Pemanfaatan Enzim Papain Dalam Produksi Hidrolisat Protein Dari Limbah Industri Minyak Kelapa
advertisement
PEMANFAATAN ENZIM PAPAIN DALAM PRODUKSI HIDROLISAT PROTEIN DARI LIMBAH INDUSTRI MINYAK KELAPA IDA ROSDIANTI PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ABSTRACT IDA ROSDIANTI. Papain Enzyme Utilization in the Production of Protein Hydrolysate from Industrial Coconut Oil Waste. Under supervision of MARIA BINTANG and TAMI IDIYANTI. Coconut press cake (galendo), a high protein substance, is a waste from the production of virgin coconut oil. The protein was able to hydrolyzed by proteolytic enzyme, such as papain. Hydrolitical condition was obtained by variation of substrate and enzyme concentration, pH, temperature, also hydrolysis time gradually. The measuring parameter was the highest elevation of soluble protein concentration, which was obtained by spectrophotometric method. The activity of papain was 1460,63 Unit/ml in 1%(w/v) Km and 3333,33 Unit/ml Vmax. Optimum condition of hydrolyzing galendo by papain can be achieved in 3,16%(w/v) substrate concentration, 0,2%(w/v) enzyme concentration, 7,0 pH, 70oC temperature and 3 hours of hydrolysis time. Protein hydrolysate resulted was 1,47%(w/v) and it was contained of 70,22%(w/v) total protein and 796,41 mg/ml soluble protein. There were 15 amino acid that could be identified according to high performance liquid chromatography analysis using ophtalaldehid. Major amino acid in hydrolysate were glutamic acid 12,47%(w/w) and arginine 7,22%(w/w), in contrast histidine was 1,51%(w/w). Galendo hydrolysate was rich of valine and isoleucine which give chemical value 104 and 92. This hydrolysate can be used as flavoring agents, as dietary supplement for athlete and bodybuilder, as dietary intake of digestive track defect patient, moreover it can be used to provide free amino acid substrate for food, chemical, and health industry. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ABSTRACT IDA ROSDIANTI. Papain Enzyme Utilization in the Production of Protein Hydrolysate from Industrial Coconut Oil Waste. Under supervision of MARIA BINTANG and TAMI IDIYANTI. Coconut press cake (galendo), a high protein substance, is a waste from the production of virgin coconut oil. The protein was able to hydrolyzed by proteolytic enzyme, such as papain. Hydrolitical condition was obtained by variation of substrate and enzyme concentration, pH, temperature, also hydrolysis time gradually. The measuring parameter was the highest elevation of soluble protein concentration, which was obtained by spectrophotometric method. The activity of papain was 1460,63 Unit/ml in 1%(w/v) Km and 3333,33 Unit/ml Vmax. Optimum condition of hydrolyzing galendo by papain can be achieved in 3,16%(w/v) substrate concentration, 0,2%(w/v) enzyme concentration, 7,0 pH, 70oC temperature and 3 hours of hydrolysis time. Protein hydrolysate resulted was 1,47%(w/v) and it was contained of 70,22%(w/v) total protein and 796,41 mg/ml soluble protein. There were 15 amino acid that could be identified according to high performance liquid chromatography analysis using ophtalaldehid. Major amino acid in hydrolysate were glutamic acid 12,47%(w/w) and arginine 7,22%(w/w), in contrast histidine was 1,51%(w/w). Galendo hydrolysate was rich of valine and isoleucine which give chemical value 104 and 92. This hydrolysate can be used as flavoring agents, as dietary supplement for athlete and bodybuilder, as dietary intake of digestive track defect patient, moreover it can be used to provide free amino acid substrate for food, chemical, and health industry. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com PEMANFAATAN ENZIM PAPAIN DALAM PRODUKSI HIDROLISAT PROTEIN DARI LIMBAH INDUSTRI MINYAK KELAPA IDA ROSDIANTI Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Program Studi Biokimia PROGRAM STUDI BIOKIMIA FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Judul Skripsi : Nama NIM : : Pemanfaatan Enzim Papain dalam Produksi Hidrolisat Protein dari Limbah Industri Minyak Kelapa Ida Rosdianti G44101049 Disetujui Komisi Pembimbing Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. Ketua Dra. Tami Idiyanti, M.Sc. Anggota Diketahui Dr. drh. Hasim, DEA Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Tanggal lulus : PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com ABSTRAK IDA ROSDIANTI. Pemanfaatan Enzim Papain dalam Produksi Hidrolisat Protein dari Limbah Industri Minyak Kelapa. Dibimbing oleh MARIA BINTANG dan TAMI IDIYANTI. Limbah industri minyak kelapa murni (Virgin Coconut Oil, VCO) berupa galendo memiliki kandungan protein tinggi. Protein tersebut dapat dihidrolisis oleh enzim proteolitik papain. Pemilihan kondisi hidrolisis ditentukan secara bertahap melalui variasi konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu inkubasi, dan waktu hidrolisis. Parameter penentu kondisi proses adalah kenaikan jumlah protein terlarut optimum yang ditentukan dengan metode spektrofotometri. Aktivitas papain yang digunakan sebesar 1460,63 Unit/ml dengan Km 1%(b/v) dan Vmaks 3333,33 Unit/ml. Kondisi optimum proses hidrolisis galendo oleh enzim papain pada konsentrasi substrat 3,16%(b/v), konsentrasi enzim 0,2%(b/v), pH 7,0, suhu inkubasi 70oC, dan waktu hidrolisis 3 jam. Rendemen hidrolisat protein yang dihasilkan sebanyak 1,47%(b/v) dengan kandungan protein total 70,22%(b/b) dan protein terlarut 796,41 mg/ml. Hidrolisat protein galendo mengandung 15 jenis asam yang dapat dideteksi dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi menggunakan reagen o-ftalaldehida. Komposisi asam amino tertinggi berupa asam glutamat sebesar 12,47%(b/b) dan arginin sebesar 7,22%(b/b), sedangkan asam amino yang paling sedikit adalah histidin yaitu sebesar 1,51%(b/b). Hidrolisat protein galendo kaya asam amino esensial valin dan isoleusin dengan nilai kimia berturut-turut sebesar 104 dan 92. Hidrolisat protein galendo dapat dimanfaatkan sebagai penyedap rasa, suplemen diet bagi atlet maupun orang-orang yang ingin membentuk otot tubuhnya, sebagai menu bagi penderita gangguan pencernaan, serta dapat dijadikan intermediet isolasi asam amino bebas untuk memenuhi kebutuhan industri, pangan dan kesehatan. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan ke hadhirat Allah SWT atas segala rahmat dan karunia-Nya sehingga karya ilmiah ini berhasil diselesaikan. Karya ilmiah dengan judul Pemanfaatan Enzim Papain dalam Produksi Hidrolisat Protein dari Limbah Industri Minyak Kelapa ini disusun berdasarkan hasil penelitian yang dilaksanakan pada bulan Agustus 2006 hingga bulan Februari 2007 di Laboratorium Mikrobiologi, Bidang Teknologi Lingkungan, Pusat Penelitian Kimia LIPI, Serpong. Karya ilmiah ini disusun sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Terima kasih penulis haturkan kepada Prof. Dr. drh. Maria Bintang, M.S. dan Dra. Tami Idiyanti, M.Sc. atas bimbingan dan pengarahan yang diberikan selama penelitian dan penulisan karya ilmiah ini. Selain itu, penghargaan penulis sampaikan kepada Mba Ai, Mba Irni, Putri, Vina, Desi, dan segenap staf Pusat Penelitian Kimia LIPI atas bantuan dan saran yang diberikan selama penelitian. Ungkapan terima kasih juga penulis sampaikan kepada keluarga tercinta, a’Azies, sahabatku Rosa, Fri, Jane, Dimas, serta teman-teman biokimia’38 atas segala doa, kasih sayang, bantuan, dan motivasi yang tiada hentinya. Akhir kata, semoga karya ilmiah ini bermanfaat. Bogor, Juni 2008 Ida Rosdianti PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com RIWAYAT HIDUP Penulis, barnama lengkap Ida Rosdianti, lahir di Tangerang pada tanggal 4 Agustus 1984 sebagai bungsu dari lima bersaudara dari pasangan Mutadih dan Salimah (Alm.). Tahun 2001 penulis lulus dari MA Negeri 4 Jakarta dan pada tahun yang sama penulis lulus seleksi masuk IPB melalui jalur Ujian Masuk Perguruan Tinggi Negeri (UMPTN) pada Departemen Biokimia, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam. Penulis pernah mengikuti Praktik Kerja Lapang di Laboratorium Mikrobiologi, Pusat Penelitian Kimia LIPI selama periode Juni sampai dengan Agustus 2004 dan menulis laporan ilmiah berjudul Produksi dan Karakterisasi Ekstrak Kasar Lakase dari Kapang Pelapuk Putih (Coriolus versicolor) dengan Media Pertumbuhan Coir Dust. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ........................................................................................... viii DAFTAR GAMBAR....................................................................................... ix DAFTAR LAMPIRAN ................................................................................... x PENDAHULUAN........................................................................................... 1 TINJAUAN PUSTAKA Potensi Kelapa Sebagai Sumber Protein............................................... Pemisahan Protein Kelapa.................................................................... Enzim Papain....................................................................................... Hidrolisat Protein................................................................................. 1 2 3 4 BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat .................................................................................... Metode Penelitian ................................................................................ 5 6 HASIL DAN PEMBAHASAN Aktivitas Proteolitik dan Kinetika Reaksi Enzim Papain ...................... Analisis Proksimat Galendo ................................................................. Optimasi Kondisi Hidrolisis Protein Galendo....................................... Produksi Hidrolisat Protein Galendo .................................................... Karakterisasi Hidrolisat Protein Galendo.............................................. 7 8 8 10 10 SIMPULAN DAN SARAN Simpulan ............................................................................................. Saran ................................................................................................... 13 13 DAFTAR PUSTAKA...................................................................................... 13 LAMPIRAN.................................................................................................... 16 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com DAFTAR TABEL Halaman 1 Komposisi daging buah dan krim santan kelapa (% bk) ............................. 2 2 Komposisi asam amino dalam protein daging buah kelapa......................... 2 3 Hasil analisis proksimat tepung galendo .................................................... 8 4 Hasil analisis proksimat serbuk hidrolisat protein galendo ......................... 11 5 Ringkasan komposisi galendo basah, tepung galendo, dan produk hidrolisat protein per 100 gram .................................................................. 11 6 Hasil analisis asam amino hidrolisat protein galendo dengan HPLC........... 12 7 Nilai kimia hidrolisat protein galendo terhadap kebutuhan asam amino esensial pola provisional WHO.................................................................. 13 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Hasil fermentasi krim santan oleh ragi tempe............................................. 