combinepdf-28 (1)

ДАРКО БОШНАКОВСКИ МОЛЕКУЛАРНА БИОЛОГИЈА СО ГЕНЕТИКА Штип, 2018 Дарко Бошнаковски МОЛЕКУЛАРНА БИОЛОГИЈА СО ГЕНЕТИКА Автор: проф. д-р Дарко Бошнаковски МОЛЕКУЛАРНА БИОЛОГИЈА СО ГЕНЕТИКА Рецензенти: проф. д-р Тања Рушковска проф. д-р Невенка Величкова Лектор: Виолета Карагунова Техничко уредување: Дарко Бошнаковски Издавач: Универзитет „Гоце Делчев” - Штип Објавено во е-библиотека: https://e-lib.ugd.edu.mk CIP - Каталогизација во публикација Национална и универзитетска библиотека "Св. Климент Охридски", Скопје 577.2(075.8) БОШНАКОВСКИ, Дарко Молекуларна биологија со генетика [Електронски извор] / Дарко Бошнаковски. - Штип: Универзитет 'Гоце Делчев"-Штип, Факултет за медицински науки, 2018 Начин на пристап (URL): https://e-lib.ugd.edu.mk/716. - Текст во PDF формат, содржи 218 стр., илустр. - Наслов преземен од екранот. - Опис на изворот на ден 13.04.2018. - Белешка за авторот: стр. 218. Библиографија: стр. 217 ISBN 978-608-244-513-7 1. Гл. ств. насл. а) Молекуларна биологија - Високошколски учебници б) Молекуларна генетика - Високошколски учебници COBISS.MK-ID 106953994 УНИВЕРЗИТЕТ „ГОЦЕ ДЕЛЧЕВ” – ШТИП ФАКУЛТЕТ ЗА МЕДИЦИНСКИ НАУКИ проф. Дарко Бошнаковски МОЛЕКУЛАРНА БИОЛОГИЈА СО ГЕНЕТИКА Штип, 2018 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ПРЕДГОВОР Учебникот „Молекуларна биологија со генетика“ е предвиден да биде учебно помагало по предметот Молекуларна биологија со генетика кој се изучува на студиската програма по Фармација на Факултетот за медицински науки при Универзитетот „Гоце Делчев“-Штип. Потребата од овој учебник произлезе од недостатокот на соодветна литература на македонски јазик за некои наставни сегменти предвидени со учебната програма на предметот. Поради тоа и тематската организација е насочена кон делови за кои пристапот за соодветна литература е лимитиран. Пред сè, станува збор за теми кои се во доменот на молекуларната биологија и молекуларната генетика. При дизајнирањето на учебникот, не се опфатени наставни теми или делови од теми кои соодветно се обработени во други наставни помагала, а се издадени на Универзитетот „Гоце Делчев“ или на другите универзитети во Македонија. Станува збор за тематски единици кои редовно се застапени во учебници по Клеточната биологија, Биохемија или Медицинска генетика. Фокусот на учебникот е да се објаснат основните молекуларно-биолошки процеси во клетката и организмот, базичните принципи на генетиката и генетскиот инжинеринг. При обработка на материјата, вниманието е насочено кон основните принципи, а не кон деталите. Притоа е земено предвид дека студентите имаат доволно предзнаења од општа и клеточна биологија и базични знаења од хемија и биохемија. При пишувањето на учебникот се соочивме со технички проблеми од недостаток на соодветна стручна терминологија на македонски јазик. Молекуларната биологија, како една од моментално најдинамичните биолошки науки, глобално се соочува со проблемот на неунифицирана терминологија. Како и областа која ја обработува, предвидено е овој учебник да биде динамично учебно помагало кое благовремено ќе се обновува, надополнува и надградува. Ова е негово прво издание кое, се надеваме, во годините кои следат, ќе претрпи подобрувања, така што секоја конструктивна забелешка и сугестија е добредојдена. Од авторот Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски СОДРЖИНА ВОВЕД ................................................................................................................................. 1 НУКЛЕИНСКИ КИСЕЛИНИ ................................................................................................. 5 Структура на нуклеинските киселини ............................................................................. 5 Градба на дезоксирибонуклеинска киселина (ДНК) ...................................................... 6 Рибонуклеинска киселина (РНК) ................................................................................... 11 Рибозомална РНК (рРНК) ............................................................................................. 12 СТРУКТУРА НА ГЕНОМОТ .............................................................................................. 14 Општи карактеристики кај прокариотите и еукариотите .............................................. 15 Општи карактерискики на хромозомите ....................................................................... 17 Молекуларна организација на хромозомите ................................................................ 19 Организација на хетерохроматинот ............................................................................. 21 Градба на хетерохроматинот во теломерниот дел на хромозомот ........................ 21 Градба на хетерохроматинот во центромерниот дел од хромозомот .................... 23 Заштитна улога на хетерохроматинот ...................................................................... 24 Дистрибуција на гените во геномот .............................................................................. 25 Групирања на гените според нивната функција ....................................................... 26 Генски фамилии ......................................................................................................... 27 Екстрануклеарен геном кај еукариотските организми .............................................. 28 Потекло на органелниот геном .................................................................................. 30 Наследување на митохондријалниот геном ............................................................. 31 Повторувачки секвенции во ДНК молекулата .............................................................. 33 Тандемски повторувачки ДНК секвенции (Tandemly repeated DNA) ....................... 33 Повторувања кои случајно се лоцирани во геномот (Interspersed genome-wide repeats) ....................................................................................................................... 34 ОСНОВНИ НА МОЛЕКУЛАРНО-БИОЛОШКИ ТЕХНИКИ ............................................... 36 Изолација на специфични ДНК фрагменти со помош на рестрикциони ензими ........ 37 Вектори........................................................................................................................... 38 Сепарирање на фрагменти на ДНК со помош на електрофореза .............................. 39 Клонирање на рекомбинирана ДНК in vivo ................................................................... 39 In vitro клонирање на сегмент од ДНК со полимеразна верижна реакција ................. 41 ДНК рекомбинирачки библиотеки (DNK recombinant libraries) .................................... 43 Хибридизација на нуклеинските киселини ................................................................... 45 Детекција на нуклеинските киселини со помош на блотинг (blotting) техники ............ 45 Секвенционирање на ДНК ............................................................................................. 48 СИНТЕЗА НА НУКЛЕИНСКИТЕ КИСЕЛИНИ .................................................................. 50 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Ензими кои учествуваат во синтетизирање на нуклеинските киселини ..................... 51 Организација на генетскиот материјал во прокариотски и еукариотски клетки ......... 53 Транскрипција кај прокариотските клетки .................................................................... 55 ........................................................................................................................................ 57 Транскрипција кај еукариотските клетки ...................................................................... 58 СИНТЕЗА НА ПРОТЕИНИ ................................................................................................ 64 Транспортна РНК (тРНК) ............................................................................................... 66 ........................................................................................................................................ 67 Транслација ................................................................................................................... 68 КОНТРОЛА НА ГЕНЕТСКАТА ЕКСПРЕСИЈА ................................................................ 74 Механизам на генетска регулација кај прокариотите .................................................. 75 Механизам на генетска регулација кај еукариотите .................................................... 77 Хроматинско ремоделирање ........................................................................................ 77 Cis и Trans генски регулаторни елементи .................................................................... 79 Посттранскрипциона регулација на генетската експресија ......................................... 84 РЕПЛИКАЦИЈА НА ДНК ................................................................................................... 87 Репликација на ДНК кај прокариотите .......................................................................... 88 Репликација на ДНК кај еукариотите ............................................................................ 95 ОШТЕТУВАЊЕ И РЕПАРИРАЊЕ НА ДНК ..................................................................... 99 Поправање со отстранување на оштетените нуклеотоди (Excision repair) ........... 101 Поправање на прекини на двојната верига со рекомбинација .............................. 102 ДНК рекомбинација ..................................................................................................... 104 ОСНОВА НА КЛЕТОЧНА ДЕЛБА .................................................................................. 107 Митоза .......................................................................................................................... 107 Мејоза ........................................................................................................................... 108 ОСНОВНИ ПРАВИЛА НА МЕНДЕЛОВОТО НАСЛЕДУВАЊЕ .................................... 112 Основни поими кои се користат во генетиката .......................................................... 115 Фамилијарно или родословно стебло ........................................................................ 115 Видови на Менделово наследување .......................................................................... 117 Автосомно доминантно наследување..................................................................... 117 Автосомно рецесивно наследување ....................................................................... 118 Полово-врзано наследување (наследување поврзано со гени лоцирани на X или Y хрмомозомот) ........................................................................................................... 119 Х-поврзано доминанто наследување ...................................................................... 120 Y-врзано наследување ............................................................................................ 120 АТИПИЧНИ МОДЕЛИ НА НАСЛЕДУВАЊЕТО-НЕМЕНДЕЛОВО НАСЛЕДУВАЊЕ .. 122 Пенетрантност и експресивност ................................................................................. 122 Некомплетна доминантост (Интермедиерно наследување) ..................................... 123 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Генетска антиципација ................................................................................................ 124 Мозаицизам ................................................................................................................. 126 Унипарентерална дисомија ......................................................................................... 126 Генетски импринтинг ................................................................................................... 127 Полигенo наследување ............................................................................................... 129 Мултипли алелни форми на еден ген и Кодоминантно наследување .................. 129 Генска интеракција при полигенетското наследување .......................................... 132 Мултифакторијално наследување .............................................................................. 134 Наследувања на мутации во митоходријалната ДНК ................................................ 137 НУМЕРИЧКИ И СТРУКТУРНИ ХРОМОЗОМСКИ АБНОРМАЛНОСТИ ........................ 139 Еуплоидија и Анеуплоидија......................................................................................... 139 Синдроми предизвикани од хромозомски абнормалности........................................ 143 Трисомии на автосомните хромозоми .................................................................... 143 Промена во бројот на гоносомните хромозоми ...................................................... 145 Структурни хромозомски аберации ............................................................................ 147 Синдром поврзан со делеција на автосомните хромозоми ................................... 150 МОЛЕКУЛАРНА ОСНОВА НА ГЕНЕТСКИТЕ МУТАЦИИ ............................................. 151 Наследување на рецесивните и доминантните мутации .......................................... 152 Промени во ДНК молекулата при точкести мутации (point mutations) ...................... 153 Мутагени фактори........................................................................................................ 157 ГЕНЕТСКИ ИНЖЕНЕРИНГ ............................................................................................. 162 Генетски инженеринг кај растенијата ......................................................................... 162 Добивање на фармацевтски продукти со помош на генетски инженеринг .............. 163 Рекомбинантни протеини......................................................................................... 163 Антитела добиени со генетски инженеринг ............................................................ 165 Вакцини добиени со генетски инженеринг .............................................................. 167 Генетска терапија ........................................................................................................ 169 Генетскиот инженеринг во медицински дијагностички цели ..................................... 171 Генетски тестови на база на микроареј технологија (microarray) .......................... 173 Анализа на генетската експресија со микроареј (gene expression microarray) и РНК секвенционирање (RNAseq) .................................................................................... 173 Примена на ДНК за одредување на идентитетот ................................................... 175 Трансгенетски животни, анимални модели за хумани заболувања ......................... 178 ГЕНЕТИКА НА РАКОТ .................................................................................................... 182 Потекло на канцерот ................................................................................................... 183 Геномска нестабилност кај канцерот.......................................................................... 185 Регулација на клеточниот циклус и апоптозата кај карциномите ............................. 186 Онкогени и тумор-супресор гени................................................................................. 189 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Онкогените од Ras генската фамилија ................................................................... 190 p53 тумор-супресор генот ........................................................................................ 191 Генетската поврзаност на инвазивната и метастатска способност на канцерот ..... 191 Наследна предиспозиција кон одредени видови на канцер...................................... 192 Улогата на вирусите во разитокот на канцер ............................................................. 193 Влијанието на надворешните фактори на малигната трансформација ................... 194 ЕПИГЕНЕТИКА ............................................................................................................... 196 МикроРНКи (miRNA) .................................................................................................... 198 Епигенетиката и генетскиот импринтинг .................................................................... 199 Епигенетика и канцер .................................................................................................. 200 Епигенетиката и надворешната средина ................................................................... 203 ФАРМАКОГЕНЕТИКА..................................................................................................... 204 Варијации во фармакокинетскиот одговор во фазата I од метаболизмот на лековите ...................................................................................................................................... 204 Варијации во фармакокинетскиот одговор во фазата II од метаболизмот на лековите ...................................................................................................................................... 206 Варијација во фармакодинамиката на лекот ............................................................. 208 ГЕНОМСКИ ВАРИЈАЦИИ И ИНДИВИДУАЛНИ ГЕНЕТСКИ РАЗЛИКИ ....................... 209 Полиморфизам во еден базен пар (Single Nucleotid Polymorphisms, SNP) ........... 209 Инсерции и делеции (INDELs (INsertion/DELetion) ................................................. 209 Варијација во бројот на копиите на гените (Copy Number Variation, CNVs) .......... 210 МАТИЧНИ КЛЕТКИ (STEM CELLS) ............................................................................... 211 Хуманите ембринални матични клетки (Human Embryonic Stem Cells; hESCs) ....... 211 Адултни матични клетки .............................................................................................. 213 Индуцирани плурипотентни матични клетки .............................................................. 214 Потенцијална апликација на матичните клетки ......................................................... 215 КОРИСТЕНА ЛИТЕРАТУРА ........................................................................................... 218 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ВОВЕД Биологијата претставува една од најстарите и најкомплексни природни науки. Како предмет на проучување, во поширока смисла, таа ги има живите суштества, односно сите процеси поврзани со градбата и функционирањето на живата материја. Затоа таа се нарекува наука за животот. Живите суштества се наоѓаат во вчудовидувачка разновидност на облици, форми и нивоа на структурна организација. Ова ѝ овозможува на биологијата да го проучува животот на најразлични начини. Сепак, сите форми на живот, почнувајќи од наједноставните едноклеточни микроорганизми, па сè до најсложените цицачи, се базираат на исти фундаментални биохемиски процеси кои им го овозможуваат нивното преживување. Еден од основните постулати во биологијата претставува клеточната теорија претставена од Шван (Schwann) и Шлајден (Schleiden) во 1839 година со која се заклучува дека сите живи организми се изградени од клетки. Подоцна, теоријата е надополнета со тоа дека сите клетки водат потекло од други клетки со што е поставена основата за разбирање на репродукцијата и развојот на сите живи организми. Во деветнаесеттиот век, развојот на биологијата доживува огромен напредок, најмногу благодарејќи на истражувањата на големиот англиски научник Чарлс Дарвин (Charles Darwin) кој ги објавил своите научни сознанија во дело „On the Origin of Species“, отпечатено во 1859 година. Дарвин ја развил теоријата за органска еволуција која ја објаснува природата како непрекинат историски процес на промени, појавувања и исчезнувања на нови облици. Според Дарвин, посебно значење за еволуцијата има наследната варијабилност, односно наследната неодреденост. Скоро во исто време, во 1865 година, Грегор Мендел ги објавил своите откритија поврзани со наследувањето на седум различни особини на градинарскиот грашок. Пред појавата на Менделовите истражувања, научниците сметале дека наследувањето се остварува преку спојување на секоја од наследните особини на родителите во потомството. Преку своите испитувања Медел, всушност, докажал дека наследувањето е поврзано со одредени честички кои потекнуваат од двата родитела, се пренесуваат во потомството и во себе ја содржат информацијата за наследувањето на својствата. Денес, овие честички се нарекуваат гени. Увидел дека генот може да постои во неколку негови различни форми наречени алели. На пример: Во растенијата користени во неговиот експеримент, бојата на зрната грашок можела да биде жолта или зелена. Една алелна форма на генот за боја овозможува формирање на жолти зрна, а друга на зелени. Испитувајќи ги соодносите на различните алели помеѓу себе, покажал дека одредени алели можат да бидат доминантни над други алели. Врз основа на своите експерименти Мендел ги предложил двата законa за пренесувањето на наследниот материјал: правилото за независна сегрегација на наследните фактори и правилото на независно комбинирање на наследните фактори. И двете правила денеска се основа на сите генетски Слика 1 Грегор Мендел испитувања. Менделовите истражувања биле надградени со понатамошните испитувања во рамките на клеточната биологија. Со подетално проучување на градбата на хромозомите се прикажало дека токму тие се физичките ентитети кои се носители на гените, односно се дошло до хромозомската теорија на наследување. Во разработувањето на оваа теорија, најголем придонес дал Томас Морган (Thomas 1 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Morgan) кој работел со наследните својства на винската мушичка, Drosophila melanogaster. Овој инсект е многу погоден за истражување бидејќи лесно се одгледува и брзо се размножува, што овозможува во лабораториски услови да можат да се произведат и до 50 генерации годишно. Винската мушичка има само 4 хромозома во половите клетки, а во плунковите жлезди има гигантски хромозоми кои можат да се изучуваат и под обичен микроскоп. Благодарејќи на ова Морган воочил и многу нови појави и закономерности во наследувањето. Имено, тој ја дал основата за поделбата на хромозомите на соматски и полови, ја докажал диплоидноста на повеќето организми, (поседување на две копии од секој хромозом во секоја клетка) и ја открил појавата на размена на делови помеѓу хомологните хромозоми т.