LAPORAN PRAKTIKUM NUTRIGENOMIK
“UJI SDS PAGE”
Dosen Pengampu : Dr. Diana Nur Afifah, S.TP., M.Si.
Disusun oleh :
Rizky Noer Aurelia
22030119140133
PROGRAM STUDI S-1 GIZI
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
SEMARANG
2022
PROGRAM STUDI ILMU GIZI
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS DIPONEGORO
SEMARANG
METODE SDS PAGE
Rizky Noer Aurelia, 22030119140133
Kata kunci: Protein, SDS PAGE, Separating gel, Stacking gel, Commasie Brilliant Blue
Jumlah kata: 2530
Abstrak
Protein merupakan makromolekul yang terbentuk dari gabungan asam amino-asam amino yang
mengandung atom nitrogen, karbon, hidrogen dan oksigen, yang dihubungkan oleh ikatan peptida.
Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE) adalah teknik untuk
memisahkan rantai polipeptida pada protein berdasarkan kemampuannya untuk bergerak dalam arus
listrik, yang merupakan fungsi dari panjang rantai polipeptida atau berat molekulnya. Hal ini dicapai
dengan menambahkan deterjen SDS dan pemanasan untuk merusak struktur tiga dimensi pada
protein dengan terpecahnya ikatan disulfide yang selanjutnya direduksi menjadi gugus sulfidihidril.
SDS akan membentuk kompleks dengan protein dan kompleks ini bermuatan negatif karena gugusgugus anionik dari SDS. Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan
memurnikan suatu makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan berat
molekul. Terdapat gel yaitu terdiri dari stacking gel dan separating gel. Dari hasil running
elektroforesis sampel gambar 2 dan 4, dapat dilihat hanya pada sampel terasi dan cincalok yang
menunjukkan adanya pita protein. Berdasarkan hasil running dengan marker dual color, terlihat
sebanyak 4 pita pada sampel terasi dan 7 pita pada sampel cincalok. Berdasarkan hasil running
dengan marker dual color dan marker unstained, terlihat hanya sampel terasi dan cincalok yang
menunjukkan adanya pita protein sedangkan sampel petis, kecalo, terasi juwana, dan rusip tidak
terlihat adanya pita protein yang kemungkinan terjadi karena perubahan sifat pada protein tersebut.
1
PENDAHULUAN
Protein merupakan makromolekul yang terbentuk dari gabungan asam amino-asam amino yang
mengandung atom nitrogen, karbon, hidrogen dan oksigen, yang dihubungkan oleh ikatan peptida.(1)
Pengertian lain terkait protein yaitu merupakan senyawa organik kompleks dengan bobot molekul
tinggi. Protein juga merupakan suatu polimer yang terdiri dari monomer-monomer asam amino yang
dihubungkan dengan ikatan peptida. Protein memiliki banyak fungsi diantaranya sebagai enzim,
hormon dan antibodi. Di alam, bentuk protein spesifik untuk suatu fungsi. Oleh karena itu agar suatu
polipeptida yang baru dibentuk siap menjadi protein yang berfungsi secara biologis dan mampu
mengkatalisis suatu reaksi metabolik, menggerakkan sel, atau makromolekul, polipeptida tersebut
harus mengalami pelipatan membentuk susunan tiga dimensi tertentu atau konformasi.(2)
Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE) adalah teknik untuk
memisahkan rantai polipeptida pada protein berdasarkan kemampuannya untuk bergerak dalam arus
listrik, yang merupakan fungsi dari panjang rantai polipeptida atau berat molekulnya. Hal ini dicapai
dengan menambahkan deterjen SDS dan pemanasan untuk merusak struktur tiga dimensi pada
protein dengan terpecahnya ikatan disulfide yang selanjutnya direduksi menjadi gugus sulfidihidril.
SDS akan membentuk kompleks dengan protein dan kompleks ini bermuatan negatif karena gugusgugus anionik dari SDS.(3)
Elektroforesis merupakan teknik yang digunakan untuk memisahkan dan memurnikan suatu
makromolekul khususnya protein dan asam nukleat berdasarkan perbedaan berat molekul.