2 2 Mekanisme katalisis hidrolisis gugus amida oleh enzim papain (Harrison et al. 1997) ................................................................................................ 3 Hubungan aktivitas papain dengan konsentrasi kasein, serta penetapan nilai Km dan Vmaks ..................................................................................... 8 Hubungan protein terlarut dengan konsentrasi substrat galendo, serta penentuan nilai Km dan Vmaks .................................................................... 9 5 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap protein terlarut hidrolisat galendo .... 9 6 Pengaruh pH terhadap protein terlarut hidrolisat galendo .......................... 10 7 Pengaruh suhu terhadap protein terlarut hidrolisat galendo......................... 10 8 Pengaruh waktu inkubasi terhadap protein terlarut hidrolisat galendo ........ 10 9 Serbuk hidrolisat protein galendo............................................................... 10 10 Kromatogram HPLC hidrolisat protein galendo ......................................... 12 3 4 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tahapan penelitian .................................................................................... 17 2 Produksi tepung galendo............................................................................ 18 3 Hidrolisis protein galendo, pemekatan hidrolisat, dan karakterisasi produk 19 4 Analisis aktivitas proteolitik enzim papain metode hidrolisis kasein (Bergmeyer & Grassi 1983) ....................................................................... 20 5 Penentuan kadar N-total (metode Kjeldahl, AOAC 1999) .......................... 21 6 Analisis konsentrasi protein terlarut (Lowry 1951) .................................... 22 7 Konsentrasi protein terlarut galendo basah, tepung galendo, dan hidrolisat protein ....................................................................................................... 23 8 Penentuan konsentrasi total gula pereduksi (Somogyi-Nelson 1952).......... 24 9 Konsentrasi gula pereduksi tepung galendo dan hidrolisat protein............. 25 10 Analisis kadar lemak (metode Soxhlet, AOAC 1999) ................................ 25 11 Analisis kimia tepung galendo ................................................................... 26 12 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai konsentrasi substrat .. 28 13 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai konsentrasi enzim..... 28 14 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai pH ............................ 28 15 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai suhu inkubasi ........... 28 16 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai waktu hidrolisis........... 29 17 Kromatogram HPLC standar asam amino .................................................. 29 18 Bahan baku yang digunakan dan produk yang dihasilkan dalam penelitian 30 19 Alat-alat yang digunakan dalam penelitian ................................................ 30 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com PENDAHULUAN Indonesia merupakan negara kedua penghasil kelapa terbesar di dunia. Departemen Pertanian melaporkan bahwa pada tahun 2006 total produksi kelapa nasional rata-rata 15,5 milyar butir/tahun atau 3,16 juta ton kelapa setara dengan 3,02 juta ton kopra. Penggunaan produk kelapa domestik sebagian besar untuk konsumsi segar atau dalam bentuk kopra dan minyak kelapa. Data yang dihimpun oleh Asia Pasific Coconut Community (2004) menunjukkkan bahwa konsumsi domestik dalam bentuk kelapa segar mencapai 52,6% dari total produksi kelapa nasional dan sisanya sebanyak 47,4% diolah menjadi kopra dengan proporsi 85-90% untuk pembuatan crude coconut oil (CCO) dan 10-15% untuk olahan lanjutan. Sedangkan produk lainnya seperti tempurung, air kelapa, ampas kelapa, sabut, dan hasil samping pengolahan minyak kelapa belum dimanfaatkan sepenuhnya dan dianggap sebagai limbah bernilai ekonomi rendah (Mahmud & Ferry 2005). Medio dasawarsa terakhir ini telah berkembang pula produksi minyak kelapa secara fermentasi yang disebut Virgin Coconut Oil (VCO). VCO dimanfaatkan secara luas sebagai obat dan makanan suplemen untuk meningkatkan daya imunitas tubuh terhadap berbagai penyakit degeneratif (Deptan 2005). Residu padatan berupa galendo yang diperoleh sebagai hasil samping produksi minyak kelapa secara enzimatis tanpa perlakuan suhu tinggi diperkirakan masih mengandung protein dengan mutu dan nilai gizi yang cukup tinggi serta komposisi asam amino yang cukup lengkap. Berbagai penelitian terdahulu menunjukkan bahwa komposisi protein kelapa cukup baik dan mengandung sembilan asam amino esensial. Berdasarkan pemikiran di atas maka penulis tertarik untuk meneliti mengenai pemanfaatan galendo sebagai sumber protein bernutrisi tinggi dalam bentuk hidrolisat protein. Hidrolisat protein didefinisikan sebagai protein yang mengalami degradasi hidrolitik dengan asam atau alkali kuat maupun enzim proteolitik. Hidrolisis yang dilakukan dalam penelitian ini menggunakan enzim proteolitik. Keuntungan lain dari hidrolisis enzimatis selain dapat bekerja pada kondisi normal atau tidak memerlukan suhu, tekanan dan pH yang tinggi, juga produk yang dihasilkan lebih spesifik dengan karakter yang diinginkan dan dekomposisi asam amino dapat dihindari (Sediaoetama 1996). Pemilihan enzim proteolitik untuk proses hidrolisis protein berdasarkan pada spesifikasi, pH optimal, kestabilan panas, pengaruh aktivator dan inhibitor, harga, dan ketersediaan enzim bersangkutan (Johnson & Peterson 1974). Berdasarkan faktor-faktor tersebut maka pada penelitian ini digunakan enzim papain untuk menghidrolisis protein galendo. Papain merupakan enzim proteolitik yang diisolasi dari buah pepaya (Carica papaya) yang banyak dihasilkan di negara-negara tropis seperti Indonesia. Papain memiliki sifat kestabilan yang relatif tinggi terhadap faktor suhu dan pH. Kestabilan enzim papain baik sekali pada larutan yang mempunyai pH 5,0. pH optimal untuk substrat albumin maupun kasein adalah 7,0 dan untuk substrat gelatin 5,0. Papain mempunyai daya tahan panas lebih tinggi dibanding enzim lain. Keaktifan enzim papain hanya menurun 20% pada pemanasan 70oC selama 30 menit pada pH 7,0 (Winarno 1986). Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum untuk hidrolisis protein galendo menggunakan enzim papain, mengetahui kuantitas produksi hidrolisat protein dari galendo, dan untuk menganalisis jenis-jenis asam amino serta mengukur konsentrasi asam amino dalam hidrolisat yang dihasilkan. Hipotesis dari penelitian ini adalah limbah industri minyak kelapa berupa galendo dapat diolah menjadi hidrolisat protein. Papain sebagai enzim proteolitik dapat digunakan untuk menghasilkan hidrolisat protein galendo. Konsentrasi hidrolisat protein dan asam amino yang dihasilkan diduga dipengaruhi oleh kondisi hidrolisis protein galendo dengan enzim papain. Hasil hidrolisis protein galendo ini diharapkan dapat dimanfaatkan sebagai menu bagi penderita gangguan pencernaan, bahan tambahan makanan, serta sebagai sediaan asam amino untuk memenuhi kebutuhan industri, pangan, dan kesehatan. TINJAUAN PUSTAKA Potensi Kelapa Sebagai Sumber Protein Tanaman kelapa (Cocos nucifera L.) diklasifikasikan ke dalam famili Palmae dan kelas Monocotyledonae. Tanaman perkebunan ini banyak terdapat di daerah beriklim tropis dan dikenal sebagai tanaman penghasil minyak nabati yang utama (Warisno 2003). Buah kelapa merupakan bagian yang paling tinggi nilai ekonominya dibandingkan dengan bagian lain dari tanaman kelapa. Rindengan et PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 2 al. (1995) mengemukakan bahwa dalam sebutir kelapa tua rata-rata terdiri dari 35% sabut, 12% tempurung, 28% daging buah, dan 25% air kelapa. Hasil pengolahan daging buah kelapa merupakan sumber potensial untuk mendapatkan protein yang bernilai gizi tinggi dan mudah dicerna. Kandungan protein daging buah kelapa muda, setengah tua, dan tua dalam 100 g daging buah berturut-turut sebesar 1,0 g, 4,0 g dan 3,4 g (Poedjiadi 2006). Komposisi daging buah dan krim santan kelapa dapat dilihat pada Tabel 1. Protein kelapa tidak memiliki senyawa antinutrisi seperti yang terdapat pada protein nabati lainnya (kacang-kacangan). Selain itu, daging buah kelapa juga mengandung asam amino esensial yang lengkap seperti tercantum dalam Tabel 2. Protein kelapa berupa galendo merupakan ampas atau residu produksi minyak kelapa melalui proses ekstraksi dari kopra maupun fermentasi santan. Galendo ini pada umumnya digunakan sebagai pakan ternak atau dijadikan bahan pengisi dari beberapa jenis makanan. Kandungan protein galendo sekitar 20% dari bahan kering (Purwadaria 2004). Sistem pengolahan daging buah kelapa yang baik akan mengurangi tingkat kehilangan protein yang terkandung di dalamnya. Pada pembuatan minyak klentik, galendo sebagai hasil samping pada kadar air 13,8% memiliki kadar protein 22,2% dan pada kadar air 7%, kadar proteinnya menjadi 43,8% dari daging buah kelapa. Hasil galendo adalah 5,5% dari daging buah kelapa, sehingga kadar protein galendo adalah 2,4% dari bahan asal (Soemaatmadja et al. 1984). Rindengan (1988) melaporkan bahwa hidrolisis santan menggunakan NaOH 10% pada suhu 60oC selama 30 menit dan dilanjutkan dengan penambahan HCl pada skim kelapa menghasilkan konsentrat dengan kadar protein 31,49%, sedangkan hasil hidrolisis tepung kelapa oleh enzim bromelin 1% pada suhu 50oC selama 5 jam memiliki kadar protein 46,63%. Tabel 2 Komposisi asam amino protein daging buah kelapa Asam amino Konsentrasi (%) Esensial : Isoleusin Treonin Lisin Metionin Fenilalanin Triptofan Valin Leusin Histidin 2,50 2,30 5,80 1,43 2,05 1,25 3,57 5,96 2,42 Nonesensial : Arginin Tirosin Sistin Prolin Serin Asam aspartat Asam glutamat 15,92 3,18 1,44 5,54 1,76 5,12 19,07 Sumber : Ketaren 1986 Pemisahan Protein Kelapa Protein kelapa yang digunakan pada penelitian ini berupa galendo sebagai limbah dari industri VCO yang dikelola Pusat Penelitian Kimia LIPI bersama mitra kerja. Teknik yang digunakan pada kegiatan ini adalah proses fermentasi krim santan menggunakan ragi tempe pada suhu 30oC selama 24 jam. Proses fermentasi dinyatakan berjalan baik jika dari campuran tersebut terbentuk tiga lapisan, yakni lapisan atas berupa galendo berwarna putih, lapisan tengah yang jernih berupa VCO, dan lapisan bawah berupa air seperti yang terlihat pada Gambar 1. Minyak dipisahkan secara dekantasi untuk kemudian di inkubasi selama 5 menit pada suhu lebih dari 60oC untuk mengendapkan partikel protein yang tersisa. Penyaringan minyak dilakukan sehingga minyak yang diperoleh berwarna putih, bening dan beraroma khas kelapa. Tabel 1 Komposisi daging buah dan krim santan kelapa (% bk) Komponen Daging buah Krim santan Protein 4,0 4,4 Lemak 40,0 32,3 Karbohidrat 3,5 4,7 Air 45,0 54,0 Abu 0,2 3,3 Serat kasar 7,3 1,7 bk = bobot kering Sumber : FAO 2004 dalam Galendo VCO Air Gambar 1 Hasil fermentasi krim santan oleh ragi tempe PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 3 Galendo dipisahkan dari lapisan minyak dan air. Sebagian besar kandungan minyak dipisahkan melalui pengepresan dan ekstraksi. Pelarut yang dapat digunakan