н. crossing over, што му овозможува да го анализира наследувањето на врзаните својства. Набргу потоа бил дефиниран и терминот локус, односно точната локација на генот во ДНК молекулата. Покрај генетските истражувања на вишите организми, започнале да се изведуваат истражувања и на микроорганизмите како што се: Escherichia Coli, Neurospora, Salmonella. Истражувањата на вишите организми, иако биле многу интензивни и значајни, поради сложеноста на процесите не можеле да дадат одговор на прашањата што е ген, каква е неговата функција и што, всушност, се пренесува од родителите на потомството. Во периодот кој следел, преку активноста на плејада генетичари ширум светот, биле презентирани нови докази дека хромозомите се главни носители на наследноста, дека гените се наследни единици со што хромозомската теорија се здобила со општо признание. Откривањето на структурата на хромозомите, односно заклучокот дека тие се изградени од силно кондензиранa ДНК молекулa, овозможило започнување на друга област во генетиката која ќе се занимава со испитувањето на наследните процеси на молекуларно ниво, односно до зачеток на молекуларната биологија. Молекуларната биологија е интердисциплинарна научна област создадена како резултат на своевидна симбиоза помеѓу биохемијата, цитологијата и генетиката. Потребата да се осознаат принципите на животот на молекуларно ниво е главна причина за развој на оваа наука. Во 1869 година Фридрих Мишер (Friedrich Miescher) во клеточното јадро открил мешавина од состојки кои тој ги нарекол нуклеин. Главната компонента на нуклеинот била дезоксирибонуклеинската киселина (ДНК). До крајот на деветнаесеттиот век хемичарите успеале да ја опишат општата структура на ДНК, како и на сродната молекула, рибонуклеинска киселина (РНК). Обете молекули претставуваат долги полимерни синџири изградени од мали составни делови наречени нуклеотиди. Секој нуклеотид е изграден од шеќер, фосфатна група и азотна база. Синџирот се формира преку поврзување на шеќерните молекули преку нивните фосфатни групи. Освалд Ајвери (Oswald Avery) заедно со неговите колеги во 1944 година демонстрирале дека ДНК претставува основа на наследувањето. Овие истражувачи продолжиле да работат на еден претходно успешен експеримент спроведен од Фредерик Грифит (Frederick Griffith) во кој тој успеал да пренесе способноста за вируленција од една група на бактерии на друга. Пренесувањето било извршено со едноставно мешање на мртви вирулентни соеви со невирулентни живи бактериски соеви. Со овие експерименти било предложено дека материјата, која ја предизвикала трансформацијата од невирулентни во вирулентни микроорганизми, претставувала ген за вирулентност бидејќи новодобиените изменети клетки ја пренесувале новата особина на своето потомство. По овој експеримент, останало да се утврди хемиската природа на трансформирачкиот агенс во мртвите вирулентни клетки. Ајвери со соработниците тоа го направиле преку низа хемиски и биохемиски тестови на трансформирачкиот агенс при што покажале дека тој поседувал карактеристики на ДНК, а не на РНК или на протеин. 2 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Во 1953 година, користејќи ги податоците од кристалографските анализи извршени од Розалинда Франклин (Rosalind Franklin), двајцата млади истражувачи Вотсон (J. D. Watson) и Крик (F. H. C. Crick) објавиле епохално откритие поставувајќи ја теоријата за двојно верижната структура на ДНК молекулите, за што им била доделена и Нобелова награда за медицина и физиологија. Ватсон и Крик предложиле дека ДНК претставува двоен хеликс, односно две нишки (вериги) на ДНК усукани една околу друга. Уште поважно, тие покажале дека азотните бази на секоја од веригите се наоѓаат на внатрешната страна на хеликсот и дека базите од едната верига се Слика 2 Ватсон и Крик и нивниот модел на ДНК поврзуваат со базите од другата верига на многу специфичен начин. ДНК има четири различни бази: аденин (А), гванин (G), цитозин (С) и тимин (Т). Притоа, кога А е на едната верига, спротивно на неа на другата верига се наоѓа Т и кога на едната верига е G, на спротивната верига е сместена С. Од ова се заклучило дека двете вериги се комплементарни една со друга. Доколку е позната базната секвенца на едната верига, автоматски се знае и секвенцата на другата. Ваквата комплементарност овозможува ДНК прецизно да се реплицира. Метју Меселсон (Matthew Meselson) и Френклин Штал (Franklin Stahl) во 1958 година, работејќи на бактериска ДНК, потврдиле дека нејзиното умножување (репликација) е семиконзервативно. При овој начин на репликација на ДНК, двете вериги се раздвојуваат, по што ензимите создаваат нови вериги користејќи ги старите како урнек (матрица). Притоа, се запазува и правилото на Вотсон и Крик за спарување на базите (А со Т и G со С). Името семиконзервативна е дадено затоа што секогаш едната верига од родителскиот двоен хеликс се конзервира (зачувува) во секој од новодобиентите два ќеркини двојни хеликса. Овие големи откритија ја отвориле вратата за интензивен технолошки и методолошки развој во молекуларната биологија. Набргу по нив почнале да се развиваат најразлични технологии за in vitro манипулација на ДНК. Со тоа се овозможило детално откривање на начинот на кодирање на генетската информација и нејзина употреба за синтеза на протеини, односно испитување на генската експресија. Генска експресија е процесот преку кој се создава продуктот на активноста на гените. Потребни се два чекора, транскрипција и транслација за да се добие полипептид од информациите содржани во соодветен ген. При транскрипцијата, ензимот РНК полимераза копира дел од една од ДНК нишките. Добиената копија не е ДНК, туку другиот тип на нуклеинска киселина РНК. Во чекорот на транслација, добиената РНК (информациона РНК или иРНК) ги пренесува инструкциите од генот во клеточните „фабрики“ за создавање на протеини, наречени рибозоми. Рибозомите го „читаат“ генетскиот код од иРНК и синтетизираат протеин според неговите инструкции. Природата на генетскиот код е откриен на почетокот на 60-тите години кога се утврдило дека редослед на 3 бази, наречен кодон, носат информација која одговара на една аминокиселина. Од 64-те возможни различни кодони, 61 специфицираат аминокиселини, додека останатите 3 се „СТОП“ сигнали за прекин на синтезата на полипептидната верига. Откривањето на ваквиот начин на складирање и користење на информациите отворило можност за анализа на мутациите што се јавуваат кај гените. Имено, гените можат да претрпат измени на најразличен начин. Наједноставен и најчест начин е промената на една азотна база во друга азотна база. На пример: Доколку кодонот GAG 3 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски се промени во GTG ќе настане и промена во информацијата за аминокиселината која ја кодираат, односно наместо информација за синтеза на глутаминска киселина ќе се добие информација за синтеза на валин. Ова може да биде незабележлива промена помеѓу стотиците аминокиселини, но може да предизвика и промени од кои протеинот ќе биде нефунционален. Големиот напредок во разоткривањето на структурата и функцијата на молекулите одговорни за пренесување на наследните својства произлегле од развојот на молекуларни методи и техники кои се користат во молекуларната биологија. Развиени се палета на техники за изолација и манипулација на гените и нивен тренафер во нови организми. Во последните неколку декади се развиени уште многу значајни техники на манипулацијата со нуклеинските киселини, како што се: пронаоѓањето на рестрикциски ензими кои ја сечат ДНК молекулата на строго одредени места, употребата на плазмиди за клонирање на ДНК, потоа Сангеровитот (Sanger) метод на секвенционирање на ДНК молекули и разработување на Полимеразната верижна реакција (PCR), како метод за многу брзо и лесно добивање на огромен број копии на сегменти од ДНК, и пред се новата генерација на секвенционирање на ДНК со која за неколку дена може да се секвенционира целиот хуман геном. Овие техники, паралелно со развојот на биоинформатиката, овозможиле обработка на огромен број податоци добиени во молекуларно-биолошките истражувања и до одредување на ДНК секвенцата на целосни геноми кај поедини организми. Најпрво, во 1995 година, на бактериите Haemophilus influenza и Mycoplasma genitalium, а година подоцна бил секвенциониран и првиот еукариотски геном на квасната габа Saccharomyces Cerevisiae. Следниот логичен чекор, односно секвенционирањето на целосниот човечки геном со долгогодишна работа на многу истражувачи, бил успешно завршен во 2003 година. Експериментите во современата молекуларна биологија и молекуларна генетика, главно, се базираат на трите групи биолошки макромолекули - ДНК, РНК и протеини. Преку детално проучување на функционирањето и интеракции на овие групи макромолекули, молекуларно-биолошките техники наоѓаат голема практична примена во многу сегменти на човековото живеење. Тие се и основа на развитокот на персонализираната медицина. Во медицината молекуларно-биолошките методи се применуваат за дијагностика на вродени (хередитарни) заболувања, како на пример, цистична фиброза, таласемија, хемофилија и многу други. Молекуларно-биолошките техники овозможуваат брза, специфична и многу сензитивна идентификација на патогени микроорганизми или точна дијагностика на малигните заболувања. Техниките на молекуларната биологија наоѓаат и своја примена во базичните биолошки испитувања, во еколошки и популациони студии и во судска медицина. Молекуларно-биолошките методи во фармацијата овозможуваат пронаоѓање на нови фармацевтски продукти, проучување на дејството на медикаментите на молекуларно ниво, развој на генетска терапија, масовно произведување на, воглавно, ретки активни материи (инсулин, коагулациски фактор VIII) или вакцини. 4 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски НУКЛЕИНСКИ КИСЕЛИНИ Фредерик Миешер (Friederich Miescher) во 1869 година во спермата на рибите пронаоѓа нова биолошка материја која содржи Na и P во специфичен сооднос незабележaн претходно. Бидејќи истата ја изолирал од јадрото на клетките, ја нарекол нуклеин, кој подоцна, поради киселинскиот карактер, се нарекува нуклеинска киселина. Хемискиот состав е објаснет во 1920 година од П. А. Левен (P. A. Levene) кој утврдил дека нуклеинските киселини се составени од повторувачки сегменти кои содржат пентозен шеќер, фосфорна група и азотна база. Доколку пентозниот шеќер е дезоксирибоза, во тој случај молекулата е дезоксирибонуклеинската киселина (ДНК), а доколку е рибоза, станува збор за рибонуклеинска киселина (РНК). ДНК е молекула која во себе ги содржи сите информации за градбата и функцијата на секоја клетка. Со нејзината репликација се овозможува континуирано пренесување на информациите од една генерација на друга. Информациите за синтеза на протеини се кодирани во точно определи сегменти и се нарекуваат гени. За да стане информацијата функционална, посредуваат рибонуклеинските киселини. Притоа, при процесот на транскрипција, информационата рибонуклеиска киселина (иРНК) се синтетизира на база на кодирачката секвенција од ДНК. Таа ја носи информацијата за точниот аминокиселински редослед во протеините. На база на иРНК, со посредство на транспортната (тРНК) и рибозомалната (рРНК) рибонукленска киселина, се синтетизираат протеините во рибозомите. Овој процес се нарекува транслација. Слика 3 Градба на нуклеотидите. Градба на аденозин 5`-монофосфат (AMP) и структура на пентозните шеќери рибоза и дезоксирибоза Структура на нуклеинските киселини Нуклеинските киселени се полимерни органски соединенија изградени од нуклеотиди. Сите нуклеотиди се изградени од пентозен шеќер, дезоксирибоза кај ДНК и рибоза кај РНК, кој со својот јаглероден атом на позиција 5` е поврзан со фосфорната група, а со јаглеродниот атом на позиција 1` е поврзан со азотна база. Четири азотни бази учествуваат во градбата на ДНК и РНК. Од нив аденин (А), гванин (G) и цитозин (C) се заеднички за двете молекули, тиминот (Т) е карактеристичен за ДНК, а урацилот (U) за РНК. Два нуклеотида се поврзуваат на тој начин што фосфорната група од едниот нуклеотид се поврзува со хидроксилната група која се наоѓа на позиција 3` на пентозниот шеќер од другиот нуклеотид при што се формира динуклеотид и се ослободува вода. Врската помеѓу двата нуклеотида е од ковалентен карактер и, бидејќи во неа учествуваат алкохолната група од 5` на шеќерот и фосфорната киселина, се нарекува фосфодиестерска врска. 5 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Новосоздадениот димер повторно има слободна фосфорна група на позиција 5` и слободна хидроксилна група на позиција 3` на кои можат да се врзуваат други нуклеотиди. На овој начин можат да се создадат полимери составени од илјадници мономери (нуклеотид) кои, доколку се линеарни, секогаш на своите краеви ќе имаат фосфорна група и хидроксилна група. Со ова се формира поларитет на молекулата при кој разликуваме 5`-крај на кој се наоѓа фосфатната група и 3`-крај на кој е хидроксилната група. Во ваквиот полимер, пентозниот шеќер и фосфорната група учествуваат во формирањето на основната верига (`рбетот) на молекулата на која странично се поставени азотните бази. Азотните бази се хетероциклични молекули чии прстени се изградени од јаглерод и азот. Цитозинот, тиминот и урацилот се пиримидински молекули изградени од еден цикличен прстен, а аденинот и гванинот се пурински молекули изградени од два циклични прстена. Јаглеродниот атом на позиција 1` од пентозниот шеќер е поврзан со азотниот атом кој се наоѓа на позиција 1 кај пиримидинските Слика 4 Хемиска структура на азотбази или на позиција 9 кај пуринските бази. ните бази кои влегуваат во состав на нуклеинските киселини Комплексот од пентозен шеќер и азотна база се вика нуклеозид. Името на нуклеозидот потекнува од името на азотната база која учествува во неговата градба. Според тоа, нуклеозидот се нарекува аденозин доколку во неговата градба учествува аденинот и рибозата (во РНК) или се нарекува дезоксиаденозин доколку е изграден од аденин и дезоксирибоза (во ДНК). Градба на дезоксирибонуклеинска киселина (ДНК) Основниот структурен тродимензионален моделот на ДНК молекулата за првпат е претставен во 1953 година од Ватсон и Крик. Моделот го изградиле врз база на претходните експериментални сознанија добиени од останатите лаборатории кои работеле паралелно на разоткривање на структурата на ДНК. Некои од сознанијата кои тие ги искористиле при формирањето на нивната хипотеза се: - ДНК е изградена од нуклеотиди кои се поврзани помеѓу себе со фосфодиестерски врски. - Количеството на пурински и пиримидински бази во молекулата на ДНК е идентично. Односно, количеството аденин е идентично со количеството на тимин, а на цитозин со гванин. Соодносот помеѓу А и Т со C и G е идентичен кај еден ист вид и специфичен за него. Овие откритија се познати како Чаргаф-ови (Chargaff) правила. 6 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски - Фотографијата која била добиена од анализата на ДНК со помош на кристалографија со X-зраци укажала дека ДНК има спирална или форма на хеликс. Притоа авторите на ова истражување, Р. Франклин (R. Franklin) и М. Вилкинс (M. Wilkins) пресметале дека ДНК има дијаметар од 2 nm и се завива на секои 3.4 nm. На база на овие податоци, Ватсон и Крик изградиле хипотетичен модел со кој предложиле дека молекулата на ДНК претставува двоен хеликс. Хеликсот е составен од две комплементарни вериги чии `рбети се изградени од дезоксирибоза и Слика 5 Оригиналната фотографија фосфорна група поврзани со добиена со кристалографија на ДНК фосфодиестерски врски. `Рбетот на веригите молекулата е поставен кон надворешната страна на хеликсот. Веригите се антипаралелни, односно едната верига се простира во правец од 5` кон 3`, а другата од 3` кон 5`. Азотната база која е врзана за шеќерот е ориентирана кон внатрешноста на хеликсот. Базите во една верига помеѓу себе се поставени на растојание од 0.34 nm. Базите од спротивните вериги формираат базни парови со што ги држат двете вериги заедно и го формираат хеликсот. Притоа пуринските бази се спојуваат со пиримидинските бази и тоа секогаш аденинот се врзува со две водородни врски со тиминот, а гванинот со три водородни врски со цитозинот. Иако природата на овие врски не е толку јака, илјадници вакви врски ја овозможуваат големата стабилност на двојниот хеликс. Ова правило на поврзување на базите се вика комплементарно базно врзување или Ватсон-Криково-ово поврзување. Затоа и се вели дека двете вериги на молекулата на ДНК се комплементарни. Двојниот хеликс еднаш се извиткува на секои 3.4 nm или секои 10 базни парови. При спирализирањето на хеликсот се формираат два типа на Слика 6 Моделот на ДНК иницијално предложен од Ватсон и Крик. На левата страна се претставени двете комплементарни спирално извиткани вериги на ДНК молекулата (aденин (A), тимин (Т), цитозин (C), гванин (G)). На деснат страна се прикажани хемиските врски помеѓу нуклеотидите 7 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски асиметрични жлебови, мал и голем. Големиот е кога веригите се најоддалечени една од друга, а малиот е кога се најблиску. Оваа асиметрија е поради врските на поврзување на елементите во еден нуклеотид и поставеноста на азотната база под агол од 120° во однос на `рбетот. Завиеноста на ДНК е во правец од десно кон лево. Ваквата конформација на ДНК е најчеста и се вика Б-ДНК. Покрај оваа, ДНК може да се сретне во покомпактна форма или А-ДНК и тоа Слика 7 Хемиска структира на Ватсон и Крик најчесто во средина со пониска (панел-горе) и Хогстен (Hoogsteen, панел-доле) влажност како онаа што владее при врските помеѓу нуклеотидите во двојниот кристалографија. Оваа ДНК е десно хеликс ориентирана, има должина на завојот од 24.6 nm и содржи малку повеќе базни парови (10.7) во едно завиткување од Б-ДНК. Поголемата компактност ја прави целата молекула поширока, со дијаметар од 2.3 nm. Во некои случаи, Б формата на ДНК може да помине во Z-форма и обратно. И тоа најчесто се јавува на местата каде што започнува транскрипцијата кај активните гени. Имено, при врзување на РНК полимераза за ДНК, таа предизвикува негативно спирализирање во 5` правецот, а позитивно кон 3` правецот. Новонастанатата конформација има преоден карактер и се враќа на нормалната Б-форма со завршувањето на транскрипцијата. Z-формата се карактеризира со лева ориентација, спирализацијата е во спротивна насока од Б-формата (од лево кон десно). Завивањата се на секои 45.6 nm и во секој завој има по 12 базни пара. Конформациски изгледа како двата синџира да се вкрстени помеѓу себе и притоа истакнатоста на големиот жлеб се намалува, а малиот жлеб станува тесен и длабок. ДНК е динамична молекула која постојано ја менува својата форма и структура. Така, покрај конвенционалната и најчеста Б-форма и веќе опишаните А-форма и Zформа, се јавува во уште многу други различни структурни конформации. Овие структури се формираат поради специфични секвенции во молекулата кои овозможуваат различно спарување или привлекување на нуклеотидите. Така, на пример: Доколку се јават секвенции со одредена должина и центар на симетрија од Слика 8 Шематски приказ на различните форми на ДНК. Со стрелките е претсавен спротивниот правец на движење на комплементарните вериги 8 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски типот на инвертирани повторувања (inverted repeats): CGATCTGG-CCAGATCG, пресликувачки повторувања (mirror repeats): GGTTGGCC-CCGGTTGG или, пак, директни повторувања (direct repeats): GGTTGGCC-GGTTGGCC, молекулата во тој дел може да формира петелка (hairpin). Петелките можат да бидат единечни или повеќе на број и најчесто се наоѓаат во регулаторните елементи на генот за кои се врзуваат специфични протеини. Покрај двоен ДНК, може да се јави и во троен (triple) и кватерен хеликс. Овие различни ДНК структури се неопходни интермедијарни форми кои се јавуваат при кондензацијата на хромозомите, ги градат теломерите, се фромираат при репликација, рекомбинација и транскрипција. Покрај учеството во нормалните биолошки процеси, истите можат да бидат и причина за пречки при репликација или транскрипција. Тројниот хеликс, најчесто, настанува кај повторувачки исти или различни секвенци изградени од пурински/пиримидински нуклеотиди. Тројниот хеликс може да биде од интермолекуларна и интрамолекуларна природа. Интермолекуларниот се создава најчесто при хомологна рекомбинација кога третата верига се поврзува за дуплексот со помош на Хогстен врски. Овие врски се од различен карактер од ВатсонКрик врските, поради различната поставеност на пуринот во просторот. Како предуслов за нивно формирање е ротација на пуринот околу гликозоидната врска. Со помош на нуклеарна магнетна резонанција е потврдено дека скоро 1% од врските во двојниот хеликс привремено се од ваков карактер и најчесто ги има во предели каде повеќе аденини се следени од повеќе цитозини. Интрамолекуларниот троен хеликс се формира најчесто при репликација на ДНК кога ДНК полимераза III после репликацијата, несразмерно повторно ќе удвои еден сегмент од само едната верига. Кватерната структура на ДНК се карактеризира со заемно поврзување на четири секвенци на ДНК. Најчесто се јавува во дел од молекулата на ДНК богата со цитозин. Типичен пример за формирање на кватерна структура на ДНК е пределот на теломерот. Теломерот е крајниот дел на хромозомот во кој ДНК е едноверижна и изградена од илјадници повторувања на TTAGGG. Овие сегменти имаат функција во репликација на крајните делови од хромозомот и негова заштита. За да ја постигнат својата заштитна улога, повторувањата формираат кватерна структура.Таа се добива кога прстени изградени од четири молекула на гванин поврзани помеѓу себе со Хогстен врски, ќе се групираат еден над друг. Дуплекс Триплекс Квадриплекс Слика 9 Шематски приказ на различни структурни форми на ДНК 9 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Кај сите прокариотски организми, молекулата на ДНК се јавува во циркуларен облик. Притоа крајните делови на молекулата се поврзуваат помеѓу себе и формираат структура без слободни краеви. Во еукариотските клетки ДНК од ваков тип е присутна кај митохондриите и хлоропластите. Нормално, при репликацијата на ДНК или, пак, при кинење на едната верига од двојниот хеликс, настанува циркуларен сегмент од ДНК. При кинење на едната верига се формира една циркуларна молекула, а другата непрекината останува непроменета. Кога ДНК ќе се завитка (усука) околу својата оска, повеќе отколку во нормалната релекасирана форма, ќе се добие суперизвиткана ДНК. Притоа, доколку усукувањето е во правец на извиеноста на молекулата на ДНК (кај Б-ДНК од десно на лево, позитивно извиткување), ќе се добијат повеќе од десет базни пара во едно извиткување и молекулата на ДНК добива покомпактна структура. Ова е особено важно за контрола на волуменот на ДНК, односно овозможува истата и покрај својата значителна должина, да се смести Слика 10 Електронмикрограф на во јадрото на клетката. Доколку усукувањето е циркуларна митохондријална ДНК. спротивно од извиеноста на ДНК, во тој случај Rелаксирана структура е прикажана станува збор за негативно суперизвиткување. Со на горниот панел, а суперизвиткана ова извиткување се добива релаксирана форма на долниот панел на ДНК, која најчесто е неопходна при процесот на транскрипција. Овие извиткувања се посредувани со помош на група ензими неречени топоизомерази. Структурната организација, двојниот хеликс и врските кои владеат во него ѝ даваат исклучителна стабилност на ДНК молекулата. Како потврда на ова се изолираните неоштетени делови од ДНК од фосили кои живееле пред десетици илјади години. Ваквата структура овозможува точно и сигурно складирање и пренесување на информациите за функционирање на самата клетка. Со еволуцијата на оваа молекула, организмите пронашле начин како да го заштитат својот животен код од менување или исчезнување. 