·实验与技术· 资源开发与市场 Resource Development ＆ Market 2 0 0 92 5（2） 不同碳氮源对双孢蘑菇2 7 9 6深层发酵的影响 王 敏刘爱民 （安徽师范大学 生命科学学院安徽 芜湖2 4 1 0 0 0） 摘要：碳源和氮源是食用菌生长发育过程中不可缺少的营养物质。通过单因子试验研究了液体培养中4种碳源和4种氮源对 双孢菇菌丝体生物量、胞内多糖、胞外蛋白、酶活性的影响。结果表明对菌丝生物量而言可溶性淀粉是最适的碳源玉米粉是最 适的氮源；对产胞外蛋白而言葡萄糖是最适的碳源蛋白胨是最适的氮源；对产过氧化物酶、淀粉酶和多酚氧化酶而言蔗糖是最 适的碳源酵母粉是最适的氮源。该试验为进一步研究双孢蘑菇的营养生理奠定了基础为生产上选择优良的母种培养基及开发 利用双孢蘑菇深层培养生产代谢产物资源提供了科学依据。 关键词：双孢菇；碳源；氮源；胞外酶 中图分类号： S6 4 6 ∙ 0 3 文献标志码： A 文章编号： 1 0 0 5－8 1 4 1（2 0 0 9）0 2－0 1 0 0－0 4 Effects of Carbon and Nitrogen Nutrient on Submerged Fermentation in Agaricus bisporus WANG Min LIU Ai－min （College of Life Sciences Anhui Normal University Wuhu2 4 1 0 0 0 China） Abstract：Carbon and nitrogen sources were the essential nutrients of edible fungus growth． Under the liquid culture conditions the effects of four carbon sources and four nitrogen sources on mycelium biomass intracellular polysaccharides extracellular protein content and extracellular enzyme ac- tivity of Agaricus bisporus were studied by single factor tests method in this paper． The results showed that the optimum carbon and nitrogen sources were soluble starch and cornstarch to mycelial dry weight． In terms of extracellular protein glucose and peptone were the most suitable carbon and ni- trogen sources sucrose and yeast powder were the best carbon and nitrogen sources respectively to inducing peroxydase amylase and polyphenol oxidase． The experiments fixed a basic to research on the nutrition of Agaricus bisporusalso provided a science evidence to select good medium in the produce process and utilize the metabolize outcome in deep liquid culture． Key words： Agaricus bisporus； carbon source； nitrogen source； extracellular enzyme 双孢蘑菇（ Agarigus bisporus Imbach）在分类上属于 真菌门、担子菌纲、伞菌目、伞菌科、蘑菇属 ［1］ 。