dalam proses ekstraksi minyak antara lain hidrokarbon, dietil eter, karbon disulfida, alkohol, triklor etilen serta heksana yang telah dipergunakan secara luas (Anang 1991). Galendo yang telah bebas minyak tersebut dikeringkan dan digiling sehingga diperoleh tepung galendo yang akan dijadikan bahan baku utama pembuatan hidrolisat protein. Rindengan (1988) mengemukakan bahwa efisiensi ekstraksi protein kelapa selain dipengaruhi oleh kelarutan protein, juga dipengaruhi oleh perbandingan antara bahan baku dan pelarut, suhu, dan lamanya ekstraksi serta penambahan garam. Hasil percobaan yang telah dilakukannya menunjukkan bahwa kelarutan protein yang minimum terjadi pada pH 3,9 dan 90% protein dan total padatan akan larut pada pH 7,0. Berdasarkan kelarutannya, Rindengan (1988) telah menentukan bahwa protein daging buah kelapa tersusun dari globulin, albumin, glutelin, prolamin, dan N nonprotein. Globulin adalah protein yang larut dalam asam kuat, alkali, atau larutan garam encer, sedangkan albumin larut dalam air. Kelarutan protein dipengaruhi oleh ukuran molekulnya dan hal ini akan mempengaruhi proses hidrolisis. Dengan teknik kromatografi, Hagenmaier (1980) telah menentukan bahwa 84% fraksi protein kelapa mempunyai bobot molekul 150 kDa dan sekitar 14% mempunyai bobot molekul 24 kDa. Gugus sulfihidril ini berperan dalam reaksi hidrolisis substrat menyangkut pembentukan ikatan kovalen tiol ester antara gugus karboksil dan sulfihidril protein papain. Papain dapat menghidrolisis amida pada residu asam amino arginin, lisin, glutamin, histidin, glisin, dan tirosin (Leung 1996). Aktivitas enzim papain ditandai dengan proses pemecahan substrat menjadi produk oleh gugus histidin dan sistein pada sisi aktif enzim. Beveridge (1996) memaparkan bahwa selama proses katalisis hidrolisis gugus-gugus amida, mula-mula gugus sistein (Cys-25) yang bersifat sangat reaktif berikatan dengan substrat pada sisi aktif papain sehingga dihasilkan ikatan kovalen substrat dengan enzim yang berbentuk tetrahedral. Kemudian gugus histidin (His-159) terprotonasi sehingga berikatan dengan nitrogen yang terdapat di dalam substrat. Akibatnya gugus amin pada substrat terdifusi dan kedudukannya digantikan oleh molekul-molekul air yang pada akhirnya menghidrolisis hasil intermediet sehingga mengembalikan enzim ke dalam bentuk dan fungsinya seperti semula (Gambar 2). Aktivitas katalitik enzim papain juga dipengaruhi oleh karakteristik getah pepaya yang digunakan untuk isolasi enzim papain serta proses pengeringan getah. Menurut IDEA (2000), isolasi getah pepaya perlu dilakukan pada pagi hari agar tidak terjadi proses oksidasi pada getah. Pengeringan dalam waktu singkat pada suhu dibawah 50oC menghasilkan produk yang lebih bersih dan lebih aktif. Enzim Papain Papain (EC 3.4.22.2) merupakan salah satu enzim hidrolase yang bersifat proteolitik hasil isolasi dari penyadapan getah buah pepaya (Carica papaya, L). Selain mengandung papain sebanyak 10%, getah buah pepaya juga tersusun atas enzim kemopapain dan lisozim sebesar 20% dan 45% (Winarno 1986). Papain tersusun atas 212 residu asam amino yang membentuk sebuah polipeptida rantai tunggal dengan bobot molekul sebesar 23.000 Dalton (Harrison et al. 1997). Menurut Muchtadi (1992), aktivitas papain dipengaruhi oleh konsentrasi, pH, suhu, waktu inkubasi, kekuatan ion, dan tekanan. Selain itu, Belitz dan Grosch (1999) menyatakan bahwa papain termasuk ke dalam golongan protease sulfihidril yang aktivitasnya sangat dipengaruhi oleh adanya satu atau lebih gugus S-H pada sisi aktifnya. Gambar 2 Mekanisme katalisis hidrolisis gugus amida oleh enzim papain (Harrison et al. 1997) PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 4 Pengeringan getah pepaya menggunakan spray dryer mampu menghasilkan papain kasar dengan aktivitas proteolitik yang lebih baik daripada pengeringan menggunakan pengering kabinet atau sinar matahari. Teknik pengendapan dengan alkohol dapat menghasilkan perolehan papain dengan aktivitas lebih tinggi dan menurunkan kadar impuritis logam pada produk akhir. Aktivitas enzim papain cukup spesifik karena papain hanya dapat mengkatalisis proses hidrolisis dengan baik pada kondisi pH serta suhu dalam kisaran tertentu. Kemampuan papain pada sebagian besar substrat protein lebih ekstensif daripada protease pankreas seperti tripsin dan pepsin (Leung 1996). Daya proteolitik papain sangat aktif pada suasana reduktif, karena itu adanya penambahan bahan-bahan pereduksi akan dapat meningkatkan aktivitas papain. Aktivitas papain dapat diukur dengan beberapa metode antara lain metode penggumpalan susu dengan satuan Milk Clotting Units (MCU/mg), dan metode hidrolisis kasein dengan satuan Casein Digestion Unit (CDU/mg) atau Tyrosine Unit (TU/mg) (Muhidin 1999; EDC 2001) Papain mempunyai sifat kestabilan yang relatif tinggi terhadap faktor suhu dan pH. Aktivitas enzim ini berada pada daerah pH yang luas dan tergantung pada substrat (4,510,0). Papain biasanya aktif pada pH antara 5,0 hingga 7,0 dengan titik isoelektrik 8,75 dan suhu optimum 60-750C. Winarno (1986) menyatakan bahwa kestabilan enzim papain baik sekali pada larutan yang mempunyai pH 5,0, pH optimal untuk substrat albumin maupun kasein adalah 7,0 dan untuk substrat gelatin 5,0. Keaktifan enzim papain hanya menurun 20% pada pemanasan 700C selama 30 menit dan 50% pada pemanasan suhu 76 sampai 850C selama 56 menit pada pH 7,0. Papain dalam bentuk bubuk tahan terhadap panas kering 100oC selama 3 jam (Leung 1996). Enzim papain sangat sensitif terhadap zat pengoksidasi seperti H2O2, iodoasetat, gugus alkil, ion logam (Cu2+, Au2+, Ag2+, Zn2+, Hg3+) atau zat pengemulsi yang akan mengikat gugus tiol. Papain dapat diaktifkan oleh zat pereduksi seperti sistein dan glutation, serta zat pengkelat EDTA. Aktivitas papain masih dapat dipertahankan apabila enzim tersebut distabilkan dalam bentuk kristal melalui penambahan antioksidan Na-Bisulfit 0,7%, 2,3-dimerkaptopropanol, sistein, dan EDTA dengan kondisi penyimpanan pada suhu 5oC selama enam hingga 12 bulan (EDC 1999). Papain murni berbentuk kristal kasar, amorf, berwarna putih sampai coklat muda dan bersifat agak higroskopis. Papain murni mudah larut dalam air, gliserin, dan larutan alkoholik berair yang berkonsentrasi rendah. Enzim ini tidak larut dalam alkohol, kloroform dan eter. Secara umum, papain mudah larut dalam larutan bebas garam. (Suhartono 1992). Papain dimanfaatkan secara luas pada berbagai bidang. Industri pangan menggunakan papain dalam proses pengempukan daging, konsentrat protein, dan hidrolisat protein. Papain juga berfungsi untuk menggumpalkan susu pada pembuatan keju, penghidrolisis protein pada pembuatan bahan obat seperti untuk gangguan pencernaan protein, dispesia gastritis, obat cacing, sebagai bahan aktif dalam pembuatan krim pembersih kulit dan pasta gigi, serta membuang sisa serat dari kain pada industri detergen (Muhidin 1999). Di bidang kesehatan, papain dimanfaatkan untuk mencegah deformasi luka pada kornea mata dan pembersih lensa mata (Leipner & Saller 2000). Hidrolisat Protein Protein berfungsi sebagai komponen struktural, fungsional, dan reproduksi makhluk hidup. Protein sebagai nutrisi berperan penting dalam menyediakan asam amino sebagai unit pembangun bagi biosintesis protein kembali. Protein yang terbentuk dibutuhkan untuk pertumbuhan bayi dan anak-anak serta untuk mengganti protein tubuh yang terjadi secara tetap pada orang dewasa. Asam amino juga merupakan prekursor hormon, enzim, dan berbagai biomolekul lainnya. Oksidasi kerangka karbon pada asam amino juga melengkapi sebagian kecil kebutuhan total energi harian (Lehninger et al. 2004). Hidrolisat protein merupakan suatu campuran asam amino yang diperoleh melalui degradasi hidrolitik protein dengan asam, basa, atau enzim proteolitik. Hidrolisis secara parsial mampu memecah molekul protein menjadi beberapa gugus asam amino maupun melalui pemutusan ikatan rantai peptida (Rehm & Reed 1995). Hidrolisat umumnya mengandung peptida dengan bobot molekul rendah terdiri atas 2 hingga 4 residu amino. Bila hidrolisis dilakukan dengan sempurna maka akan diperoleh hidrolisat yang terdiri dari campuran 18 sampai 20 macam asam amino. Hidrolisis asam menggunakan asam keras anorganik seperti HCl atau H2SO4 pekat dan PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 5 dipanaskan pada suhu mendidih dengan tekanan diatas 1 atm. Proses berlangsung beberapa jam. Hidrolisis alkali, menggunakan alkalis keras seperti NaOH dan KOH pada suhu tinggi, dilakukan beberapa jam dan dengan tekanan diatas 1 atm. Penambahan asam maupun basa pada proses hidrolisis dapat merusak beberapa gugus asam amino serta menghasilkan senyawa karsinogenik. Davidex et al. (1990) melaporkan bahwa hidrolisis secara kimia menyebabkan destruksi triptofan serta pelepasan amonia pada pemecahan gugus amida asparagin dan glutamin menjadi asam aspartat dan asam glutamat. Selain itu gugus amino hidroksin (serin dan treonin) mengalami kerusakan sekitar 5-10%, sedangkan sistein, asam aspartat, asam glutamat, lisin, arginin, tirosin dan prolin terdegradasi sebagian. Williams (1998) mengemukakan bahwa hidrolisis protein dengan konsentrasi HCl yang tinggi disertai suhu tinggi dapat menyebabkan terjadinya rasemasi asam amino dari L-asam amino menjadi D-asam amino yang tidak dibutuhkan oleh tubuh, bahkan terkadang menjadi racun. Selain itu, produk yang dihasilkan menjadi sangat asam. Penggunaan alkali untuk menetralkan sampai pH 7 menyebabkan hidrolisat protein mengandung sejumlah garam yang akan menurunkan kualitas dan nilai biologis protein (Bucci & Unlu 2000). Proses hidrolisis secara enzimatis dipandang lebih efisien dan banyak digunakan dalam industri. Selain itu, proses pengolahannya lebih cepat dan menghasilkan hidrolisat protein tanpa kehilangan banyak asam amino esensial. Pemilihan enzim proteolitik untuk proses hidrolisis protein berdasarkan pada spesifikasi, pH optimal, kestabilan panas, pengaruh aktivator dan inhibitor, harga, dan ketersediaan enzim bersangkutan (Johnson & Peterson 1974). Dasar proses hidrolisis enzimatis adalah pemutusan ikatan peptida oleh enzim dengan bantuan air. Hidrolisis ikatan peptida dapat meningkatkan jumlah gugus terionisasi dan sisi hidrofilik karena membukanya molekul protein, umumnya meningkatkan kelarutan dan menurunkan viskositas dan diamati dengan meningkatnya derajat hidrolisis (Zayas 1997). Giese (1994) menyebutkan protease mengkatalisis pemutusan ikatan peptida yang akan menghasilkan unit peptida dan molekul lebih kecil yang akan mudah larut. Hidrolisis secara luas oleh protease non-spesifik seperti papain menyebabkan kelarutan yang lebih tinggi pada protein yang sukar larut. Protein dengan nilai kelarutan tinggi mengindikasikan protein yang serbaguna dan potensial dalam sistem pangan. Keuntungan penggunaan hidrolisat protein dalam berbagai bidang antara lain memperbaiki kelarutan, stabilitas panas, dan secara relatif memperbesar resistensi terhadap presipitasi oleh beberapa kondisi, seperti pH. Hidrolisat protein ini pada umumnya digunakan secara intravena untuk memelihara kesetimbangan nitrogen pada penderita sakit keras, diet khusus pasca-pembedahan saluran pencernaan, menu bagi penderita gangguan pencernaan atau sebagai suplemen protein tinggi (Schimidi et al. 1994; Astuti 2003). Hidrolisat protein secara luas digunakan untuk memperbaiki karakteristik berbagai produk pangan, sebagai penyedap rasa, formulasi bahan makanan tambahan balita, pembuatan produk dermatologis seperti krim pembersih muka dan pelembab kulit, serta sebagai lanjutan untuk isolasi asam amino (Kirk & Othmer 1953; Pigot & Tucker 1990; Pedersen 1994). BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Pada penelitian ini digunakan galendo dari industri VCO yang dikelola Puslit Kimia LIPI bersama mitra kerja. Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini antara lain enzim papain produk Puslit Kimia LIPI, heksana, kasein, tirosin, larutan Bovine Serum Albumin (BSA), larutan TCA, pereaksi Folin Ciocalteau, campuran selenium, indikator bromcresol green, merah metil, pereaksi arsenomolibdat, pereaksi o-ftalaldehida (OPA), larutan standar asam amino, NaEDTA, Na-asetat, tetrahidrofuran (THF), metanol, NaH2PO4, Na2HPO4.7H2O, NaOH, H2SO4 pekat, H3BO3, HCl, Na2CO3.10H2O, CuSO4.5H2O, Na-K-tartrat, NaHCO3, Na2SO4, kertas parafilm, alumunium foil, kertas saring Wathman No.40, dan akuades. Umumnya bahan kimia yang digunakan berkualitas proanalisa. Alat-alat yang digunakan dalam penilitian ini antara lain autopipet Finnpipette 1.0-5.0 ml dan 40-200 µl, autopipet Eppendorf 100-1000 µl, tabung reaksi kecil, pengaduk magnetik, vortex, kuvet, tabung Kjeldahl, pemanas Kjeldahl, perangkat destilasi, buret 25 ml, tabung sentrifuse, sentrifuse kokusan H-103 N, sentrifuse berpendingin Beckman J221M/E, neraca analitik Scaltec (ketelitian 0,1 mg), pH meter, oven kabinet, tanur, PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 6 stopwatch, recipro shaker, vacum buchner, rotary evaporator, penangas air HAAKE Fisons DC 3 dan Thermomix B-Braun, pengaduk Biodrive B-Braun, spektrofotometer UV/Vis Hitachi U-2000, spray dryer, perangkat HPLC, dan alat-alat gelas yang umum digunakan di laboratorium. Metode Penelitian Penelitian dilakukan dalam beberapa tahapan kerja secara berurutan yaitu tahap produksi bahan baku tepung galendo, tahap analisis pendahuluan, tahap optimasi kondisi hidrolisis, tahap produksi hidrolisat protein pada kondisi optimum, tahap pemekatan hidrolisat protein, serta tahap karakterisasi hidrolisat protein. Produksi Tepung Galendo Bahan baku yang digunakan pada penelitian ini merupakan limbah industri VCO berupa galendo. Galendo dipisahkan dari lapisan minyak dan air melalui pengepresan, kemudian diekstraksi dengan pelarut organik untuk menghilangkan sisa minyak. Ekstraksi galendo menggunakan heksana (1:5 b/v) dilakukan bertahap sebanyak dua kali selama 2 jam pada suhu ruang (28oC) dengan agitasi 200 rpm. Galendo yang telah bebas minyak dievaporasi dan dikeringkan dalam oven pada suhu 50oC selama 24 jam, lalu digiling dan ukurannya diseragamkan lolos 50 mesh (Modifikasi metode Rindengan 1988). Untuk analisis, tepung galendo dilarutkan dengan akuades. Analisis Pendahuluan Penelitian pendahuluan dilakukan dengan mengukur aktivitas proteolitik dan kinetika reaksi enzim papain yang akan digunakan dengan metode hidrolisis kasein (Bergmeyer & Grassi 1983) serta analisis proksimat tepung galendo. Parameter analisis proksimat meliputi sifat fisik, pH larutan, kadar protein total dengan metode Kjeldhal (AOAC 1999), konsentrasi protein terlarut (Lowry 1951), konsentrasi gula pereduksi (Somogyi-Nelson 1952), kadar lemak dengan metode Soxhlet, kadar air dan abu dengan metode gravimetri (AOAC 1999), serta kelarutan dalam air (Pedroza-Islas 2000). Optimasi Hidrolisis Protein Galendo Pemilihan kondisi hidrolisis optimum dilakukan bertahap dengan menggunakan lima variabel, yaitu konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu inkubasi, dan waktu hidrolisis. Pada penentuan konsentrasi substrat optimum, tepung galendo dilarutkan dalam akuades dengan konsentrasi 1-10%(b/v). pH larutan diatur sampai 7,0 dengan menambahkan NaOH 0,1 N. Disiapkan tabung blanko dan tabung sampel masing-masing berisi 1800 μl larutan substrat, duplo untuk setiap konsentrasi. Larutan stok enzim konsentrasi 10%(b/v) dipersiapkan segar dalam larutan dapar fosfat 0,2 M pH 7,0. Larutan substrat diinkubasi pada suhu 60oC selama 5 menit. Kemudian ke dalam tabung sampel ditambahkan 200 μl larutan enzim, sedangkan ke dalam tabung kontrol ditambahkan 200 μl larutan dapar fosfat 0,2 M pH 7,0. Hidrolisis dilakukan selama 1 jam. Aktivitas enzim dihentikan dengan penambahan TCA 0,1 M. Ke dalam tabung kontrol ditambahkan 200 μl larutan enzim (Fachraniah 2002). Semua larutan didinginkan dan disentrifugasi dengan kecepatan 3000 rpm, 4oC selama 15 menit untuk memisahkan enzim papain dengan hidrolisat protein. Konsentrasi hidrolisat protein bagian supernatan dianalisis dengan metode Lowry (1951). Parameter yang digunakan adalah kenaikan jumlah protein terlarut optimum. Konsentrasi substrat pada setengah kecepatan reaksi maksimum Km digunakan sebagai dasar penentuan kondisi reaksi optimum selanjutnya. Penentuan konsentrasi optimum enzim papain dilakukan dengan menginkubasikan campuran 1800 μl larutan substrat konsentrasi optimum dan 200 μl larutan enzim konsentrasi 0,01;0,05;0,1;0,2;0,4;0,6; dan 0,8%(b/v) dari volume substrat dalam dapar fosfat 0,2 M pH 7,0 pada suhu 60oC selama 1 jam. Perlakuan selanjutnya sama dengan pada penentuan konsentrasi substrat optimum. Begitu pula dengan variabel pH larutan substrat dan enzim dengan taraf 5,0;5,5;6,0;6,5;7,0;7,5; 8,0, variabel suhu inkubasi dengan taraf 55;60;65;70;750C, dan variabel waktu hidrolisis dengan taraf 15;30;45 menit dan 1;2;3;4;5 jam. Kondisi optimum ditunjukkan oleh kondisi yang memiliki konsentrasi protein terlarut tertinggi dan perubahan konsentrasi terbesar. Produksi Hidrolisat Protein Galendo Hidrolisis protein galendo oleh enzim papain dilakukan dengan cara menginkubasi substrat, larutan dapar fosfat dan suspensi enzim dalam penangas air disertai pengadukan secara kontinyu pada pH optimum dan suhu inkubasi maksimum, selama waktu hidrolisis tetentu, serta pada konsentrasi substrat dan PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 7 konsentrasi enzim yang memberikan hasil hidrolisis maksimum. Aktivitas enzim dihentikan dengan menginkubasi hasil hidrolisis pada suhu 40C selama 24 jam (Sabariyyah 2005). Pemekatan Hidrolisat Protein Galendo Hidrolisat yang dihasilkan pada tahap produksi disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm pada suhu 40C selama 15 menit untuk mengendapkan enzim dan komponen non-protein (Sabariyyah 2005). Filtrat yang terbentuk dipisahkan dari endapan melalui penyaringan. Filtrat hidrolisat berupa campuran peptida dan asam amino dikeringkan menggunakan spray-dryer untuk memekatkan hasil hidrolisis. Sistem pengeringan menggunakan suhu udara masuk 150oC dan suhu udara keluar 80oC pada tekanan 4,5 bar, dengan interaksi panas terhadap bahan selama 2 sampai 5 detik hingga menjadi serbuk. Karakterisasi Hidrolisat Protein Galendo Serbuk hidrolisat protein yang terbentuk dianalisis lebih lanjut meliputi pH dalam bentuk larutan, protein total, protein terlarut, kadar gula, air, abu, serta kelarutannya dalam air. Selanjutnya hidrolisat protein galendo dikarakterisasi jenis asam amino dan konsentrasinya masing-masing dengan metode HPLC (AOAC 1999). Analisis asam amino dilakukan di Laboratorium Terpadu IPB, Bogor. Pada tahap HPLC diperlukan precollum derivatization untuk analisis asam amino dengan mereaksikan sampel dengan reagen o-ftalaldehida (OPA), kemudian dipisahkan dengan kolom C18 dan dideteksi dengan detektor fluoresen. Eluen yang digunakan antara lain larutan A, terdiri atas Na-asetat 0,025M pH 6,5, Na-EDTA 0,05%, metanol 9%, dan THF 1%, dan larutan B terdiri atas metanol 95% dan akuades. Sampel dielusi menggunakan sistem gradien dengan laju alir 1 ml/menit. Konsentrasi asam amino dalam sampel dihitung dengan mengkonversi luas area sampel dari hasil pemisahan terhadap luas area standar asam amino yang telah diketahui konsentrasinya. Luas area standar asam amino dapat dilihat pada Lampiran 17. HASIL DAN PEMBAHASAN Kebutuhan asam amino untuk metabolisme tubuh dapat dipenuhi melalui asupan makanan berprotein, konsumsi suplemen protein tinggi, asam amino bebas, dan hidrolisat protein. Hidrolisat protein dapat diperoleh melalui hidrolisis limbah industri VCO berupa galendo oleh enzim proteolitik. Enzim yang digunakan dalam penelitian ini adalah refined papain berbentuk bubuk berwarna putih kekuningan yang diisolasi dari getah buah pepaya dan diproses lebih lanjut melalui pengeringan semprot. Sebelum hidrolisis, terlebih dahulu dilakukan analisis pendahuluan untuk mengukur aktivitas proteolitik dan kinetika reaksi enzim papain serta analisis proksimat tepung galendo yang akan digunakan. Aktivitas Proteolitik dan Kinetika Reaksi Enzim Papain Aktivitas proteolitik enzim papain ditentukan dengan menggunakan substrat kasein 1%(b/v) pH 6,5 yang diinkubasi pada suhu 40oC selama 5 menit. Nilai aktivitas relatif papain yang diperoleh sebesar 1460,63 Unit/ml, yang berarti terdapat 1460,63 µmol tirosin yang terbentuk per menit untuk setiap 1 ml enzim papain pada kondisi assay. Penentuan kinetika reaksi penting dilakukan untuk mengetahui kecepatan reaksi enzim dalam menguraikan substrat. Kinetika reaksi ditentukan dengan dua parameter utama yaitu nilai Km dan kecepatan maksimum (Vmaks). Km merupakan salah satu ciri tetap suatu enzim untuk keadaan reaksi pada suhu dan pH tertentu., sedangkan Vmaks bersifat tidak tetap dan dapat ditingkatkan dengan meningkatkan konsentrasi enzim dan mengubah faktor lingkungan (Suhartono 1992). Korelasi aktivitas proteolitik enzim papain terhadap konsentrasi substrat kasein menurut Michaelis-Menten diperlihatkan pada Gambar 3. Nilai Km dan Vmaks enzim papain ditentukan dengan metode Lineweaver-Burk. Melalui ekstrapolasi persamaan regresi linear, diperoleh nilai Km enzim papain sebesar 1%(b/v) dan Vmaks 3333,33 Unit/ml. Nilai Km menunjukkan konsentrasi substrat pada saat enzim mencapai setengah dari kecepatan reaksi maksimum (Vmaks) yang ditandai dengan terbentuknya kompleks ES yang stabil dan aktivitasnya yang tinggi. Pada saat Vmaks seluruh enzim akan terikat dengan substrat dan enzim tersebut sudah jenuh terhadap substrat (Lehninger et al. 2004). PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 8 Aktivitas proteolitik (Unit/m l) 2500 2000 1500 1000 500 0 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 k ons e ntrasi kase in (%) 0.0018 y = 0.0003x + 0.0003 R2 = 0.9592 0.0015 1/V 0.0012 Tabel 3 Hasil analisis proksimat tepung galendo Parameter Satuan Hasil Coklat muda Warna serbuk 3,8 – 4,1 pH larutan 59,48 %(b/b) Protein total 327,29 mg/ml Protein terlarut 149,99 Gula pereduksi mg/ml 11,74 %(b/b) Lemak 8,53 %(b/b) Air 2,14 %(b/b) Abu 50,39 %(b/b) Kelarutan 0.0009 0.0006 0.0003 0.0000 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 1/[S] Gambar 3 Hubungan aktivitas papain dengan konsentrasi kasein, serta penetapan nilai Km dan Vmaks Analisis Proksimat Galendo Bahan asal yang digunakan dalam penelitian ini berupa galendo berbentuk bubur hasil pemisahan dari fraksi lemak dan air pada produksi VCO. Ekstraksi galendo menggunakan pelarut organik dan pengeringan pada suhu 50oC selama 24 jam bertujuan untuk mengurangi