10 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Рибонуклеинска киселина (РНК) РНК е вториот вид на нуклеинска киселина присутна во клетката. Покрај замената на дезоксирибозата со рибоза и присуството на урацил, наместо тимин, примарната структура на РНК е идентична со онаа на ДНК. Разликата во пентозниот шеќер, кој учествува во градбата на нуклеинските киселини, е само во позицијата 2` каде во дезоксирибозата C атом е поврзан со H, а во рибозата со OH група. ОH групата во молекулата на РНК ја прави истата хемиски понестабилна и овозможува поголема реактивност во ензимски посредуваните реакции. РНК, исто така, се среќава во различни структурни конформации, па така може да биде: едноверижна и двоверижна, линеарна или циркуларна. Во споредба со ДНК, промените на просторните конфигурации кај РНК се многу почести и од нив најчесто зависи функцијата на самата молекула. Комплементарните места на едноверижната молекула можат по принципот на комплементарно базно поврзување (A со U, и C со G) да се врзат и притоа да формираат Слика 11 Хемиска структура на РНК тридимензионална структура. Наједноставни секундарни структури се добиваат доколку дојде до спарување на неколку нуклеотиди (од 5 до 10) и се формираат мали јамки (петелки) кои се викаат „hairpin“, а доколку дојде до преклопување на поголеми секвенции од неколку стотици нуклеотиди, се формираат „stem loops“. Ако дојде до преклопување и заемно поврзување од поголеми размери, при што молекулата се завиткува околу истите, се добива терциерна структура. Доколку дојде до поврзување на повеќе молекули на РНК во една молекула, се добива кватерна структура. Овие комплексни структури, кои наликуваат многу на оние кај протеините, можат да имаат и каталитички својства. Имено, ваквите форми на РНК можат да учествуваат во сечењето на РНК при процесот на сплајсинг (splicing, објаснето подоцна), или, пак, да ги катализираат пептидните врски при полимеризацијата на аминокиселините во полипептиди. Ваквите РНК молекули се нарекуваат рибозими (ribozymes) и за нивното пронаоѓање С. Алтман (S. Altman) и Т. Чех (T. Cech) во 1989 год. ја добиле Нобеловата награда за хемија. На база на својата Слика 12 Шематски приказ на секундарна и терциерна структура на РНК 11 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски хемиска градба и разновидната просторна структура, РНК се наоѓа помеѓу едноставноста на ДНК и комплексноста на протеините. Теоријата за хемиска еволуција се базира на тоа дека животот се создал од молекула која имала способност да се самореплицира и, притоа, не била ограничена во просторот со мембрана. Притоа, е потребно молекулата истовремено да е матрица која ги носи информациите и да ги катализира реакциите кои ќе учествуваат во нејзината саморепликација. Во контекст на ова, молекулата на РНК поседува повеќе карактеристики од ДНК за молекула од која, можеби, настанал животот. Како и да е, сè уште не е докажано дека молекулата на РНК може да се самореплицира. Најблиску до докажување на ова својство, по експериментален пат е стигнато со in vitro селектирање на рибозими кои имаат способост да додаваат рибонуклеотиди на крајот од растечка верига на РНК. Поддржувачите на теоријата дека РНК е молекулата од која настанал животот, сметаат дека ДНК настанала со еволуција на РНК при која е добиена молекула која е постабилна, каталитички неактива и при процесот на синтеза на протеини не е изложена на опасност од менување или деградирање. Рибозомална РНК (рРНК) Само мал процент (3-5%) од целокупната РНК во клетката, отпаѓа на иРНК. Останатиот дел е РНК со протеин-некодирачки својства. За разлика од прокариотите, каде РНК полимераза има својство да ги синтетизира сите типови на РНК, кај еукариотските клетки различни РНК полимерази учествуваат во синтеза на различни РНК. Најзастапена РНК во клетката е рибозомалната РНК (рРНК). На оваа молекула отпаѓа околу 80% од целокупната РНК во клетката. рРНК се синтетизира со помош на РНК полимераза I, која за разлика од РНК полимераза II, нема опашка која учествува во создавањето на „капа“ и поли(А) формациите на иРНК. Се претпоставува дека ова е и една од причините зошто рРНК нема „капа“ и поли(А) опашка. рРНК молекулите влегуваат во состав на рибозомите, односно, секоја молекула на рРНК е краен продукт, кој за да се надополни, повторно треба да се синтетизира. Ова е различно од иРНК, која може да биде матрица за синтеза на повеќе протеини. Ако се земе предвид дека една активно пролиферирачка клетка има околу 10 милиони рибозома, лесно може да се заклучи дека клетката треба да создаде најмалку 10 милиони рРНК единици. Ова може да се постигне само доколку во геномот на клетката има мултипни копии кои служат како матрица за синтеза на рРНК. Така, хуманиот геном содржи околу 200 копии кои се групирани на пет различни хромозома. Во составот на Слика 13 Синтеза на рРНК. Прикажана е рибозомите на еукариотската модификацијата на на прекурсорната рРНК со која се добиваат 18S, 5.8S и 28S рРНКи клетка влегуваат четири различни рРНК, од кои 18S, 5.8S и 28S се добиваат со модифицирање и сечење на една прекурсор рибозомална РНК верига, долга околу 13000 нуклеотиди. 5S рРНК се добива со независна транскрипција. Модифицирањето на прекурсор рРНК се одвива под дејство на мали нуклеарни РНКи (small nucleolar RNAs (snoRNAs)) кои најчесто се кодирани во интроните на рибозомалните протеини. Комплементарните сегменти од 12 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски рРНК молекула имаат способност да се поврзат помеѓу себе, а на некомплементарните краеви да формираат петелки. Интересно е да се напомене дека и покрај тоа што секвенцијата на нуклеотидите во рРНК кај различни видови е различна, комплементарните поврзувања и формираните петелки се на идентични места. Централно место за формирање на рибозомалните компоненти е нуклеолусот. Тоа е најпроминентна органела во клеточното јадро која лесно се забележува со микроскоп. Во неа се гените за синтеза на рРНК, прекурсорната РНК, ензимите кои учествуваат во реорганизација на прекурсорната рРНК, Слика 14 Електронмикрограф на нуклеусот snoRNA, сите видови на рРНК, рибозомалните протеини, делови од рибозомите. Присуството на сите компоненти на едно место овозможува лесно составување на рибозомите. Бидејќи гените за рРНК се групирани на краевите на 5 различни хромозома (13, 14, 15, 21, и 22), односно на 10 кај диплоидна клетка, краевите на овие хромозоми се групираат кога се формира нуклеолусот. Кога сме веќе кај нуклеолусот, да напоменеме дека во него, исто така, се синтетизираат и модифицираат уште многу други некодирачки РНКи, како тРНКи и се формираат различни РНК-протеин комплекси. Покрај споменатите рРНК во градба на рибозомите учествуваат и над 50 различни протеини кај бактериите и 30-ина повеќе кај еукариотите. Подединиците се обележани со „S“ големини кои ја претставуваат нивната седиментациона единица. Двете подединици се формираат во нуклеолусот и оттаму се транспортираат во цитоплазмата каде се спојуваат со иРНК и го формираат рибозомот. Кога рибозомот не е активен, двете подединици се раздвоени. Функцијата на малата подединица е да ја држи иРНК и, притоа, да може да се запази рамката на транслацијата, додека во големата подединица се случува синтезата на полипептидот. Големата подединица содржи три сегмента каде што врзуваат тРНКи. Првиот сегмент или А (acceptor) е местото каде што се прима тРНК која носи нова аминокиселина. Следната централна позиција се нарекува P (peptide bound formation) е местото каде тРНК го држи полипептидниот ланец кој се синтетизира. Последната E (exit) е единица во која тРНК не е повеќе поврзана со аминокиселина и е подготвена да излезе од целиот Слика 15 Шематски приказ на малата и подединица на рибозомот. комплекс. Поради истата големата тридимензионална форма, сите тРНК Прикажани се 3-те сегменти A, P и E можат да влезат и да излезат од трите A, 13 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 16 Обојување по Гимза на хуманите хромозоми. На периферниот дел на хромозомите 13,14,15, 21 и 22 се прикажани деловите кои кодираат рРНК P, E рибозомални позиции. Синтезата на протеинот во рибозомите се базира на три чекора кои се повторуваат. Првиот е кога тРНК навлегува во А единицата и се воспоставува врската помеѓу кодонот и антикодонот. Пептидна врска се овозможува помеѓу аминокиселината (пептидот) кој е прицврстен за тРНК која се наоѓа на позиција P и аминокиселината на позиција А. Последниот чекор се состои од поместување на рибозомот во 3` правец за еден кодон. Притоа тРНК, која се наоѓа на позиција E, излегува од рибозомот, тРНК од позиција P преоѓа на позиција E, тРНК, која се наоѓа на позиција А, преоѓа на позиција P. При овој единечен циклус, полипептидот добил една аминокиселина повеќе и притоа позицијата A останува празна со што се создаваат услови за навлегување на нова тРНК која ќе ја донесе наредната аминокиселина во ланецот. Со ова циклусот се повторува. Синтезата на полипептидниот ланец кај бактериите е некаде околу 20 аминокиселини во секунда, додека кај еукариотските клетки 2-5 аминокиселини во секунда. Слика 17 рРНКи и рибозомалните протеини кои влегуваат во градба на рибозомоте кај прокариотските и еукариотските организми 14 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски СТРУКТУРА НА ГЕНОМОТ Општи карактеристики кај прокариотите и еукариотите Целокупната генетска информација во организмот го претставува геномот. Тој кај сите еукариотски организми се дели на: нуклеарен дел, составен од линеарни ДНК молекули сместени во хромозомите и органелен (митохондријален кај животните) дел, составен од мали циркуларни молекули. Варијациите во големината на геномот кај еукариотите е голема. Најмалиот е помал од 10 Mbp, а најголемиот е над 100.000 Mbp. Притоа, големината соодветствува со комплексноста на организмот и бројот на гените. Тоа е и логично бидејќи за покомплексен организам потребни се и повеќе информации, односно гени, а со тоа и поголема ДНК молекула. Меѓутоа, доколку се спореди бројот на гените со големината на геномот, ќе се увиди дека соодносот не е пропорционален. Поедноставните организми многу поекономично го користат геномот. Тие имаат многу повеќе гени во еден сегмент на ДНК, гените содржат помалку интрони и имаат многу помалку некодирачки повторувачки секвенции (genome-wide repeats). Во просек, на секои 1Мb од геномот на човекот има по 11 гена, додека во исто толкава секвенција кај S. Cerevisiae (квасец) има 479 гена. Во целиот геном кај S. Cerevisiae има само 239 интрона или во просек 0.04 интрона на еден ген, во споредба со над 300.000 кај човекот или во просек по 9 интрона на секој ген. Дополнително, над 40% од човечкиот геном се состои од секвенции кои се повторуваат, споредено со само 3.4% кај квасецот. Слика 18 Компарација на 50 kb од геномот на човек, квасец (Saccharomyces cerevisiae), винска мушичка (Drosophila melanogaster), пченка и Escherichia Coli 15 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Геномот кај прокариотите се разликува многу од оној кај еукариотите. Во однос на големината е значително помал. На пример, кај Е. Coli е голем: 4639 базни пара во кои се кодирани 4405 гени. Во организациска структура геномот на повеќето прокариоти се состои од една циркуларна ДНК молекула, а со тоа и еден циркуларен хромозом. Надвор од хромозомот имаат мали циркуларни ДНК молекули (од 1 до 1000 kbp), наречени плазмиди. Плазмидите носат информации за некои посебни карактеристики на организмот со кои се адаптираат кон надворешната средина, на пример, резистенција кон антибиотици. Плазмидите можат да се размножуваат независно од хромозомот, така што нивниот број во клетката не е константен. Некои прокариоти имаат покомплексна организација на геномот, притоа наместо единечна циркуларна ДНК молекула, имаат повеќе линеарни ДНК молекули. Пример, Borrelia burgdorferi B31 има линеарен хромозом поврзан со повеќе линеарни и циркуларни ДНК молекули. Ако се спореди, ќе се види дека геномот на прокариотите е уште покомпактен во споредба со наједноставните еукариоти. Гените кај прокариотите не содржат интрони (освен во исклучителни ретки случаи), притоа протеин кодирачките секвенции се значително пократки отколку кај еукариотските. На сликата бр. 17 може да се види дека во 50 kb секвенција кај E. Coli сместени се 43 гена. Притоа, некои гени се „залепени“ еден за друг. Односно, кога едниот ген ќе заврши, веднаш по него започнува следниот. Ова особено е присутно во опероните. Оперон е група на гени кои учествуваат во една биохемиска реакција и притоа делат заеднички експресионен регулаторен механизам. Пример, гените thrA, thrB и thrC формираат еден оперон, кој учествуваат во синтезата на аминокиселината треонин. 16 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Општи карактерискики на хромозомите Хромозомите се структури во клетката во кои е инкрпориран генетскиот материјал во форма на двоверижна молекула на ДНК. Доминантно се изградени од ДНК и протеини, формирајќи стуктура наречена хроматин. По должината на молекулата на ДНК се сместени гените и останатите генетски регулаторни елементи, кои се носители на наследните особини на организмот. Кај бактериите, обично, има само еден хромозом, додека кај организмите кои полово се размножуваат се среќаваат парови од хромозоми, хомологни парови. На хомолгите хромозоми на исти локации се распоредени гени, генски алели, кои носат инфомации за иста наследна особина. Центромерот е примарното стеснување на хромозомот. Тоa е место каде што се формира кинетохорот при клеточната делба. Центромерот го сегментира хромозомот на два крака, пократок кој се обележува со p (petit) и подолг крак q. Според должината на p и q краковите, односно според поставеноста на центромерот, метафазните хромозоми се класифицираат на: метацентрични, субметацентрични, акроцентрични и телоцентрични. Метацентричниот хромозом има централно поставен центромер, а со тоа и скоро идентични два хромозомски крака. Кај субметацентричниот хромозом центромерот е локализиран повеќе кон едниот крај на хромозомот. Акроцентричниот хромозом има центромер кој е поставен скоро на крајот на хромозомот и притоа се формираат јасно изразен пократок и подолг хромозомски крак. Телоцентричниот хромозом има центромер кој е поставен на треломерниот (крајниот) дел од хромозом, а со Слика 19 Класификација на хромозомите во однос на поставеноста на ценромерот тоа изостанува и p кракот. Збирот на сите хромозоми во едена клетка се означува како кариотип. За полесна идентификација, хромозомите се ообојуваат или обележуваат со специфични цитолошки методи и сликовито се прикажуваат подредени во однос на нивната големина и во парови. Таквиот сликовит приказ се вика кариограм. Една од првите воведени и најчесто користени техники е обојувањето на хромозомите по Гимза. Со помош на ова обојување на хромозомите се разликуваат сегменти со различен интензитет на обојување, G бандови. Притоа, местата каде што хромозомите се покондензирани се обојуваат потемно, а местата каде што хроматинот е порелаксиран се обојуваат посветло. Секој хромозом има каректеристичен распоред на G бандовите, со што се овозможува полесна идентификација и класификација. Покрај големината на хромозомоот и положбата на центомерот, распоредот на G бандовите е една од првите индикатори при анализа на структурните хромозомски аберации. Околу 300 G бандови можат за се забележат на хуманите хромозомите во метафаза, а околу 800 во прометафаза. Слика 20 Кариограм на жена 17 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски За полесна детерминација на генските локуси секој хромозомски крак е поделен според бандовите на региони, а секој регион е на подбандови, а секој подбанд на подподбандови. Нумерирањето на сите елементи започнува од центромерот кон теломерите. При номенклатурата на хромозомите најпрво се назначува бројот на хромозомот, потоа следи кракот, па бeндот, па подбендот и на крај подподбендот. Така, на пример, локацијата на CFTR генот е 7q31.2, односно генот се наоѓа на хромозомот 7, q кракот, бандот 3, подбендот 1 и подподбендот 2. Слика 21 Нумеричко обележување на G бендовите на хромозоми кај човекот. На левата хроматида е претставен распоредот на G бендовите кога клетката е во метафаза, а на десната хроматида е прикажан распоредот во прометафаза Бројот на хромозомите, нивната стуктура и големина се видова специфичност за секој организам, притоа не се поврзани со нивото на еволутивниот развиток на ораганизмите во кој се наоѓаат. Така, на пример, човекот има 46 хромозома (Homo sapience), глушецот (Mus musculus) 40, винската мушичка (Drosophila melanogaster) 8, кучето (Canis familiarus) 78, говедото (Bos taurus) 60, а мачката (Felis catus) 38. Иницијално трите хромозомски карактеристики, големината, положбата на центромерот и присуство или отсуство на сателит, се земени во предвид при класификација хромозомите кај човекот. Според овие параметри хромозомите се поделени во подгрупа А, 1-3; B, 4-5;C, 6-12; D, 13-15; E, 16-18; F 19-20; G, 21-22; X, Y. Хромозомите X и Y се викаат полови хромозоми (гоносомни хромозоми) бидејќи имаат доминантна улога во детерминирање на полот. Кај човекот и скоро сите цицачи женските индивидуи имаат два X хромозоми (XX), додека машките имаат еден X, и еден Y(XY). Y е значително помал од X хромозомот и на него се сместени неколку гени значајни за развитокот на тестисите (SRY) и сперматогенезата. 18 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Молекуларна организација на хромозомите Линеарните молекули на ДНК се интегрирани во хромозомски структури. Должината на хромозомите е многу помала од должината на ДНК молекулата. ДНК молекулата кај човекот е 3m долга, „спакувана“ во хромозоми кои се со микроскопски димензии. За да се овозможи долгата ДНК молекула да се собере во клетката, таа се кондензира во компактна структура со помош на група од протеини, хистони. Пет различни типа на хистонски протеини, H1, H2A, H2B, H3 и H4 се во корелација со еукариотската ДНК. Овие протеини имаат позитивен електричен полнеж и реагираат со негативно наелектризираната фосфорна група од нуклеотидите. Интересно е дека градбата на H2A, H2B, H3 и H4 протеините е слична кај сите еукариотски организми. Помеѓу некои видови организми разликата е само во една аминокиселина. Во средината на 70-тите години на минатиот век, хистоните за првапат биле визуализирани со помош на електронски микроскоп и опишани како „бисери нанижани на конец“. Притоа, ДНК молекулата го претставува „конецот“, а нуклеосомите се бисерите. Нуклесомите се основните структури на хроматинот и се составени од протеини и ДНК. Во средината на нуклеосомот се наоѓа октамер од хистонски протеини, по два од H2A, H2B, H3 и H4. Околу основата октамерната хистонска структура 140 до 150 bp од ДНК прават скоро два завоја. Помеѓу два нуклеосома се наoѓа секвенција од 50 до 70 bp која се нарекува линкер ДНК (linker DNA). Според ова, должината на ДНК од еден нуклеотид до друг нуклеотид се движи од 190 до 220 bp. Варијацијата во должината е видова специфичност. Истовремено, за нуклеосомот и линкер ДНК се центромер поврзува една молекула на H1 хистонот. Оваа структура се нарекува хроматозом. Функцијата на H1 протеинот не е до крај разјаснета. Има различни објаснувања, од тоа дека учествува во намалување на должината на линкерот, до тоа дека Слика 22 Структура на хроматинот. го менува аголот под кој Претставени се различните степени на нуклеозомите се поставени. кондензација на хроматионот. Одозгоре надолу: нуклеозомски филамент, хромотинско Класичното толкување е дека H1 ја ДНК, влакно, соленоидна структура, кондензиран стабилизира врската помеѓу ДНК и сегмент од хромозомот и, хромозом во митоза октамерот во нуклеозомот, не дозволуваjќи ѝ на ДНК да се расплете од структурата. 19 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Нуклеозомскиот филамент, структурата која наликува на „нанижани бисери“, е многу ретка состојба во која се наоѓа хроматинот. Таа продолжува да се спирализира, формирајќи хроматински влакна со дебелина од 30 nm кои наликуваат на спирала или пружина. При овој втор степен на спирализација, се добива таканаречена соленоидна структура (solenoid structure). Оваа е најчестата состојба во која се наоѓа хроматинот за време на интерфазата. Постојат две толкувања за тоа кој ја овозможува компактноста на оваа Слика 24. Електронмикрограф на хроматин. Структура која наликува структура. Едното толкување е дека линкерните на нанижани бисери. хистони го намалуваат растојанието помеѓу два нуклеозома, а другото толкување е дека краевите на протеините, кои го градат октамерот, се поврзуваат помеѓу различни нуклеозоми и ја овозможуваат кондензацијата. Најверојатно е дека N-терминален дел и двата механизма учествуваат во создавањето на вториот степен на спирализација. Секој од Ацетил октамерните протеини имаат слободен N-крај составен од 20 до 40 аминокиселини. Со овој Ацетил сегмент, хистонските протеини се поврзуваат помеѓу себе во истиот или соседниот нуклеозом. Ацетил Некои од краевите се во тесна врска и со линкер протеините. Во овој дел од протеините, лизинот специфично подлежи на ацетилација и Ацетил деацетилација. При ацетилација, позитивниот електричен полнеж на лизинот се губи и со тоа се намалува неговата врска со фосфорната група во молекулата на ДНК. Колку повеќе лизини се ацетилирани, толку хроматинската структура е во „порелаксирана“ форма, односно кондензацијата е намалена. Ацетилација и деацетилација на N краевите на хистонските протеини се динамички процеси кои играат и голема улога во контрола на транскрипцијата и репликацијата. 30 nm хроматинска нишка продолжува да се спирализира (третиот степен на спирализација), формирајќи поголеми извиткувања во форма на петелки. Притоа се прикачува за структура од нехистонски C-терминален дел протеини кои формираат хромозомски скафолд. Скафолдот ја има формата на метафазниот Слика 24 Ацетилација на лизионот хромозом. При процесот на клеточна делба, на N-терминалниот дел на H4 неопходно е дополнително кондензирање на хроматионот, така што спирализацијата и кондензацијата продолжуваат (IV степен на спирализација) за да се постигне максималната компактност, која е карактеристична за хромозомите во метафаза или анафаза. 20 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Организација на хетерохроматинот Уште со првичните анализи на клеточното јадро било забележано дека хроматинот може да биде во кондензирана форма, наречена хетерохроматин и во некондензирана форма, еухроматин. Еухроматинска состојба на хроматинот е кога се наоѓа во форма на 30nm хроматинското влакно или, евентуално, малку покондензирана состојба. Со понатамошна спирализација, хроматинот преоѓа во хетерохроматинска форма. Некаде околу 10% од геномот се наоѓа во хетерохроматинска состојба. Хетерохроматинот, најчесто, е групиран во специфични региони на хромозомот, вклучувајќи ги теломерот и центромерот. Вообичаено, овие хетерохроматински сегменти се сиромашни со гени или воопшто ги нема. Доколку генот е спакуван во хетерохроматинска структура, тој е транскрипционо неактивен. Експериментално е покажано дека активен ген доколку се наоѓа во хетерохроматичен хроматин станува неактивен и обратно, хетерохроматинот доколку се декондензира, во тој случај генот кој се наоѓа во него станува транскрипцоионо активен. Позицијата на хроматинот во однос на гените, исто така, делува на нивната активност. Наједноставно ова ќе го објасниме со примерот за влијанието на хроматинот на експресијата на white генот кај винската мушичка. Бојата на очите кај винската мушичка е црвена и зависи од генот white. Доколку дојде до мутација на овој ген, бојата на очите ќе биде бела. При ретки хромозомски мутации, може да дојде до позиционирање на генот white во близина на хетерохроматинот. Притоа, генот е нормален, само неговата позиција е сменета. Во овој случај, винската мушичка ќе има очи во кои делови ќе имаат црвена, а делови бела боја. Ген (w) Белата боја потекнува од клетките Хетерохроматин во кои позициониот ефект на хетерохроматинот ја деактивирал активноста на white генот. Црвената боја потекнува од истиот тој ген кој транслокација во случајов не е активиран. Активен е бидејќи не бил „зафатен“ од хетерохроматинот при неговото Ген (w) формирање во ембрионалниот развиток. Оваа состојба е наследна, односно позициониот ефект на Слика 25 Позиционен ефект на хроматинот врз хетерохроматинот врз генетската експресијата на white (w) генот кај винската активност се пренесува од мушичка генерација на генерација. Градба на хетерохроматинот во теломерниот дел на хромозомот И покрај тоа што хетерохроматинските сегменти од хромозомот не се активно вклучени во синтезата на протеините, не станува збор за „непотребна ДНК“. Овие делови имаат исклучителна важност за зачувување на интегритетот на ДНК во хромозомот, а со тоа обезбедуваат и опстанок на клетката. Така, хетерохроматинот во теломерниот дел на хромозомот овозможува крајот на ДНК молекулата да не биде препозната како прекината ДНК. Воедно, ја контролира должината на теломерот и најверојатно зема активна улога при клеточната делба. Теломерот се состои од кратки повторувачки ДНК секвенции. Кај човекот се повторувања од шест нуклеотида, 5′-TTAGGG-3′. За нив се врзуваат различни групи на протеини кои влегуваат во различни процеси. Некои од нив се: формирање на хетерохроматинска структура на краевите на хромозомот, регулација на должината на теломерот, локализација на теломерот во јадрото (најчесто блиску до јадрената мембрана). 