Elektroforesis gel adalah teknik yang paling sering digunakan di laboratorium untuk analisis protein
dan DNA. Teknik ini menggunakan prinsip elektroforesis zona dimana molekul protein bermigrasi
pada medium gel yang direndam dengan larutan penyangga di bawah pengaruh medan listrik. Prinsip
kerja elektroforesis gel dimulai saat makromolekul yang bermuatan listrik ditempatkan pada medium
berisi tenaga listrik. Molekul-molekul tersebut bermigrasi menuju kutub positif atau kutub negatif
berdasarkan muatan yang terkandung di dalamnya. Molekul-molekul yang bermuatan negatif (anoda)
akan bergerak menuju kutub positif (katoda), sedangkan molekul-molekul yang bermuatan positif
(katoda) akan bergerak menuju kutub negatif (anoda). Elektroforesis gel memisahkan molekul DNA
menjadi pita-pita yang masing-masing terdiri atas molekul DNA dengan panjang yang sama. Molekul
DNA bermigrasi melalui pori-pori kecil yang terbentuk dalam padatan gel.(4) Gel ini terdiri dari
stacking gel dan separating gel. Separating gel dibuat dengan mencampurkan semua bahan kecuali
ammonium persulfat (APS) dan tertrametiletilen diamina (TEMED), kemudian didegas selama 10
menit. APS dan TEMED ditambahkan, dikocok sebentar kemudian dimasukkan dalam plate dan
dibiarkan 10-30 menit sampai gel mengeras. Stacking gel dibuat dengan cara yang sama tanpa
didegas dan setelah separating gel mengeras, larutan stacking gel dituangkan di atasnya dan dipasang
sisiran sampai gel mengeras dan terbentuk sumuran. Plate dipasang pada alat elektroforesis set mini
protein gel, dan running buffer dituangkan pada alat tersebut.(5) Pada metode ini juga menggunakan
pewarna comassie brilian blue (CBB) yang berikatan dengan protein dalam suatu larutan yang
bersifat asam sehingga memberikan warna (kebiruan).(6) Secara umum, molekul yang lebih kecil
bergerak lebih cepat dan bermigrasi lebih jauh dari molekul kecil karena memiliki gesekan yang
lebih rendah saat bergerak menuju elektroda positif. Konsentrasi yang rendah pada gel memberikan
resolusi yang lebih baik untuk fragmen besar, dengan memberikan pemisahan yang lebih besar antara
band yang secara ukuran tidak terlalu jauh berbeda. Konsentrasi gel yang lebih tinggi, di sisi lain,
dapat mengurangi kecepatan migrasi fragmen panjang yang sementara itu dapat memfasilitasi
pemisahan yang lebih baik pada fragmen DNA kecil. Namun disamping itu, elektroforesis gel juga
memiliki kekurangan yaitu pada deteksi atau identifikasi amplikon. Penggunaan elektroforesis gel ini
dirasakan kurang efisien karena lama pengerjaannya dan terbatasnya jumlah sampel yang dapat
diperiksa. Disamping itu, kadang kadang hasil PCR dalam gel muncul pita yang tidak berbentuk
(ghost atau smeary bands) atau pita yang terlampau banyak sehingga hasilnya sulit
diinterpretasikan.(4)
Tujuan dari praktikum ini adalah untuk penetapan berat molekul protein dengan metode sodium
dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE).