kandungan lemak dan air tanpa merusak komponen protein dan asam amino yang terkandung di dalamnya, sehingga dihasilkan bahan baku yang layak untuk dihidrolisis. Kandungan lemak terekstrak dari galendo basah adalah sebesar 27,19%(b/b). Kandungan air dalam galendo basah dinyatakan sebagai kehilangan bobot selama proses pengeringan, yaitu sebesar 57,49%(b/b). Galendo basah mengandung protein terlarut sebesar 240,22 mg/ml. Produksi bahan baku menghasilkan tepung galendo berbentuk padatan kering berwarna coklat muda dengan butiran lolos 50 mesh. Ekstraksi 2026,11 gram galendo basah menghasilkan rendemen sebanyak 14,49%(b/b) setara 295,74 gram tepung galendo. Hasil analisis proksimat tepung galendo disajikan pada Tabel 3. Jika dibandingkan dengan galendo basah, maka tepung galendo mengandung protein telarut 1,4 kali lebih tinggi, yaitu sebesar 327,29 mg/ml. Selain itu, tepung galendo yang dihasilkan memiliki kadar air kurang dari 10%, sehingga memperkecil kemungkinan terkontaminasi jamur, meningkatkan stabilitas selama penyimpanan, dan memperpanjang masa simpan. Optimasi Kondisi Hidrolisis Protein Galendo Spesifisitas aktivitas enzim papain membutuhkan pemilihan kondisi hidrolisis yang tepat dan akan menentukan kekhasan hidrolisat protein yang dihasilkan. Optimasi hidrolisis protein galendo dilakukan secara bertahap melalui variasi konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, pH, suhu inkubasi, dan waktu hidrolisis didasari oleh faktor-faktor yang mempengaruhi aktivitas enzim. Konsentrasi hidrolisat protein dianalisis dengan metode Lowry (1951). Protein yang dihidrolisis oleh enzim akan menghasilkan produk yang larut dalam TCA, sedangkan protein yang tidak dapat dihidrolisis akan mengendap. Produk terhidrolisis yang larut dalam TCA adalah tirosin dan triptofan yang akan menghasilkan warna biru dengan pereaksi Folin Ciocalteau, yang menunjukkan adanya hidrolisis dari enzim yang dianalisis (Kirk & Othmer 1953). Parameter untuk menentukan aktivitas hidrolisis optimum adalah kenaikan jumlah protein terlarut maksimum. Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai variabel optimasi terdapat di Gambar 4-8 dan Lampiran 12-16. Kebutuhan banyaknya substrat galendo bagi enzim papain ditentukan dengan menggunakan jumlah bahan yang bervariasi antara 1%(b/v) hingga 10%(b/v) dengan konsentrasi enzim dibuat tetap. Hidrolisis dilakukan pada suhu 60oC selama 1 jam. Gambar 4 memperlihatkan pengaruh konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim dalam menghidrolisis protein yang ditunjukkan oleh perubahan kenaikan protein terlarut. Pada konsentrasi substrat yang rendah hingga 3%(b/v), terjadi kenaikan jumlah protein terlarut dengan pesat sampai tercapai kecepatan maksimum. Peningkatan konsentrasi substrat lebih lanjut tidak berpengaruh nyata terhadap laju hidrolisis dikarenakan enzim telah jenuh terhadap substrat. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 7.0 Protein terlarut (mg/ml) Protein terlarut (mg/mL) 9 6.0 5.0 4.0 3.0 2.0 1.0 0.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 100 86.92 80 60 40 20 0 0 Ko ns e n tr as i s ub s tr at (%) 0.2 0.4 0.6 0.8 Konsentrasi enzim (%) 0.4 y = 0.2158x + 0.1369 R2 = 0.9755 Gambar 5 Pengaruh konsentrasi enzim terhadap protein terlarut hidrolisat galendo (Ket: T= 60oC) 1/V 0.3 0.2 0.1 0.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1/[S] Gambar 4 Hubungan protein terlarut dengan konsentrasi substrat galendo, serta penentuan nilai Km dan Vmaks Konsentrasi substrat yang akan digunakan pada kondisi hidrolisis selanjutnya ditentukan dengan menggunakan kurva Lineweaver-Burk melalui penetapan nilai Km. Melalui ekstrapolasi persamaan regresi linear, diperoleh nilai Km sebesar 1,58%(b/v) dan Vmaks 7,30 mg/ml. Hal ini berarti untuk mencapai setengah dari kecepatan reaksi maksimum dibutuhkan substrat dengan konsentrasi 1,58%(b/v), sehingga konsentrasi substrat sejumlah 3,16%(b/v) sudah cukup dijadikan dasar untuk optimasi produksi hidrolisat protein selanjutnya. Murray et al. (2003) mengemukakan bahwa konsentrasi enzim berpengaruh terhadap reaksi inisiasi antara enzim dengan substrat yang akan menentukan kecepatan awal reaksi hidrolisis. Gambar 5 memperlihatkan perubahan konsentrasi enzim berkorelasi terhadap perubahan kenaikan protein terlarut. Aktivitas hidrolisis meningkatkan kelarutan protein dengan pesat pada konsentrasi enzim 0,01; 0,05; dan 0,1%(b/v). Laju reaksi optimum proses hidrolisis galendo oleh papain tercapai pada konsentrasi enzim 0,2%(b/v) dengan menghasilkan kenaikan protein terlarut sebesar 86,92 mg/ml. Aktivitas hidrolisis semakin menurun pada penggunaan konsentrasi enzim yang lebih tinggi, yang ditandai oleh berkurangnya laju kenaikan protein terlarut. Penggunaan enzim yang berlebih menyebabkan tidak semua enzim berikatan dengan substrat, sehingga kecepatan maksimum tidak dapat dicapai dan proses hidrolisis menjadi tidak efisien (Pelczar & Chan 1986). pH lingkungan dapat mempengaruhi efektifitas pembentukan kompleks ES melalui pengubahan struktur dan muatan residu fungsional pada sisi aktif enzim yang berperan dalam pengikatan substrat (Poedjiadi 2006). Papain memiliki stabilitas tinggi pada kisaran pH yang luas antara pH 4,5–10 (Belitz & Grosch 1999). Gambar 6 memperlihatkan aktivitas hidrolisis papain terhadap substrat galendo mencapai optimum pada pH 7,0 dengan menghasilkan kenaikan protein terlarut sebesar 168,13 mg/ml. Penyimpangan dari pH tersebut baik di bawah maupun di atas pH optimum menyebabkan penurunan aktivitas hidrolisis yang ditunjukkan oleh semakin berkurangnya laju kenaikan protein terlarut. Hal ini dikarenakan terjadi perubahan konformasi enzim yang mengakibatkan enzim kehilangan aktivitas katalitiknya dan terdenaturasi (Murray et al. 2003). Suhu mempengaruhi laju degradasi kompleks ES membentuk produk pada kisaran yang terbatas. Gambar 7 memperlihatkan pengaruh perubahan suhu terhadap laju hidrolisis pada konsentrasi substrat, konsentrasi enzim, dan pH optimum yang ditandai oleh perubahan kenaikan protein terlarut. Pada suhu 55oC hingga 65oC, laju hidrolisis terlihat terus meningkat sebanding dengan kenaikan suhu dan mencapai aktivitas maksimum pada suhu 70oC dengan menghasilkan kenaikan protein terlarut sebesar 104,87 mg/ml. Pada suhu 75oC terjadi penurunan aktivitas hidrolisis. Kenaikan suhu lebih lanjut menyebabkan laju kerusakan enzim akan melampaui reaksi katalisis enzim, sehingga reaksi berjalan tidak efisien yang ditunjukkan oleh penurunan tingkat kenaikan protein terlarut. Penggunaan suhu yang terlalu tinggi dapat menurunkan fungsi kerja enzim akibat membukanya lipatan molekul protein yang menyebabkan kerusakan sisi katalitik enzim dan enzim terdenaturasi (Pelczar & Chan 1986; Muchtadi 1992). PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 10 Protein terlarut (mg/ml) 200 168.13 150 100 50 0 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 pH Gambar 6 Pengaruh pH terhadap protein terlarut hidrolisat galendo (Ket: T= Protein terlarut (mg/ml) 60oC) 110 104.87 100 90 80 70 60 55 60 65 70 75 o Suhu ( C) Gambar 7 Pengaruh suhu terhadap protein terlarut hidrolisat galendo (Ket: pH=7,0) Protein terlarut (mg/ml) Lama proses hidrolisis merupakan faktor yang paling berpengaruh terhadap mutu hidrolisat yang dihasilkan. Astuti (2003) mengemukakan bahwa proses hidrolisis protein akan meningkatkan polaritas protein melalui pemecahan ikatan peptida membentuk NH2 dan COOH, sehingga peningkatan waktu hidrolisis tertentu akan menyebabkan kenaikan protein terlarut. Gambar 8 memperlihatkan laju hidrolisis protein galendo oleh enzim papain meningkat dengan pesat pada menit ke-15 hingga menit ke-60. Aktivitas optimum tercapai pada jam ke-3 dengan menghasilkan kenaikan protein terlarut sebesar 114,56 mg/ml. Semakin lama proses hidrolisis, diduga produk yang terbentuk dapat menghambat aktivitas enzim papain dalam menghidrolisis substrat dan menyebabkan jumlah peptida dan asam amino menurun, serta meningkatkan jumlah padatan tidak fungsional (Astuti 2003; Hidayat 2005). Produksi Hidrolisat Protein Galendo Hidrolisat protein galendo diproduksi pada kondisi optimum dengan menginkubasi 3,16%(b/v) substrat galendo dan suspensi enzim 0,2%(b/v) dalam dapar fosfat pH 7,0, yang selanjutnya dihidrolisis pada suhu 70oC selama 3 jam disertai pengadukan secara kontinyu. Proses hidrolisis protein galendo oleh papain menghasilkan produk berupa campuran peptida dan asam-asam amino melalui pemecahan ikatan peptida. Inaktivasi enzim dilakukan melalui inkubasi hidrolisat pada suhu 4oC selama 24 jam. Selanjutnya hidrolisat protein yang terbentuk dipisahkan secara sederhana dengan sentrifugasi dan penyaringan. Filtrat hidrolisat dipekatkan hingga menjadi serbuk menggunakan pengering semprot. Menurut Hidayat (2005), proses pengeringan semprot dapat mengatasi perubahan karakteristik hidrolisat yang tidak diinginkan, mencegah terjadinya penyusutan padatan dengan mempertahankan bentuk dan dimensi aslinya, meningkatkan stabilitas selama penyimpanan, mencegah kehilangan flavor, dan menghambat pertumbuhan bakteri. Pengeringan 1400 ml filtrat hidrolisat menghasilkan rendemen sebanyak 1,47%(b/v) setara 20,45 gram serbuk hidrolisat. Karakterisasi Hidrolisat Protein Galendo Warna, rasa, bau, dan tingkat kerusakan asam amino dipengaruhi oleh kemurnian protein dan komposisi asam amino bahan baku, kondisi hidrolisis serta bahan penghidrolisis yang digunakan (Kirk & Othmer 1953; Fennema 1996). Proses hidrolisis galendo oleh enzim papain yang dilakukan pada penelitian ini berjalan dengan baik menghasilkan produk hidrolisat berbentuk serbuk berwarna coklat muda dan berbau harum (Gambar 9). Hasil analisis proksimat terhadap serbuk hidrolisat protein galendo disajikan pada Tabel 4. 