21 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Мутационите анализи на квасецот покажале дека промени на протеините од групата Sir (Silent information regulator) индуцираат генетска активност на гените лоцирани во теломерниот регион. Понатамошните анализи го објаснуваат комплексот на теломерврзувачки Sir протеини (telomere-bound Sir protein complex) кој специфично се врзува за деацетилираните краеви на хистонските протеини. Деацетилацијата, пак, од своја страна е еден од предусловите за кондензирање на хроматинот. Еден од протеините во целиот комплекс е и Sir2 кој е хистон деацетилаза. Sir2 во присуство на NAD+ индуцира дополнителна деацетилација на хистоните и со тоа овозможува дополнителни протеини од Sir комплексот да се поврзат. На овој начин се „шири“ хетерохроматинот по должината на ДНК. Овој процес е од исклучителна важност при репликацијата на хромозомите. Раздвоените сестрински хроматиди имаат по половина од хетерохроматинските протеини и со способноста за „ширење“ се обновува хетерохроматинот кој недостасува. Во моделирањето на хетерохроматинот, покрај Sir протеинскиот комплекс, учествуваат и други фактори. Еден од нив е ДНК-врзувачки протеини кои се врзуваат со еден дел за теломерната ДНК, а со другиот дел за Sir протеините. Покрај деацетилацијата во моделирањето на хетерохроматинот учествува и хистон метил трансферазата. Овој ензим специфично го метилира лизинот на позиција 9 од H3 протеинот. Вака метилираниот лизин е дополнително врзувачко место за протеините кои влегуваат во хетерохроматинскиот комплекс. Слика 26 Предложен модел за градбата на хетерохроматинот во делот на теломерот. Деацетилираните краеви на хистонските молекули (пред се H3) се поврзуваат со Sir протеините со што се овозможува поврзување на нуклеозомите помеѓу себе во компактна структура. За разлика од тоа, хистонските молекули во еухроматинот се ацетилирани и не се поврзуваат со Sir протеините. ДНК врзувачките протеини се врзуваат за ДНК од крајот на хромозомот и за Sir протеините формирајќи извиткувања со кои се кондензира теломерот 22 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Градба на хетерохроматинот во центромерниот дел од хромозомот Центромерот, исто така, е изграден од хетерохроматин. Неговата структура сè уште потполно не е разјаснета. Ги поседува сите општи карактеристики на хетерохроматинот. Дополнително на хистонските молекули, кои и овде се деацетилирани и метилирани, поседува и десетици различни специфични компоненти кои ја овозможуваат функцијата на центромерот. Карактеристично за центромерот е присуство на специфичен тип на нуклеозоми кои во себе покрај класичните хистонски протеини, H2A, H2B и H4, содржат изменета форма на H3 протеинот, кај човекот наречена CENP-A. ДНК во центромерниот регион е составена од кратки повторувачки секвенции (higher-order repeat (HOR)). Центромениот регион, вообичаено, е сиромашен со гени, освен кај некои организми кај кои се пронајдени протеин-кодирачки секвенции. Кај растението Arabidopsis thaliana се мапирани од 7 до 9 гена на секои 100 kbp. Хуманите повторувачки секвенции се составени од уште помали повторувачки елементи кои се големи 171 bp и се викаат αсателитска ДНК (alpha satellite DNA). Интересно е дека оваа секвенција не е специфична само за центромерот, туку е присутна и во други делови на хромозомот. Ова наведува Слика 27 Структура на хуманиот хромозом. Организација на повторувачките центромерни елементи и α сателитската ДНК (горен панел). Организација на центромерот и кинетохорот (долен панел). Со сино е претставен хетерохроматин во кој ДНК не е составена од α сателитски повторувања. Поставеноста на двете плочи на кинетохорот и микротубулите е, исто така, прикажана дека местото на создавање на центромерот, пред сè, го дефинира иницијалното поврзување на протеините за ДНК, отколку самата ДНК секвенција. На кој начин се воспоставува иницијалната ДНК-протеин врска сè уште не е познато. Меѓутоа, веднаш по обележувањето на местото каде што треба да се создаде центромерот, факторите кои го градат комплексот почнуваат да се надоврзуваат еден по друг. Најпрво се создава внатрешната плоча на кинетохорот, па следува надворешната, за која за време на митозата се закачуваат микротубулите од делбеното вретено. Маркираното место, каде треба да се формира центромерот, останува и по клеточната делба, со тоа центромерот се создава во истиот регион и на новосинтетизираните хромозоми. 23 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Заштитна улога на хетерохроматинот Повторувачки сегменти на ДНК се дел од хетерохроматинот во регионот на теломерот и центромерот. Спротивно на ова, во еухроматинот влегуваат најчесто неповторувачки секвенции кои кодираат информации за синтеза на протеини. Ова наведува дека, можеби, повторувачките елементи се основа за создавање на хетерохроматинот, односно го даваат иницијалниот сигнал да започне формирање на хетерохроматинот. За да се провери оваа хипотеза, изведени се неколку едноставни истражувања: секвенција на повеќе стотици копии на еден ген биле внесени во герминативните клетки на глушец и била анализирана нивната активност. Интересно, на местото каде што се интегрирала повторувачката секвенција се создал хетерохроматин. Притоа, гените биле транскрипциски неактивни. Кога на истиот дел од хромозомот бил вметнат истиот единечен ген, истиот бил транскрипциски активен. Овој експеримент наведува на заклучок дека клетката со формирање на хетерохроматин во повторувачките секвенции на некој начин се заштитува од нивното негативно влијание. Зголемената неконтролирана експресија на повеќето од гените, најчесто, ќе предизвика нарушување на функцијата на клетката. Формирањето на повторувачки секвенции во ДНК е многу често. Како причина за ова се најчесто мобилните ДНК елементи, транспозомите. Покрај инхибиција на транскрипцијата, хетерохроматинот го спречува и понатамошното ширење на овие елементи. 24 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Дистрибуција на гените во геномот Претходно напоменавме дека еухроматинските регионите се богати со гени во споредба со хетерохроматинските региони. Ова индицира дека дистрибуцијата на гените не е рамномерна. Во суштина, генетската дистрибуција кај повеќето еукариотски организми е случајна со големи варијации во самиот хромозом и помеѓу хромозомите. Kaj Arabidopsis thaliana, просечната густина е 25 гена на 100 kbp. Доколку не се земат предвид теломерите и центромерите, бројот на гени се движи од 1 до 38 на 100 kbp. Бројот на гени во хуманиот геном се движи од 0 до 64 на 100 kbp. Генетската дистрибуција не е еднакво распоредена на сите хумани хромозоми. Сегментите богати со гени, се раздвоени со сегменти сиромашни со гени. Генетската дистрибуција во хуманиот геном сликовито може да се претстави со специфично обојување на хромозомите. Некои бои имаат афинитет кон одредени базни парови. Како на пример, при обојување по Гимза (Giemsa), регионите богати со аденин и тимин се обојуваат темно. Генерално, гените содржат повеќе G-C парови отколку А-Т. Според тоа, логички треба да се очекува дека темно обоените хромозомски сегменти (G-band) по Гимза, ќе бидат посиромашни со гени отколку необоените. Со помош на „Human Genome Project“ со кој се секвенционираше геномот на човекот и со развивањето на новата технологија за секвенционирање на ДНК, се овозможија услови за детална анализа на геномот на човекот и другите организми. И покрај тоа што веќе петнаесетина години е Слика 28 Хуман кариограм. Хромозомите се секвенционирана скоро целата ДНК обоени по Гимза и G-band распоредот е молекула на човекот (99%), сепак ни прикажан. Со црвено е обележан центромерот. оддалеку не е разјаснето која е Сегементите од ДНК, кои се состојат од функцијата на секој нејзин поединечен рДНК, се исто прикажани. „Constitutive дел. Некои од генералните заклучоци heterochromatin“ (обележан со жолто) е кои произлегоа со иницијалното хетерохроматин кој многу малку подлежи на секвенционирањето на хуманиот геном промени и е сиромашен со гени се: - Хуманиот геном се состои од над 3 билиони нуклеотиди, од кои само околу 5% учествуваат во градба на протеин-кодирачки секвенции. - Повеќе од половината од геномот се состои од транспозомални елементи, LINE и Alu секвенции. Ова значи дека најголема секвенција од нашиот геном потекнува од вирусната ДНК. - Хуманиот геном содржи од 25.000 до 30.000 протеин-кодирачки гени. - Повеќе од 41% од гените се со непозната функција. Најголем дел од гените со позната функција учествуваат во метаболизмот на нуклеинските киселини (7.5%), потоа следуваат транскрипциските фактори (6%) и рецепторските протеини (5%). Дијаграмот на гените кој ја прикажува функционалната групираност е прикажан на слика бр. 28. 25 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски - Гените не се рамномерно распоредени во геномот. Најголема густина на гени се забележува на хромозомот 19, а со најмала на Y. - Најголем ген е генот на дистрофин (2.5 Mbp). - Бројот на интрони во хуманите гени се движи од 0 кај хистонските гени до 235 кај генот титин. - Редоследот на речиси сите нуклеотиди (99.9%) кај сите луѓе е идентичен. Како сè уште несеквенционирани делови од хуманиот геном, остануваат некои репетативни секвенции кај кои, поради нивниот повторувачки карактер, не може да им се одреди точниот нуклеотиден редослед, како и деловите околу центромерот, теломерот или ДНК кои се во хетерохроматинска состојба. Групирања на гените според нивната функција Редоследот на нуклеотидите го дава точниот аминокиселински состав на протеините, што ни оддалеку не е доволно за да се знае функцијата на тој протеин. Функцијата на протеинот не произлегува само од неговиот аминокиселински состав, туку и од неговата тридимензионална структура. Генерално, се користат два начина да се класифицираат гените, односно протеините, според нивната функција. Едното групирање е доколку е позната нивната функција базирано на мутациони анализи. Притоа, гените се поделени според нивната инволвираност во клеточното функционирање, вклучувајќи учество во сигнални патишта, клеточна интеракција, метаболичката активност или ензимска активност. Нормално, овие општи категории понатаму можат да се поделат на поткатегории, како, на пример, гени кои учествуваат во репликација на ДНК, во транскрипција, транслација и така натаму. Ова е една од најточните класификации бидејќи се темели на точно определени карактеристики. Некои гени учествуваат во повеќе различни процеси, па така во зависност од Слика 29 Гените од хуманиот геном групирани според нивната функција. Претставени се бројот на гените и нивниот процент од вкупниот геном класификацијата, можат да се вбројат во повеќе различни категории. Како недостаток на овој начин на класификација е што, речиси, половината од гените се со непозната функција. Со тоа овие гени не можат да влезат во процесот на анализа. Aлтернативен начин на карактеризација на протеинот е да се предвиди неговата функција на база на неговите структурни елементи. На пример, функцијата на ДНК врзувачките протеини се базира на нивната способност да се врзат за ДНК со помош на специфичен домен (сегмент од протеинот). Структурата на овие домени е иста или слична кај различни протеини од ваков вид. На база на типот на доменот, може да се направи класификациона група, пример, група на протеини кои имаат zink finger домен. Слично 26 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски е и со протеини кои учествуваат во процесот на апоптозата. На овој начин, и покрај тоа што на некои протеини не им се знае точната функција, сепак можат да бидат класифицирани според структурните елементи кои ги содржат. Генски фамилии Мултигенетска фамилија е група на гени во еден организам кои кодираат протеини со иста или слична секвенција. Идентичноста може да биде во целата секвенција или само во определени делови, на пример, исти домеини. Кога станува збор за гени од кои се синтетизираат исти или скоро исти транскрипти, станува збор за класични или едноставни мултигенетски фамилии. Таков е примерот со ДНК секвенцијата која ја кодира рРНК. На хромозомот 1 има над 2000 гена кои кодираат 5S rRNK или има некаде околу 2800 копии за 28S, 5.8S и 18S рРНК на хромозомите 13, 14, 15, 21 и 22. Фамилиите од овој тип настануваат со копирање на еден ген. Потребата од постоење на вакви фамилии со повеќе копии од еден ист ген, се објаснува со поголема потреба од нивниот транскрипт. рРНК влегува во состав на рибозомите, па кај клетка која активно синтетизира протеини, понекогаш истовремено се создаваат и по неколку илјада рибозоми. Во една таква состојба, доколку би имало само еден ген за рРНК, потребите на клетката не би можеле да се задоволат. Покомплексни фамилии на гени се оние кои имаат слична секвенција, меѓутоа нивните продукти имаат значително различни функција. Класичен пример е фамилијата на глобински гени која се состои од 14 паралогни гени лоцирани на 3 хромозома. Со еволуциска генетската анализа е утврдено дека пред повеќе од 500 милиони години од еден глобулински ген се добиваат гени кои учествуваат во кодирање на миоглобинот и хемоглобинот. Миоглобинот е протеин застапен во мускулите и има способност за врзување и складирање на кислородот во овие клетки, додека, пак, хемоглобинот е протеин застапен во еритроцитите и придонесува во транспортот на кислородот низ целиот организам. Од инцијалниот глобински ген еволуциски се добиваат останатите хемоглобински гени меѓу кои и α и β глобините кои се наоѓаат на хромозомот 16 и 11 и кодираат информација за синтеза на двете поддединици на адултниот хемоглобин. Сличност во секвенцијата на глобинските гени е причина да се групираат во една фамилија и покрај тоа што диверзитетот ги прави функционално сигнификантно различни. Така ε и ζ глобините се експресираат за време на раниот ембрионален развиток, α и γ за време на вториот и третиот триместер од гестацијата, а, пак, α, β и во мал процент δ постнатално. Сите имаат различна способност за врзување на кислородот, што се рефлектира и во нивното присуство за време на ембрионалниот, феталниот и постнаталниот период од животот на човекот. Други примери на фамилии на гените се оние гени кои ги кодираат актински протеини, имуноглобулини, интерферони или хистони. Слика 30 Фамилиите на хуманите α и β глобулински гени. Со различна боја се претставени развојните стадиуми кога секој ген се индуцира. Псеудогените или не се експресираат или, пак, протеини од нив се неактивни 27 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Фамилиите и суперфамилиите, како што кажавме, се добиени со повеќекратно копирање на еден ген. Притоа, гените од една фамилија не се сместени секогаш на еден ист хромозом, како што е примерот со членовите на α или β глобинските фамилии. Тие може да се сместени на два или повеќе различни хромозома. При формирањето во некои копии може да се индуцираат мутации при што можат да се стекнат со нови карактеристики. Во зависност на новодобиените карактеристики, одредени протеини се оптимизирале да функционираат во различни клетки и ткива во различни етапи од развитокот. Таков е примерот и со феталниот глобин кој има многу поголем афинитет кон кислородот отколку адултниот глобин. Мутациите во копиите на гените не секогаш придонесуваат за зголемена или подобрена активност. Во некои случаи тие го прават генот, односно неговиот производ, нефункционален. За таквите гени се вика дека се псеудогени. Вакви псеудогени се присутни и во глобинските фамилии на гени. Екстрануклеарен геном кај еукариотските организми Во 50-тите години на минатиот век, врз база на анализа на наследувањето на некои особини, кај квасците и фотосинтетските микроорганизми била предложена можноста за постоење на екстрануклеарен генетски материјал. Подоцна, овие тврдења биле поткрепени со биохемиски анализи и електрон микроскопија. Речиси сите еукариотски организми имаат екстрануклеарен геном. Тој се состои од ДНК која се наоѓа во митохондриите и хлоропластите кај фотосинтетските организми. Најчесто, оваа ДНК е во циркуларен облик. Кај некои организми, како Paramecium и Chlamydomonas, се среќава и линеарна форма на органелна ДНК. Бројот на органелните геноми е варијабилен, во зависност од видот и состојбата (активноста, Слика 31 Митохондријален геном на Saccharomyces cerevisiae (лево) и хлоропластен геном на пченка (десно). Геномот на хлоропластите се состои од 4 типа на гени кои учествуваат во транскрипцијата, транслацијата, фотосинтезата и биосинтезата на мали молекули клеточна делба) на клетката. Бројот на митохондриите и хлоропластите, а со тоа и нивните геноми, се добиваат со репликација. Тоа значи дека овие органели најпрво треба да пораснат до одреден степен, па да потоа се поделат на две. Репликацијата на органелната ДНК не е поврзана со S-фазата од клеточниот циклус. Воедно и нема некој 28 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 32. Митохондријална ДНК. Шематски приказ на митохондријалната ДНК кај луѓето (лево). Обележани со црвено се гените кои учествуваат во респираторните процеси, а со зелено двата гена кои учествуваат во синтеза на рибозомалните протеини. Со точки се претставени гените кои кодираат тРНК. Електронмикрограф на митохондријалана ДНК за време на репликација. Со жолто е претставена новосинтетизираната ДНК распоред која органела кога ќе се подели. Така, во однос на потребите на клетката и нејзината состојба, бројот на митохондриите и хлоропластите се зголемува или намалува. Една митохондрија кај луѓето има околу 10 идентични ДНК копии, што значи во секоја клетка има околу 8000 молекули. S. Cerevisiae има некаде околу 6500 молекули. Големината на митохондријалната ДНК е, исто така, варијабилна и не е поврзана со комплексноста на организмот. Хуманиот митохондријален геном е голем околу 17 kb, на глушецот 16 kb, S. Cerevisiae 75 kb, пченката 570 kb, а лубеницата 2500 kb. Генерално, гените во овој геном се густо распоредени. Интересно, кај пониските еукариотски организми просторот помеѓу гените во митохондријалниот геном е поголем, односно гените се поретко поставени. Ова е спротивно во однос на нуклеарниот геном. За разлика од митохондријалниот, кај хлоропласниот геном помеѓу различните видови се забележува помали варијации во големината и составот. Бројот на гените кои се присутни во органелниот геном е неспоредливо помал од нуклеарниот геном. Типот на гени е, обично, различен во зависност од видот на организмот. Секој митохондријален геном носи информации за рРНК и минимум еден ген кој кодира протеин кој е вклучен во клеточната респирација. Доколку станува збор за посложен митохондријален геном, во тој случај можат да имаат гени кои се поврзани со транскрипцијата, транслацијата или, пак, транспортот на материи во митохондријата. Слично, и кај хлоропластите се наоѓаат гени за рРНК и тРНК, рибозомални, со тоа што има дополнителна група на гени кои учествуваат во фотосинтезата. Така, на пример, митохондријалниот геном кај човекот има 37 гени. Од овие 13 се протеин-кодирачки секвенции за протеини кои учествуваат во респирацијата. Останатите се некодирачки РНК секвенции и тоа 2 рРНК и 22 тРНК. Интересно, двете вериги на циркуларната ДНК молекула еднакво се траснкриптираат од еден промотор со што се добиваат две големи различни РНК молекули кои се големи колку целата ДНК матрица. Од транскриптот на едната верига се добиваат двете рРНК, најголемиот број на тРНК, како и десетина РНК кои содржат поли(А) опашка. Од другата верига со радикална реорганизација се добиваат 8 тРНК и една мала РНК со поли(А) опашка. Поли(А) опашката на протеинкодирачката РНК посттранскрипционо се синтетизира со помошна митохондријалната поли(А) полимераза. Да се напомене, митохондријална иРНК не поседува „капа“ на 5` крајот, што ја прави различна од останатата клеточна иРНК. Друга специфичност за 29 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски митохондријата е флексибилноста на криптираниот кодон за секоја аминокиселина. Има само 22 различни митохондријални тРНК кои не се доволни за специфично поврзување на секоја аминокиселина. Ова е решено со тоа што една тРНК може да се поврзе со повеќе од една аминокиселина. Притоа, третиот, последниот нуклеотид, не ја определува специфичноста на информацијата. Можеби најголема уникатност за митохондријалниот геном е тоа што 4 кодона даваат различна информација споредбено со истите тие кодони во нуклеарниот геном. UGA е универзален „СТОП“ кодон, меѓутоа кај митохондријата кодира информација за триптофан. AUA универзално кодира информација за изолеуцин, меѓутоа кај митохондријалната ДНК кодира информација за метионин. AGA и AGG се кодови за аргинин, а кај митохонријата се „СТОП“ кодони. Ова е многу необично бидејќи сите ораганизми имаат Слика 33 Генетски код кај органелите. Обележани се разликите споредбено со универзалниот код унифициран код, пред сè, поради заедничкото еволутивно потекло. Се смета дека митохондријалниот код, со тек на времето, претрпел измени поради едноставноста на својот геном и помалиот број на тРНК кои ги кодира. Во прилог на тоа е фактот дека митохондријалниот геном, кој содржи многу повеќе гени, кај растенијата има ист код како и нуклеарниот генетски код. За разлика од многу помалиот митохондријален геном, кај цицачите и квасците кај кои се стекнати измени во текот на еволуцијата. Биосинтезата во митохондријата и хлоропластите бара синхронизирано учество на двата генома, нуклеарниот и органелниот. Повеќето од протеините за потребите на двете органели специфично се кодирани во нуклеарниот геном. Синтезата на овие протеини се одвива во цитоплазмата и оттаму преку митохондријалната мембрана се пренесува во органелата. Протеините, кои се синтетизираат во самата органела, остануваат секогаш во неа. Само при некои случаи на апоптоза, се забележува присуство на митохондријално синтетизирани протеини во цитоплазмата. Потекло на органелниот геном Присуството на гените во митохондријалниот геном за протеини кои учествуваат во клеточната респирација е очекувано, со оглед на функцијата на оваа органела. Меѓутоа, тие не се единствени протеини кои учествуваат во градбата или функцијата на митохондријата. Едно од основните прашања на кое сè уште нема соодветен одговор е зошто митохондријата сама кодира и синтетизира некои протеини, а други, пак, ги прима од цитоплазмата. До скоро едно од најприфатените објаснувања беше дека некои од протеините, кои се синтетизираат во митохондријата, се екстремно хидрофобни и бидејќи тешко се транспортираат низ клеточната мембрана, потребно е да синтетизираат во самата митохондрија дополнителен систем за да внесе и инкорпорира протеини кои се кодирани во нуклеарниот. Меѓутоа сè повеќе експериментални докази демонстрираат дека дури и уште повеќе хидрофобни молекули од оние кои се 30 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски синтетизираат во митохондријата, се пренесуваат низ митохондријалната мембрана. Со ова веродостојноста на оваа хипотеза се намалува. Генерално, прифатена теорија е дека митохондријалната и хлоропластната ДНК потекнуваат од бактерии кои симбиотички живееле со некоја форма на предеукариотски клетки во раните етапи на еволуцијата. Оваа теорија се нарекува ендосимбиотичка теорија и се базира на поголемите сличности на органелната ДНК со бактериската, отколку со еукариотската. Механизмот на експресијата на гените во органелите многу е сличен, ако не и ист како и кај бактериите. Како поддршка на оваа теорија се и некои понови форми на симбиотичка интеракција кај некои организми. Таков е примерот со протозоата Cyanophora paradoxa, која има фотосинтетски структури различни од хлоропластите, а многу слични со цијанобактериите. Се смета дека митохондриите потекнуваат од аеробен тип на бактерија, а хлоропластите дека потекнуваат од бактерии кои имале способност за фотосинтеза. Во текот на еволуцијата на еукариотските клетки, дошло до Слика 34 Шематски приказ за еволуциониот пат на митохондријата и хлоропластот. Аеробната преоѓање на дел од генетскиот еукариотска клетка настанува со фузирање со материјал од органелата аеробен прокариотски организам. Растителните (бактеријата) во нуклеусот. Така, клетки способни за фотосинтеза настанале со само минимален број гени, кои фузирање на аеробна еукариотска клетка и поради непознати причини, прокариот способен за фотосинтеза останале во органелниот геном. Најголем број гени преминале во нуклеарниот геном од каде ги даваат потребните информации за градба и функција на органелите. Како пример, идентификувани се повеќе од 90 различни нуклеарни гени кои се вклучени во одржувања на функцијата на митохондријалниот геном. Тука спаѓаат многу рибозомални протеини, аминоацил-тРНК синтетаза, ДНК и РНК полимерази. Најголем број