2
BAHAN DAN METODE
2.1
Bahan baku
2.1.1
Bahan Separating Gel (10 ml)
a. Aquades 3,8 ml
b. 1,5 M Tris-HCL, pH 8,8 2,6 ml
c. 10% (w/v) SDS 0,1 ml
d. Acrylamide (30%/0,8% w/v) 3,4 ml
e. 10% (w/v) amonium persulfat (AP) 100 𝜇l
f. TEMED 10 𝜇l
2.1.2
Bahan Stacking Gel (5 ml)
a. Aquades 2,975 ml
b. 1,5 M Tris HCL, pH 8,8 1,25 ml
c. 10% (w/v) SDS 0,05 ml
d. Acrylamide (30%/0,8% w/v) 0,67 ml
e. 10% (w/v) amonium persulfat (AP) 0,05 ml
f. TEMED 0,005 ml
2.2
Alat
a. Alat elektroforesis
b. Gelas beker
c. Timbangan digital
d. Spatula
e. Pipet volume
f. Pipet ball
g. Mikropipet
h. Kompor listrik
2.3
Prosedur analisa
Langkah pertama adalah timbang sebanyak 0,02 gr APS, kemudian tambahkan aquades 180 𝜇l
kemudian di vortex sampai larut. Setelah itu satukan kedua casting frames, kemudian disetting pada
casting stands. Isi aquades pada masing-masing casting frames, pastikan tidak ada kebocoran di sisi
bawah dan samping, kemudian kosongkan kembali
Untuk langkah kedua ada pembuatan separating gel dengan memasukkan 3,8 ml aquades ke
dalam gelas beker kecil lalu menambahkan 3,4 ml akrilamid ke dalam gelas beker kecil,
menambahkan 2,6 ml 1,5 M Tris, dan menambahkan 0,1 ml SDS menggunakan mikropipet
kemudian mengocok larutan sampai tercampur menggunakan mikropipet ditandai dengan larutan
agak berbusa. Kemudian menambahkan 100 𝜇l larutan APS dan 10 𝜇l TEMED dan memipet 4 ml
larutan separating gel pada tiap frames. Setelah itu membuat lapisan atas horizontal tanpa
gelembung, diisi dengan aquades sampai penuh dan ditunggu sekitar 20-30 menit sampai gel
terbentuk. Kemudian sisa air diserap oleh kertas saring.
Untuk langkah ketiga ada pembuatan stacking gel dengan memipet 2,975 ml aquades dan
memipet 1,25 ml 0,5 M Tris-HCL. Kemudian menambahkan 0,05 ml SDS 10% dan menambahkan
akrilamid 0,67 ml. Lalu mencampur bahan tersebut hingga larut berbusa menggunakan mikropipet.
Setelah itu menambahkan 0,05 ml APS 10% dan menambahkan 0,005 ml TEMED. Setelah
tercampur, stacking gel dipipet sampai memenuhi frames dan ditunggu sekitar 20-30 menit sampai
stacking gel padat terbentuk.
Untuk langkah keempat terdapat persiapan sampel yang diuji (produk fermentasi hasil laut)
yaitu dengan menimbang sampel masing-masing sebanyak 1 gr. Kemudian sampel yang sudah
ditimbang masing-masing diberi label pada tiap microtube sampel T (MJ terasi rebon), P (cincalok),
U (petis udang), K (kecalo), R (rusip), D (terasi daun). Kemudian tambahkan fosfat buffer salin 2 ml
perbandingan sampel : buffer (1 : 2). Pada tiap campuran divortex selama 2 menit lalu disentrifugasi
dengan kecepatan 3000 rpm selama 10 menit. Setelah disentrifugasi, campuran di running buffer.
Lalu, campurkan 950 𝜇l Laemmi sample buffer dengan 50 𝜇l beta ME, kemudian divortex.
Kemudian supernatan masing-masing sampel diambil 30 𝜇l ditambahkan dengan 30 𝜇l buffer sampel
dan divortex sampai tercampur. Setelah itu, panaskan tabung selama 5 menit dalam air mendidih.
