эпидемиология
АпРель N04 (277)
ЗНиСО
35
УДК 579.843.1:575.25:612.017.4:002.5/6
АНАЛИЗ ВНУТРИВИДОВОЙ КОНКУРЕНЦИИ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE
С ПОМОЩЬЮ INDEL-МАРКЕРОВ
С.О. Водопьянов, А.С. Водопьянов, И.П. Олейников, Л.К. Лысова, С.В.Титова
ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт»
Роспотребнадзора, г. Ростов-на-Дону, Россия
При анализе коллекции из 16 штаммов был отобран INDEL-маркер «VC2429» позволяющий
дискриминировать токсигенные и атоксигенные штаммы Vibrio cholerae. Атоксигенные
штаммы образовывали амплификат размером 100 п.о., в то время как токсигенные формировали амплификат размером 84 п.о. Изученные 13 ctx+tcpA+-штаммов по устойчивости к ингибирующей активности атоксигенного штамма разделились на две группы: подавляемые и
штаммы, способные сосуществовать со штаммом-антагонистом. На наш взгляд, наибольшую
опасность при попадании в водоемы представляют штаммы второй группы, способные противостоять ингибирующей активности ctx-tcpA--штамма.
Ключевые слова: холерный вибрион, конкуренция, типирование, INDEL.
S.O. Vodopyanov, A.S. Vodopyanov, I.P. Oleynikov, L.K. Lysova, S.V. Titova ‰ THE ANALYSIS
OF INTRASPECFIC COMPETITION OF VIBRIO CHOLERAE STRAINS BY MEANS
OF INDEL-MARKERS ‰ Rostov-on-Don Anti-Plague Scientific Research Institute of
Rospotrebnadzor, Rostov-on-Don, Russia.
In the course of analysis of a collection including 16 Vibrio cholerae strains an INDEL-marker
«VC2429» had been selected which allowed to discriminate between toxigenic and non-toxigenic strains.
Non-toxigenic strains yielded 100 bp amplicon while toxigenic formed 84 bp amplicon. The 13
ctx+tcpA+ toxigenic strains studied were divided into two groups according to their resistance to
inhibitory activity of a non-toxigenic strain – suppressible and able to co-exist with the antagonist
strain. The strains of the second group, resistant to the inhibitory activity of ctx-tcpA- strains, are likely
to represent particular danger when they contaminate water reservoirs.
Key words: Vibrio cholera, intraspecfic competition, genotyping, INDEL.
Эпидемиологический надзор за холерой, реализуемый в Российской Федерации, включает систему мер, направленных на своевременное выявление завозных и местных случаев холеры [1].
Эта задача осуществляется путем слежения за
циркуляцией холерных вибрионов в объектах
окружающей среды путем целенаправленного
исследования воды поверхностных водоемов.
За последние десятилетия на территории Российской Федерации в пробах воды поверхностных водоемов регулярно обнаруживают атоксигенные штаммы холерных вибрионов, что
указывает на их стабильное сохранение в окружающей среде [2–5]. Выделение токсигенных культур из воды и от людей носит единичный и спорадический характер, причем практически все случаи являются завозными [4, 5].
Значимость атоксигенных штаммов холерных
вибрионов, циркулирующих в поверхностных
водоемах, не установлена. Высказано предположение о возможности горизонтального обмена генетической информацией [6], что может
приводить к появлению новых форм возбудителя. Практически не исследована их возможная роль во внутривидовой конкуренции, приводящей к последующему исчезновению токсигенных штаммов из воды водоемов. На настоящее время имеются лишь единичные работы такого плана, например, описан результат
изучения взаимодействия вибрионов, основанный на анализе совместной инкубации штаммов, различающихся по чувствительности к
антибиотикам [7].
Вместе с тем проведение полномасштабной
работы по оценке внутривидовой конкуренции
между токсигенными и атоксигенными штаммами Vibrio cholerae невозможно без простых и
точных методов, способных уверенно дифференцировать в смеси различные штаммы. Один
из таких перспективных подходов базируется
на недавно разработанном методе молекулярного типирования на основе INDEL-маркеров,
которые представляют собой вставки-делеции
(insertions/deletions) коротких фрагментов ДНК [8].