双孢蘑 菇味道鲜美是我国目前出口量最大、创汇最多的一种 食用菌也是世界上人工栽培最广泛、产量最高的一种 食用菌约占全世界食用菌总产量的4 0％左右。双孢 蘑菇营养丰富。有文献报道它除了供食用外还具有 多种药用价值如能降低血压、防癌、抗癌、抗菌、防腐、 清除·OH自由基等作用对慢性肝炎、早期肝炎有明显 疗效 ［2 3］ 。 “骨架”也是维持食用菌生长的重要能量来源。有研 究表明食用菌吸收的碳素中有一小部分用于合成细 胞物质 8 0％产生的能量用于维持生命活动。氮源是 菌体细胞合成蛋白质、核酸及代谢产物必不可少的原 料。培养基中不同的氮源影响着菌丝体的生物量也 5］ 影响着其生物活性物质的形成 ［4 。 目前尚鲜见报道有关双孢蘑菇深层培养产生代谢 产物和酶的主要影响因子。为此本试验研究了在不 同碳源、氮源的培养基中双孢蘑菇菌丝体生物量、胞 深层培养生产的食用菌菌丝体的营养成分类似子 内多糖、胞外蛋白、胞外酶的活性与不同碳氮源的关 实体有的高于子实体而菌丝体是双孢蘑菇液体发酵 系为进一步研究双孢蘑菇的营养生理奠定基础为生 培养的主要成分富含多种氨基酸、维生素等具有很 产上选择优良的母种培养基及有效研究和开发利用双 高的开发应用价值。双孢蘑菇深层培养的菌丝体产量 孢蘑菇资源提供了科学依据。 与培养基的成分密切相关特别是培养基中的碳氮源。 碳氮源是食用菌生长发育的重要营养因素碳源是真 菌的碳素营养来源它是合成碳水化合物和氨基酸的 收稿日期： 2 0 0 8－1 2－2 6；修订日期： 2 0 0 9－0 1－1 7 基金项目：生态环境与生态安全由安徽省高校重点实验室经费资 助。 第一作者简介：王敏（1 9 7 8－）女安徽省阜阳人硕士研究生研 究方向为微生物发酵与酶工程。 ·100· 1 材料与方法 1． 1 供试材料 供试菌株为双孢蘑菇2 7 9 6菌种由安徽省芜湖市 食用菌研究所提供；供试碳源为葡萄糖、麦芽糖、可溶 性淀粉、蔗糖由上海试剂一厂生产供试氮源为酵母 粉、 蛋白胨、硝酸铵、以及上海试剂一厂生产的市售玉 米粉。 ·实验与技术· 资源开发与市场 Resource Development ＆ Market 2 0 0 92 5（2） 1． 2 培养基配制 固体培养基为马铃薯2 0％、葡萄糖2％、琼脂2％、 水1L；液体基础培养基为葡萄糖2％、蛋白胨0． 4％、 KH2PO40． 3％、 MgSO40． 1 5％。碳源配方培养基分别用 等量麦芽糖、可溶性淀粉、蔗糖替代基础培养基中的葡 萄糖；氮源配方培养基分别用等量酵母粉、硝酸铵、玉 米粉替代基础培养基中的蛋白胨。 1． 3 液体培养方法 我们将上述配制好的液体发酵培养基分装于 1 0 0ml／ 2 5 0ml 的三角瓶中每种培养基装3瓶灭菌冷 却后接入经活化的直径为6mm、菌龄6d 的平板菌种2 块 2 3℃、 1 3 0r／min 恒温摇床振荡培养6d。 1． 4 胞外粗酶液样品的制备 培养6d 后将每个处理的3个三角瓶中的培养基 混合取样在4℃、 4 0 0 0r／min 离心机上离心1 0min取 上清液即为胞外粗酶液于4℃保存备用。 1． 5 检测方法 主要检测方法有：①菌丝体生物量测定。发酵液 抽滤后获得菌丝体和滤液；菌丝体用蒸馏水冲洗多次 后在6 0℃的干燥箱中干燥至恒重用分析天平称量 得菌丝体干重取其平均值。②胞外蛋白质含量的测 ［6］ 定。