Pasang frames pada alat elektroforesis dan pastikan terpasang sesuai warna (Hitam - Hitam dan
Merah – Merah). Lalu, isi bagian dalam casting frame dengan buffer sampai penuh dan bagian luar
diisikan setengah penuh. Kemudian mempersiapkan well dengan melepas comb. Well ke 2
diinjeksikan sebanyak 7 𝜇l protein marker (dual color) dan well ke 4-9 diinjeksikan sebanyak 7 𝜇l
masing-masing sampel. Ulangi langkah yang sama pada frames sebaliknya. Well ke-2 diinjeksikan
sebanyak 7 𝜇l protein marker (unstained) dan well ke 4-9 diinjeksikan sebanyak 7 𝜇l masing-masing
sampel. Lalu, letakkan pada wadah yang telah diisi air dingin dan ice gel. Tutup dan hubungkan
dengan power supply yang telah diatur 120 volt, adanya gelembung kecil merupakan tanda bahwa
arus listrik mengalir. Kemudian, tunggu sekitar 1 jam sampai sampel di setiap well turun. Setelah 1,5
jam, lepaskan frame dari stand kemudian diberi label A (unstained) dan label B (dual color). Frame
B dan frame A dilepaskan dari frame kemudian direndam dengan staining coomassie brillian blue R250. Kemudian, rendam 24 jam pada suhu ruang sambil terus dishaking dan setelah 24 jam kemudian
dibilas dengan destaining coomassie brillian blue R-250. Bilas berulang kali sampai larutan bilasan
tersebut berwarna bening. Lalu, pindahkan ke mika yang telah diberi label A dan B.
3
3.1
HASIL DAN DISKUSI
Hasil Pengukuran dengan Marker Dual Color
Gambar 1. Hasil Elektroforesis Sampel dengan Marker Dual Color
Tabel 1. Nilai Rf dan Log BM Marker Dual Color
Pita ke-
Marker Dual Color
Jarak Running
Rf
(cm)
6
0,133
1
Jarak migrasi ke
sampel (cm)
0,8
2
1,1
6
3
1,5
4
BM
log BM
250000
5,39794
0,183
150000
5,17609
6
0,250
100000
5
1,8
6
0,300
75000
4,87506
5
2,7
6
0,450
50000
4,69897
6
3,5
6
0,583
37000
4,56820
7
4,7
6
0,783
25000
4,39794
8
5,2
6
0,867
20000
4,30103
Kurva Log BM Dual Color
6
5
Log BM
4
y = -1.3205x + 5.3714
R² = 0.9339
3
2
1
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Rf
Gambar 2. Kurva Standar Log BM Marker Dual Color
Tabel 2. Nilai Rf dan BM Sampel dengan Marker Dual Color
Sampel
4
0
Jarak migrasi ke
sampel (cm)
0
0
0
BM (anti
log)
0
5
1
1,5
6
0,25
5,06
114762,5
2
2,5
6
0,41667
4,84
6,8854,7
3
3,6
6
0,6
4,59
39253,6
4
4,2
6
0,7
4,46
28890,8
1
1,5
6
0,25
5,06
114762,5
2
1,8
6
0,3
4,99
98455,5
3
1,9
6
0,31667
4,97
93552,1
4
2,4
6
0,4
4,86
72463,6
5
3
6
0,5
4,73
53333,5
6
3,6
6
0,6
4,59
39253,6
7
4,2
6
0,7
4,46
2,8890,8
7
0
0
6
0
0
0
8
0
0
6
0
0
0
9
0
0
6
0
0
0
6
Pita ke-
Jarak Running
(cm)
6
Rf (x)
Log BM
3.2
Hasil Pengukuran dengan Marker Unstained
Gambar 3. Hasil Elektroforesis Sampel dengan Marker Unstained
Tabel 3. Nilai Rf dan Log BM Marker Unstained
Pita ke-
Jarak migrasi ke
sampel (cm)
Marker Dual Color
Jarak Running
Rf
(cm)
BM
log BM
1
0,7
6
0,1167
250000
5,39794
2
1
6
0,1667
150000
5,17609
3
1,4
6
0,2333
100000
5
4
1,8
6
0,3000
75000
4,87506
5
2,6
6
0,4333
50000
4,69897
6
3,4
6
0,5667
37000
4,56820
7
4,6
6
0,7667
25000
4,39794
8
5,2
6
0,8667
20000
4,30103
Kurva Log BM Unstained
6
5
Log BM
4
y = -1,3206x + 5,3714
R² = 0,9339
3
2
1
0
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
Rf
Gambar 4. Kurva Standar Log BM Marker Unstained
