека зависноста помеѓу двете променливи е праволиниска. Константата а претставува точка во која регресионата линија (права) ја сече yоската (y-intercept или y-отсечка) и укажува на постоење на систематски грешки во тек на работата е (вредност на Y, за X = 0). Константата b е еднаква на тангенс од аголот на регресионата права со апцисата (x - оската), го определува наклонот на регресионата линија и укажува на сложувањето помеѓу Y и X. Податоците кои меѓу себе се праволиниски (линеарно) зависни, т.е покажуваат одредена корелација, можеме да ги претставиме графички, во координатен систем. Меѓутоа ретки се случаите во праксата кога корелацијата меѓу двете променливи (X и Y) е толку висока (освен кај математичките закони), што кога ќе се нанесат вредностите за X и Y во координатен систем се добие нивно целосно сложување на регресионата права. Обично измерените вредности за величините кои се нанесуваат на x и y оската не покажуваат идеално сложување на една иста права. Тогаш како би ја нацртале регресионата права, која најточно ќе ја прикаже корелацијата меѓу вредностите на мерените величини? Математичарите нашле решение на овој проблем: најточен е оној правец на регресионата права кој има најмала сума на квадратни отстапувања на поединечните Y ~ резултати од тој правец. Имено, ако вредностите на тој правец ги означиме со Y (регресиски Y), тогаш за секој индивидуален резултат (т.е за секоја точка од правата) ќе ~ добиеме некоја разлика (Y Y ) . Сумата од квадратите на тие разлики (т.е отстапувањата од правецот на регресионата права) треба да биде најмала од сите можни. Методот со кој тоа се постигнува се вика метод на најмали квадрати. Со други зборови, со овој метод математички се покажува дека со експериментално добиените податоци најдобро се сложува оној правец во кој сумата на квадратите од разликата на правите и измерените вредности за ординатата поприма најмал износ. Математички е најдено дека константите a и b може да се пресметаат преку формулите: X Y n X Y ; a Y b X b X2 n X2 Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 83 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Пример: X 2,5 5,0 7,5 Y 0,105 0,202 0,319 b = 0,0425; a = - 0,0054 Y = a + bX за X = 7,5 Y = -0,0054 + 0,0425 x 7,5; Y = 0,3135 10,0 0,422 12,5 0,515 Прилог 1 15,0 0,624 17,5 0,750 Корелациона анализа го покажува степенот на зависност помеѓу променливите. Степенот на зависноста помеѓу променливите се одредува преку големината на растурањето на податоците околу регресионата линија, а се изразува со коефициентот на корелација, r. Доколку сите податоци лежат на регресионата линија, r = 1 (апсолутно сложување). 10 9 8 7 6 5 r=1 4 3 2 1 0 0 2 4 6 8 10 Слика 5. Апсолутно сложување на податоците од непознатата променлива y и познатата променлива х (сите податоци лежат на регресионата линија) Во случај кога помеѓу променливите не постои зависност регресионата линија е паралелна со x-оската, r = 0 Слика 6. Не постои зависност помеѓу податоците од непознатата променлива y и познатата променлива х (регресионата линија е паралелна со апцисата) Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 84 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите r X Y ( X 2 2 Прилог 1 n X Y n X ) ( Y2 n Y 2) Коефициентот на корелација може да има: - позитивна вредност, доколку постои правопропорционална зависност помеѓу променливите X и Y (т.е ако X се зголемува, тогаш и Y се зголемува и обратно) - негативна вредност, доколку постои обратнопропорционална зависност меѓу променливите (т.е ако X се зголемува, тогаш Y се намалува и обратно) Регресионата и корелационата анлиза се применуваат: - при споредување на две методи - определување на точноста на методот - пресметување на аналитичкиот принос, “recovery" - констриурање на баждарен дијаграм. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 85 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Точност и прецизност на резултатите Точност на резултатите подразбира споредување на еден резултат или на средната вредност од една група резултати со вистинската вредност или евентуално прифатената вистинска вредност. Точноста на резултатот ја означува близината на резултатот до неговата вистинска вредност. Често пати не може да се изрази со потполна сигурност (треба да се познава ). Точноста е мерка за сигурноста на еден метод, а проверување на точноста се врши со Студентовиот t - тест. Точност % (x ) 100 % Точноста се изразува преку добиениот аналитички принос за аналитот. Аналитички принос % x 100 % Кога одреден примерок се мери повеќе пати, редок случај е резултатите за бидат идентични со претходните мерења. Наместо тоа резултатите се случајно расеани. Прецизноста е мерка за оваа варијабилност. Прецизност на резултатите се дефинира како сложување помеѓу нумеричките вредности на мерењата, изведени на идентичен начин. За изразување на прецизноста најчесто се користи стандардната девијација, варијансата и релативната стандардна девијација. Доколку сакаме да ја споредиме прецизноста на две методи се применува F - тестот. Постигнувањето на добра прецизност (за еден низ на мерења, на иста величина и на идентичен начин) се користи како одреден критериум за точноста. Општо, прецизноста е поделена во две категории: повторливост и репродуцибилност. Повторливост (рипитабилност) е прецизност добиена кога сите мерења се извршени од ист аналитичар при исти услови на работа и опрема во тек на еден период на лабораториска работа. Позната е уште како short-term precision или прецизност на краток период. Репродуцибилноста на резултатите добиени со еден метод е дефинирана како варијабилност на процесот во подолг временски период: добиени во една лабораторија, но во различни денови; од различни оператори во различни лаборатории; на различна апаратура или нивни комбинации. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 86 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ a Статистичка обработка на резултатите б в Прилог 1 г Слика 7. Прецизност и точност на резултатите a) систематска грешка б) резултатите се непрецизни, но во просек се точни в) резултатите се прецизни, но не се точни г) резултатите се прецизни и точни Калибрација на инструментални методи Со исклучок на гравиметриските и кулометриските методи, сите аналитички методи бараат калибрација, процес кој го споредува измерениот аналитички сигнал со концентрацијата на аналитот. Трите најчести калибрациони методи се: метод на директна калибрација (изработување на баждарен дијаграм), метод на стандардни додатоци и метод на внатрешен стандард. Метод на директна калибрација За изработка на баждарен дијаграм се подготвува серија на стандарди, што содржат позната концентрација на аналит и се забележува одговорот на инструментот. Одговорот на инструментот се корегира со одговор на слепа проба 1. Од добиените податоци, одговор на инструментот во однос на концентрацијата на аналитот, се конструира баждарен дијаграм. Со обработка на баждарниот дијаграм со метод на најмали квадрати, се добива регресионата равенка, од која потоа директно може да се пресмета концентрацијата на примерокот. Пожелно е да се добие права која демонстрира линеарност во широк опсег на концентрации. Успешноста на методот на директна калибрација најмногу зависи од тоа со колкава точност се подготвени стандардите и колку е сличен матриксот 2 на стандардите со примероците кои се испитуваат. За жал, подготовката на стандарди чиј матрикс би се совпаднал со матриксот на комплексни примероци често е многу тешко или невозможно, па ефектот на матриксот може да биде причина за појава на грешки од интерференција. Во вакви случаи, за да се намалат ефектите од матриксот, често е неопходно да се одвои аналитот од компонентите на матриксот кои интерферираат. 1 Слепата проба ги содржи сите компоненти на испитуваниот примерок, освен компонентата од интерес - аналитот. 2 Терминот матрикс се однесува на сите различни конституенти содржани во испитуваниот примерок, вклучувајќи го и аналитот. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 87 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Метод на стандардни додатоци Методот на стандардни додатоци е особено корисен за испитување на комплексни примероци, заради тоа што овозможува делумно или целосно отстранување на интерференции предизвикани од матриксот на примерокот. Најчесто за изведува со додавање на еден или повеќе волумени на стандарден раствор на еднакви волумени од промерокот. Овој процес често се нарекува ”спајкување” на примерокот. Потоа примероците се раздредуваат до ист волумен. Доколку количината на примерокот е ограничена, методот на стандардни додатоци се изведува со мерење на истиот примерок после секое последователно додавање на стандард. Матриксот на примерокот после секое додавање на стандард е практично идентичен, се разликува единствено концентрацијата на аналитот. Според овој метод, еднакви волумени од растворот на аналитот со непозната концентрација cx, се пренесуваат во волуметриски садови со определен волумен Vt. Во секој од овие садови се додаваат различни волумени Vs од стандардниот раствор на аналитот со позната концентрација cs. Потоа, доколку е потребно се додаваат соодветни реагенси и волуметриските садови се дополнуваат до декларираниот волумен Vt. На крај, се мерат аналитичките сигнали S (апсорбанцијата) на подготвените раствори. Ако одговорот на инструментот е пропорционален со концентрацијата на аналитот, како што всушност мора да биде ако се употребува методот на стандардни додатоци, може да се напише: k Vs cs k Vx c x S Vt Vt каде к е константа на пропорционалност. Зависноста на S од Vs е линеарна и може да се прикаже со равенката на права: S b Vs a каде b k cs / Vt , преставува нагибот на правата, а a k Vx cx / Vt е y-отсечката. Со примена на методот на најмали квадрати може да се пресметаат вредностите за a и b, а потоа и за cx: a k Vx cx / Vt Vx cx b k cs / Vt cs односно, a cs cx b Vx Алтернативно, може да се конструира баждарен дијаграм и со екстраполација на правата до негативниот дел од апцисата да се отчита вредноста за Vs: k Vs cs k Vx c x S 0 Vt Vt k Vx c x k Vs cs Vt Vt Vs cs cx Vx Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 88 ИНСТРУМЕНТАЛНИ ФАРМАЦЕВТСКИ АНАЛИЗИ Статистичка обработка на резултатите Прилог 1 Слика 8. Баждарен дијаграм за метод на стандардни додатоци. Бидејќи баждарниот дијаграм на стандардните додатоци е конструиран за одреден примерок, истиот не може да се искористи за определување содржина на друг примерок со ист аналит. Метод на внатрешен стандард Внатрешен стандард претставува супстанција која се додава во точно одредена количина на сите примероци, слепи проби и стандарди, вклучени во испитувањата. Методот на внатрешен стандард вклучува конструирање на баждарен дијаграм, при што на ординатата се нанесува односот помеѓу сигналот на стандардите и сигналот на внатрешниот стандард, а на апцисата концентрацијата на стандардите. Концентрацијата на аналитот во примероците се пресметува од баждарниот дијаграм, графички или од регерсината равенка (метод на најмали квадрати). Внатрешниот стандард, доколку е одбран и употребен соодветно, може да компензира неколку типови на системски и случајни грешки. Така, доколку сигналите на аналитот и внатрешниот стандард поединечно се зависни од одредени варијации на инстерументот или на методот, тогаш односот на овие два сигнала е независен од овие варијации. Доколку матриксот влијае на ист начин на двата сигнала, со методот на внатрешен стандард се компензира овој ефект. Главна потешкотија при употреба на методот на внатрешен стандард е да се одбере соодветна супстанција како внатрешен стандард, како и додавањето на таа супстанција во примероците и стандардите на репродуцибилен начин. Внатрешниот стандард треба да даде сигнал кој е сличен со сигналот на аналитот, но сепак доволно различен за да може инструментот да ги разликува двата сигнала. Најчесто како внатрешен стандард се одбира супстанција која не е присутна во матриксот на примерокот, така што единствен извор на сигналот на внатрешниот стандард е додадената количина на внатрешен стандард. При развој на нов метод на внатрешен стандард, мора да се води сметка промената на концентрацијата на аналитот да не влијае на инензитетот на сигналот на внатрешниот стандард. Институт за применета хемија и фармацевтски анализи Фармацевтски факултет, Универзитет “Св.Кирил и Методиј“, Скопје 89