140 114.56 120 100 80 60 40 20 0 0 60 120 180 240 300 Waktu inkubasi (menit) Gambar 8 Pengaruh waktu inkubasi terhadap protein terlarut hidrolisat galendo (Ket: T= 70oC) Gambar 9 Serbuk hidrolisat protein galendo PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 11 Tabel 4 Hasil analisis proksimat hidrolisat protein galendo Parameter Warna serbuk pH larutan Protein total Protein terlarut Gula pereduksi Lemak Air Abu Kelarutan Satuan %(b/b) mg/ml mg/ml %(b/b) %(b/b) %(b/b) %(b/b) serbuk Hasil coklat muda 6,6 70,22 796,41 103,04 6,81 6,37 1,15 77,34 Serbuk hidrolisat galendo mengandung protein total sebesar 70,22% (b/b) atau 18% lebih tinggi dari tepung galendo. Perubahan kandungan protein total disebabkan oleh banyaknya komponen berupa lemak, gula, dan senyawa lain yang terendapkan selama sentrifugasi, sehingga konsentrasi asam amino pada hidrolisat galendo lebih tinggi daripada bahan baku. Proses pengeringan yang efektif menghasilkan produk dengan kadar air rendah turut berperan meningkatkan kepekatan protein dalam hidrolisat galendo. Konsentrasi protein terlarut dari serbuk hidrolisat galendo adalah sebesar 796,41 mg/ml, yang berarti 3,3 kali lebih tinggi dari galendo basah dan 2,4 kali lebih tinggi dari tepung galendo. Perubahan konsentrasi protein terlarut disebabkan oleh pemutusan ikatan peptida pada protein galendo yang selanjutnya meningkatkan gugus amina dan karboksil yang bersifat polar, sehingga meningkatkan kelarutan protein dalam air (Astuti 2003). Ringkasan proksimat galendo basah, tepung galendo, dan serbuk hidrolisat protein disajikan pada Tabel 5. Kadar karbohidrat dinyatakan sebagai selisih antara jumlah bahan dengan komponen proksimat yang telah diketahui. Karbohidrat yang terkandung dalam substrat galendo tidak menghambat kinerja enzim papain dalam menghidrolisis protein serta terendapkan pada proses sentrifugasi, sehingga menyebabkan perubahan kadar karbohidrat dalam serbuk hidrolisat menjadi 15% lebih rendah dari tepung galendo, yaitu sebesar 15,45%(b/b). Hal ini juga ditunjukkan oleh perubahan konsentrasi gula pereduksi menjadi 31% lebih rendah dari tepung galendo. Jika dibandingkan dengan tepung galendo, hasil analisis proksimat terhadap serbuk hidrolisat menunjukkan penurunan kandungan lemak, air, dan abu berturut-turut sebesar 42%, 25%, dan 46%. Hal ini menunjukkan proses hidrolisis berlangsung efektif menghasilkan hidrolisat dengan karakteristik dan nilai mutu yang lebih baik, lebih stabil, dan tahan lama. Kelarutan serbuk hidrolisat di dalam air meningkat menjadi 1,5 kali lebih besar dari tepung galendo yang menunjukkan kemudahan fortifikasi makanan. Disamping itu, rendahnya kandungan lemak mengindikasikan serbuk hidrolisat protein galendo potensial untuk dimanfaatkan sebagai suplemen diet dan formulasi makanan bayi (Hidayat 2005). Komposisi asam amino penyusun protein menentukan kualitas hidrolisat protein dan nilai gizinya. Hidrolisis protein secara enzimatis yang berlangsung sempurna akan menghasilkan hidrolisat yang terdiri dari 18 sampai 20 jenis asam amino. Analisis komposisi asam amino yang terkandung dalam hidrolisat protein galendo dengan metode HPLC menggunakan reagen OPA menghasilkan 15 jenis asam amino baik yang bersifat esensial maupun nonesensial. Asam amino sistein, prolin, dan triptofan tidak dapat diidentifikasi dengan metode ini. Hasil analisis asam amino dengan metode HPLC disajikan pada Gambar 10 dan Tabel 6. Konsentrasi asam amino tertinggi yang terkandung dalam serbuk hidrolisat protein galendo adalah asam glutamat sebesar 12,47%, diikuti arginin 7,22%, asam aspartat 5,91%, leusin 4,20%; dan valin 3,64%. Histidin merupakan asam amino pembatas dengan konsentrasi terkecil yaitu sebesar 1,51%. Tabel 5 Ringkasan komposisi galendo basah, tepung galendo, dan serbuk hidrolisat protein per 100 gram Produk Protein (g) Lemak (g) Karbohidrat* (g) Air (g) Abu (g) Galendo basah Tepung galendo Serbuk hidrolisat protein 14,49 59,48 70,22 27,91 11,74 6,81 18,11 15,45 57,49 8,53 6,37 2,14 1,15 *by difference PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 12 Gambar 10 Kromatogram HPLC hidrolisat protein galendo Tabel 6 Hasil analisis asam amino hidrolisat protein galendo dengan HPLC * No Asam amino 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Asam aspartat Asam glutamat Serin Histidin* Glisin Threonin* Arginin Alanin Tirosin Metionin* Valin* Fenilalanin* Isoleusin* Leusin* Lisin* Konsentrasi % (b/b) µM 5,91 31312 66121 12,47 2,10 11106 1,51 7987 3,11 16482 1,86 9859 7,22 38256 2,58 3673 1,63 8664 1,71 9073 3,64 19280 3,08 16296 2,57 13607 4,20 22281 2,40 12706 esensial Asam glutamat sebagai asam amino nonesensial merupakan sumber energi utama bagi sel usus (Reeds 2000). Menurut Augustin et al. (2007), 60% asupan asam glutamat dalam makanan dimetabolisme oleh sel usus dan hanya 4% yang dikeluarkan dari tubuh. Selain itu, asam glutamat berperan sebagai neurotarsmitter dalam otak yang menunjang fungsi berpikir, mempermudah proses belajar, dan memperkuat ingatan. Lee dan Ho (2002) mengemukakan bahwa asam glutamat memiliki rasa asam dan umami (gurih), sehingga kandungan asam glutamat yang tinggi menyebabkan hidrolisat protein galendo dapat dimanfaatkan sebagai penyedap makanan. Asupan asam glutamat dan asam amino bercabang (leusin, isoleusin, dan valin) dapat meningkatkan metabolisme di otot dengan cara meningkatkan sintesis protein dan menurunkan proteolisis (Manninen 2004). Oleh karena itu, hidrolisat protein galendo dapat dimanfaatkan sebagai makanan suplemen bagi atlet maupun orangorang yang ingin memperbesar massa otot tubuhnya. Komposisi asam glutamat bersama dengan sistein dan glisin berperan sebagai prekursor dalam sintesis glutation, suatu molekul antioksidan yang berperan penting dalam mekanisme detoksifikasi di hati. Asupan asam glutamat yang berlebihan dapat menyebabkan kerusakan sistem syaraf sehingga dapat menimbulkan penyakit Alzheimer dan amyotrophic lateral sclerosis (Sabariyyah 2005). Arginin merupakan asam amino esensial untuk bayi dan anak-anak yang berperan menstimulasi pembentukan hormon pertumbuhan yang disegregasikan oleh hypothalamus dan penting untuk pembaharuan sel, terutama untuk regenerasi ginjal, otot dan sel kartilago (Alba et al. 1988; Koesel et al. 2001; Poedjiadi 2006). Penambahan arginin ke dalam minuman kaya karbohidrat memiliki efek insulinotropik yang turut berperan dalam pembentukan otot (Ivy et al. 2002). Arginin juga merupakan nutrisi penting yang dibutuhkan oleh penderita AIDS dan penderita penyakit kronis dalam rangka meningkatkan sistem imun. Asam amino histidin bersifat esensial untuk pertumbuhan dan perkembangan anak-anak, namun tidak esensial bagi orang dewasa (Poedjiadi 2006). Penetapan nilai kimia protein mengindikasikan kualitas produk hidrolisat yang dihasilkan dalam upaya pemanfaatannya sebagai suplemen makanan. Nilai kimia merupakan perbandingan konsentrasi asam amino esensial dalam produk hidrolisat protein terhadap pola provisional yang menyatakan kebutuhan asupan asam amino bagi manusia (WHO 2002). Nilai kimia hidrolisat protein galendo disajikan pada Tabel 7. Hidrolisat protein galendo kaya asam amino valin dan isoleusin dengan nilai kimia berturut-turut sebesar 104 dan 92, yang berarti konsumsi produk hidrolisat dapat memenuhi seluruh kebutuhan asam amino valin dan 92% kebutuhan isoleusin bagi metabolisme tubuh. Hidrolisat protein galendo defisien asam amino lisin dengan nilai kimia 41. Hal ini disebabkan bereaksinya lisin dengan gula sederhana pada suhu tinggi yang menimbulkan reaksi browning selama proses pengeringan. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 13 Tabel 7 Nilai kimia hidrolisat protein galendo terhadap kebutuhan asam amino esensial pola provisional WHO Hidrolisat Pola galendo provisional* % (b/b) % (b/b) 2,57 2,80 Isoleusin 4,20 6,60 Leusin 2,40 5,80 Lisin 4,71 6,30 Fenilalanin Metionin 1,71 2,50 Treonin 1,86 3,40 Triptofan T 1,10 Valin 3,64 3,50 Asam amino esensial Nilai kimia 92 64 41 75 68 55 104 T : Tidak teridentifikasi adalah asam glutamat sebesar 12,47%(b/b), sedangkan histidin merupakan asam amino pembatas dengan konsentrasi terkecil yaitu sebesar 1,51%(b/b). Saran Analisis konsentrasi asam amino sistein, prolin, dan triptofan dari hidrolisat protein galendo perlu dilakukan dengan metode HPLC menggunakan pre-collum derivatization yang berbeda. Selain itu, perlu dilakukan uji toksisitas dan uji daya cerna in vitro untuk mengetahui keamanan dan efektifitas pemanfaatan hidrolisat protein galendo lebih lanjut sebagai alternatif bahan tambahan makanan atau suplemen protein tinggi. *WHO 2002 Efektifitas proses hidrolisis ditunjukkan oleh kandungan protein terlarut yang tinggi dan komposisi asam amino yang lengkap baik asam amino esensial maupun nonesensial dalam produk hidrolisat. Selain itu, hidrolisat umumnya mengandung peptida dengan bobot molekul rendah terdiri atas 2 hingga 4 residu asam amino yang lebih mudah diabsorpsi dalam metabolisme tubuh. Oleh karena itu, hidrolisat protein galendo dapat dimanfaatkan sebagai menu bagi para penderita gangguan pencernaan dengan memanfaatkan asam amino esensial yang terdapat di dalamnya. Hidrolisat protein galendo juga dapat dimanfaatkan sebagai intermediet isolasi asam amino bebas untuk memenuhi kebutuhan industri, pangan dan kesehatan. SIMPULAN DAN SARAN Simpulan Galendo, limbah industri VCO, dapat diolah menjadi hidrolisat protein. Papain sebagai enzim proteolitik dapat digunakan untuk menghasilkan hidrolisat protein galendo. Kondisi optimum untuk hidrolisis galendo dengan enzim papain adalah pada konsentrasi substrat 3,16%(b/v), konsentrasi enzim 0,2%(b/v), pH 7,0, suhu inkubasi 70oC, dan waktu hidrolisis selama 3 jam. Aktivitas proteolitik papain relatif sebesar 1460,63 Unit/ml untuk menghasilkan hidrolisat dengan kandungan protein total 70,22%(b/b) dan protein terlarut 796,41 mg/ml. Produksi hidrolisat protein pada kondisi optimum menghasilkan rendemen sebanyak 1,47%(b/v). Komposisi asam amino tertinggi yang terkandung dalam hidrolisat protein galendo DAFTAR PUSTAKA Alba-Roth J, Müller O, Schopohl J, von Werder K. 1988. Arginine stimulates growth hormone secretion by suppressing endogenous somatostatin secretion. J Clin Endocrinol Metab 67(6):1186-9. Anang SA. 1991. Kelapa: Kajian Sosial Ekonomi. Yogyakarta: Penerbit Aditya Media. [AOAC] Association of Official Analitical Chemists. 1999. Official Method of analysis. Ed ke-17. Virginia: AOAC. [APCC] Asia Pacific Coconut Community. 2004. Coconut statistical yearbook 2003. Astuti NS. 2003. Pengaruh konsentrasi jagung dan waktu hidrolisis terhadap karakteristik hidrolisat protein secara enzimatik [skripsi]. Bandung: Universitas Pasundan. Augustin H, Grosjean Y, Chen K, Sheng Q, Featherstone DE. 2007. Nonvesicular release of glutamate by glial xCT transporters suppresses glutamate receptor clustering in vivo. J Neuroscience 27(1):111-123. Belitz HD, Grosch W. 1999. Food Chemistry. Germany: Springer. Bergmeyer HU, Grassi M. 1983. Methods of Enzymatic Analysis. Ed ke-3. Florida: Verlag Chemie. Beveridge AJ. 1996. A theoretical study of the active sites of papain and S195C rat trypsin: Implication for the low reactivity of mutant serine proteinases. J Protein Sci 5:1355:1365. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 14 Bucci LR, Unlu L. 2000. Protein and Amino Acid Supplements in Exercise and Sport in: Energy Yielding Macronutrients and Energy Metabolism in Sports Nutrition. Florida: CRC Press. Davidex J, Velisek J, Pokarny J. 1990. Chemical Change During Food Processing. California: Elsevier Academic Press. Departemen Pertanian. 2005. Prospek dan Arah Pengembangan Agribisnis Kelapa. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Departemen Pertanian. 2008. Pusat data statistik: Produksi kelapa nasional. http://database.deptan.go.id/bdspweb/bds p2007/hasil_ind.asp. [27 Februari 2008] [EDC] Enzyme Development Corporation. 1999. Meat Tenderizing: A Brief Discussion. New York: EDC. [EDC] Enzyme Development Corporation. 2001. Traditional Baking Enzymes. New York: EDC. Fachraniah. 2002. Pembuatan peptone dari bungkil kedelai dan limbah bir dengan enzim papain untuk media pertumbuhan bakteri [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, IPB. [IDEA] Investment in Developing Export Agriculture Product. 2000. Papain. Comertial Buletin 13:1-5. Ivy JL, Goforth HW Jr, Damon BM, McCauley TR, Parsons EC, Price TB. 2002. Early post-exercise muscle glycogen recovery is enhanced with a carbohydrate-protein supplement. J Appl Physiol 93:1337–1344. Johnson AH, Peterson MS. 1974. Encyclopedia of Food Technology. Volume ke-2. Westport: The AVI Publ. Ketaren S. 1986. Pengantar Teknologi Minyak dan Lemak Pangan. Jakarta: UI-Press Kirk RE, Ortmer JB. 1953. Encyclopedia of Chemical Technology. Volome ke-5. New York: The Interscience Encyclopedia. Koesel, Kurt, Ray J. 2001. Multiple usage of green papaya in healing. http://www.universal-tao.com/article.html [27 Februari 2008] Lee TC, Ho CT. 2002. Bioactive Compounds in Foods: Effects of Processing and Storage. Washington: American Chemical Society. Lehninger AL, DL Nelson, MM Cox. 2004. The Principles of Biochemistry. 