Tabel 4. Nilai Rf dan BM Sampel dengan Marker Dual Color
Sampel
4
0
Jarak migrasi ke
sampel (cm)
0
0
0
BM (anti
log)
0
5
1
1,5
6
0,25
5,04
109963,9
2
2,5
6
0,41667
4,82
66244,5
3
3,6
6
0,6
4,58
37935,0
4
4,1
6
0,68333
4,47
29443,5
5
5
6
0,83333
4,27
18659,5
1
1,6
6
0,26667
5,02
104529,8
2
1,9
6
0,31667
4,95
89786,3
3
2
6
0,33333
4,93
85349,3
4
2,5
6
0,41667
4,82
66244,5
5
3,7
6
0,61667
4,56
36060,4
6
4,2
6
0,7
4,45
27988,5
7
0
0
6
0
0
0
8
0
0
6
0
0
0
9
0
0
6
0
0
0
6
Pita ke-
Jarak Running
(cm)
6
Rf (x)
Log BM
3.3
Pembahasan
Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electroforesis (SDS-PAGE) adalah teknik untuk
memisahkan rantai polipeptida pada protein berdasarkan kemampuannya untuk bergerak dalam arus
listrik, yang merupakan fungsi dari panjang rantai polipeptida atau berat molekulnya. Hal ini dicapai
dengan menambahkan deterjen SDS dan pemanasan untuk merusak struktur tiga dimensi pada
protein dengan terpecahnya ikatan disulfide yang selanjutnya direduksi menjadi gugus sulfidihidril.
SDS akan membentuk kompleks dengan protein dan kompleks ini bermuatan negatif karena gugusgugus anionik dari SDS.(3) Dan menurut pengertian lain, metode SDS-PAGE sering digunakan untuk
menentukan berat molekul suatu protein dengan menggunakan gel poliakrilamid yang terdiri dari 2
gel yaitu gel pemisah dan gel penahan. Gel pemisah berfungsi sebagai tempat dimana protein akan
bergerak atau berpindah menuju anoda, sedangkan gel penahan berfungsi sebagai gel tempat
meletakkan sampel yang terdapat di beberapa dinding sumur.(7) Dari hasil elektroforesis yang
dilakukan pada sampel produk fermentasi hasil laut, didapatkan pita-pita protein dimana dari pita
yang terbentuk kemudian dihitung panjang atau nilai Rf (retention factor) sehingga diperoleh berat
molekul sampel. Pada praktikum ini digunakan 2 jenis marker, yaitu marker dual color dan marker
unstained dengan berat molekul 20-250 kDa sebagai standar yang digunakan untuk menentukan berat
molekul protein sampel.
Dari hasil running elektroforesis sampel gambar 2 dan 4, dapat dilihat hanya pada sampel terasi
dan cincalok yang menunjukkan adanya pita protein. Berdasarkan hasil running dengan marker dual
color, terlihat sebanyak 4 pita pada sampel terasi dan 7 pita pada sampel cincalok. Setelah
dimasukkan ke dalam persamaan regresi y = -1,3312x + 5,3926 dengan nilai R² = 0,9322 dari kurva
log BM dengan Rf marker dual color, diketahui bahwa sampel terasi memiliki protein dengan berat
molekul 114.8 kDa, 68.9 kDa, 39.3 kDa, dan 28.9 kDa sedangkan sampel cincalok memiliki protein
dengan berat molekul 114.8 kDa, 98.5 kDa, 93.4 kDa, 72.5 kDa, 53.3 kDa, 39.3 kDa, dan 28.9 kDa.
Berdasarkan hasil running dengan menggunakan marker unstained, terlihat sebanyak 5 pita
pada sampel terasi dan 6 pita pada sampel cincalok. Setelah dimasukkan ke dalam persamaan regresi
y = -1,3206x +5,3714 dengan nilai R² = 0,9339 dari kurva log BM dengan Rf marker unstained,
diketahui bahwa sampel terasi memiliki protein dengan berat molekul 110 kDa, 66.2 kDa, 37.9 kDa,
29.4 kDa, dan 18.7 kDa sedangkan sampel cincalok memiliki protein dengan berat molekul 104.5
kDa, 89.8 kDa, 85.3 kDa, 66.2 kDa, 36.1 kDa, dan 28 kDa.