Использование для этой цели метода VNTR-типирования [4, 5] на наш взгляд не вполне уместно, поскольку для каждого штамма вибрионов характерна уникальная VNTR-формула,
что требует специального подбора праймеров
для каждой изучаемой пары праймеров.
Цель исследования – разработка способа
быстрого определения внутривидовой ингибирующей активности холерных вибрионов на
основе INDEL-маркеров.
Материалы и методы. В работе использовали 13 ctx+tcpA+-штаммов, выделенных на территории Российской Федерации
в период 2000–
2012 годов и три ctx–tcpA–-штамма вибиронов
изолированных при проведении мониторинга
на холеру из воды открытых водоемов в 2014 г.
Штаммы хранили в лиофильном состоянии.
Для анализа внутривидовой конкурентной
активности культуры изучаемых штаммов в
соотношении 1 : 1 смешивали во флаконе со
стерильной водопроводной
водой до конечной
концентрации каждого 104 и инкубировали при
25 °С. В указанные интервалы времени (сразу
на этапе внесения в среду культивирования,
пятые и десятые сутки) отбирали пробы, проводили два пассажа через 1 %-ю пептонную
воду в течение 3 ч при 37 °С. Для анализа отбирали 0,5 мл пробы, которые исследовали в ПЦР.
Для генотипирования штаммов холерного
вибриона использовали INDEL-маркер, нахо-
ЗНиСО
АпРель N04 (277)
дящийся в промоторной области гена VC2429, штаммов. Таким образом, разработанный метод
кодирующего цинк-связывающий белок. Для вы- ПЦР с праймерами к INDEL-маркеру «VC2429»
явления использовали авторские праймеры (5'-3') позволял в одной пробирке определять относиatgtatttttggttcgcaacatt и ctcaagatatcgcctttgatttg.
тельное соотношение в смеси каждого из двух
Культивирование на питательных средах, изучаемых ctx–tcpA–- и ctx+tcpA+-штаммов.
выделение ДНК, постановку ПЦР и учет реРазработав несложный метод определения
зультатов проводили по методикам, описанны- соотношения ctx–tcpA–- и ctx+tcpA+-штаммов в
ми ранее [4, 5].
ПЦР с одной парой праймеров, мы приступили
Соотношение ДНК ctx–tcpA–- и ctx+tcpA+- к изучению феномена внутривидовой конкуренштаммов определяли в ПЦР со специфически- ции. В первой серии экспериментов мы устаноми праймерами к INDEL-локусу VC2429 по вили, что три исследованных ctx–tcpA–-штамма
интенсивности полос амплификатов на элек- Р-19645, Р-19666 и Р-19670, выделенные из вотрофореграмме. Кластерный анализ и построе- ды поверхностных водоемов России в 2014 г.,
ние дендрограммы проводили с помощью про- обладают различной ингибирующей активнограммы GeneExpert (ФКУЗ Ростовский-на-Дону стью в отношении токсигенных штаммов. Пропротивочумный институт Роспотребнадзора, цесс занимал от пяти до десяти дней. НаибольРостов-на-Дону, Россия).
шей ингибирующей активностью обладал штамм
Результаты исследования. При анализе Р-19670, выделенный в августе 2014 г. из реки
INDEL-маркеров, входящих в состав базы дан- Неман. Этот штамм был отобран для дальнейных «Гены, позволяющие дифференцировать ших экспериментов.
токсигенные и нетоксигенные штаммы Vibrio
В следующей серии экспериментов в парных
cholerae и проводить внутривидовое типирова- опытах определяли взаимодействие ctx–tcpA–-штамние» [8], на подобраной коллекции штаммов ма Р-19670 с 13 ctx+tcpA+-штаммами. Для додля последующего анализа был отобран полнительного контроля подавления размножеINDEL-маркер «VC2429», позволяющий быст- ния вибрионов после инкубации в исследуемый
ро и однозначно дифференцировать токсиген- интервал времени с помощью ПЦР анализированые и атоксигенные штаммы холерного виб- ли не только саму водопроводную воду, но и пеприона с использованием одной пары прайме- тонную воду после двух последовательных пасров. Так три ctx–tcpA–-штамма образовывали сажей через пять и десять суток совместного инамплификат размером 100 п.о., в то время как кубирования (табл. 1). Изученные ctx+tcpA+-штамвсе 13 ctx+tcpA+-штаммов из-за делеции участ- мы по устойчивости к ингибирующей активнока в 16 нуклеотидов формировали амплификат сти атоксигенного штамма разделились на две
размером 84 п.о., что позволяет легко диффе- группы: подавляемые ctx-штаммом при совмеренцировать делеционный вариант с помощью стной инкубации и штаммы резистентные, т. е.