4th Ed. New York: Worth Publisher. [FAO] Food and Agriculture Organization of the United Nations. 2004. The Pasific Island Food Composition Tables. Ed Ke2. Rome: FAO. Leipner J, Saller R. 2000. Systememic enzyme therapy in oncology: effect and mode of action. J Drugs 59(4):769-780. Fennema OR. 1996. Principles of Food Science: Food Chemistry. New York: Marcel Dekker. Leung AY. 1996. Encyclopedia of Common Natural Ingredients Used in Food, Drugs, and Cosmetics. Ed ke-2. New York: Interscience. Giese J. 1994. Protein as ingredients: types, functions, applications. J Food Tech.:5060. Hagenmaier R. 1980. Coconut Aqueous Processing. Philippines: San Carlos Publications. Harrison MJ, NA Burton, LH Hillier. 1997. The mechanism of the papain catalysed amide hydrolysis: Prediction with a hybrid quantum mechanical or molecular mechanical potential. J Am Chem Soc 119:12285–12291 Hidayat T. 2005. Pembuatan hidrolisat protein dari ikan selar kuning (Caranx leptolepis) dengan menggunakan enzim papain [skripsi]. Bogor: Fakultas Perikanan dan Ilmu Kelautan, Institut Pertanian Bogor. Lowry OH, NJ Rosebrough, AL Farr, RJ Randall. 1951. Protein measurement with the folin phenol reagent. J Biol Chem 193:265-270. Mahmud Z, Ferry Y. 2005. Prospek pengolahan hasil samping buah kelapa. J Litbang Perkebunan 4(2):55-63. Manninen AH. 2004. Protein hydrolysates in sports and exercise: a Brief review. J Sports Science and Medicine 3:60-63. Muchtadi D. 1992. Enzim dalam Industri Pangan. Bogor: PAU-IPB. Muhidin D. 1999. Agroindustri Papain dan Pektin. Jakarta: Penebar Swadaya. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 15 Murray RK, Granner DK, Mayes PA, Rodwell VW. 2003. Harper Biochemistry. Ed ke25. Hartono A, penerjemah; Bani AP, Tiara MN, editor. Jakarta: EGC. Pedersen. 1994. Removing bitternes from protein hidrolysates. Di dalam: Food Industry X. Chicago: Institute of Food Technology. Pedroza-Islas R, JA Ramirez, EJV Carter. 2000. Using biopolimer blends for shrimp feedstuff microencapsulation-II: dissolution and floatability kinetics as solution criteria. Food Research International 33:119-124. Pelczar MJJr, Chan ECS. 1986. Dasar-dasar Mikrobiologi. Volume ke-1. Hadioetomo RS, Imas T, Tjitrosomo SS, Angka SL, penerjemah. Jakarta : UI Pr. Terjemahan dari: Elements of Microbiology. Poedjiadi A. 2006. Dasar-Dasar Biokimia. Jakarta: UI-Press. Pigot GM, Tucker BW. 1990. Utility Fish Flesh Effectively While Maintaining Nutritional Qualities, Sea Food Effect of Technology on Nutrition. New York: Marcel Decker. Purwadaria T. 2004. Bungkil kelapa fermentasi untuk pakan itik [publikasi elektronis]. Warta Penelitian dan Pengembangan Pertanian Indonesia 26(5):9-10. Schimidi MK., Taylor SL, Nordlee JA. 1994. Use of hydrolisate-based product in special medical diets. J Food Tech. Sediaoetama D A. 1996. Ilmu Gizi. Cetakan ke-3. Jakarta: Dian Rakyat. Soemaatmadja E, Djoerwani, AS Herman. 1984. Pemanfaatan Bungkil dan Ampas Kelapa. Bogor: Balai Penelitian Kimia. Somogyi M. 1952. Comparative study of Xylanase kinetics using dinitrosalicylic, arsenomolibdate, and ion chromatographics assay. J Biol Chem 195:19-23. Cetak ulang dalam Appl Biochem & Biotech 1998;70-72:257-265. Suhartono MT. 1992. Protease. Bogor: PAU Bioteknologi IPB. Warisno A. 2003. Budidaya Kelapa Genjah. Yogyakarta: Kanisius. Williams AP. 1998. Determination of Amino Acid. HPLC in Food Analysis. Academic Pr Limited.Winarno FG. 1986. Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: Gramedia. [WHO] World Health Organization. 2002. WHO/FAO report: Energy and Protein Requirements. WHO Technical Report. Ser. no. 724. Geneva: WHO. Zayas JF. 1997. Functionality of Protein in Food. Germany: Springer. Reeds PJ. 2000. Intestinal glutamate metabolism. J Nutrition 130(4):978-982. Rehm HJ, G Reed. 1995. Biotechnology: Enzymes, Biomass, Food, and Feed. New York: VCH. Rindengan B. 1988. Mempelajari penggunaan konsentrat protein kelapa (Cocos nucifera L.) untuk makanan bayi [tesis]. Bogor: Program Pascasarjana, IPB. Rindengan B, A Lay, H Novarianto, H Kembuan, Z Mahmud. 1995. Karakterisasi daging buah kelapa hibrida untuk bahan baku industri makanan. Laporan Hasil Penelitian. Jakarta: Badan Penelitian dan Pengembangan Pertanian. Sabariyyah PN. 2005. Pemanfaatan enzim papain dalam produksi hidrolisat protein susu sapi [skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 16 LAMPIRAN PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 17 Lampiran 1 Tahapan penelitian Produksi tepung galendo Tepung galendo (Analisis proksimat) Refined papain • Aktivitas proteolitik • Kinetika reaksi (Km & Vmaks) Optimasi kondisi hidrolisis (jumlah peptida terlarut optimum) • • • • • Konsentrasi substrat Konsentrasi enzim pH Suhu inkubasi Waktu hidrolisis Produksi hidrolisat protein pada kondisi optimum Pemekatan hidrolisat protein (spray-drying) Serbuk campuran asam amino dan peptida Karakterisasi produk • Analisis proksimat • Analisis asam amino dengan HPLC PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 18 Lampiran 2 Produksi tepung galendo Galendo basah Ekstraksi dengan heksana (1:5), 200 rpm, 2 x 2 jam; suhu ruang Dekantasi Bubur galendo bebas minyak Residu heksana Evaporasi Oven 50oC, 24 jam Galendo kering Digiling dan diseragamkan lolos 50 mesh Tepung galendo Perhitungan : 2026,11 gram galendo basah ekstraksi, evaporasi 1460,62 gram bubur galendo oven, digiling lemak terekstrak 2026,11 − 1460,62 = x 100% = 27,91% 2026,11 kadar 1460 ,62 − 295 ,74 = x 100 % 2026 ,11 air rendemen = = 57 , 49 % 295,74 x 100% = 14,49% 2026,11 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 295,74 gram tepung galendo 19 Lampiran 3 Hidrolisis protein galendo, pemekatan hidrolisat, dan karakterisasi produk. Larutan galendo konsentrasi optimum (pH 3,9) NaOH 0,1 N Pengaturan pH = pH optimum Suspensi papain konsentrasi optimum dalam dapar fosfat 0,2 M pH optimum Hidrolisis pada kondisi optimum, kec. 120 rpm Inaktivasi enzim (simpan pada suhu 4oC, 24 jam) Sentrifugasi t=15’,T=40C, kec.= 10.000 rpm Hidrolisat protein total (campuran peptida & asam amino) Spray-drying Serbuk campuran peptida dan asam amino • Analisis proksimat • Karakterisasi asam amino dengan HPLC 1400 ml filtrat (hidrolisat total) rendemen Spray Drying 20,45 gram tepung hidrolisat 20,45 g x 100 % = 1,47 %(b/v) = ________ 1400 ml PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Endapan 20 Lampiran 4 Analisis aktivitas proteolitik enzim papain metode hidrolisis kasein (Bergmeyer & Grassi 1983) Prinsip pengukuran aktivitas proteolitik enzim papain dengan metode hidrolisis kasein adalah mengukur banyaknya tirosin yang dihasilkan dari hidrolisis kasein oleh satu konsentrasi papain pada suhu 40oC, pH 6,5. Prosedur: Disiapkan tiga buah tabung reaksi untuk blanko, standar, dan sampel. Larutan kasein 1% pH 7,0 dimasukkan ke dalam setiap tabung masing-masing 0,6 ml. Sejumlah 0,2 ml larutan dapar fosfat pH 6,5 ditambahkan ke dalam tabung blanko, untuk tabung standar ditambahkan larutan 0,2 ml tirosin 5 mM, dan untuk tabung sampel ditambahkan 0,2 ml larutan papain 0,1%. Ketiga tabung dipanaskan dalam penangas air pada suhu 40oC selama 5 menit. Reaksi dihentikan dengan menambahkan 2 ml TCA 0,1 M. Kemudian ditambahkan 0,2 ml larutan dapar fosfat pH 6,5 ke dalam ketiga tabung tersebut, lalu dihomogenkan dan disentrifuse dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang diperoleh dipipet masing-masing 0,6 ml. Kemudian ditambahkan masing-masing 2 ml NaOH 1 M dan 0,4 ml larutan folin, divortex, diamkan selama 10 menit, dan dianalisis dengan spektrofotometer pada λ 578 nm. Pada penentuan kinetika reaksi enzim papain terhadap substrat kasein, digunakan konsentrasi papain 0,5%(b/v) dengan konsentrasi substrat kasein bervariasi antara 0,2-2,5%(b/v). Prosedur analisis serupa dengan penentuan aktivitas proteolitik enzim papain metode hidrolisis kasein. Satu unit proteolitik didefinisikan sebagai jumlah μmol tirosin yang terbentuk per menit pada kondisi assay. Kinetika reaksi enzim papain terhadap substrat kasein Konsentrasi kasein (%) b/v 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,50 2,00 2,50 Aktivitas proteolitik (Unit/ml) 547,45 1162,04 1523,08 1629,77 1661,93 1826,57 2070,50 2119,47 1/[S] 1/AE 5,00 2,50 1,67 1,25 1,00 0,67 0,50 0,40 0,0018 0,0009 0,0007 0,0006 0,0006 0,0005 0,0005 0,0005 Perhitungan : Aktivitas proteoliti k = A sampel - A blanko A standar - A blanko x 1 1 x x Fp t V papain 0.425 - 0.054 1 1 x x x 1000 0.308 - 0.054 5 0.2 = 1460 .63 U / ml = Km V maks 1 1 + [S ] V maks Persamaan Lineweaver-Burk adalah; 1 V = dengan persamaan garis yang diperoleh; y = 0,0003 x + 0,0003 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 21 Lampiran 5 Penentuan kadar N total (metode Kjeldahl, AOAC 1999) Prinsip penentuan kadar N-total dengan metode Kjeldahl adalah penetapan protein berdasarkan oksidasi bahan-bahan berkarbon dan konversi N menjadi amonia. Selanjutnya amonia bereaksi dengan kelebihan asam membentuk amonium sulfat. Larutan dibuat menjadi basa dan amonia diuapkan untuk kemudian diserap oleh larutan asam borat. N yang terkandung dalam larutan dapat ditentukan jumlahnya dengan titrasi menggunakan HCl. Prosedur : Sejumlah 0,51 g sampel ditimbang di dalam tabung Kjeldahl, kemudian ditambahkan 2 g campuran selen dan 25 ml H2SO4 pekat. Campuran selen dibuat dari 2,5 g serbuk SeO2, 100 g K2SO4, dan 20 g CuSO4.5H2O. Larutan sampel dipanaskan di atas pemanas listrik atau bunsen selama dua jam sampai mendidih dan larutan menjadi jernih kehijauan, lalu didinginkan. Selanjutnya larutan sampel diencerkan dan dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml dan ditepatkan sampai tanda tera. Sejumlah 5 ml larutan sampel dimasukkan ke dalam alat destilasi dan ditambahkan 5 ml NaOH 30% dan labu destilasinya segera ditutup. Sebagai penampung, erlenmeyer berisi 10 ml larutan asam borat (H3BO3) 2% dan 2-4 tetes larutan indikator (campuran bromcresol green 0,1% dan merah metil 0,1% dalam alkohol 95% (5:1)) diletakkan di bawah kondensor dan diusahakan ujung pipa kondensor selalu tercelup dalam larutan borat. Destilasi dilakukan selama 10 menit. Ujung pipa dibilas dengan air suling, kemudian larutan dititrasi dengan HCl 0,01 N hingga warna larutan menjadi ungu seulas Perhitungan: V.HCl x N.HCl x 0,014 x Fp x 100% bobot sampel %N = Protein to tal = % N x faktor konversi Faktor konversi = 6,25 ( produk tur unan kelapa) a. Tepung galendo Hasil titrasi :I 17,10 ml II 17,60 ml %N Protein to tal 17,35 ml x 0,01 x 0,014 x 20 x 100% = 9,52% 0,51 g = 9,52% x 6,25 = 59,48% = b. Produk hidrolisat protein Hasil titrasi :I 20,40 ml II 20,55 ml %N Protein to tal 20, 48 ml x 0,01 x 0,014 x 20 x 100% = 11,24% 0,51 g = 11,24% x 6, 25 = 70,22% = PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 22 Lampiran 6 Penentuan konsentrasi protein terlarut (Lowry 1951) Metode Lowry merupakan