采用双缩脲法 用酪蛋白粉末配制标准蛋白质 溶液；将1ml 经适当稀释的酶液加4ml 双缩脲试剂摇 匀在5 4 0nm 处测定 OD 值以加蒸馏水作为对照。③ 多酚氧化酶活力的测定。取1 0mmol／L 邻苯二酚0． 5ml 作为底物加入0． 0 5ml 磷酸缓冲液（pH6． 0）3． 5ml再 加入0． 5ml 的酶液充分摇匀后放入水温为2 8℃的水 浴锅中反应3 0min然后立即在波长4 0 0nm 处测定其 OD 值每个试验设3个重复以沸水灭活处理（1 5min） 的酶液作为对照。酶活力以每毫升样品与底物反应 3 0min 内改变0． 0 0 1个光密度值为一个活力单位（U）。 ④过氧化物酶活力的测定。取反应混合液4ml（0． 0 5ml pH6． 0磷酸盐缓冲液5 0ml加入0． 0 2 8ml H2O2、愈创木 酚0． 0 1 9ml） 与1ml 粗酶液混合 2 8℃水浴保温3 0min 后在4 7 0nm 处测定 OD 值。酶活力以每毫升样品与底 物反应3 0min 内改变0． 0 0 1个光密度值为一个活力单 定。用热水浸提法提取多糖用苯酚－硫酸 法 ［7］ 在 4 9 0nm 处测定其含量。 2 结果与分析 2． 1 不同碳氮源对双孢蘑菇菌丝生物量的影响 不同碳氮源对菌丝生物量的影响结果见图1和图 2。从图1、图2中可见双孢蘑菇在不同碳氮源液体 培养基中的菌丝生物量有明显差别。其影响因素主要 为：①不同碳源对菌丝生物量的影响。从图1可知双 孢菇菌丝体对不同碳源的利用能力是有差异的。以培 养第6d 时的菌丝干重比较来看以葡萄糖为碳源的液 体培养基最有利于菌丝生长菌丝体产量达到5 7 5mg／ 1 0 0ml 其次是可溶性淀粉5 5 5mg／ 1 0 0ml最差的是麦芽 糖菌丝生成量仅1 5 9． 5mg／ 1 0 0ml。添加葡萄糖的培养 基比其它3种碳源所产生的菌丝生物量高这可能是 因为葡萄糖能直接被菌体吸收利用而其它3种碳源 都是非还原性糖需要相应的水解酶催化才能被菌丝 体利用 ［8］ 。同时还表明培养基中添加不同的碳源影 响着菌丝的生物量。②不同氮源对菌丝生物量的影 响。不同氮源影响着菌丝生物量的产量。氮源是食用 菌合成蛋白质和核酸的必要元素。食用菌生长中可利 用的氮源有蛋白质、氨基酸、尿素和铵盐等其中氨基 酸和尿素能被菌丝体直接吸收而大分子的蛋白质需 分解成氨基酸后才能被吸收利用 ［9］ 。由图2可知双 孢蘑菇在以玉米粉为氮源的液体培养基中菌丝产量最 佳达到2 7 7． 6mg／ 1 0 0ml其次是以酵母粉、硝酸铵为氮 源的培养基。在以蛋白胨为氮源的液体培养基中菌丝 生成量最差菌丝产量只有1 5 6． 6mg／ 1 0 0ml。在玉米粉 中除含有丰富的有机氮源外还有多种维生素而且它 所含的淀粉增加了培养液的黏度这些可能是菌丝体 生物量较高的原因。酵母粉营养丰富含有大量的氨 基酸、多种维生素、矿物质及硒、锌、铁等微量元素能 1 1］ 较好地促进菌丝的生长 ［10 。从降低生产成本上考 虑以获得较大菌丝干重为研究目的在培养基中选择 酵母粉为碳源比较合适。 位（U）。⑤淀粉酶活力的测定。取4ml0． 5％可溶性淀 粉（用 pH5． 8、 0． 1ml 乙酸盐缓冲液配制）作为底物加 入1ml 经适当稀释的酶液 3 7℃水浴恒温3 0min取出 后从反应体系中吸取反应液0． 5ml再加 DNS 试剂1． 5 图1 不同碳源对菌丝生物量的影响 ml 在1 0 0℃水浴中煮沸1 0min冷却后加蒸馏水3ml 混匀在5 4 0nm 处测定 OD 值以煮沸灭活1 5min 的同 种酶液作为对照每组设3个重复求其平均值。酶活 力以每毫升样品与底物反应3 0min 后改变0． 0 0 1个光 密度值为一个活力单位（U）。⑥胞内多糖含量的测 图2 不同氮源对菌丝生物量的影响 ·101· ·实验与技术· 2． 