ПЦР с одной парой праймеров и последующего сохраняющие свое количество на уровне штамма-антагониста.
электрофореза в полиакриамидном геле.
В первую группу «подавляемых» ctx+tcpA+При постановки ПЦР со смесью ДНК ctx–tcpA–+
+
и ctx tcpA -штаммов в различном соотношении штаммов вошло восемь культур, при этом три
было установлено, что амплификация успешно штамма были выделены из воды, а пять – от
проходит с обеих матриц (с делецией и без человека. Группа «устойчивых» штаммов была
нее), а различие в молекулярной массе ампли- представлена пятью штаммами (четыре выдеконов позволяет надежно детектировать даже лены от человека и один – из воды). Таким обминорное количество аллеля INDEL-ген. Прак- разом, особой связи между устойчивостью к
тически стабильно выявлялось присутствие да- внутривидовой конкуренции и источником выже 10 % минорного аллеля в смеси ДНК двух деления штамма вибрионов не обнаружено.
Таблица 1. Распределение ctx+tcpA+-штаммов V. cholerae по устойчивости к ингибирующему
воздействию ctx–tcpA–-штаммом при совместной инкубации
Группа ctx+-штаммов
Подавляемые ctx-штаммом при
совместной инкубации
Устойчивые к воздействию ctxштамма при совместной инкубации
Штамм
18252
18588
18826
18847
18899
19188
19187/2
19241 (301)
18368
18746
19191
18895
6878
Год выделения
2000
2003
2005
2005
2006
2010
2010
2011
2001
2004
2010
2005
2012
Источник выделения
сточная вода
речная вода
клинический
речная вода
клинический
клинический
клинический
морская вода
речная вода
клинический
клинический
клинический
клинический
эпидемиология
36
ЗНиСО
37
эпидемиология
АпРель N04 (277)
Обозначения: «–» штамм подавляется клетками ctx–tcpA–-штамма Р-19670,
* штамм резистентен к внутривидовой ингибирующей активности
Рис. 1. Фрагмент дендрограммы распределения штаммов V. cholerae по анализу результатов полногеномных
сиквенов на основе единичных нуклеотидных замен в 1 700 открытых рамках считывания
При анализе дендрограммы, построенной с
помощью программы «GeneExpert» на основании единичных нуклеотидных замен в 1 700 открытых рамках считывания 43 штаммов Vibrio
cholerae, обнаружено, что три «резистентных»
штамма (отмечены звездочкой) сгруппированы в
одной области, при этом штаммы 19191 и 6879
относятся к группе «гаитянских» штаммов, вызвавших эпидемию на о. Гаити. При этом «подавляемые» штаммы сгруппированы в других
участках дендрограммы. Этот факт заслуживает дальнейшего изучения и на наш взгляд может указывать на существование каких-то
групп генов, обусловливающих «резистентный» или «подавляемый» генотип вибрионов.
Тонкая природа механизма внутривидовой
ингибирующей активности токсигенных и атоксигенных вибрионов на данный момент неясна.
Возможно, это событие является частью общебиологической закономерности конкуренции –
взаимодействия близкородственных микроорганизмов, стремящихся получить один и тот же
пищевой субстрат. Нельзя исключить и возможность продукции конкурирующими штаммами метаболитов или вибриоцинов, подавляющих развитие другой популяции [9, 10]. С
другой стороны, у холерных вибрионов «убийство соседей» может происходить при помощи
«секреторной системы типа VI» (T6SS) – молекулярного комплекса, составленного из белков
вирусного происхождения, при помощи которого вибрионы-убийцы разрушают оболочку
клеток-реципиентов и вводят в них токсичные
вещества [11].
