What impact does surface area have on HPLC column performance? Zmiana ciśnienia wstecznego jest jednym z pierwszych sygnałów wskazujących na problemy w analizie chromatograficznej. W związku z tym konieczna jest znajomość normalnego ciśnienia w odniesieniu do wymiarów kolumny, składu fazy ruchomej i natężenia przepływu. Charakterystyczne problemy dotyczące ciśnienia wstecznego można podzielić na następujące kategorie: brak ciśnienia, niskie ciśnienie, wysokie ciśnienie i nieregularne ciśnienie. Źródłem generującym ciśnienie jest pompa LC. Stanowi więc ona główną przyczynę większości problemów dotyczących ciśnienia wstecznego. Bardziej złożone przyczyny problemów dotyczących ciśnienia wstecznego mogą być następujące: 1. nieszczelne uszczelki pompy lub wyciek w systemie 2. zator w kapilarach pompy 3. zablokowany wlot kolumny 4. wybór niewłaściwego rozpuszczalnika 5. pusta przestrzeń w kolumnie 6. pęcherzyki powietrza na linii przepływu brak ciśnienia wstecznego lub jego zbyt wysoki poziom Przyczyna: Pomijając banalne kwestie, główną przyczyną braku ciśnienia lub jego zbyt wysokiego poziomu jest zator w kolumnie lub na linii przepływu. Nieorganiczne sole buforów są najczęstszym powodem tworzenia zatorów w kapilarach i na wlocie kolumny, a nawet wewnątrz porów sorbentu krzemionkowego. Stosowane w wysokich stężeniach lub gdy system LC i kolumny nie są regularnie/odpowiednio czyszczone, może łatwo dojść do zapchania zarówno kapilary, jak i wlotu kolumny. Poza tym, również niektóre anality i matryce próbek mogą gromadzić się przy wlotach kolumn i wewnątrz porów sorbentów krzemionkowych, powodując całkowite zablokowanie kolumny i w efekcie uniemożliwiając przepływ fazy ruchomej. Do takich analitów/próbek można zaliczyć cukry. W warunkach wysokiego stężenia rozpuszczalnika organicznego fazy ruchomej mogą one krystalizować się wewnątrz porów ziarna i całkowicie zablokować przepływ. Czasami skrajnie niepolarne związki lub oleiste matryce, np. niektóre kannabinoidy, mogą silnie wiązać fazy hydrofobowe C8 i C18. Substancje o takiej charakterystyce gromadzą się na kolumnie i mogą powodować wysokie ciśnienie zwrotne. Białka lub niektóre związki biologiczne o dużej masie cząsteczkowej mogą również powodować wysokie ciśnienie wsteczne lub zatory, jeśli nie zostaną usunięte z matrycy próbek przed nastrzykiem. Jeżeli jednak występują w formie analitu, należy je usunąć z kolumny po nastrzyku. Mikroskopowy obraz zanieczyszczonego sorbentu krzemionkowego wewnątrz zanieczyszczonej kolumny Górna ilustracja przedstawia czystą frytę; dolna ilustracja przedstawia zanieczyszczoną frytę wlotu kolumny Rozwiązanie: Najlepszym sposobem usuwania buforu i związków, które mogą się krystalizować i odkładać w kapilarach i porach kolumn, jest czyszczenie wodą klasy HPLC w podwyższonej temperaturze. Podczas czyszczenia systemu lub kolumny przepływ powinien być zmniejszony w celu zapewnienia wystarczającej ilości czasu, aby rozpuszczalnik do przemywania mógł rozpuścić zanieczyszczenia lub usunąć je, oddziałując z nimi. W zależności od średnicy kolumn można stosować następujące natężenia przepływu: dla 4,6/4,0 mm = 0,5 ml/min, 3,0 mm = 0,3 ml/min, 2,1 mm = 0,2 ml/min W celu usunięcia zanieczyszczeń, które mogą osadzać się na frycie wlotowej kolumny, wymagane jest