2 不同碳氮源对双孢蘑菇胞外蛋白含量的影响 胞外蛋白质是菌丝体在生长过程中产生并分泌到 培养液中的各种水解酶如淀粉酶、纤维素酶、蛋白酶、 木质素降解酶等。因此在液体培养过程中胞外蛋白 资源开发与市场 Resource Development ＆ Market 2 0 0 92 5（2） 可看出双孢蘑菇在所选用的4种碳源的液体培养中 多酚氧化酶的活性并不高最高不超过2 6U／ml说明 该菌在液体培养中分泌的这种酶较少对木质素的降 解能力较弱。试验结果说明 3种胞外酶的分泌对碳 质含量的变化反应了菌丝生长过程中胞外酶的种类及 源的要求是不同的。②不同氮源培养对菌丝胞外酶活 数量的变化也说明了菌丝体在生长过程中对外界有 性的影响。不同氮源培养对菌丝胞外酶活性的影响结 机营养物质分解利用能力的变化。其影响主要有：① 果见图6。测定的3种酶活性最高值均出现在添加酵 不同碳源对胞外蛋白含量的影响。由图3可知双孢 母粉为氮源的培养基中其次是以蛋白胨为氮源的培 蘑菇胞外蛋白含量在不同碳源的培养基上存在明显的 养基。 差别。在添加葡萄糖的培养基上胞外蛋白质的含量最 高为3． 7 7mg／ml其次是添加可溶性淀粉的培养基。4 种碳源中麦芽糖最不利于胞外蛋白质的产生仅为 1． 8 5mg／ml。②不同氮源对胞外蛋白含量的影响。如 图4所示在供试的4种氮源中添加蛋白胨的培养基 最有利于产生胞外蛋白达到5． 6 5mg／ml；其次是加入 酵母粉的培养基产生胞外蛋白的量为3． 3 3mg／ml；加 入硝酸铵的是最差的胞外蛋白的量只有1． 2 1mg／ml。 图5 不同碳源对胞外酶活性的影响 总体来说有机氮源比无机氮源更有利于双孢蘑菇胞 外蛋白的产生。 图3 不同碳源对胞外蛋白含量的影响 图6 不同氮源对胞外酶活性的影响 2． 4 不同碳氮源对双孢蘑菇胞内多糖含量的影响 大量研究已表明双孢蘑菇多糖不但能抑制小鼠 S－1 8 0实体肿瘤的生长而且能干扰体外培养的人肝 癌 SMMC－7 7 2 1癌细胞增殖具有较好的抗肿瘤活性 图4 不同氮源对胞外蛋白含量的影响 2． 3 不同碳氮源对双孢蘑菇菌丝胞外酶活性的影响 双孢蘑菇属草腐生菌菌丝在生长发育过程中能 分泌各种胞外酶将死亡的有机体分解如将大分子的 多糖物质分解成小分子的营养物质吸收同化后供给 菌丝或从中获得能量满足自身的生长发育需要。多 酚氧化酶是一种重要的木质素降解酶其活性的高低 可表明分解利用木质素的能力 ［12］ 。淀粉酶是真菌在 生长过程中分解利用外界碳水化合物的主要酶类之 一活性的变化与胞外蛋白酶浓度有着极大的相关性。 其影响主要有：①不同碳源对菌丝胞外酶活性的影响。 不同碳源培养对胞外酶活性的影响结果见图5。过氧 化物酶在以可溶性淀粉为碳源的培养基中产生的活性 最高达到1 8 2U在葡萄糖为碳源的培养基中过氧花物 酶的活性最低。淀粉酶活性在以麦芽糖为碳源的培养 基中活性最高达到2 0 1U／ml；而在可溶性淀粉为碳源 的培养基中淀粉酶活性最低仅2 0U／ml。从图5还 ·102· 1 4］ 和抗肝炎、抗氧化、增强免疫力等功效 ［13 因此可以 说多糖是一种极具发展前途的成分。从图7和图8可 看出通过热水浸提的方法提取胞内多糖胞内多糖含 量的多少与培养基中不同的碳源、氮源有着很大的相 关性。其影响主要有：①不同碳源对胞内多糖含量的 影响。从图7可知不同的碳源影响着双孢菇胞内多 糖的含量。就胞内多糖含量而言在供试的4种碳源 中可溶性淀粉最佳达到4 0． 9 7 8mg／ 1 0 0ml；其次是蔗 糖生产多糖含量为3 2． 2 3 8mg／ 1 0 0ml；最差的是麦芽 糖 胞内多糖产生量仅为2 2． 4 0 8mg／ 1 0 0ml。②不同氮 源对胞内多糖含量的影响。