од овие митохондријални протеини се разликуваат од останатите клеточни протеини со иста функција. Всушност, само мал број митохондријални протеини имаат иста структура како и остатокот на клетката. Зошто клетката создала или поточно го задржала овој двоен генетски систем сè уште е нејасно. Енигмата е уште поголема бидејќи се работи за многу неекономичен начин на функционирање. Воглавно, сите клеточни механизми се базираат на скоро идеална економичност и функционалност. Меѓутоа, во овој случај клетката задржала два паралелни система, еден за потребите на целата клетка и друг рудиментиран систем за потребите на органелата. Така, на пример, нуклеарниот геном кодира рибозомални протеини за градба на рибозомите кои ги синтетизираат протеините за целата клетка и истовремено кодира рибозомални протеини за рибозомите кои синтетизираат само минорна подгрупа на митохондријални протеини. Наследување на митохондријалниот геном Кај посложените организми наследувањето на митохондријалната ДНК е по мајчина линија. Цитоплазмата на оплодената јајце клетка доминантно потекнува од јајце клетката, а не од сперматозоидот. Со тоа и митохондриите потекнуваат од јајце клетката, односно мајката, а не од таткото, односно сперматозоидот. Дури и доколку мал број митохондрии, кои потекнуваат од сперматозоидот, се најдат во оплодената 31 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски јајце клетка, ќе бидат разградени. Ваквиот начин на пренесување на генетскиот материјал се вика унипарентално наследување по мајчина линија. Како и нуклеарниот геном, така и митохондријалниот геном е подложен на мутации. Митохондријалните мутациите се повеќе фреквентни бидејќи системот за поправка на митоходријалната ДНК не е толку ригиден како кај нуклеарната ДНК. Притоа, не сите митохондрии во една клетка содржат ист вид на мутации. Поради начинот на пренесување од мајката на деца, ефектот од мутациите е присутен и кај машките и кај женските деца. Слика 35 Шематски приказ за наследување на Притоа, само афектираните митохондриите, а со тоа и митохондријалната женски деца понатаму можат да ја ДНК по мајчина линија пренесат оваа мутација на своите поколенија. До заболување доаѓа поради сегрегација на мутираните митохондрии во одреден тип на клетки за време на ембрионалниот развиток. Особено се чувствителни мускулните и нервните клетки бидејќи тие имаат и најголема потреба од оксидоредуктивните метаболични процеси. Фактот дека митохондријалната ДНК се пренесува само преку мајката, служи за одредување на потеклото по мајчина линија со стотици генерации наназад. Во корист на ова оди и отсуството на рекомбинација и честите мутации во одредени сегменти. Со ваква анализа се одредува заедничкото потекло на фамилии, група на луѓе или, пак, цели народи. На овој начин е потврдено и потеклото на кучето од волкот. При анализата се користат два хиперваријабилни региони HVR1 и HVR2 кои подлежат на чести Слика 36 Наследување на генетскиот материјал. Нуклеарната ДНК се наследува од двата родители (лево), додека митохондријалната ДНК се наследува само по мајчина линија (десно) 32 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски мутации. Со компарација на податоци може да се најдат заеднички мутации, а со тоа филогенетски да се поврзат испитаниците. Повторувачки секвенции во ДНК молекулата Секвенци од ДНК молекулата кои се повторуваат се карактеристични за сите организми. Во геномот кај некои организми, нивниот број е помал додека во геномот на други, вклучувајќи ги и луѓето, е поголем. Кај цицачите, над 40% од молекулата на ДНК се состои од повторувачки секвенци од различен вид. Овие секвенци се, најчесто, од некодирачки карактер. Некои од нив учествуваат во важни структурни организациони елементи на хромозомот. Доколку повторувањата се групирани во групи или тандеми, се нарекуваат тандемски повторувања. Тандемски повторувачки ДНК секвенции (Tandemly repeated DNA) Овие повторувања се доста чести во геномот на еукариотските организми, а се сретнуваат многу поретко кај прокариотските организми. Се нарекуваат и сателитска ДНК (satellite DNA) бидејќи е составен дел на придружните „сателитски“ бендови кои се добиваат при густинско градиентно центрифугирање на фрагментирана ДНК (фрагменти од 50 до 100 kb). Густината на ДНК зависи од нејзиниот состав, кој просечно е 40.3% составен од гванин и цитозин. Оваа доминантна фракција има густина од1.701 gcm-3. При густинско градиентно центрифугирање се забележуваат 3 многу помали дополнителни бендови со густина од 1.687, 1.693 и 1.697 g·cm-3. Овие бендови имаат различна густина бидејќи имаат различен, помал, GC состав од поголемиот дел на ДНК. Дополнителна анализа на овие бендови покажала дека се состојат од многубројни кратки репетативни елементи. Нивната големина се движи од 5 до 200 bp. Типичен пример за вакви повторувања е ACAAACT секвенцијата кај винската мушичка или, пак, ДНК Слика 37 Сепарирање на фрагменповторувањата кај центромерот. Милиони од вакви тирана ДНК со густинско повторувања се присутни во геномот на градиенто центрифугирање. посложените организми и зафаќаат некаде од 10 Претставени се трите сателитдо 20% од нивната ДНК. ски бендови кои се полесни од И покрај тоа што не се сепарираат во остатокот на ДНК сателитските бендови, сепак два вида на мали повторувања, исто така, се вбројуваат во сателитска ДНК. Едниот вид се минисателитски повторувања кои се со големина до 25 bp и се групираат во групи кои можат да достигнат големина и до 20 kbp. Овде припаѓаат теломерните повторувања, кои кај луѓето се составени од 6 нуклеотида, 5′-TTAGGG-3′. Вторите се микросателитските повторувања кои се со големина до 13 bp и се групираат во структури до 150 bp. Процентот на микросателитската ДНК во хуманиот геном е значителна, на пример, CA повторувањето се јавува во 0.25% од целиот геном. Претставено на друг начин, во хуманиот геном повторувања составени од два нуклеотида има околу 140.000 копии, повторувања од 3 нуклеотида има 37500 копии, а од 4 нуклеотида 105000 повторувања. Функцијата на микросателитските повторувања не е позната, меѓутоа нивната варијабилност е искористена во генетиката. Имено, анализата на микросателитските повторувања е основа на утврдување на идентитетот со помош на ДНК методи кои екстензивно се користат во форензиката. За ова многу повеќе е објаснето во делот за генетски инженеринг. 33 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Повторувања кои случајно се лоцирани во геномот (Interspersed genome-wide repeats) Голем дел од ДНК повторувачките секвенции не се групирани, туку можат да се сретнат насекаде низ геномот. Самата нивна организација, поточно дезорганизација низ геномот, наведува дека настанале на различен начин од тандемските повторувачки елементи. Ако се смета дека тандемските повторувања настанале со копирање на една секвенција при процесот на репликација или рекомбинација, за повторувањата кои не се во група се смета дека настанале со транспозиција или префрлувања на дел од секвенција (траснпозом) од едно на друго место во геномот. Два различни механистички модела се разликуваат во зависност од тоа дали РНК е присутна како интермедијален продукт. Транспозицијата во која РНК се јавува како интермедијален продукт, се нарекува ретротранспозиција, а ДНК елементот кој е предмет на префрлување ретротранспозом. Целиот процес се состои од три фази. Во првата фаза настанува создавање на РНК на база на ретротраспозомот со транскрипција. Потоа РНК танскриптот е матрица за создавање на ДНК со помош на реверзибилна транскриптаза. Најчесто информацијата за синтеза на овој ензим е кодирана во самиот транспозом. Последниот чекор е интеграција на копијата од ретротранспозомот во геномот. Инкорпорацијата може да се случи во истиот или во различен хромозом од Слика 38 Шематски приказ на транспозиција на каде потекнува иницијалниот еден ретротранспозом ретротранспозoм. Ретротранспозомите се интересни елементи бидејќи се многу слични на ретровирусите. Во оваа гупа припаѓа и HIV вирусот кој ја предизвикува СИДА-та. Шематски, градбата на ретровирусот и останатите ретротранспозомни елементи се прикажани на сликата бр. 38. Ретровирусот е изграден од неколку основни структури. На краевите се наоѓаат долги терминални повторувачки елементи (long interspersed elements, LTR), потоа го содржат генот gag кој дава информација за синтеза на структурни протеини кои влегуваат во градба на вирусот, pol генот кој учествува во создавањето на реверзибилната транскриптаза и другите ензими кои учествуваат во репликација на вирусниот геном и на крај env генот кој ги создава протеините на капсидот. Геномот на ретровирусите, кога ќе навлезат во клетките, служи како матрица за синтеза на комплементарна ДНК со помош на ензимот реверзибилна транскриптаза. Новосинтетизираната комплементарна ДНК понатаму се инкорпорира во геномот на клетката-домаќин. При создавање на нови вирусни честички, се создава нов вирусен геном кој се пакува во капсид со помош на env генот. Ендогени ретровируси (Endogenous retroviruses, ERVs), се ретровирусни геноми интегрирани во хромозомот на ‘рбетниците. Повеќето од ваквите форми немаат способност да се активираат и да создадат нови вирулентни вирусни честички. Истите можат да се сретнат насекаде низ геномот како повторувачки секвенции. Како примери од овој тип на ретротранспозоми ќе ги напоменеме: ERV класа I со 112000 копии и MaLR со 240 000 копии во хуманиот геном. Ретротранспозомите имаат слична секвенција како и ERV и се среќаваат најчесто кај растенијата, габите и без’рбетниците. Застапени се со многубројни копии 34 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски интегрирани насекаде низ геномот. Како екстремен пример е застапеноста на ретротранспозомите во геномот на пченката. Во некои случаи може да заземе и до 50% од целиот геном. Ретротранспозомот може да се јави во две форми: едната е Ty3/gypsylike, која има иста структура како и ERV, а другата е Ty1/copia-like во која недостасува env генот. Бидејќи env генот учествува во формирање на капсидот, нормално е дека Ty1/copia-like формата не може да создава нови вирусни честички. Кај цицачите се сретнуваат ретропозони (retroposons), вид на ретротранспозоми кои немаат LTR елементи. Во однос на структурата и големината се делат на два вида: LINEs (long interspersed nuclear elements) форма која содржи ген за реверзибилна транскриптаза и SINEs (short interspersed nuclear elements) која не содржи ваков ген, меѓутоа има способност реверзибилно да се транскриптира со користење на реверзибилна транскриптаза од други извори за транспозиција. И двата елемента на 3` крајот имаат сигнал за полиаденилација (ААТААА) и способност да се шират низ геномот со копирање на своите секвенции. Како пример за LINE кај човекот, ќе го земеме LINE-1 кој е голем 6.1 kb и е застапен со повеќе од половина милион копии (516000) во геномот на човекот и LINE-2 со 315 000 Слика 39 Шематски приказ на различните копии. На LINE формите отпаѓа некаде видови на ретроелементи околу 17% од целиот хуман геном. Еден од најзастапените ретротранспозомни елементи во хуманиот геном е Alu секвенцијата која е од типот на SINE. Alu секвенцијата е со големина помала од 500 kb. Застапена е со над 1 милон копии и зафаќа околу 11% од хуманиот геном. Се смета дека потекнува од 7SL РНК, некодирачка форма на РНК, која има транспортна функција на протеините во клетката. Таа во раниот период на еволуцијата на човекот, случајно реверзибилно се транскриптирала и инкорпорирала во хуманиот геном. Alu секвенцијата може да создаде РНК и активно да пролиферира низ геномот на луѓето. Се претпоставува дека ова се случува со фреквенција 1 на 200 индивидуи. Ова придонесува да биде еден од факторите за генетската разновидност кај човекот, меѓутоа може да биде и фактор за генетски нарушувања. Нормално цитозинот и гванинот во Alu секвенцијата се метилирал со цел да се спречи неговата ретротранспозиција. Во одредени случаи, најчесто под дејство на надворешни влијанија, настанува деметилација, а со тоа и негова транскрипција и пролиферација низ геномот. Најчесто, при интеграција на нова копија во геномот, не настануваат значителни промени за клетката, освен доколку истото не се случи во кодирачките региони. Проценето е дека 0.1% од генетските нарушувања се должат на пролиферацијата на Alu секвенцијата во геномот. 35 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ОСНОВНИ НА МОЛЕКУЛАРНО-БИОЛОШКИ ТЕХНИКИ Она што во 50-тите и 60-тите години од минатиот век за биолозите изгледаше скоро невозможно молекуларно да се анализира ДНК и со тоа да се разбере основниот код на живиот свет, денес преоѓа во рутинска анализа која се базира на софистицирана технологија која рапидно се развива. Почетоци на функционалната анализа на ДНК молекулата, со in vitro манипулација, започнува во почетокот на 70-тите години. Првите експерименти се базираат на изолирање на сегменти од ДНК на прокариотските организми и нивно клонирање. Со тоа се поставуваат темелите на една нова биотехнолошка ера која се вика рекомбинантна ДНК технологија. Манипулираната ДНК in vitro, односно ДНК молекула која артифицијално (вештачки) е составена со спојување на различни сегменти, се вика рекомбинантна ДНК. Денеска, со помош на оваа технологија, многу едноставно од илјадници гени во геномот може да се изучува само еден, група на гени, или, пак, целиот геном заедно. Генот или сегмент од генот може да се изолира и да се клонира во илјадници копии. ДНК копиите, пак, можат да се употребат во базични генетско-структурни и функционални анализи, специфични биотехнички производствени технологии или биомедицински дијагностички методи. Основните елементи на рекомбинантната ДНК технологија се: - изолација на ДНК молекулата и сечење на специфичниот фрагмент од ДНК кој е цел на клонирањето. Специфичното отсекување се врши со помош на рестрикциони ензими; - поврзување на отсечениот ДНК фрагмент со вектор, друга ДНК молекула која служи како носач на фрегментот од интерес. Новата хибридна молекула, односно ДНК фрагментот споен со векторот, во суштина, е рекомбинантна ДНК молекула; - рекомбинантната молекула се внесува во клетка каде што се мултиплицира, со што се добиваат илјадници нејзини копии и - изолирање на клонираната рекомбинантна ДНК молекула и нејзина истражувачка или апликативна употреба. Бидејќи станува збор за технички постапки, во оваа прилика само накратко ќе ги објасниме принципите за секоја од етапите. 36 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Изолација на специфични ДНК фрагменти со помош на рестрикциони ензими Рестрикционите ензими или рестрикциони нуклеази се протеини кои имаат способност да го пресечат двојниот хеликс на ДНК. Карактеристично за овие ензими е дека ја сечат фосфодиестерската врска на точно определено место. Рестрикционите места се најчесто „палиндромни секвенци“, односно редоследот на нуклеотидите прочитан од лево кон десно е идентичен со редоследот на нуклеотидите од комплементарната верига прочитани во спротивниот правец. Секој рестрикционен ензим препознава специфично рестрикционо место, односно специфичен распоред на нуклеотиди, се поврзува за него и ја сече двојната верига. Над 400 различни рестрикциони ензими се изолирани од бактериите. Големиот број различни нуклеази и нивната специфичност ги прават исклучителна полезна алатка во молекуларнобиолошките техники. Колку често еден ензим Слика 41 Рестрикциони ензими. Со ја сече молекулата на ДНК може математички зелена стрелка е претставено да се предвиди. Така, на пример, доколку местото каде дадените ензими ја сечат ДНК веригата. При сечење со ензимот препознава секвенција составена од 4 HpaI се добиваат два слепи краеви, а нуклеотида, како, на пример, ензимот HaeIII кој со EcoRI се добиваат два „лепливи“ ја препознава секвенцијата GGCC, тогаш во краеви просек на секои 256 bp (44=256) ќе ја сече молекулата на ДНК. Ова е доколку сите 4 нуклеотида се застапени еднакво во геномот. Доколку рестриктивниот ензим препознава 8 bp како NotI (GCGGCCGC), тогаш ДНК ќе ја сече во просек на секои 65.500 bp (48). Нормално, нуклеотидите не се рамномерно распоредени насекаде низ геномот, па рестрикционите фрагменти кои се добиваат при дигестија на ДНК со една нуклеаза не се идентични. Некои ендонуклеази како HpaI, AluI, EcoRV, ги сечат двете вериги на ист нуклеотиден пар со што се добиваат два „слепи“ краеви. За разлика од нив, EcoRI, HindIII, PstI ги сечат двете вериги на различен нуклеотид во рестрикционата секвенција при што се добиваат два краја кои завршуваат со едноверижна опашка. Овие едноверижни кохезивни краеви, бидејќи се комплементарни, лесно се спојуваат помеѓу себе и се нарекуваат „лепливи краеви“. ДНК Слика 40 Поврзување на две ДНК фрагментите, кои се користат за генерирање молекули со ДНК лигаза. Двете на рекомбинантни молекули, можат да се молекули се дигестирани со EcoRI при добијат со дигестија со рестрикциони ензими. што се добиени фрагменти со лепливи Притоа, се добиваат фрагменти кои имаат краеви. На база на комплементарност, кохерентни краеви кои на база на двата краја имаат афинитет да се спојат. Стабилната врска помеѓу комплементарост се поврзуваат помеѓу себе. споени краеви се овозможува со ДНК Перманентно поврзување на двата лигаза комплементарно споени краеви се овозможува со ензимот ДНК лигаза. 37 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Вектори За да се овозможи клонирање на саканиот фрагмент во бактерија, најпрво е потребно истиот да се спои со одреден вектор. На овој начин сегментот може да навлезе во бактеријата и така да се мултиплицира. За една молекула да служи како вектор за клонирање, потребно е да има способност да се самореплицира. Една од техничките карактеристики на векторот е да има рестрикциони секвенции во кои со помош на дигестија може да се вметнат саканите фрагменти. Понатаму, да има некои карактеристики со кои може лесно да се препознае неговото присуство, односно интегрирањето во клетката. И на крај, истиот да може лесно да се изолира од бактериската клетка. Првите вектори биле модифицирани бактериски плазмиди. Ова се циркуларни нехромозомски ДНК молекули кои, нормално, се наоѓаат во бактеријата и кодираат некои специфични својства. Некои од првично генерираните вектори сè уште активно се користат за клонирање. Поголемиот број вектори, кои денеска се користат, се добиени со екстензивно генетско модифицирање со цел да одговорат на експерименталните или индустриските потреби. Како група на специјализирани вектори ќе ги напоменеме експресионите вектори со кои генот од интерес се индуцира во трансформираната клетка. Потоа, BAC (bacterial artificial chromosomes) и YAC (yeast artificial chromosomes) векторите кои се специјализирани да можат да интегрираат долги сегменти на ДНК. Како пример за вектор, кој е генетски модифициран за да одговори на потребите на клонирањето, ќе го земеме pUC18. - Векторот е релативно малечок (2.6 kb), па може да носи релативно големи фрагменти. - Во клетката домаќин интензивно се размножува. Создава и до 500 копии во една клетка. - Бројни рестрикциони секвенции се генерирани со цел да може што поедноставно да се вметнуваат фрагменти во него. Група од вакви рестрикциони места се вика полилинкер (polylinker site). - Поседува ампицилин резистентен ген, кој обезбедува пролиферација на бактеријата во која се наоѓа векторот. - Поседува дополнителен маркер кој овозможува следење на бактериите во кои се наоѓа рекомбинираната ДНК. На пример, LacZ генот ги обојува бактериите сино Слика 42 Дијаграм од pUC18 векторот (лево). Прикажано е местото каде се вметнуваат фрагментите (poylinker) и ампицилин резистентниот ген. Петриева плоча на која се израснати бактериски колонии (десно). Сините бактериски колонии се составени од бактерии во кои се наоѓа само векторот (празен вектор), додека во белите се наоѓа рекомбинираната ДНК 38 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски доколку растат на подлога која содржи Xgal. Со инсерција на фрагмент од ДНК во полилинкерот, односно при формирање на рекомбинантна ДНК молекула, доаѓа до прекинување на LacZ генот, а со тоа и негово деактивирање. Така, бактериите во кои се наоѓа рекомбинираната ДНК не се обојуваат сино, туку бело. На база на селекција на сини и бели колонии, може да се разликува во кои бактерии се наоѓа само векторот, а во кои векторот со интегрираната ДНК (рекомбинираната ДНК). Сепарирање на фрагменти на ДНК со помош на електрофореза Добиените фрагменти при дигестијата на ДНК со рестриктивните ензими може да се одвојат и изолираат со помош на гел електрофореза. ДНК е негативно наелектризирана молекула поради присуството на фосфорната група и во електрично поле се движи кон позитивната електрода. Во различни типови на гелови, полиакриламиден за помали фрагменти на ДНК (<500 bp) или агарозен за поголеми фрагменти, се нанесува ДНК и со помош на електрофореза се сепарира. Принципот е едноставен: поголемите се движат побавно, а помалите фрагменти се движат побрзо низ гелот. Специфичен тип на агарозна електрофореза е таканаречената „pulsed-field“ електрофореза. Со овој метод се изолираат многу големи молекули на ДНК. Ваквите молекули, при обична електрофореза, наместо да се движат компактно низ гелот, во зависност од нивната големина се движат само со едниот крај и притоа формира издолжена структура во форма на змија. За да се надмине ова, големите ДНК молекули се сепарираат во електрично поле во кое континуирано се менува правецот на електричното поле. На овој начин не се дозволува издолжување на долгите молекули, туку се движат низ гелот во компактна форма и, доколку се помали, можат да се сепарираат и цели хромозоми. За да се визуализира на агарозниот гел, ДНК треба да се се обележи на различни начини. Еден од најчесто користените начини е со помош на етидиум бромид (ethidium bromide), кој флуоресцира кога е врзан за ДНК на ултравиолетова светлина. Многу посензитивен метод е доколку за ДНК фрагментите се поврзе 32P, кој лесно може да се детектира со авторадиографија. Слика 43 Гел елекКлонирање на рекомбинирана ДНК in vivo трофореза на ДНК фрагменти За да може да се мултиплицира рекомбинантната ДНК молекула, истата треба да се внесе во клетка домаќин. За оваа постапка се користат различни прокариотски и еукариотски клетки. Една од најчесто користените клетки домаќини е К12 сојот на E. Coli. Предностите на оваа бактерија е дека во детали е проучена и може да прими различни типови на вектори. S. Cerevisiae е, исто така, екстензивно користен клеточен систем. Тој, покрај тоа што се користи за клонирање, се употребува и за експресирање на гени од интерес. S. Cerevisiae има неколку предности кои го прават супериорен во споредба со прокариотските системи. Некои од неговите карактеристики се: а) лесно се размножува и манипулира; б) екстензивно е изучуван, геномот му е секвенциониран, има голема колекција на мутанти; в) бидејќи е еукариотски организам, посттранскрипциските и посттранслационите модификации се исти како и кај човекот и г) се работи за безбеден организам кој со векови се користи во прехранбената индустрија. Поради тоа нема опасности од негова употреба при производство на терапевтски протеини или вакцини. 39 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Некои од рекомбинантните протеини добиени со експресија во квасци се: Hepatitis B вирусниот површински протеин, инсулинот, EGF, PDGF, факторот за колагулација XIIIA. Бидејќи накратко ги опишавме сите етапи на рекомбинантната ДНК технологија, за да биде појасно, со еден пример ќе ги поврземе сите заедно во еден процес. Да речеме дека сакаме да го клонираме хуманиот ген кој ја кодира информацијата за синтеза на инсулин. Слика 44 Клонирање на ДНК фрагмент во плазмид вектор - Најпрво треба да ја проучиме секвенцата на нуклеотидите пред, во и после генот. Целта на ова е да ја знаеме неговата точна големина и да пронајдеме рестрикциони места кои можеме да ги употребиме за негово отсекување од остатокот на геномот. Местата треба да се надвор од самиот ген во близина на неговиот 5`и 3` крај. - Потребно е да изолираме ДНК од човек. Ова може да го направиме од секое ткиво или клетки кои ни се на располагање. За вакви потреби, мононуклеарните клетки во периферната крв се добар извор на геномска ДНК. - Изолираната ДНК потребно е да се дигестира со специфични рестрикциони ензими кои ќе го отсечат генот на инсулинот. Истовремено, со истите рестрикциони ензими се дигестира и векторот кој ќе се користи за клонирање. 