TEMA-1.pdf Apuntes_Biotec Virología 2º Grado en Biotecnología Facultad de Ciencias Experimentales Universidad Pablo de Olavide Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-3969360 VIRUS Y BIOTECNOLOGÍA Los virus son un tipo de organismo muy característico, ya que fuera de una célula es un simple conglomerado de proteínas y ácidos nucleicos, mientras que en el interior de una célula es capaz de replicarse y dar lugar a nuevas partículas que infectarán otras células, ya sean eucariotas (vertebrados, invertebrados, plantas y hongos) o procariotas (bacterias y arqueas). El estudio de éstos ha sido muy útil a lo largo de la historia: tipado de bacterias, fuente de obtención de enzimas (T4 pol. Y T7 lig.), insecticidas, antibacterianos (terapia fágica), anticancerígenos, vectores virales, fabricación de vacunas, terapia génica y descubrimiento de las CRISPR/Cas VIRUS A LO LARGO DE LA HISTORIA • 3700 AC: Evidencia del virus de la poliomielitis (poliovirus) en un grabado del antiguo Egipto. • S. XVII: El fnal de la generación espontánea con el microscopio de van Leeuwenhoek e inicio de la microbiología (animáculos). • S. XVIII: La primera vacuna, creada por Edward Jenner. Se administró suero de vaca infectada con viruela vacuna a humanos, haciendo de esta forma que los humanos no pudieran ser infectados por el virus de la viruela humana. • S. XIX: A comienzos de este siglo, la teoría del germen de Koch demuestra la presencia de microbios en el aire pero no reconocía la existencia de virus. Sin embargo, Iwanowski y Beijerinick fltrar líquidos que producían enfermedades con un fltro capaz de separar bacterias, se veía que el líquido fltrado también podía infectar. Por lo tanto, se pensaba que la enfermedad se producía por una sustancia líquida (teoría del fuido). • S. XX: La primera evidencia de virus vino de la mano del poliovirus, el cual al ser muy grande podía ser fltrado. Renato Dulbecco desarrolló el denominado plaque assay o ensayo de calvas, en el que se aplicaban diluciones del líquido fltrado que contenía partículas capaces de lisar células. • 1952: El experimento de Hershey y Chase. Este experimento fue el que permitió defnir la molécula en la que estaba contenida la información en los virus. Consistía en el cultivo de un mismo tipo de virus en dos medios distintos, uno conteniendo una especie radiactiva de azufre, 35S, y otro conteniendo una especie radiactiva de fósforo, 32P. El azufre formaría parte de las proteínas y el fósforo forma parte del esqueleto carbonado del DNA/RNA que contenga el virus. Después de cultivar los virus, los mezclamos con bacterias para que se adsoban y las inyecten, agitamos y centrifugamos para separar fagos y bacterias. En el sobrenadante se quedan los fagos y en el pellet las bacterias. Observamos que, en sus respectivos tubos, el azufre se ecuentra en el sobrenadante y el fósforo en el pellet. Aducimos que la información que se transmite al interior celular es en forma de DNA/RNA. Además, los nuevos viriones de éstos contienen material radiactivo. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. TEMA 1: INTRODUCCIÓN A LA VIROLOGÍA a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-3969360 Una vez hecho esto, se indujo la infección por parte del virus a una planta de tabaco. La infección tiene lugar, se extraen los virus y se analizan. Se observó que en el cultivo 1 teníamos ahora proteínas de tipo B, y en el cultivo 2 proteínas de tipo A. Con esto se dedujo que la molécula que transportaba la información era el RNA. CARACTERÍSTICAS GENERALES DE LOS VIRUS Los virus son entidades bioquímicamente más simples que una célula eucariota o procariota. Para reproducirse utilizan una estrategia de ensamblaje, en lugar de división celular. Para ello, al carecer de la información genética y orgánulos necesarios para generar energía metabólica o síntesis de proteínas, dependen de una célula huésped que les provea de toda la maquinaria necesaria (parásitos intracelulares obligados). Debido a su necesidad de un huésped, solo pueden cultivarse in vitro en otras células. Son extraordinariamente pequeños (24-300 nm), por lo que no son visibles a microscopio electrónico y atraviesan la mayoría de fltros de esterilización de bacterias. Además, son cristalizables; esto es, tienden a formar una estructura donde las fuerzas iónicas se encuentren compensadas y las partículas estén ordenadas en una pauta tridimensional y periódica. Fuera de una célula huésped no se consideran seres vivos, sino que son ensamblajes de compuestos químicos inertes, partículas. Sin embargo, al entrar en una célula huésped si pueden considerarse seres vivos. Tienen una alta tasa de mutación de su material genético, lo que no permite caracterizarlos por características genéticas concretas. Existe mayor diversidad biológica dentro de los virus que en el resto de los reinos bacteriano, animal y plantas juntos. CLASIFICACIÓN DE LOS VIRUS Debido a la heterogeneidad de estos seres, se pueden clasifcar atendiendo al tipo de ácido nucleico, morfología de la cápsida, relaciones flogenéticas, criterios serológicos, naturaleza del huésped que infectan, criterios epidemiológicos y criterios históricos. Destaca la clasificación de Baltimore, que se basa en la relación que se establece entre el genoma y el mensajero que se traduce, ya que como sabemos para producir una proteína se requiere la transcripción del DNA a mRNA. El criterio, por tanto, asienta su base en la forma que tienen los virus de llegar al mRNA necesario para la síntesis de proteínas, el +mRNA. Tenemos 7 grupos, de los cuales el último es el “cajón desastre”, en el cual introducimos todos aquellos que no podemos clasifcar. ¿Quieres una MÁXIMA concentración y ENERGÍA? ¡Pincha aquí! Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. • 1956: El experimento de Gierer y Schramm. Este experimento consiste en que se produce un tratamiento de dos cepas del virus del mosaico del tabaco con urea, produciendo la desnaturalización de las subunidades y la separación de estas y el RNA de cada virus. Después de esto, se realizó el reensamblamiento de cada RNA con las proteínas de la cápside del otro virus, obteniendo dos cultivos mezclados entre proteínas y RNA: proteínas A y RNA B, y proteínas B y RNA A. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-3969360 1. Virus que contienen una doble hélice de DNA (dsDNA). Da lugar directamente al +mRNA. 3. Virus con doble cadena de RNA (dsRNA). Dan lugar directamente a +mRNA. 4. Virus con cadena simple de RNA (+RNA). Replican esta cadena, dando lugar a –RNA, que dará lugar mediante replicación a las copias de +mRNA. 5. Virus de cadena simple de RNA (-RNA). Se replica directamente a +mRNA. 6. Virus con cadena simple de RNA (+RNA). Esta cadena se retrotranscribe mediante la retrotranscriptasa a una cadena de –DNA, que se replica formando dsDNA, que se transcribe a +mRNA. Es importante conocer también la clasificación del ICTV (International Committee on Taxonomy of Viruses), en función del genoma que presenta la partícula viral. 1. Virus DNA de doble cadena 6. Virus RNA y DNA con transcripción inversa 2. Virus DNA de cadena sencilla 7. Agentes subvirales (viroides) 3. Virus RNA de cadena doble 8. Agentes subvirales (satélites y priones) 4. Virus RNA de cadena negativa 9. Virus pendientes de clasifcación 5. Virus RNA de cadena positiva MANIPULACIÓN DE VIRUS Para tratar virus procariotas (mayoría) sólo necesitamos un medio rico LB. Para tratar virus eucariotas necesitamos cultivos más delicados, más lentos y más específcos que han de contener una fuente de energía, aminoácidos esenciales, vitaminas, cofactores metálicos en trazas, lípidos, solución salina, tampón, antibióticos/antifúngicos y suero (anticuerpos, colágeno, fbronectina, factores de crecimiento y hormonas). DETECCIÓN DE VIRUS • Unidades formadoras de calvas o plaque assay Este es un método en el que se aplican disoluciones seriadas de una solución de virus a una población sensible, cultivada en césped en una placa con nutrientes, ya sea de eucariotas o procariotas. Al diluir la muestra de virus disminuimos la cantidad de virus, por lo que aseguramos que no vamos a acabar con toda la población de células cultivadas. Es un método muy efcaz, ya que nos permite detectar el tipo de virus, debido a su especifcidad de infección, además de ¿Quieres una MÁXIMA concentración y ENERGÍA? ¡Pincha aquí! Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. 2. Virus con una hélice simple de DNA (+DNA). Este ha de replicarse para formar la doble hélice, y después dar lugar al +mRNA. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-3969360 • Lesiones foliares Se manifesta como lesiones (manchas o agujeros) en las hojas y son producidas por la infección de un virus que puede haber sido transmitido por otro organismo (una mosca). Esto nos permite visualizar y detectar la infección. Se pueden aprovechar para benefcio económico (los tulipanes adquieren un gradiente de tonalidades). • Pústulas en la membrana corioalantoidea (MCA) Esta es una herramienta muy potente en biotecnología, ya que es un sistema que permite la producción masiva de virus animales en huevos de pollo, no necesitando el uso de líneas celulares establecidas. Se inyecta el virus en la MCA para amplifcar la cantidad de ellos, tras 14 días de incubación, dependiendo del tipo de virus y de las características del medio. También se pueden inocular virus en otras partes del huevo. • Hemaglutinación Es una técnica semicuantitativa (cuántos hay) que consiste en la aglutinación de eritrocitos por proteínas virales, debido a la presencia de proteínas en la superfcie de las partículas virales que reconocen a receptores de la membrana del eritrocito. Depende de la cantidad de virus adsorbidos a la célula, a mayor cantidad, mayor precipitación. Se hacen diluciones seriadas de los virus y los ponemos en contacto con una misma cantidad de eritrocitos, no siempre siendo estos infectivos (funcionan virus útiles o atenuados). Se obtienen unidades de hemaglutinación por ml (UHA/mL). Es sencillo, barato y rápido, pero no muy sensible. • Microscopía electrónica Es una técnica que permite la visualización directa de las partículas virales en un preparado de virus. Esta técnica no permite diferenciar entre partículas infectivas y no infectivas, además de requerir unas preparaciones muy purifcadas con mucha cantidad de virus. Podemos obtener sensación de relieve mediante el uso de partículas de platino. • Microscopía de fuorescencia y confocal En esta se permite observar distintas fases o capas del cultivo. El hecho de añadir fuorescencia permite diferenciar la cromatina (azul) del citoplasma (rojo) y las partículas virales (verde). En el ejemplo vemos el paso de una infección de virus VIH desde una célula dendrítica a un linfocito T sin infectar. Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. cuantificar las partículas infectivas, ya que solo formarán colonias aquellas que sean capaces de infectar. Para saber el número total de partículas infectivas en la muestra fnal, simplemente multiplicamos el u.f.p. obtenido por el factor de dilución empleado. a64b0469ff35958ef4ab887a898bd50bdfbbe91a-3969360 • Inmunoensayo enzimático (ELISA) • Cuantificación de proteína viral por Western Blot • Determinación de ácidos nucleicos virales por Southern/Northern Blot o PCR/qPCR ¿Quieres una MÁXIMA concentración y ENERGÍA? ¡Pincha aquí! Reservados todos los derechos. No se permite la explotación económica ni la transformación de esta obra. Queda permitida la impresión en su totalidad. Basado en la determinación cuantitativa de antígenos virales contra los que se dispone de anticuerpos específcos. La muestra viral se dispone sobre un soporte sólido, en el que van a establecerse las reacciones antígenoanticuerpo seguidas de un sistema de revelado y cuantifcación visual.