przepłukiwanie wsteczne. Istnieje jednak bezwzględny warunek, który musi zostać spełniony podczas wstępnego przepłukiwania wstecznego kolumny – należy odłączyć detektor od kolumny. W przeciwnym razie zanieczyszczenia eluujące z (fryt wlotowych) kolumny osadzą się w celce przepływowej lub interfejsie detektora. Części te są zdecydowanie trudniejsze do oczyszczenia. Przynajmniej na początkowych etapach przepłukiwania wstecznego kolumny należy odłączyć detektor od linii przepływu. Zarówno bufory, jak i cukry są łatwo rozpuszczalne w wodzie, a zatem można je usunąć z kapilar i kolumny Idealnym rozwiązaniem będzie zapewnienie wysokiej temperatury, która ułatwi rozpuszczenie tych związków w wodzie, tak aby można je było łatwo usunąć. Polarne i stabilne w warunkach 100% wodnych aromatyczne fazy fenylowe, fazy wykluczania jonowego, fazy jonowymienne i fazy GFC-SEC można czyścić za pomocą 100% wody klasy HPLC. Fazy hydrofobowe, takie jak C8, C18, fenyl-heksyl, polimerowa faza odwrócona, fazy GPC-SEC i fazy chiralne na bazie polisacharydów nigdy nie powinny być czyszczone 100% wodą, ponieważ istnieje duże prawdopodobieństwo rozpadu hydrofobowego lub rozszczepienia związanego liganda. Ponieważ faza odwrócona jest najczęściej stosowaną w chromatografii, omówimy kilka punktów dotyczących odpowiednich procedur czyszczenia kolumn RP w celu uniknięcia i rozwiązania problemów związanych z wysokim lub zerowym ciśnieniem podczas analizy. Należy pamiętać, że bufory i kilka „agresywnych” dodatków do fazy ruchomej powodują uszkodzenia kolumny, jednak jej główną przyczyną są złożone matryce próbek i analitów. Producenci kolumn do przygotowania fazy ruchomej zalecają stosowanie soli i rozpuszczalników klasy HPLC lub „do MS”, a także stosowanie filtrów membranowych 0,2µ do filtrowania fazy ruchomej po jej przygotowaniu. Dzięki temu można łatwo uniknąć zanieczyszczenia pochodzącego z fazy ruchomej lub jest ono znikome. Rozsądnym byłoby więc, aby rozważyć rozpuszczalnik próbki (bez buforów i agresywnych dodatków) do celów czyszczenia kolumny. Rozpuszczalnik próbki można uznać za najlepszy roztwór do czyszczenia kolumn. Roztworami pierwszego wyboru do czyszczenia kolumn powinny być różne kombinacje wody, metanolu i ACN, w zależności od składu fazy ruchomej i rozcieńczalnika próbki. Do usuwania zanieczyszczeń niepolarnych z kolumn można użyć wielu różnych rozpuszczalników, takich jak alkohol izopropylowy (IPA), chlorek metylenu, heksan i heptan itp. Jednak w razie stosowania tych rozpuszczalników w kolumnach LC zaleca się po skończonym myciu przemycie kolumny wodą z metanolem, aby usunąć z niej wszelkie pozostałości silnych rozpuszczalników. W celu usunięcia białka, jeśli wstępne płukanie wodą i metanolem nie pomaga, należy zastosować płukanie gradientowe z użyciem 0,1% TFA w wodzie i 0,1% TFA w ACN. W przypadku silniejszego zanieczyszczenia fazy stacjonarnej białkami, jako rozpuszczalników do przemywania można użyć tetrahydrofuranu (THF) lub sulfotlenku dimetylu (DMSO). Innymi rozpuszczalnikami, które mogą skutecznie usunąć białka z kolumn, są chlorowodorek guanidyny i mocznik. Jednak w razie stosowania tych rozpuszczalników w kolumnach LC zaleca się przemycie kolumny wodą z metanolem, aby usunąć z niej wszelkie pozostałości tych rozpuszczalników.