salah satu reaksi warna untuk uji protein yang konsentrasinya rendah (1-300 µg/ml), Prinsip penentuan kadar protein terlarut dengan metode Lowry adalah reaksi antara Cu2+ dengan ikatan peptida dan reduksi asam fosfomolibdat dan asam fosfotungstat oleh tirosin dan triptofan yang ditandai dengan terbentuknya kompleks berwarna biru keunguan. Intensitas warna kompleks sebanding dengan kadar protein. Pereaksi: Lowry A : Na2CO3 2% (b/v) dalam larutan NaOH 0,1 N Lowry B : CuSO4 0,5% (b/v) dalam larutan Na-K- tartrat 1%(b/v) Lowry C : Campuran Lowry A dan B (50:1) (dibuat insitu) Lowry D : Pereaksi Folin Ciocalteau dan akuades (1:1) (dibuat insitu) Sejumlah sampel (50-500 µl) ditambahkan akuades hingga volumenya 4 ml. Kemudian ditambahkan 5,5 ml pereaksi Lowry C, dikocok, dan didiamkan selama 15 menit. Lalu Lowry D ditambahkan sebanyak 0,5 ml, dikocok dengan cepat, dan dibiarkan selama 30 menit hingga terbentuk warna biru. Serapannya diukur pada panjang gelombang 650 nm. Untuk kurva standar protein, sampel digantikan dengan stok Bovine Serum Albumin 100 µg/ml. Sederetan standar BSA dibuat dengan konsentrasi 0, 20, 40, 60, 80 dan 100 µg/ml. Perlakuan selanjutnya sama seperti prosedur pada analisis kadar protein terlarut. Konsentrasi standar BSA dan absorban pada λ 650 nm Konsentrasi BSA (mg/ml) 0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 Abs = K1 (Kons) + K0 Abs = 5,5700 [Kons] + 0,0237 Absorban 0,000 0,145 0,264 0,372 0,467 0,565 0.700 y = 5.5700x + 0.0237 R2 = 0.9935 Absorban 0.600 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Konsentrasi BSA (mg/mL) Kurva standar protein BSA pada panjang gelombang 650 nm PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 23 Lampiran 7 Konsentrasi protein dan N-terlarut galendo basah, tepung galendo, dan hidrolisat protein Konsentrasi protein terlarut Absorban Konsentrasi Fp Konsentrasi total (mg/ml) Rata-rata Galendo basah 0,158 0,157 0,024 0,024 10000 241,11 239,32 240,22 Tepung galendo 0,200 0,212 0,032 0,034 10000 316,52 338,06 327,29 Hidrolisat protein 0,245 0,246 0,040 0,040 20000 794,61 798,20 796,41 Sampel Perhitungan : Absorban = 5,5700[Kon s] + 0,0237 Konsentras i Abs − 0.0237 = x Fp 5,57 Peningkata n kelarutan protein konsentras i tepung galendo konsentras i galendo basah 327 , 29 mg/ml = 240 ,22 mg/ml = = 1,4 kali Peningkata n kelarutan protein konsentras i produk hidrolisat konsentras i tepung galendo 796 ,41 mg/ml = 327 .29 mg/ml = = 2,4 kali Peningkata n kelarutan protein = konsentras i produk hidrolisat konsentras i galendo basah 796 , 41 mg/ml 240 .22 mg/ml = 3,3 kali = PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 24 Lampiran 8 Penentuan konsentrasi total gula pereduksi (Somogyi-Nelson 1952) Analisis kadar gula tereduksi dilakukan dengan metode Somogyi-Nelson, yang menggunakan glukosa sebagai standar. 1 ml sampel ditambahkan 1 ml Nelson C, kemudian diinkubasi selama 20 menit pada penangas air mendidih. Selanjutnya didinginkan dan ditambahkan 1ml reagen arsenomolibdat, dikocok sampai endapan Cu2O larut sempurna dan diencerkan dengan akuades hingga volumenya menjadi 10 ml. Absorbansinya dibaca dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 520 nm. Blanko menggunakan akuades sebagai pengganti sampel. Reagen Somogyi-Nelson: a. Reagen Nelson A Reagen Nelson A terdiri dari 12,5g Na2CO3 anhidrat, 12,5 g garam KNa.Tartrat, 10 g NaHCO3 dan 100 g Na2SO4 anhidrat yang dilarutkan dalam akuades hingga tepat 500 ml. b. Reagen Nelson B Reagen Nelson B terdiri dari 7,5 g CuSO4.5H2O yang dilarutkan dalam 50 ml air demineral dan ditambahkan 1 tetes H2SO4 pekat. c. Larutan Stok C Larutan stok C dibuat dengan mencampur reagen A dan B dengan perbandingan 25:1 (in situ) d. Pereaksi Arsenomolibdat Larutan 1 terdiri dari 25 g (NH4)2MoO4 dalam 450 ml akuades dan 25 ml H2SO4. Larutan 2 terdiri dari 3 g (Na2HAsO4.7H2O) yang dilarutkan dalam 25 ml akuades. Pereaksi arsenomolibdat dibuat dengan mencampurkan larutan 2 ke dalam larutan 1 dan dihomogenkan. Kemudian diinkubasi pada 370C selama 24 jam dan disimpan dalam botol coklat di lemari pendingin. Konsentrasi dan absorban standar glukosa pada λ 520 nm K o n s Konsentrasi BSA (mg/ml) 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Absorban 0.000 0.109 0.220 0.333 0.399 0.531 = K1 (Abs) + K0 Kons = 5,1971 (Abs) + 0,0055 0.600 y = 5.1971x + 0.0055 R2 = 0.9955 Absorban 0.500 0.400 0.300 0.200 0.100 0.000 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 Konsentrasi glukosa (m g/mL) Kurva standar glukosa pada λ 520 nm PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 0.10 25 Lampiran 9 Konsentrasi gula pereduksi tepung galendo dan hidrolisat protein Sampel Absorban Konsentrasi 0,766 0,804 0,540 0,542 0,146 0,154 0,103 0,103 Tepung galendo Hidrolisat protein Fp 1000 1000 Konsentrasi total (mg/ml) 146,33 153,64 102,85 103,23 Rata-rata 149,99 103,04 Perhitungan : Konsentras i gula tepung galendo Abs − 0,0055 = x Fp 5,1971 0,766 − 0,0055 = x 100 5,1971 = 146 ,33 mg/ml Lampiran 10 Analisis kadar lemak (metode soxhlet, AOAC 1999) Sebanyak 2 g sampel dibungkus dengan kertas saring dan diekstrak dengan pelarut heksana pada labu dan alat destilasi soxhlet secara refluks selama 5-6 jam. Pelarut yang masih tercampur dengan lemak di pisahkan dengan cara destilasi. Lemak hasil ekatraksi yang tertampung dalam labu dikeringkan dalam oven 110oC hingga diperoleh bobot yang konstan. Kadar lemak dapat dihitung dengan rumus : Kadar lemak (%) = bobot labu & lemak setelah ekstraksi - bobot labu x 100 % bobot sampel awal Kadar lemak tepung galendo dan hidrolisat protein Sampel Tepung galendo Hidrolisat protein Bobot sampel (g) 2,0008 2,0005 2,0000 2,0005 2,0005 2,0011 Bobot labu + sampel sebelum ekstraksi (g) 156,9125 157,0233 160,4412 155,7404 158,4111 156,5379 Bobot labu setelah ekstraksi (g) 157,1506 157,2542 160,6768 155,6090 158,2755 156,3957 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Kadar lemak % (b/b) 11,54 11,90 11,78 6,57 6,78 7,07 Rata-rata 11,74 6,81 26 Lampiran 11 Analisis kimia tepung galendo a. Kadar air (Gravimetri, AOAC 1999) Sejumlah 1 g sampel ditimbang dengan teliti dan dimasukkan ke dalam cawan porselen kering yang telah diketahui bobotnya. Kemudian dikeringkan dalam oven pada suhu 105oC selama 3 jam. Setelah kering, cawan tersebut didinginkan di dalam desikator dan ditimbang. Pengeringan contoh dilakukan sampai diperoleh bobot konstan. Kadar air (%) = W1 - W2 x100% W1 Keterangan : W1 = bobot sampel awal (g) W2 = bobot sampel akhir (g) Perhitungan kadar air Bobot awal (g) 0,9948 1,0014 1,0094 0,5000 0,5000 0,5000 Sampel Tepung galendo Hidrolisat protein b. Bobot akhir (g) 0,9048 0,9196 0,9249 0,4689 0,4675 0,4681 Kadar air (%) 9,05 8,17 8,37 6,22 6,50 6,38 Kadar air rata-rata (%) 8,53 6,37 Kadar abu (Gravimetri, AOAC 1999) Sejumlah sampel hasil analisis kadar air yang telah diketahui bobotnya diabukan dalm tanur bersuhu 600oC selama 6 jam. Kemudian cawan yang telah berisi abu tersebut didinginkan dalam desikator dan ditimbang. Pengabuan contoh dilakukan sampai diperoleh bobot konstan. Kadar abu (%) = bobot abu (g) x100% bobot sampel awal (g) Perhitungan kadar abu Sampel Tepung galendo Hidrolisat protein Bobot awal (g) 0,9948 1,0014 1,0094 0,5000 0,5000 0,5000 Bobot abu (g) 0,0204 0,0198 0,0242 0,0057 0,0066 0,0049 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Kadar abu (%) 2,05 1,98 2,40 1,14 1,32 0,98 Kadar abu rata-rata (%) 2,14 1,15 27 c. Kelarutan (Pedroza-Islas et al. 2000) Sejumlah 0,3 g sampel ditimbang dengan teliti dan ditambahkan 25 ml akuades. Larutan dipanaskan pada suhu 28oC selama 2 jam, kemudian disaring dengan kertas saring Whatman No.40 menggunakan pompa vacum. Filtrat dikeringkan pada suhu 60oC. Setelah kering, cawan tersebut didinginkan di dalam desikator dan ditimbang. Pengeringan contoh dilakukan sampai diperoleh bobot konstan. Kelarutan (%) = bobot bahan terl arut (g) x 100 % bobot bahan awal (g) Perhitungan kelarutan Sampel Tepung galendo Hidrolisat protein Bobot awal (g) 0,3000 0,3003 0,3003 0,3000 0,3000 0,3002 Bobot sampel kering (g) 0,1589 0,1512 0,1437 0,2317 0,2352 0,2292 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Kelarutan (%) 52,97 50,35 47,85 77,23 78,40 76,38 Kelarutan rata-rata (%) 50,39 77,34 28 Lampiran 12 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai konsentrasi substrat Konsentrasi substrat [S] (%) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut (mg/ml) Kontrol Sampel Kenaikan (V) 1,10 3,89 2,79 2,45 6,48 4,03 3,67 8,96 5,30 6,13 11,66 5,53 7,26 12,87 5,61 7,96 13,89 5,93 8,27 14,22 5,94 9,33 15,08 5,74 10,47 16,37 5,89 11,03 17,03 6,01 1/[S] 1/V 1,00 0,50 0,33 0,25 0,20 0,17 0,14 0,13 0,11 0,10 0,358 0,248 0,189 0,181 0,178 0,169 0,168 0,174 0,170 0,167 Lampiran 13 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai konsentrasi enzim Konsentrasi enzim (%) 0,01 0,05 0,10 0,20 0,40 0,60 0,80 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut (mg/ml) Kontrol Sampel Kenaikan 129,55 160,61 31,06 144,37 197,09 52,72 150,92 215,90 64,97 161,18 248,10 86,92 209,06 290,56 81,50 239,55 298,82 59,27 267,48 318,77 5130 Lampiran 14 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai pH pH 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 8,0 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut (mg/ml) Kontrol Sampel Kenaikan 146,93 235,56 88,63 148,07 241,26 93,19 145,79 254,94 109,14 145,51 284,57 139,07 147,79 315,92 168,13 161,75 309,94 148,19 164,60 305,95 141,35 Lampiran 15 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai suhu inkubasi Suhu inkubasi (oC) 55 60 65 70 75 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut (mg/ml) Kontrol Sampel Kenaikan 162,32 240,40 78,08 161,18 248,10 86,92 162,32 259,50 97,18 164,32 269,19 104,87 168,02 264,34 96,32 PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com 29 Lampiran 16 Konsentrasi hidrolisat protein terlarut pada berbagai waktu hidrolisis Waktu hidrolisis Konsentrasi hidrolisat protein terlarut (mg/ml) (menit) Kontrol Sampel Kenaikan 0 15 30 45 60 120 180 240 300 153,77 142,94 151,21 165,46 155,20 170,58 145,51 161,18 158,62 156,91 192,81 235,56 257,50 251,80 269,19 260,07 266,34 260,92 3,13 49,87 84,35 92,05 96,61 98,60 114,56 105,16 102,31 Lampiran 17 Kromatogram HPLC standar asam amino Keterangan : No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Asam amino Asam aspartat Asam glutamat Serin Histidin Glisin Threonin Arginin Alanin Tirosin Metionin Valin Fenilalanin Isoleusin Leusin Lisin Perhitungan : [asam amino] = µmol AA % asam amino = luas puncak sampel luas puncak standar x 0,5 µmol/ml x 5 ml µmol AA x Mr AA x 100 µg sampel PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Luas puncak 458564 476787 537260 438358 474713 521353 484325 437117 417028 339210 502873 358870 447038 399870 229275 30 Lampiran 18 Bahan baku yang digunakan dan produk yang dihasilkan dalam penelitian Enzim refined papain Tepung galendo Filtrat hidrolisat protein Lampiran 19 Alat-alat yang digunakan dalam penelitian waterbath HAAKE Fisons DC 3 Waterbath thermomix B-Braun & Stirer Biiodrive Sentrifuse kokusan H-103 N series Sentrifuse Beckman J2-21M/E PDF created with pdfFactory Pro trial version www.pdffactory.com Spektrofotometer UV-Vis Hitachi U-2000 Spray Dryer