Pita-pita tersebut terbentuk karena adanya sejumlah partikel sampel yang tersangkut pada titiktitik tertentu dalam gel akibat adanya muatan listrik pada sampel yang bergerak menuju katoda.
Partikel yang memiliki berat molekul sama akan terakumulasi di titik yang sama, sehingga
membentuk beberapa pita dengan panjang berbeda yang terpisah berdasarkan berat molekulnya. Pada
praktikum ini, sampel petis, kecalo, terasi juwana, dan rusip tidak terlihat adanya pita protein baik
pada marker dual color maupun marker unstained. Hal ini kemungkinan karena terjadinya perubahan
sifat pada protein tersebut.(7)
4
KESIMPULAN
Berdasarkan hasil running dengan marker dual color dan marker unstained, terlihat hanya sampel
terasi dan cincalok yang menunjukkan adanya pita protein sedangkan sampel petis, kecalo, terasi
juwana, dan rusip tidak terlihat adanya pita protein yang kemungkinan terjadi karena perubahan sifat
pada protein tersebut.
Berdasarkan hasil running dengan marker dual color diketahui bahwa sampel terasi memiliki
protein dengan berat molekul 114.8 kDa, 68.9 kDa, 39.3 kDa, dan 28.9 kDa sedangkan sampel
cincalok memiliki protein dengan berat molekul 114.8 kDa, 98.5 kDa, 93.4 kDa, 72.5 kDa, 53.3 kDa,
39.3 kDa, dan 28.9 kDa.
Berdasarkan hasil running dengan marker unstained, diketahui bahwa sampel terasi memiliki
protein dengan berat molekul 110 kDa, 66.2 kDa, 37.9 kDa, 29.4 kDa, dan 18.7 kDa sedangkan
sampel cincalok memiliki protein dengan berat molekul 104.5 kDa, 89.8 kDa, 85.3 kDa, 66.2 kDa,
36.1 kDa, dan 28 kDa.
DAFTAR PUSTAKA
1.
Safiera AA. Aktivitas Antioksidan dan Kemampuan Proteksi Terhadap Kerusakan DNA dari
Protein Isolat Biji Melinjo (Gnetum gnemon L.) Terhidrolisis Menggunakan Alkalase
Terimobilisasi. 2016.
2.
Sawitri KN, Sumaryada T, Ambarsari L. Analisa Pasangan Jembatan Garam Residu Glu15Lys4 Pada Kestabilan Termal Protein 1Gb1. J Biofisika [Internet]. 2014;10(1):68–74.
Available from: www.rscb.org
3.
Mukaromah AH, Ethica SN. Profil Protein Berbasis SDS-PAGE Pada Ulat Sagu Pengasapan
dengan dan tanpa Penggaraman. Semin Nas Edusainstek FMIPA UNIMUS 2018 [Internet].
2018;(October):8–14.
Available
from:
http://journal.ipb.ac.id/index.php/jphpi/article/view/10607
4.
Setiawan A. Instrumentation & Biomolecular Technique Elektroforesis Vertical Sds-Page.
Univ
Brawijaya
[Internet].
2018;(February):9.
Available
from:
https://www.researchgate.net/publication/339132965
5.
Muchtaromah B, Sumitro SB, Soemarno S, Susilawati T. Isolasi dan Karakterisasi Protein
100kDa dari Membran Kepala Spermatozoa Kambing. J Exp Life Sci. 2012;2(1):13–9.
6.
Wa Atima. Isolasi Dan Pengukuran Aktivitas Enzim Bromelin Dari Ekstrak Kasar Bonggol
Nanas (Ananas comosus) Pada Variasi Suhu Dan pH. J Biol Sci Educ. 2013;2(1):70–9.
7.
Kasmawati. Karakterisasi Berat Molekul Protein Hasil Fraksinasi Enzim Selulase dari Candida
Utilis [Internet]. Skripsi. 2017. Available from: makassar: FST UIN Alauddin.