Выводы. Таким образом, на основании проделанной работы обнаружена гетерогенность
ctx+tcpA+-штаммов холерного вибриона по способности планктонной формы конкурировать с
ctx–tcpA–-штаммом. Способность токсигенных
штаммов вибрионов противостоять внутривидовой конкуренции может иметь большое биологическое значение, при этом, на наш взгляд,
наибольшую опасность при попадании в водоемы представляют штаммы первой группы,
способные противостоять ингибирующей активности ctx–tcpA–-штамма. Разработанный несложный метод оценки внутривидовой конкурентной активности в ПЦР с одной парой
праймеров также может быть использован для
изучения возможного взаимодействия вибрионов в составе биопленок. Задача облегчается
тем, что в последнее время разработан удобный
лабораторный метод моделирования формирования биопленок холерными вибрионами [12].
ЛИТЕРАТУРА
1. Москвитина Э.А. Современные тенденции в развитии
седьмой пандемии холеры / Э.А. Москвитина // Проблемы особо опасных инфекций. 2008. № 1. С. 22–26.
2. Онищенко Г.Г. и др. Холера в начале XXI века
/ Г.Г. Онищенко, Ю.М. Ломов, Э.А. Москвитина [и др.]
// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005. № 3. С. 44–48.
3. Москвитина Э.А. и др. Эпидемиологические особенности холеры на современном этапе седьмой пандемии
/ Э.А. Москвитина, А.Б. Мазрухо, О.А. Арешина [и др.]
// Эпидемиология и инфекционные болезни. 2014. Т. 19.
№ 4. С. 44–49.
4. Ежова М.И. и др. Холерные вибрионы O1 серогруппы,
выделенные из водных объектов Ростова-на-Дону в ходе
мониторинга в 2008–2012 гг. / М.И. Ежова, В.Д. Кругликов, А.С. Водопьянов [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2013. № 4. С. 56–59.
АпРель N04 (277)
5. Водопьянов А.С. и др. VNTR-генотипирование штаммов Vibrio cholerae, выделенных из объектов внешней
среды на территории Российской Федерации в 2012 году
/ А.С. Водопьянов, А.Б. Мазрухо, С.О. Водопьянов [и др.]
// Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2014. № 2, С. 46–51.
6. Borgeaud S. et al. The type VI secretion system of Vibrio
cholerae fosters horizontal gene transfer / S. Borgeaud,
L.C. Metzger, T. Scrignari, M. Blokesch // Science. 2015.
Vol. 347 (6217) P. 63–67.
7. Paul K. et al. Competitive Growth Advantage of Nontoxigenic Mutants in the Stationary Phase in Archival Cultures
of Pathogenic Vibrio cholerae Strains / K. Paul, A. Ghosh,
N. Sengupta, R. Chowdhury // Infection and immunity.
2004. Vol. 72, № 9. Р. 5478–5482.
8. Водопьянов А.С. и др. Свидетельство о государственной регистрации базы данных № 2014620308. Гены,
позволяющие дифференцировать токсигенные и нетоксигенные штаммы Vibrio cholerae и проводить
внутривидовое типирование / А.С. Водопьянов, С.О. Водопьянов, Б.Н. Мишанькин, И.П. Олейников. 2014.
9. Одум Ю. Экология: Т1-2. / Пер. с англ. М.: Мир, 1986.
Т. 1. 326 с. Т. 2. 376 с.
10. Экология микроорганизмов: Учеб. для студ. вузов
/ Под ред А.И. Нетрусова. М.: Издательский центр
«Академия», 2004. 272 с.
11. Basler M. et al. Type VI secretion requires a dynamic contractile phage tail-like structure / M. Basler, M. Pilhofer,
G.P. Henderson [et al.] // Nature. 2012. Vol. 483(7388).
P. 182–186.
12. Решение о выдаче патента на изобретение от
25.05.2015 по заявке № 2014121905/10(035478) Способ
моделирования образования биопленок холерных вибрионов. Авторы Титова С.В., Кушнарева Е.В.
Контактная информация:
Водопьянов Алексей Сергеевич,
тел.: +7 (863) 240-22-66,
e-mail: alexvod@gmail.com
Contact information:
Vodopyanov Alexey,
рhone: +7 (863) 240-22-66,
e-mail: alexvod@gmail.com
ØØ
Ø
эпидемиология
ЗНиСО
38