如图8所示 4种氮源都 不同程度地影响着双孢蘑菇胞内多糖的含量。其中 玉米粉为氮源时最有利于胞内多糖的产生产量达到 2 2． 8 9mg／ 1 0 0ml；其 次 是 酵 母 粉 为 碳 源 时 的 含 量 为 8． 5 9 2mg／ 1 0 0ml；蛋白胨和硝酸铵为氮源时的含量差不 多。玉米粉是成分复杂的有机氮源含有大量的营养 物质能够促进菌丝体的生长。蛋白胨和酵母粉是有 ·实验与技术· 资源开发与市场 Resource Development ＆ Market 2 0 0 92 5（2） 机氮源硝酸铵是无机氮源表明有机氮源比无机氮源 更有利于双孢蘑菇胞内多糖的产生。 3 结果与讨论 从试验结果的分析中可见在以获得较高酶活性 为目的的研究中蔗糖和酵母粉是较好的碳氮源；以获 得较高胞外蛋白质含量而言葡萄糖和蛋白胨是最适 的碳氮源；而在生产中以获得较多菌丝干重和胞内多 图7 不同碳源对胞内多糖含量的影响 糖为目的的研究中可溶性淀粉和玉米粉是较好的碳 氮源。双孢蘑菇菌丝液体在培养时菌丝干重与胞外 分泌物如胞外酶之间没有必然的联系所以在发酵培 养期间仅凭酶的活性高低并不能判断菌丝生物量的多 少。了解双孢蘑菇的营养生理便于进一步在生产上 图8 不同氮源对胞内多糖含量的影响 2． 5 在不同碳氮源的培养过程中发酵液 pH 的变化 发酵液的酸碱度直接影响着菌体细胞的通透性和 菌丝的生长液体培养基的 pH 值对菌丝生长和发酵 产物影响很大。其变化主要为：①在不同碳源的培养 过程中 pH 的变化。由图9可见在4种碳源培养基中 的发酵液 pH 均呈下降趋势其中添加葡萄糖和可溶 性淀粉的发酵液 pH 值仅4． 0可能是因为这两种培养 基中淀粉酶活性比较高分解了较多的碳水化合物而 产生还原糖后转化为有机酸的缘故。②在不同氮源的 培养过程中 pH 的变化。从图1 0可知双孢蘑菇在不 同氮源培养基液体培养的过程中其发酵液 pH 变化 基本上略呈下降趋势。 选择优良的母种培养基及有效研究和开发利用双孢蘑 菇深层培养产生代谢产物资源提供科学依据。 参考文献： ［1］吕作舟．食用菌栽培学 ［M］．北京：高等教育出版社 2 0 0 6 ∶ 1 0 9－1 1 4． ［2］田晓华丛建波孙存普等．双孢菇清除·OH 自由基作用及对胸腺 嘧啶核苷酸辐射防护作用的 ESR 研究 ［J ］．营养学报 1 9 9 6 1 8（1）∶6 1 －6 3． ［3］韦保耀余小影黄丽等．双孢蘑菇多糖抗菌活性及对食品腐败抑 制的研究 ［J ］．食品科技 2 0 0 7（4）∶ 9 3－9 5． ［4］顾芳红殷红马劲．碳、氮源对猪苓菌丝生长与胞外多糖含量的影 响 ［J ］．西北大学学报（自然科学版） 2 0 0 1（5）∶ 4 3 7－4 4 0． ［5］孙红斌刘梅森陈海晏．液态发酵猴头菌多糖工艺优化研究（I）－－－ 碳、氮源对得率的影响 ［J ］．食品与发酵工业 2 0 0 1（9）∶ 3 0－3 3． ［6］北京大学生物系生物化学教研室．生物化学实验指导 ［ M ］．北京：高 等教育出版社 1 9 8 6 ∶ 7 1－7 2． ［7］杨梅王丽雅庄跃飞等．杏鲍菇多糖的提取及其分离的研究 ［J ］．中 国食用菌 2 0 0 5 4（2 4）∶ 3 8－3 9． ［8］Jonathan G Ayodele S Damilola A． Optimization of Submerged Culture Conditions for Biomass Production in Plrurotus Florida（Mont． ）Singer a Nigerian Edible Fungus ［J ］．African Journal of 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