40 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски - ДНК фрагментот, кој го содржи генот за инсулин, треба да се сепарира со помош на гел елекрофореза. Притоа, идентификација се базира на големината на ДНК фрагментот. Истиот се отсекува од гелот и се пурифицира (прочистува). - Генот се поврзува со векторот на база на комплементарност на нивните краеви. Комплементарноста е добиена поради отсекувањето и на двата фрагмента со ист рестрикционен ензим. Залепување на двата поврзани фрагменти се врши со помош на ДНК лигазата. На овој начин се добива рекомбинирана ДНК. - Рекомбинираната ДНК се внесува во клетката домаќин каде треба да се изврши клонирањето. Успешноста на интегрирањето се детектира со помош на различни маркери, резистентност на антибиотици, селекција на бели/сини колонии и слично. - Секоја бактериска колонија потекнува од една клетка. Тоа значи дека сите клетки во таа колонија имаат ист геном. Со изолирање и експандирање на една колонија се добиваат илјадници копии на рекомбинираната молекула. - Од клетката домаќин се врши изолација на рекомбинираната ДНК. In vitro клонирање на сегмент од ДНК со полимеразна верижна реакција Полимеразна верижна реакција (Polymerase chain reaction (PCR)) е брз метод за амплификација на одредени сегменти на ДНК. Со развивањето на оваа техника во 1986 година темелно се менува методолошкиот пристап во молекуларно-биолошките истражувања и биотехнологијата. Денеска PCR-от е една од најбазичните и најупотребувани техники кога станува збор за ДНК анализа. PCR методата се базира на специфична амплификација на одреден сегмент на ДНК со серија на in vitro реакции. Притоа, количеството на ДНК од која се амплифицира сегментот, може да биде исклучително мало. Доволно е да биде само една молекула, односно ДНК од една клетка. За да се амплифицира саканиот сегмент, потребно е да се имаат две кратки олигонуклеотидни секвенции (15-30 нуклеотиди) наречени прајмери (primers). Едниот прајмер потребно е да е комплементарен со 5` крајот на сегментот од интерес, а другиот со 3` крајот. Прајмерите се додаваат на едноверижната ДНК молекула и поради комплементарноста се поврзуваат за целната секвенција. Од местото каде што се поврзал прајмерот со помош на ДНК полимераза, во присуство на сите 4 дезоксирибонуклеотиди, започнува процесот на синтеза на комплементарна ДНК верига. Целиот метод се базира на 3 чекора кои се повторуваат циклично. - Првиот чекор е денатурација. Изолирана ДНК, под дејство на висока температура (90-95 °C), од двоверижна преминува во едноверижна молекула. Под дејство на температурата доаѓа до кинење на водородните врски помеѓу двојниот хеликс и при тоа се добиваат две едноверижни молекули. За овој чекор се потребни од 30 до 60 секунди. - Вториот чекор е анелирање. За време на оваа етапа доаѓа до спојувањеанелирање на прајмерите за комплементарните секвенции на едноверижните молекули. За да се анелираат прајмерите, доволни се 30-тина секунди и температура од 50-70 °C. Од местото каде што ќе се анелираат прајмерите, ќе започне синтезата на комплементарната верига. - Третиот и последен чекор е екстензијата (синтеза). Со помош на термостабилна ДНК полимераза (Taq polymerase), изолирана од термостабилни бактерии (thermophilic bacterium), се синтетизира комплементарната верига. Синтезата се одвива во правец од 5` кон 3` со додавање на комплементарни дезоксирибонуклеотиди на полимеризацискиот ланец. Со комплетирање на трите етапи, завршува еден циклус при што се удвојува количество на саканиот ДНК сегмент. Со повторување на циклусот и новосинтетизираните вериги служат како матрица за амплификација, со тоа бројот на добиени копии во секој нареден циклус се удвојува. Така, со само 30 повторувања на реакцијата количеството на ДНК се зголемува над милион пати. Целиот процес е автоматизиран со помош на машина наречена „thermocycler”. Времетраењето на секоја 41 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски етапа, температурата на која се одвива и бројот на циклусите, однапред се програмираат со што целиот метод добива на едноставност. Предностите на PCR методот се многубројни. Станува збор за едноставен, а многу специфичен метод, со која точно може од целиот геном само мал сегмент да се амплифицира. За целата постапка е доволно да се има единечна молекула на ДНК, која може да се најде во секоја интактна клетка. Поради ова, се употребува во генетски, форензички или палеонтолошки истражувања. Интересно со помош на PCR интактен фрагмент од ДНК, изолиран од фосил стар илјадници години, многу едноставно може да се клонира. Станува збор за брз метод со кој за само неколку часа можат да се добијат милиони копии на некој ДНК сегмент. Истото да се постигне со класичното in vivo клонирање потребни се неколку денови, па и недели. Со помош на генетски специфични прајмери рутински се дијагностицираaт генетски мутации. Притоа, мутациите можат да бидат и само во еден базен пар. Анализите можат да се прават на многу мали ДНК примероци кои може да се добиени и со ласерска биопсија на само едина клетка. Како недостаток на PCR, ќе ја напоменеме можноста за добивање на неточни резултати поради контаминација на почетниот примерок. Доколку дојде до мешање на ДНК примероци од два различна извора, тогаш постојат шанси да се добијат неточни резултати. Ова се должи на големата сензитивност на реакцијата бидејќи и многу мали количини на туѓа ДНК може да интерферира во анализата. Затоа е неопходно секогаш при спроведување на методот да се користат позитивни и негативни контроли. Слика 45 Клонирање на сегмент од ДНК со помош на PCR 42 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ДНК рекомбинирачки библиотеки (DNK recombinant libraries) Група на ДНК клонови кои потекнуваат од една индивидуа или ограничена популација се вика клонирана ДНК библиотека. Таа може да го претставува целиот геном на клетката, може само некој хромозом или, пак, е составена од гените кои се експресираат во одреден клеточен стадиум. Во основа се делат на два типа: геномска библиотека (genomic libraries) и библиотека на комплементарна ДНК (cDNA libraries). Во геномската колекција на клонови потребно е да има најмалку по една секвенција од секој сегмент на геномот. Ова се постигнува со рестриктивна дигестија на ДНК молекулата со ензим кој не ја сече премногу често. При фрагментацијата на ДНК потребно е да се внимава фрагментите да не се премногу мали бидејќи ќе треба да се генерираат премногу клонови, а и да не се премногу големи бидејќи големи секвенции тешко се клонираат. Слика 46 Разлика помеѓу геномските и cDNA клонови. Во геномската ДНК библиотека се застапени клонови кои ги содржат сите сегменти на ДНК секвенцијата (лево). Во cDNA библиотеките само иРНК транскрипти се клонираат (десно). Притоа изостануваат сите елементи кои не се дел од протеин кодирачката секвенција. Важно е да се каже дека во cDNA библиотеката ќе бидат застапени повеќе клонови од оној ген кој во моментот е повеќе активен (на шемата генот Б) За формирање на геномската библиотека потребни се соодветни вектори. Во просек, плазмидските вектори можат да носат ДНК фрагменти од 5 kb, за разлика од нив Yac векторите можат да инкорпорираат и до 1Mbp. Кога се работи за големи геномски библиотеки, како хуманиот геном, се користат големи фрагменти кои се инкропорираат во соодветни вектори. Доколку се работи за помали ДНК библиотеки, 43 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски како, на пример, геномот на некој прокариотски организам, во тој случај може да се користат и плазмидни вектори. Ваквите библиотеки се формираат за полесно да се изучуваат различни сегменти од геномот, да се клонираат регулаторни елементи на некои гени, да се анализираат секвенци со непозната функција. На овој начин иницијално и се пристапува при секвенционирање на хуманиот геном. Колекција на cDNA клонови се формираат на база на иРНК која е присутна во дадениот момент. За да се формира cDNA библиотека, најпрво се изолира иРНК или, пак, целокупната РНК од испитуваниот биолошки материјал. Со помош на реверзибилна транскриптаза се синтетизира cDNA на иРНК која се наоѓа во примерокот. Селективноста при овој процес, односно добивање на cDNA само од иРНК, а не и од останатите форми на РНК, се постигнува со користење на специфични прајмери. Имено, скоро секоја иРНК молекула на својот 3` крај има поли(А) опашка. Со дизајнирање на прајмер кој се поврзува специфично за неа (oligo dT, поли(Т) секвенција) се овозможуваат услови за селективност. Следен чекор е да се добие двојна верига на ДНК од cDNA веригата. Од добиената хибридна молекула во која една верига е иРНК, а другата cDNA, РНКделот парцијално се отстранува со дигестија соРНКаза. Притоа остануваат кратки РНК фрагменти прикачени на cDNA молекулата кои служат како прајмери за ДНК полимераза I. Со нејзино врзување за cDNA започнува синтезата на двоверижната молекула. Процесот многу наликува на синтеза, односно репликација, на неводечката ДНК верига. Вака добиени двоверижни фрагменти се клонираат во соодветни вектори за да се генерираат cDNA библиотеки. Целиот процес на синтеза на cDNA може да се изврши и со помош на reverse transcriptase PCR (RT-PCR). cDNA библиотеките овозможуваат анализа на транскриптивните гени. Притоа, лесно можат да се идентификуваат нови или варијации на веќе познатите транскрипти. На овој начин не само што се детектира составот на транскриптот, туку се детектира и неговото ниво. Активните гени создаваат повеќе иРНК, а со тоа ќе се формираат и повеќе клонови при процесот на создавање на cDNK библиотеката. Слика 47 Процес на создавање на cDNA. Најпрво со помош на poly(T) прајмер и реверзибилна транскриптаза се синтетизира cDNA. Следниот чекор е деградација на иРНК со помош на RNase H. За на крај да се синтетизира комплементарната ДНК верига со ДНК полимераза 44 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Хибридизација на нуклеинските киселини Под дејство на висока температура (над 95 °C), двете вериги од двојниот хеликс на ДНК се одвојуваат. Ова настанува поради кинење на водородните врски помеѓу комплементарните нуклеотиди. Вака раздвоените вериги на температура од 65°C имаат способност повторно да се поврзат помеѓу себе и да формираат двоверижна молекула. Процесот при кој настанува поврзување на две комплементарни вериги при што се формира двоверижна структура се нарекува хибридизација. Хибридизација може да одвива помеѓу сите типови на нуклеински киселини, ДНК со ДНК, ДНК со РНК или РНК со РНК. Единечната ДНК молекула, која се користи за детектирање на комплементарната секвенција, се нарекува хибридизациона проба или накратко проба. Оваа секвенција може да биде долга од неколку десетици до неколку илјади нуклеотиди. За визуализација на хибридизацијата, пробата се поврзува со некој маркер, односно во пробата се инкорпорираат претходно маркирани нуклеотиди. Како маркер се користат радиоактивни изотопи, флуоресцентни молекули или, пак, ензимски компоненти. Хибридизацијата е многу специфичен и сензитивен процес. Со соодветена проба може да се препознае само единечна секвенца во целиот геном. Хибридизацијата има голема примена во молекуларнобиолошките истражувања и генетската дијагностика. Доколку се сака да се локализира одреден ген во геномот, да се откријат различен тип на мутации или, пак, да се детектира експресијата на некој ген, може да се користат хибридизациони методи. Основата на денешните најсовремени методи за глобална анализа на генетската експресија и глобална анализа на генетските мутации е хибридизацијата на нуклеинските киселини. Доколку секвенцата која ја изучуваме не ни е доволно позната и немаме соодветна идентична проба за нејзина детекција, специфичноста Слика 48 Варијација на специфичноста на хибридизација во зависност од температурата. на хибридизацијата може да се При намалена температура, специфичноста се намали со тоа што ќе се изведе на намалува, а со тоа и пробата може да се пониска температура. Колку хибридизира за неидеално копмелементарна поголемо е температурното секвенција отстапување од 65 °C, толку специфичноста се намалува. При ваква хибридизација не е потребно 100% комплементарност. Ова најчесто се применува кога се споредуваат некои хомологни или слични секвенции во различни геноми, на пример, доколку сакаме да локализираме некој хуман ген во геномот на некој друг организам. Детекција на нуклеинските киселини со помош на блотинг (blotting) техники Една од најупотребуваните методи за детекција на фрагменти на ДНК е со Southern blot техниката. Со оваа техника може да се одреди дали во некој фрагмент од ДНК се наоѓа некоја секвенција или, пак, да се лоцира од кој дел на геномот, односно хромозомот доаѓа фрагментот. На овој начин може да се детектираат разни генетски или хромозомски мутации, вклучувајќи делеции, инверзии или транслокации. 45 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Техниката се состои од два дела: едниот е сепарирање на ДНК фрагментите, а другиот е нивна хибридизација со специфичена проба. Постапката започнува со дигестија на ДНК со рестрикциони ензими. Кој ензим или комбинација од кои рестрикциони ензими ќе се употребат, зависи од самиот експеримент, односно кој фрагмент се сака да се добие. Фрагментираната ДНК со електрофореза се сепарира. Притоа ДНК се денатурира за да се добијат едноверижни молекули. Следната етапа е трансфер на сепарираните ДНК фрагменти на мембрана која може да биде од нитроцелулозна или најлонска природа. За да се изведе трансферот од гелот на мембраната, гелот со сепарираните фрагменти се поставува на потопен сунѓер или, пак, хартија во пуфер, над гелот се поставува мембраната, а над мембраната сува хартија. Со ова се формираат услови за капиларно движење на пуферот во правец од гелот кон мембраната, а со тоа се овозможува трансфер на ДНК фрагментите на мембраната. Откако ќе заврши трансферот, на мембраната се нанесува претходно обележаната проба (најчесто радиоактивна) и се овозможуваат услови за хибридизација. При ова пробата специфично ќе се поврзе за комплементарните ДНК фрагменти, а остатокот ќе се измие од мембраната. Хибридизацискиот комплекс се визуализира со поставување на мембраната на радиографски филм. Анализата се базира на присуството на хибридизацискиот комплекс и големината на детектираниот бенд. 46 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 49 Шематски приказ на Southern blot техниката На сличен принцип како и Southern blot-от, функционира и Northern blot техниката. Со оваа техника се детектира присуство на РНК молекули во испитуваниот примерок. Изолираната РНК со помош на гел електрофореза се сепарира. Молекулите се движат низ гелот во зависност од нивната големина. Сепарираните РНКи се тансферираат на мембрана на истиот принцип како и кај Southern blot-от. Мебраната се хибридизира со специфична проба која комплементарно се поврзува за РНК. Визуализацијата се спроведува на идентичен начин. Со анализа на сигналот може квантитативно да определиме кој ген колку е експресиран во даден примерок. Големината на бендот на радиографскиот филм зависи од хибридизацискиот сигнал, кој, пак, зависи од бројот на молекули кои се хибридизирале. Бидејќи бројот на РНК молекулите е во корелација со активноста на анализираниот ген, врз база на интензитетот на бендот лесно може да се направи квантификација. 47 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Секвенционирање на ДНК Молекулата на ДНК структурно ќе биде карактеризирана само доколку е позната секвенцијата на нуклеотидите од кои е изградена. Ова е најпрецизниот и најинформативниот начин да се анализира дали некоја ДНК секвенција има варијација, мутација, кои се нејзините структурни или регулаторни елементи. Еден од најкористените методи за секвенционирање е развиен во 1970 години од Сангер (Sanger). Методот се базира на синтеза на серија на комплементарни сегменти на база на едноверижна ДНК молекула. При тоа, синтезата на фрагменти се прекинува по принципот на случајност. Ова генерира серија од ДНК фрагменти кои се сепарираат со електрофореза и се анализираат за да се утврди секвенцијата на матрицата. Шематски, техниката е претставена на сликата бр. 50. Накратко: најпрво специфичен прајмер се анелира на местото каде што треба да започне секвенционирањето. Во реакцијата се додаваат сите 4 дезоксирибонуклеотиди (од кои еден е радиоактивно обележан) и ДНК полимераза. Ваката мешавина се раздвојува во 4 различни туби. Во секоја туба се додава мало количество различен модифициран дезоксирибонуклеотид, наречен дидезоксинуклеотид. Овие нуклеотиди структурно се изменети за, кога ќе се врзат во синтетизирачката верига, да ја прекинат елонгацијата. Бидејќи им е отстранета OH групата на пентозниот шеќер, следниот по ред комплементарен нуклеотид не може да се поврзе и со тоа целата реакција се терминализира. При полимеразната реакција, полимеразата случајно го инкорпорира дидезоксинуклеотидот и со тоа се добиваат сегменти со различна должина. На пример, во тубата каде што е присутен ddATP, на секое место каде што ќе се прекине синтезата значи дека постои дезоксиаденин, или, пак, во тубата каде што е присутен ddCTP на крајот на секој фрагмент, значи дека е позициониран дезоксицитозинот. Вака добиените фрагменти се сепарираат на гел со помош на електрофореза и во однос на големината на бендовите може да се детерминира на која позиција кој нуклеотид се наоѓа. Така фрагментите од тубата, каде што се наоѓал ddATP, ќе детерминираат на која позиција се наоѓа A,ddCTP каде се наоѓа C, ddGTP каде еG, а ddTTP ја дава информацијата за T. Новите технологии (генерации) на секвенционирање целата постапка ја спроведуваат автоматски. Во апаратот се додава ДНК примерокот и автоматски се добива секвенцијата. Различни биотехнолошки компании развиваат различни платформи за брзо секвенционирање. Оваа нова технологија овозможува брзо, точно и ефтино секвенционирање на големи геноми како што е хуманиот. На пример, за секвенционирање на 1Mbp со помош на Сангер методот, потребни се околу 2400 USD, додека со новите генерации на секвенционери цената за исто толку голема секвенција е помала од 1 USD. Денеска секвенционирањето од техничка, економска и финансиска гледна точка не претставува посериозен проблем и е рутинска пракса во секоја поголема молекуларно-биолошка институција. 48 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 50 ДНК секвенционирање базирано на методот „chain termination“ (лево). Гел добиен при ДНК секвенционирање (десно). На база на распоредот на бендовите, може да се прочита секвенцијата. Читањето започнува од долу кон нагоре. Секвенцијата претставена на гелот е 5` CGCTTTCCА 49 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски СИНТЕЗА НА НУКЛЕИНСКИТЕ КИСЕЛИНИ Сите живи организми имаат заеднички механизам со кој ги процесираат информациите за синтеза на протеини. Имено, информацијата кодирана во ДНК се пренесува на соодветна копија на РНК која, пак, го диктира редоследот на синтезата на аминокиселините во протеините. Или поедноставено, ДНК ја дава информацијата за РНК, а, пак, таа за протеин. Поради својот фундаментализам, оваа спрега се нарекува „Централната догма“ која за првпат била предложена од Ф. Крик. Преносот на информациите од ДНК на РНК се нарекува транскрипција, а, пак, процесот со кој се синтетизира протеинот во рибозомите на база на иРНК се вика транслација. Во буквална смисла на зборот, „transcription“ на англиски значи препишување, иРНК се создава со препишување на соодветниот код кој се наоѓа на ДНК. Процесот на Слика 51 „Централна догма“. Претставен е правецот на движење на информациите од кодираната информација во молекулата на ДНК до функционалниот протеин транслација, од анг. „translation“ е преведување на секвенција запишана со нуклеотиди во секвенција изградена од аминокиселини. Мора да се напомене дека преносот на информациите во живите клетки не секогаш се одвива според редоследот објаснет со Централната догма. Не секои информации најпрво се препишуваат во иРНК, напротив покрај иРНК има уште 6-7 позначајни форми на РНК кои имаат различни функции во клетката. Во некои случаи, протокот на информациите наместо од ДНК кон РНК одат во обратен редослед, од РНК кон ДНК. На таков начин функционираат голема група на вируси, ретровируси, кај кои РНК е носител на наследниот материјал. Овие вируси во клетката домаќин со помош на ензимот реверзибилна транскриптаза од РНК синтетизираат ДНК. И на крај, не може да се занемарат протеините во протокот на информации. Без нив не може да се изврши синтезата на ДНК и РНК. ДНК, РНК и протеините се органски полимерни макромолекули кои се синтетизираат на база на некои заеднички принципи: - Сите се изградени од ограничен број различни мономерни единици кои се распоредени во специфичен распоред. ДНК е изградена од четири мономеринуклеотиди (A, T, G и C), РНК, исто така, од четири нуклеотиди (A, U, G и C), а во градбата на протеините учествуваат 20 различни аминокиселини; - При синтезата мономерите се додаваат еден по еден на ланецот кој се формира; - Секој полипептид има почеток, насока во која се синтетизира и крај и - Примарниот ланец кој се синтетизира за да стане функционален, најчесто претрпува модификации. Протеини и РНК се скратуваат, помали молекули на ДНК се врзуваат во една поголема или на основниот ланец на протеините се додаваат додатни молекули. При овие промени многу често се случува и просторна модификација на молекулата со која истата станува функционална. 50 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 52 Синтеза на макромолекули. Прикажана е полимеризација на органските макромолекули, полисахариди, протеини и нуклеински киселини. Заедничко за сите е дека при синтезата се користи енергија од ATP и се ослободува вода. При раскинување на молекулата, процесот оди во спротивен правец Ензими кои учествуваат во синтетизирање на нуклеинските киселини Нуклеинските киселини се синтетизираат на база на комплементарност по дадена матрица (template). Можноста за синтезата на нуклеинските киселини на база на комплементарност први ја предложиле Ватсон и Крик. Оваа претпоставка логично произлегла од конформацијата на нивниот модел на ДНК. Двојниот хеликс, кој тие го опишале теоретски, би можел да се раздвои и со тоа би се добиле две вериги. Со синтеза на комплементарни вериги на веќе постоечките матрици би се добиле две идентични молекули како и инцијалната матрица. Синтезата на ДНК, при процесот на ДНК репликацијата, се одвива со помош на ензими кои се нарекуваат ДНК-полимерази. Синтезата на РНК, при процесот на транскрипција, се одвива со посредство на РНКполимерази. Овде ќе наведеме некои својства кои се заеднички, а некои кои се специфични за овие две групи на ензими. Основна разлика е тоа што ДНК полимеразата синтетизира дезоксинуклеотиди, а РНК полимеразата рибонуклеототиди. И двете синтезата ја вршат во правец од 5` кон 3`, односно α фосфатот од нуклеотидот, секогаш се врзува за 3` хидроксилната група на пентозниот шеќер. Притоа се создава фосфордиестерска врска помеѓу двата нуклеотида и се ослободува пирофосфат. Пирофосфатот понатаму се разложува на две молекули на неоргански фосфор. При создавањето на РНК, РНКполимераза го препознава местото од каде што треба да ја започне синтезата, привремено ги раздвојува двете вериги на ДНК и ја започнува синтезата на новата молекула. Притоа, во зависност за кој тип на клетка станува збор (прокариотска или еукариотска), на местото каде што започнува синтезата се врзуваат протеини кои 51 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски формираат иницијален комплекс. Ова својство го нема ДНК-полимеразата, која може да создава полинуклеотиден ланец само доколку има соодветен почеток кој се состои од двојна верига на ДНК или комплекс ДНК-РНК. Ова се постигнува со помош на прикачување на кратка полинуклеотидна секвенца (прajмер) на матричниот ланец, на местото каде што треба да започне синтезата. Исто така, ДНК полимеразата нема својство да го расплете двојниот хеликс. Тоа се постигнува со ензими кои се викаат хеликази кои се потпомогнати во целиот процес од топоизомерази (ензими кои не дозволуваат супер извиткување на одвоените вериги). Местото на раздвојување на двојниот хеликс, каде што дејствува ДНК полимеразата, се вика репликациона виљушка. При ова се формираат две вериги: едната во правец од 5` кон 3`, а другата од 3` кон 5`. ДНК полимеразата ја следи хеликазата и на база на матрицата која е во правец од 3` кон 5`, синтетизира комплементарни вериги. Слика 53 Хемиска основа на полимеризација на иРНК Бидејќи ДНК полимеразата не може да додава нуклеотиди во обратен правец, другата матрица, која е во спротивен правец, се синтетизира на поинаков начин со формирање на мали фрагменти во кои ДНК полимеразата може да дејствува. Целиот процес на репликација на ДНК ќе биде подетално објаснет во наредните поглавја. Заедничка особина е што и двата типа на ензими, доколку направат грешка во синтезата, можат да се вратат назад и да ја поправат. Меѓутоа, ДНК полимеразата е ензим кој е многу попрецизен и во синтезата и коригирањето на грешките од РНК полимеразата. Така, ДНК полимеразата при репликацијата прави една грешка на секои 107, а РНК полимеразата на секои 104 синтетизирани нуклеотиди. Кога ќе се земе предвид функцијата на двете молекули, едната да ја зачува информацијата, а другата привремено да ја пренесе, тогаш лесно може да се разбере зошто грешките кај ДНК полимеразата се минимални. 52 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Организација на генетскиот материјал во прокариотски и еукариотски клетки Што сè треба да се подразбере под ген, е предмет на дебата. Генерален консензус постои дека ген е наследна единица на секој жив организам која носи информација за синтеза на протеини. Ова дефинирање може да се прошири со тоа дека ген е секвенција од нуклеинските киселини бидејќи може да биде и РНК кај некои вируси, која носи информација за синтеза на функционални продукти. Или, секвенца од нуклеинската киселина која е неопходна за синтеза на еден функционален полипептид. Овде, покрај кодирачкиот дел од генот, спаѓаат и регулаторните елементи како промоторот и енхансерот, делот кој учествува во создавањето на polyA опашката или, пак, сечењето на РНК молекулата. Гените во прокариотската клетка понекогаш на хромозомот се групирани во однос на нивната функција. Тоа често се случува со различни гени кои учествуваат во ист метаболички процес. Пример за тоа се петте групирани гени кои учествуваат во синтезата на триптофанот кај E. Coli. Гени групирани на овој начин, во една транскрипциона единица, формираат оперон. Контролата на транскрипцијата на сите гени во оперонот најчесто е заедничка. Значи, кога ќе заврши транскипцијата на првиот ген од групата, истата ќе продолжува на вториот и сè така до последниот ген. Доколку се случи проблем во транскрипцијата на еден од гените, тогаш најчесто транскрипцијата не продолжува на наредниот ген. Ова е многу практично решение за организми кои треба да спакуваат повеќе информации во помала секвенција на ДНК, а и воедно процесот на синтеза на протеините е многу побрз. При транскрипција на иРНК за триптофанот се формира една молекула на РНК во која рибозомите препознаваат пет различни гена и на база на нив синтетизираат 5 различни полипептида неопходни за синтеза на триптофанот. Ваквата РНК се вика полицистронична (polycistronic), спротивно, секвенцијата која кодира еден полипептид, се вика цистронична (cystronic). Слика 54 Шематски приказ на триптофан оперонот. Сите 5 гена во оперонот создаваат еден континуиран заеднички транскрипт За разлика од прокариотските организми, РНК кај еукариотските клетки носи информација само за еден полипептид, кој понекогаш може да биде различен, иако потекнува од еден ист примарен транскрипт. Ваквата цистронична организација на гените, кај сложените организми овозможува мутацијата во еден ген да не допринесе до неактивност на останатите, како во случајот кај оперонот кај прокариотите. Транслацијата на еукариотската РНК започнува на стартниот кодон (AUG), кој е најблиску до 5`-„капа“ (cap) структурата. Најголем број од гените кај еукариотските клетки, покрај ексони (секвенции од кои ја кодираат информацијата за редоследот на аминокиселините), поседуваат иинтрони (секвенции кои се наоѓаат помеѓу ексоните и не кодираат информација за синтеза на полипептидниот ланец). Модификацијата на примарниот транскрипт кај еукариотските клетки започнува со додавање 5`-„капа“ елементот. При терминацијата на транскрипцијата, доаѓа до сечење на РНК на 3` крајот и нејзина полиаденилација. Ензимот CPSF (cleavage/polyadenylation specificity factor) го препознава AAUAAA местото (кај луѓето), се врзува за него и со помош на уште неколку дополнителни фактори ја сече РНК молекулата. Притоа се формира слободна 3` хидроксилна група на која со ензимот поли(А) полимераза (polyA polymerase) се синтетизира поли(А) опашката. Синтезата се состои од додавање од 200-на аденозинмонофосфатни. Функцијата на поли(А) опашката е да ја заштити иРНК од деградирање, учествува во терминацијата на транскрипцијата, го овозможува транспортот на иРНК од јадрото во цитоплазмата и кај некои видови на РНК учествува 53 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски во транслацијата. Последна фаза во реорганизација на примарниот транскрипт е процесот со кој се отстрануваат секвенциите препишани од интроните со механизам наречен сплајсинг (splicing). 54 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Транскрипција кај прокариотските клетки Транскрипција е процес при кој се синтетизира РНК молекула комплементарна на еден сегмент од едната верига на двојниот ДНК хеликс. Ова е прецизно диригиран процес, при кој РНК полимеразата точно знае во одреден момент каде да го започнe процесот. Тоа го постигнува со специфично врзување на определено место на ДНК матрицата. Кај прокариотските организми, РНК полимеразата сама го избира местото за почеток на транскрипцијата. Првиот чекор се вика иницијација. Тој започнува со врзување на подединицата сигма (познат како сигма фактор (sigma (σ) factor)) од РНК полимеразата за соодветна секвенција на ДНК, наречена промотор. Промоторот се наоѓа на 5` крајот на „СТАРТ“ кодонот и, обично, е во неговата близина. ДНК е двоен комплементарен хеликс и двете вериги носат иста информација за синтеза на протеинот. И покрај тоа, РНК полимеразата синтетизира транскрипт само на база на едниот ланец. Која верига ќе биде матрица за транскрипцијата, зависи од тоа на која страна се наоѓа промоторот. Мутација во оваа секвенција, може да го попречи целиот процес. Кај бактериите, во делот на промоторот се наоѓаат две секвенции кои се карактеристични за повеќето гени. Бидејќи се присутни кај најголем број гени и кај различни видови на прокариоти, истите се нарекуваат консензуални секвенции (consensus sequences). Едната е TATAAT секвенцијата и се наоѓа 10 нуклеотиди пред „СТАРТ“ кодонот (се обележува со -10), а другата е TTGACA секвенцијата која е на 35 нуклеотиди од „СТАРТ“ кодонот (-35). За овие секвенции се вика дека се во cis-позиција со генот (на иста верига). За овие ДНК секвенции се врзуваат специфични молекули кои учествуваат во транскрипционата регулација на дадениот ген. Колку силно РНК полимеразата ќе се врзе за промоторот, зависи од самиот промотор, односно од неговата секвенција. За некои промотори РНК полимеразата посилно се врзува отколку за други, а со тоа и активноста на дадениот ген се зголемува. Така, протеините кои се повеќе застапени во клетката, потекнуваат од гени кои имаат силни промотори и обратно, ретки протеини потекнуваат од гени кои имаат послаби промотори. Како последен фактор кој ја детерминира специфичноста на врзувањето на РНК полимеразата за промоторот е сигма факторот, кој најчесто е од типот σ70 (70 Слика 55 Правец на транскрипцијата на повеќе гени сместени на сегмент од хромозомот на E.Coli. Во која насока ќе се одвива транскрипцијата, зависи од промоторот (обележан со зелено) значи 70kd). Некои бактерии поседуваат специфични промотори за кои може да се врзат само дополнителни σ фактори (σ32, σ54, σS). При соединување на ензимот со матрицата, доаѓа до структурно модифицирање на комплексот со што се „релаксира“ двојниот хеликс. Раздвојувањето на двата хеликса на ДНК е неопходно за синтезата да 55 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 56 Промотор на ген од прокариотска клетка започне. Како што опишавме претходно, транскрипцијата се одвива врз основа на само една матрица и тоа во правец од 5` кон 3` и за нејзиното започнување не е потребен пример. Вака формираниот комплекс иницијално ќе создаде транскрипт кој е долг десетина нуклеотиди. Примарна функција на иницијалниот комплекс е да ја започне транскрипцијата и истиот е прилично неефикасен во процесот на синтеза. Затоа доаѓа до структурна промена, при која се одвојува σ факторот од РНК пролимеразата, која, пак, понатаму самата ја продолжува синтезата. Следната етапа од транскрипцијата е процесот на елонгација. Ова е процес при кој на новосинтетизирачката молекула се додаваат по педесетина нуклеотиди во една секунда и притоа се создава привремен дуплекс помеѓу матричната ДНК и комплементарна на неа РНК. Процесот на елонгација трае сè додека РНК полимеразата не дојде до секвенција која има функција да ја прекине транскрипцијата. Оваа секвенција е долга околу 40-тина базни пара и во најголемиот број случаи придонесува за создавање на специфични конформациони состојби на крајниот дел на РНК при кои доаѓа до ослободување на РНК полимеразата. Во некои случаи, за терминалните единици се врзува терминалниот фактор ρ (rho), протеин кој физички дејствува на терминацијата. Ослободената РНК полимераза повторно се Слика 57 Алтернативни промоторни секвенции кај E. врзува за σ факторот за да Coli. Стандардниот промотор е препознат од σ70, учествува во транскрипцијата на промоторот на „Heat-shock“ генот е препознат од нов ген, а новосоздадената РНК се σ32, а на „Nitrogen-stravation“ генот од σ54 факторот раздвојува од својата матрица. 56 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 58 Фазите на транскрипција кај Е.Coli 57 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Транскрипција кај еукариотските клетки Принципот на транскрипција кај прокариотите и еукариотите е сличен со оној кај прокариотите, со неколку суштествени разлики: - Кај еукариотите, транскрипцијата на различни типови на РНК се одвива со помош на три различни РНК полимерази. РНК полимераза I учествува во синтеза на рРНК, РНК полимераза II синтетизира иРНК и снРНК(snRNA), а РНК полимераза III ја синтетизира 5S рРНК и тРНК; - За да започне транскрипцијата, двојниот хеликс треба да биде раздвоен; - Покрај промоторот, во создавањето на иницијалниот транскрипционен комплекс учествува и енхансерот (enchancer). Тоа е ДНК секвенција за која, исто како и за промоторот, се врзуваат транскрипциони фактори кои учествуваат во регулација на транскрипцијата и - Примарниот транскрипт кај еукариотите претрпува сложени промени пред да се вклучи во процесот на транслација. Овој процес на посттранскрипциона модификација на иРНК, се нарекува матурација на иРНК. Слика 59 Еукариотски промотор За да започне транскрипцијата на иРНК кај еукариотската клетка, потребно е да се создадат соодветни услови, многу посложени отколку кај прокариотската клетка. РНК полимераза II не е способна самата да се врзе за ДНК и да го започне процесот. Како и кај бактериите и овде се сретнуваат повеќе консензуални елементи во делот на промоторот. Еден од нив е сместен од 25 до 35 базни пара пред „СТАРТ“ кодонот и, бидејќи е изграден од седум A и T нуклеотиди (TATAAAA), се нарекува TATA box. Овој елемент е карактеристичен, речиси, за сите гени поради тоа има неспецифична улога во поврзување на транскрипционите фактори кои учествуваат во почетното раздвојување на ДНК веригите. Друга е GGCCAATCT консезуална секвенција која е присутна кај некои гени. Овој таканаречен CAAT box е сместен околу -80 bp во 5` правецот од „СТАРТ“ кодонот. Во групата на cis ориентирани елементи е и гореспоменатата енхансер секвенција. За разлика од промоторот, кој секогаш се наоѓа на 5` крајот на генот, енхансерот може и да биде сместен на 3` крајот на генот или, пак, во самиот ген. За овие cis делувачки елементи се врзуваат група на trans делувачки елементи кои се од протеинска природа и учествуваат во транскрипцијата, транскрипциони фактори (ТФ). Овие фактори овозможуваат РНК полимераза II да се позиционира на промоторот, да се одвои двојниот хеликс на ДНК и да започне процесот на елонгација. Првиот транскрипционен фактор кој се врзува за ДНК, односно за TATA боксот, е TFIID. Поради тоа и се нарекува ТАТА врзувачки протеин. При оваа врска доаѓа до конформациска промена на ДНК, со што се создава простор за останатите ТФ да го препознаат активниот промотор. Како последица на тоа, на комплексот се Слика 60 3D структура на TATA врзувачкиот врзуваат уште најмалку седум ТФи меѓу протеин. Прикажано е делумно расплетукои TFIIB, TFIIА и TFIIH за да го формираат вање на ДНК (црвено) на местото каде што преиницијалниот комплекс за кој се врзува се поврзал TФ 58 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски РНК полимераза II. TFIIH има својство на ДНК хеликаза со која го расплетува двојниот хеликс и овозможува пристап на РНК полимераза II до единечната матрична верига. Следниот чекор е идентичен со оној кај бактериите, кога по синтетизирањето на иницијалните, неколку десетина нуклеотиди, РНК полимераза II ја менува својата конформација со што се ослободува од општите транскрипциони фактори и ја започнува елонгацијата. Притоа доаѓа до фосфорилација на C-териналниот домеин на РНК полимераза II од страна наTFIIH која во овој случај има улога на протеин киназа. Вака претставениот модел на иницијација на транскрипција е основата на процес кој во реални in vivo услови се многу посложени. Имено, генералните транскрипциони фактори не се специфични до тој степен да одредат кој ген треба да се траскриптира, а и генот, односно секвенцата која треба да се препише, не е лесно достапен поради хроматинските елементи. Затоа, за да започне транскрипцијата, односно да се формира иницијалниот траскрипционен комплекс, најпрво е потребно група на протеини наречени транскрипциони активатори да се врзат за регулаторните елементи на генот, понатаму потребно е група на протеини кои се викаат транскрипциони медијатори да се поврзат за да овозможат соодветна врска помеѓу транскрипционите активатори, генералните транскрипциони фактори и РНК полимераза II и на крај на овој комплекс, треба да му се придружат ензими кои учествуваат во модификација на хроматинот. Вака создадениот комплекс, во кој има над стотина компоненти, сега е подготвен да ја започне транскрипцијата. Подетално, овој комплекс ќе биде објаснет во делот на регулација на генетската експресија. При процесот на елонгација, РНК полимераза II со различна брзина се движи по различни сегмененти од матрицата, а со тоа одредени делови побрзо или побавно ги синтетизира. Како што се движи по ДНК, така и го размотува двојниот хеликс. Бидејќи ДНК е спакувана во хроматинот, најверојатно при овој процес има помош и од група на протеини кои Слика 61 Иницијација на транскриформираат хроматински ремоделирачки пцијата кај еукариотските клетки комплекс. При расплетување на ДНК се 59 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски индуцираат тензиски сили кои предизвикуваат ротирање на молекулата околу својата оска. При ова доаѓа до позитивно суперизвиткување во правецот на движење на РНК полимераза II, a негативно во обратниот правец. ДНК топоизомераза е ензимот кој притоа дејствува и го редуцира суперизвиткувањето. РНК полимераза II додека ја синтетизира примарната РНК, на неа мобилизира фактори кои понатаму учествуваат во нејзиното моделирање. Тоа го прави на тој начин што на својата фосфорилирана опашка носи некои од овие протеини и на местото каде се потребни ги закачува. Со тоа го детерминира местото каде ќе се одвива моделирањето и создава услови за прикачување на останатите Слика 62 РНК полимераза на својата елементи кои ќе учествуваат во него. Од ова опашка носи различни фактори кои ги може да се заклучи дека РНК полимераза II прикачува на соодветните места на не само што врши синтеза на молекулата на примарниот транскрипт. Овие фактоРНК, туку учествува и во нејзиното ри учествуваат во посттранскрипционото модифицирање на РНК. Како моделирање. Како што напоменавме погоре, пример на шемата се обележани: „cap“ примарниот транскрипт треба да претрпи со сино, сплајсинг факторот со кафеаво, полиаденилациониот фактор низа на промени пред да може да го напушти со зелено јадрото и да се врзе со рибозомите. Првата модификација се случува уште на самиот почеток кога веригата е долга околу 25 нуклеотиди, со додавање „капа“ („cap“) на нејзинитот 5` крај. Ова е синхронизиран процес во кој учествуваат три ензима: фосфатаза (фосфорилација на 5` крајот), гванин трансфераза (додава GMF) и метил трансферза (додава метил група на гванинот). „Капа“ има заштитна функција, учествува во понатамошната дообработка на РНК, важна е за транспортот на молекулата во цитосолот и има функција во транслацијата. Слично како што се случуваат промените додавање на метил група на 5`, така се случуваат промени и на 3` крајот. Кодираната секвенција (5′-AAUAAA-3′) на 3` крајот од генот носи информација за формирање на поли(А) опашка. Оваа структура е присутна кај речиси сите иРНК во еукариотските клетки и е составена од 150 до 250 нуклеотиди на аденозин. За разлика од останатиот дел од иРНК, поли(А) опашката не се синтетизира на база на комплементарност на дадена матрица, туку независно од ензимот поли(А) полимераза. Поли(А) сигналот и GU богатата секвенца која следи по него, се врзувачко место за факторите кои учествуваат во терминацијата на транскрипцијата и истовремено полиаденилацијата. РНК полимераза II на Слика 63 На иРНК со ѕвезда се обележасвојата опашка носи два ензима „cleavage and ни местата каде што може да се случи polyadenylation specificity factor (CPSF)” и дополнителна метилација и да се „cleavage stimulation factor (CstF)”. Кога ќе го формираат тип 1 и тип 2 „капа“ струкпомине аденилирачкиот сигнал, таа ги тури закачува овие два ензими на него и доаѓа до 60 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски сечење на веригата на местото каде што треба да почне поли(А) опашката. На тоа место се закачува поли(А) полимераза која почнува да ја синтетизира поли(А) секвенцијата. Притоа, за новосинтетизираниот дел се прикачува протеин „polyadenylate-binding protein“ (PABP) кој ја детерминира должината на опашката и понатаму учествува во процесот на транслација. Се претпоставува дека кога РНК полимераза II ќе го помине поли(А) сигналот, доаѓа до конформациска промена на Слика 64 Полиаденилација на иРНК. Прикажани се CPSF и врската помеѓу ензимот и ДНК CstF кои специфично се врзуваат за 5′-AAUAAA-3′ и GU веригата, која придонесува богатата секвенција постепено РНК полимераза II да се одвои од матрицата и со тоа да се заврши транскрипцијата. Притоа, делот на РНК кој е синтетизиран после поли(А), местото се пресекува и разградува. Најголем број од иРНК кај луѓето, на крајот содржат поли(А) опашка. Кај мал број, опашката се губи во текот на посттранскрипционата модификација. Голем број гени содржат повеќе од едно полиаденилирачко место. Така, во зависност на кое место ќе настане сечењето на РНК, можат да се добијат различни по големина иРНК молекули. Нормално, варијацијата на должината ќе се однесува на 3` крајот. Додека иРНК се наоѓа во цитоплазмата, Поли(А) опашката постепено се намалува во процес кој се нарекува деаденилација. Со нејзиното намалување, стабилноста на молекулата се намалува и под одредена критична должина РНК се разградува. Спротивно на овој процес е цитоплазматската полиаденилација со која доаѓа до зголемување на Поли(А) опашката со цел да се овозможи нормално функционирање на некои клетки во дадени услови (пр. оплодена јајце клетка). Крајниот процес во формирањето на зрела и функционална иРНК е отстранување на интроните и поврзување на ексоните еден за друг во континуирана верига. Овој процес се одвива со исклучителна прецизност бидејќи минимална грешка од само еден нуклеотид ќе создаде секвенца која понатаму може да се создаде нефункционален протеин. Кај помалите гени кои имаат помалку интрони, сплајсингот се започнува со формирањето на поли(А) опашката. Доколку примарниот танскрипт има повеќе интрони, во некои случаи повеќе десетици или стотици, тогаш сплајсингот започнува пред да заврши транскрипцијата. Местата каде се одвива сплајсингот, се, обично, конзервативни и тоа GU на 5` Слика 65 Детерминираните позиции во интронот каде што настанува сплајсингот крајот и AG на 3` крајот на интронот. Главна улога во целиот процес ја имаат група на мали нуклеарни РНК (snRNAs), обележани со U1, U2, U4, U5 and U6. Овие снРНК заедно со одредени протеини, кои можат да бидат специфични за таа снРNK или, пак, заеднички за сите, формираат 61 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски структури кои се викаат мали нуклеарни рибонуклеопротеини (small nuclear ribonucleoproteins, snRNPs). snRNP во интеракција со друга група на протеини, формираат комплекси, наречени сплајсеозоми (spliceosome), кои, всушност, го извршуваат целиот процес. Сплајсеозомот е динамичка структура во која доаѓа до замена на компонентите во текот на процесот. Најпрво, на местата каде што треба да се изврши сплајсингот, се врзуваат два протеини BBP (branch-point binding protein) и U2AF. Потоа следува врзување на U2 snRNP за 3` крајот и U1 snRNP за 5` крајот на интронот. Врзувањето на snRNA за пре-РНК e на база на комплементарно базно спарување. Следни во реакцијата влегуваат U4/U6•U5, при што доаѓа до неколку реорганизации помеѓу компо-нентите на сплајсеозомот. Притоа, настанува раздвојување на U4 и U6 и отстранување на U4 од комплексот и замена на U1 со U6. Ваквата реорганизација создава услови двата краја на интронот да бидат во близина, при што се создава активно место на кое настанува сплајсингот. Според некои сознанија, во детерминација на границата помеѓу ексонот и интронот учествува и Слика 66 Маркирање на ексоните со SR протеините група на протеини наречени SR протеини. Овие протеини им овозможуваат на снРНКи да се врзат за соодветните места предвидени за сплајсинг. Овие протеини се врзуваат на ексонскиот дел на пре-РНК и се во тесна врска со U1 на 5` и со U2AF на 3` крајот од интронот. Притоа, маркирањето на ексоните се одвива за време на транскрипцијата, започнувајќи од „капа“ врзувачкиот комплекс. Со завршувањето на реорганизацијата на пре-РНК, настанува иРНК, која е подготвена за транспорт во цитоплазмата каде што ќе се врзе со рибозомите за да се синтетизира соодветниот протеин. Само зрела и функционална иРНК може да помине низ јадрената мембрана. Останатите нефункционални сегменти на РНК кои се добиени при сплајсингот, остануваат во јадрото каде се разградуваат до структурните мономери. Селективноста на транспортот на материите од и надвор од клеточното јадро, го прават транспортните канали на јадрената мембрана (nuclear pore complex, NPC). NCP е изграден од повеќе копии на педесетина до стотина различни протеини. Низ порите на јадрената мембрана само помали молекули до 50-60 kd можат да поминат пасивно по пат на дифузија. Додека поголемите молекули, вклучувајќи ја и иРНК, поминуваат со помош на активен транспорт. Која молекула ќе биде експортирана/импортирана зависи од сигналот кој со себе го носи и како тој ќе биде препознат од NPC. Во случајот кај иРНК сигналот доаѓа од протеини кои се поврзани за неа, односно елементите кои влегуваат во „капа“ комплексот, SR протеините и поли(А) опашката. Покрај тоа, во селективноста на процесот учествуваат и голема група на протеини, над 30 кај луѓето, наречени hnRNPs (heterogeneous nuclear ribonuclear proteins). Овие протеини доминантно се наоѓаат на интроните и при процесот на сплајсинг се елиминираат од зрелата иРНК. Бидејќи истите не се присутни, или во многу мал број, на иРНК се смета дека придонесуваат во препознавањето на тоа која РНК ќе излезе од јадрото. иРНК претрпува серија на промени пред и за време на процесот на транспорт низ јадрената мембрана. Преминот низ NCP започнува со 5` крајот односно со „капа“ комплексот. При транспортот, голема група на протеини се откачуваат од молекулата и остануваат во јадрото. Дел од врзаните протеини остануваат на молекулата и учествуваат во наредниот процес, транслацијата. 62 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Како што молекулата на иРНК излегува од јадрото, така и сите протеини кои учествуваат во јадрените процеси, треба да се транспортираат во јадрото. Тука спаѓаат сите ДНК и РНК полимерази, транскрипциони фактори, сплајсинг протеини, snRNP и многу други. Овие протеини се синтетизираат во цитоплазмата и за да влезат во јадрото, потребно е со помош на активен транспорт да поминат низ NPC. За сите ова протеини е потребно да има нуклеарен локализирачки сигнал (nuclear localisation signal, NLS). За овој сигнал се врзуваат неколку протеини кои формираат комплекс неопходен за молекулата да може да помине низ јадрената мембрана. Слика 67 Шематски приказ на сплајсинг на еден интрон (лево). Конформациски промени кои се случуваат во сплајсеозомот (десно) 63 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски СИНТЕЗА НА ПРОТЕИНИ Како што многупати досега беше споменато, функцијата на иРНК е да ја пренесе информацијата од молекулата на ДНК до рибозомите во цитоплазмата за синтеза на соодветен протеин. Синтезата на протеинот, врз основа на кодот кој го носи иРНК, се нарекува транслација. Станува збор за исклучително интересен механизам при кој полимерна молекула составена од нуклeотиди, иРНК, дава информација за синтеза на друга полимерна молекула, која е составена од сосема различен тип на мономери, аминокиселини. Транскрипцијата е прилично поедноставна да се објасни бидејќи на база на една полинуклеотидна секвенција, се создава друга полинуклеотидна секвенција. Притоа се користи ист код, нуклеотидите, само при препишувањето, еден се заменува со неговиот комплементарен. Слика 68 Генетски код. Претставени се кодоните со соодветнит е аминокиселини. Некои аминокиселини се кодираат со повеќе од еден код. Кодоните кои кодираат иста аминокиселина, најчесто имаат два почетни идентични нуклеотида При транслацијата, кодот носен од нуклеотиди го детерминира редоследот на аминокиселините во протеините. Бидејќи има многу повеќе аминокиселини (20 протеиногени) од нуклеотиди (4), невозможно е еден нуклеотид да биде код за една аминокиселина. Најпрво математички, а подоцна и експериментално, е докажано дека само, ако се групираат 3 нуклеотида, можат да формираат доволно број кодови за секоја аминокиселина. Така комбинација од 3 нуклеотида, можат да дадат информација за 64 различни аминокиселини. Бидејќи има само 20 аминокиселини, нормално е да се заклучи дека некои комбинации или не кодираат информации за аминокиселини или, пак, различни комбинации кодираат информации за една иста аминокиселина. Вториот механизам е оној на кој се базира кодирањето на аминокиселините. Триплет од нуклеотиди кој дава информација за Слика 69 Три различни рамки на читање на една аминокиселина се вика кодон. Поради континуираниот карактер на една иста иРНК секвенција. Во зависност иРНК, при транслацијата, кодоните се од тоа каде ќе започне читањето, можат детерминираат според тоа од каде да се добијат 3 различни полипептиди секвенции започнало читањето. Значи, првите три 64 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски нуклеотида ја даваат информацијата за првата аминокиселина, следните три за втората и така натаму. Доколку транслацијата на истата иРНК започне еден нуклеотид подоцна, во тој случај ќе се добие различен стартен кодон, после кој сите последователни кодони ќе носат различна информација од предвидената. Со тоа ќе се добие сосема различен протеин. Затоа е важно при транслацијата на кодираната информацијата да се зачува рамката (frame) на читање на кодот. 65 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Транспортна РНК (тРНК) Кодонот на иРНК, кој носи информација за една аминокиселина, директно не се поврзува со истата при синтезата на полипептидот. Како посредник помеѓу кодонот кој се наоѓа на иРНК и соодветната аминокиселина, се јавува специфична мала РНК наречена транспортна РНК (тРНК). Името го добила според нејзината функција да ги транспортира аминокиселините на соодветното место. Оваа мала РНК, на едниот свој крај има триплет од бази наречен антикодон со кој го препознава кодонот на иРНК, а на спротивната страна на 3` крајот се наоѓа местото за кое се врзува соодветната аминокиселина. тРНК е молекула изградена од околу 80 нуклеотиди, кои во одредени кратки сегменти комплементарно се поврзуваат помеѓу себе со водородни врски. Поради овие поврзувања и петелките кои настануваат молекулата добива изглед на лист од детелина. тРНКи е генетски кодирана и се синтетизира со помош на РНК полимераза III. Во хуманиот геном има 497 гени за тРНК. При синтезата се формира примарна тРНК која претрпува серија трансформации при што се отсекуваат одредени нејзини делови за да стане на крај функционална тРНК. При модифицирањето на примарната тРНК доаѓа и до хемиска промена на некои од нејзините нуклеотиди. Слика 70 Транспортна РНК за аминокиселината фенилаланин (Phe). (А) Шематски приказ на тРНК на кој се обележани нејзините функционални делови. (Б и В) Изглед на тРНК молекулата при дифракциона анализа со X-зраци. (Г) Линеарен приказ на нуклеотидната секвенција Познати се над 50 модификации на стандардните четири нуклеотида A, U, C и G. Имено, ова модифицирање е толку често што речиси секој десетти нуклеотид е модифициран. Овие модификации придонесуваат за формирање на терцијарната структура на молекулата, конформацијата на антикодонот која е неопходна при препознавањето на кодонот или, пак, учествуваат во детерминирањето на аминокиселинското спојувачко место. Која аминокиселина ќе биде транспортирана од која тРНК, зависи од антикодонт. Аминокиселините се закачуваат за неспарениот слободен 3` крај на тРНК со помош на ензимот аминоацил-тРНК синтетаза (aminoacyl-tRNA synthetases). Кај еукариотските клетки, за секоја аминокиселина има специфична аминоацил-тРНК синтетаза. При оваа реакција се користи енергија од ATP со што се формира високоенергетска врска помеѓу тРНК и аминокиселината. Специфичноста на 66 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски аминоацил-тРНК синтетаз а да поврзе соодветна аминокиселина на дадена тРНК молекула е голема. Најпрво, тРНК синтетазата треба да поврзе соодветна аминокиселина за себе, а потоа самата да се поврзе за соодветна тРНК. Селектирањето која аминокиселина ќе се врзе за дадена тРНК синтетаза е на база на тродимензионална конформациска компатибилност на двете молекули. Врзувачкото место на тРНК синтетазата е конформациски моделирана да одговара најмногу за соодветната аминокиселина. Тој дел од ензимот е како идеален калап за дадената аминокиселина. Нормално, доколку аминокиселината е поголема, во тој случај истата не може да влезе во врзувачкото место, а доколку е помала, совпадливоста би била мала. Некои аминокиселини помеѓу себе се разликуваат многу малку. За да се избегне грешка, врската помеѓу аминокиселината и тРНК се проверува уште еднаш. Вториот контролен механизам функционира на истиот принцип на просторна совпадливост. Само доколку аминокиселината ги помине двете контролни точки, тогаш тРНК синтетазата ќе прејде на следниот чекор, а тоа е поврзување на аминокиселината за соодветната тРНК. Најчесто тРНК синтетаза на себе има 3 нуклеотидни специфични места (жлеба) со кои можат да го препознаат дадениот антикодон. Со помош на жлебовите ќе се врзат за тРНК и ќе ја закачат аминокиселината на нејзиниот 3` крај. Притоа ќе се ослободи претходно врзаниот AMP од аминокиселината. Слика 71. Пример на модифицирани азотни бази кои учествуваат градбата на тРНК во 67 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Транслација Рибозомите се органели во кои се одвива синтезата на протеините во процес наречен транслација. Вообичаено, во една секунда можат да се синтетизираат од 3 до 5 аминокиселини на полипептидниот ланец. Транслацијата се состои од три фази: иницијација, елонгација и терминација. Првата фаза или иницијација, се состои од формирање на комплекс кој ќе ја започне синтезата на полипептидот. Ова е исклучително важен сегмент бидејќи овде се детерминира рамката по која ќе се преведе иРНК. Доколку иницијално се направи грешка, целиот формиран полипептид ќе има погрешен состав. Формирањето на иницијалниот комплекс и започнувањето на иницијалната фаза имаат и регулаторна функција во однос на тоа колку еден протеин ќе биде застапен во клетката. Имено, колку побрзо ќе настане иницијацијата, толку побрзо ќе се синтетизира и протеинот. Транскрипцијата, односно синтезата на протеинот, започнува од „СТАРТ“ кодонот или AUG. На овој кодон соодветствува аминокиселината метионин или кај прокариотите нејзина модифицирана верзија, формилметионин. Специфична иницијална тРНК за метионин, која се разликува од стандардната тРНК за метионин, ја пренесува првата аминокиселина. Оваа тРНК е единствена која има способност да се врзе со малата подединица на рибозомите во отсуство на големата подединица. Врската тРНК-мала подединица е овозможена од еукариотскиот иницијален фактор (eucaryotic initiation factors (eIFs)). Вака формираниот комплекс е способен да го препознае „капа“ елементот на иРНК и со помош на eIF4E да се врзе за него. На овој комплекс се надоврзува и eIF4G. Формираниот комплекс, со помош на енергија од ATP, почнува да се лизга по иРНК кон нејзиниот 3` крај сè додека не стигне до „СТАРТ“ кодонот, AUG. Кога ќе го препознае „СТАРТ“ кодонот eIFs, се ослободуваат од комплексот и големата рибозомална единица се врзува за малата подединица. Притоа, метионинот се наоѓа во сегментот P на големата подединица. Кај бактериите бидејќи нема Слика 72 Транслација-иницијација „капа“ елемент на иРНК, рибозомите препознаваат каде да се врзат за иРНК на база на AGGAGGU секвенцијата која се наоѓа 5` од AUG. Ова место на иРНК се вика рибозом врзувачко место или „Shine-Dalgarno“ секвенција. Во некои случаи иницијалниот комплекс не ја почнува транслацијата од 68 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски првиот „СТАРТ“ кодон, туку од некој од наредните во правец на 3` крајот. На овој начин клетката може да синтетизира различни протеини на база на една иста иРНК. Нормално, разликата ќе биде во почетниот N-крај на протеинот. Следната фаза е елонгација. Во оваа фаза се одвива синтеза на полипептидниот ланец. Бидејќи првата тРНК се наоѓа на P- врзувачкото место, A е слободно и може да ја прими следната тРНК која е дефинирана со кодонот на иРНК. Во слободната А позиција тРНКи со различни антикодони можат да дифундираат, меѓутоа само онаа која ќе воспостави доволно јака комплементарна врска со кодонот ќе остане. Врзувањетона тРНК за А единицата е посредувано од факторот на елонгација (elongation factors; EFTu). Кога и двете единици P и А ќе бидат окупирани со тРНК, тогаш ќе дојде до поврзување на аминокиселините кои со себе ги носат. Притоа, карбоксилната група на аминокиселината која се наоѓа во P сегментот ќе се поврзе со слободната амино група на аминокиселината која се наоѓа во A сегментот. Пептидната врска помеѓу двете аминокиселини е овозможена поради активираноста на аминокиселина која се наоѓа на P-позицијата. Аминокиселините со помош на ковалентни врски се поврзани за тРНК, па при близок контакт во рибозомите ковалентната врска помеѓу аминокиселината и тРНК се заменува со ковалентна врска помеѓу двете аминокиселини. Оваа размена на ковалентната врска, односно додавање на аминокиселина на пептидниот ланец е посредувано од пептидил трансферазата (peptidyl transferase), која се наоѓа во големата подединица. За време на елонгацијата, C терминалниот дел на полипептидот секогаш е поврзан со високоенегретска врска со тРНК која се наоѓа на P позиција. Со поврзување на аминокиселината за растечкиот полипептид, рибозомот конформациски се менува при што се лизга за еден кодон кон 3` крајот. Ова е посредувано од вториот фактор на елонгација, EF-G, кој се врзува за GTP и го користи како извор на енергија во оваа реакција. Притоа, доаѓа до ослободување на тРНК, која е сместена во E врзувачкото место, за кое сега доаѓа тРНК од соседното P место. Истовремено, А врзувачкото место останува празно и активно да прими нова тРНК. Со ова целиот циклус се ресетира, а рибозомот може да ја врзе следната аминокиселина. Слика 73 Транслација-елонгација 69 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Крајниот дел од транслацијата е терминацијата. Ова се случува кога рибозомот ќе дојде до еден од „СТОП“ кодоните: UAA, UAG и UGA. За овие стоп кодони не постои соодветна тРНК, така што кога стоп кодонот ќе дојде до A врзувачкото место, тоа не може да се потполни со ниту една тРНК. Наместо тРНК, во него влегува и го окупира ослободувачкиот фактор (release factor, RF). Кај бактериите се знае дека има два различни вида, RF1 кој ги препознава UAG и UAA кодоните, и RF2 кој ги препознава UGA и UAA кодоните. Кај еукариотите има само еден фактор eRF1 кој ги препознава сите 3 кодони. RFs имаат слична конформација како и тРНК и затоа немаат проблем да се сместат во А врзувачкото место. Во процесот на терминација, новосоздадениот полипептид треба да се одвои од тРНК која е во P врзувачкото место. Ова се постигнува кога во рибозомот ќе навлезе третиот ослободувачки фактор RF3 кој на себе носи молекула на GTP. Ваквиот комплекс ја хидролизира пептидил-тРНК врската при што се ослободува пептидот. На ослободениот пептид се врзуваат дополнителни фактори кои му помагаат да го напушти рибозомот. Со ова завршува транслацијата на дадената иРНК, која повторно е подготвена да влезе во истата реакција за да се синтетизира нов сосема идентичен протеин на претходниот. Со терминацијата на транслацијата, двете подединици на рибозомот се раздвојуваат за да можат да учествуваат во наредната протеинска синтеза. Кај бактериите ова е посредувано од рибозомалниот рециклирачки фактор (ribosome recycling factor (RRF)). Слика 74 Транслација-терминација. „СТОП“ кодонот е препознат од ослободувачкиот фактор (RF). Транслацијата завршува со ослободување на новосинтетизираниот полипаптид и расформирање на рибозомот За да се зголеми продуктивноста на протеините, една иРНК може истовремено симултано да се транслатира од повеќе рибозоми. Во зависност во која количина е потребен протеинот во клетката, бројот на рибозомите варира. Така, понекогаш може да се забележат рибозоми на секои осумдесетина нуклеотиди по должината на иРНК. Ваквите структури, кога повеќе рибозоми се закачени на една иРНК, се нарекуваат полирибозоми. Кај бактериите, бидејќи не е потребна постранскрипциона модификација на иРНК, рибозомите се закачуваат на молекулата додека трае нејзината синтеза. Во буквална смисла на зборот ја следат РНК полимеразата и додека таа ја врши транскрипцијата, рибозомите ја извршуваат транслацијата. Кај еукариотските клетки ова не е возможно бидејќи треба да се направат модификации на пре-РНК. Кај еукариотската клетка, исто така, е развиен механизам за поефикасна синтеза на протеини. Имено, за да се забрза рециклирање на рибозомите, односно нивно што побрзо влегување во повторниот процес на транслација, иРНК прави циркуларна форма со која опашката ја доближува до почетокот. Ова се постигнува со поли(А) врзувачкиот протеин I (poly(A) binding protein I) кој заедно со уште два фактора eIF4E и eIF4G ја доближуваат поли(А) опашката до 5` крајот на иРНК. Ваквата поставеност овозможува кога ќе заврши транслацијата, елементите од рибозомот веднаш да се врзат за „капа“ делот од иРНК. 70 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 75 Полирибозом. Шематски приказ (лево) и електрномикрограм (десно) Со завршувањето на транслација не се добива функционален протеин. За да се случи истото, полипептидната верига претрпува серија од физички и модификации. При физичките модификации доаѓа до извиткување на протеинот со што се добива негова тродимензионална структура. Неколку фактори учествуваат во посттранслационите модификации. Самиот аминокиселински состав на протеинот му овозможува при излегување од рибозомите, да започне самостојно да се извиткува. Бидејќи N терминалниот дел на протеинот е првиот кој се синтетизира, нормално е дека извиткувањето ќе започне оттаму. Притоа, бројни нековалентни врски се образуваат помеѓу различни делови, а хидрофобните резидуи се вовлекуваат во внатрешноста на молекулата. Целиот процес најчесто е модифициран од протеини наречени чаперони (chaperons) кои се закачуваат на новосинтетизираниот протеин додека го напушта рибозомот. Овие протеини спаѓаат во групата на heat shocк протеини. Името го добиле бидејќи интензивно се синтетизираат кога клетката ќе биде привремено изложена на повисока температура. Кај еукариотскатa клетка има две групи на чаперон молекули, обележани со hsp60 и hsp70. Hsp70 се врзуваат за протеинот додека излегува од рибозомот, додека hsp60 се врзуваат кога протеинот е целосно синтетизиран и учествуваат во неговото правилно реизвиткување. Како индикатор дека настанале проблеми со извиткувањето е присуството на хидрофобни делови на површината на молекулата. Во такви ситуации, hsp70 се врзуваат за протеинот и се обидуваат да го поправат. Доколку успеат во тоа, протеинот станува функционален, доколку не успеат, тој подлежи на протеолиза. Хемиската модификација се базира на структурна модификација на polyA протеинот. Во едноплазматичниот врзувачки ретикулум или Голџи системот, липидни или шеќерни компоненти се додаваат на протеинот кои понатаму се суштествени за неговата функција. Овде како пример може да се наведе и додавањето или одземањето на фосфорни групи, Слика 76. Просторна поставеност на фосфорилација и дефосфорилација поли(А) опашката и „капа“ елементот соодветно. 71 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 77 Извиткување на полипептидниот ланец додека трае транскрипцијата. Притоа се добиваат секундарната и терцијалната структура на протеинот Некаде околу 30% од новосинтетизираните протеини, поради грешка во извиткувањето, подлежат на деградација. Основна структура каде протеините се лизираат се протеозомите. Тоа се структури изградени од два дела, средишниот цилиндричен дел е составен од група на протеини од кои некои имаат протеолитичко дејство. На крајните делови на цилиндерот се наоѓа друга структура во форма на „капа“ која, исто така, е изградена од група на различни протеини. Функцијата на крајните делови е да се прикачат за протеинот и да го одвиткаат со што ќе овозможат навлегување на тој дел во цилиндричниот дел каде што се лизира полипептидот. Протеозомот најчесто знае дека протеинот треба да го лизира, ако тој е поврзан со протеин наречен убиквитин (ubiquitin). Убиквитинот е мал протеин кој се наоѓа слободен или врзан во клетката и со серија на ензими се активира и врзува за протеинот кој треба да се лизира. Доколку горенаведените механизми со hsp не успеат нормално да го модифицираат протеинот и доколку протеозомите не успеат таквиот протеин да го лизираат, тогаш истиот може да е штетен за клетката, па и за целиот организам. Погрешно извитканите протеини имаат тенденција да формираат агрегати на кои можат да се закачат и други макромолекули. Протеинските агрегати доколку предизвикаат клеточна смрт, Слика 78 Учество на hsp70 протеините во постранслационата модификација на протеините 72 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски остануваат во меѓуклеточниот простор каде со понатамошна нивна агрегација можат да го оштетат и ткивото. Овие структури се доста отпорни на протеолиза и надвор од клетката. Со тек на време, истите почнуваат да формираат филаменти кои се напластуваат еден врз друг. Ваквата појава е доста изразена во нервното ткиво и е молекуларна основа во патологијата на бројни заболувања кај човекот, вклучувајќи ја и Хантинговата и Алцхајмеровата болест. Во оваа група на заболувања спаѓаат болестите предизвикани од погрешно извиткување на прион протеините (PrP). Овие заболувања можат да се пренесат од еден организам на друг, со консумирање на ткиво кое содржи вакви приони. Во оваа група на болести спаѓаат скрапие (scrapie) кај овците, Кројцфилд-Јакобсовото заболување кај луѓето (Creutzfeldt-Jacob disease) и бовината спонгиоформна енцефалопатија (bovine spongiform encephalopathy, BSE) кај говедата. Молекуларната основа на овие заболувања е во погрешното извиткување на прион протеин кој, нормално, се наоѓа на клеточната мембрана на клетките. Модифицираниот PrP станува резистентен на протеиназите и во контакт Слика 79 Лизозом. Со комјутерско моделирање на електронмикрограф добиена со нормален прион протеин добива е 3D слика на лизозомот. (А) Со жолто е способност да индуцира негово претствен цилиндричниот дел. (Б) Целиот неправилно извиткување. Со ова се лизозом со цилиндричниот жолт дел и капа формира верижна реакција на краевите (сино) модифицирање на PrP на клетките, а со тоа и нивно оштетување. 73 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски КОНТРОЛА НА ГЕНЕТСКАТА ЕКСПРЕСИЈА Под контрола на генетската експресија се подразбира механизам со кој се одредува кога генот и во колкав интензитет ќе биде активиран. Колку еден ген ќе биде активиран, зависи од тоа дали продуктот кој го кодира во дадениот момент и е потребен или не на клетката. На пример, опстанокот на бактеријата зависи од хранливите материи кои ги прима од надворешноста. За да ги прими и искористи, потребно е бактеријата да има соодветен транспортен механизам со кој ќе ги внесе и потребно е да има соодветен систем со кој ќе ги разгради. И двата механизма доминантно се изградени од специфични протеини кои клетката треба да ги синтетизира на база на генетска активација. Доколку истата бактерија се најде во друга средина во која преовладува друг тип на хранлива материја за да може да ги искористи, а со тоа и да преживее, потребно е да активира нови системи. Односно, да активира нов сет на гени со кои ќе се изградат нови транспортни канали и синтетизираат нови дигестивни ензими. Нормално, гените кои учествуваа во метаболизмот на материите во претходната состојба, повеќе нема потреба да се активни. Едноставен пример за ова е E.Coli која живее во дигестивниот систем на човекот. Во зависност од тоа кој шеќер доминирал во исхраната на човекот дадениот ден (сахароза, лактоза), E. Coli треба да активира соодветни гени за истите да ги искористи. Слика 80 Од ген до функционален протеин. Контролата на генетската активност може да е насочена кон секој чекор при создавањето на протеинот 74 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Генетската контрола може да се случи за време на целиот процес на создавањето на функционалниот протеин. За потсетување, информацијата кодирана во ДНК се пренесува на РНК, на база на која, пак, се синтетизира протеин кој понатаму се модифицира и станува функционален. Значи, контролата на создавањето на крајниот процес може да се случи уште на почетокот, при транскрипцијата, во стадиумот на синтеза на протеините, односно при транслацијата, или, пак, при посттранслационата модификација на протеините. Транскрипцијата се контролира со тоа што регулаторните молекули не дозволуваат РНК полимеразата да се врзе да ДНК матрицата. Транслацијата може да се оневозможи со предвремена деградација на иРНК, оневозможување да се формира инцијалниот комплекс или, пак, да ја оневозможи елонгацијата. На крај, со процесот на фосфорилација при посттранслационата модификација на протеините, може да се делува на нивната активност. Кој механизам на генетска контрола ќе го избере клетката зависи од дадената состојба. На пример, блокирањето на транскрипцијата е малку побавен процес, меѓутоа заштедува ресурси и енергија со тоа што клетката не создава непотребни протеини, а посттранслационата модификација е побрза, но помалку економична за клетката. Механизам на генетска регулација кај прокариотите Системот за генетско регулирање кај прокариотите едноставно може да се објасни со метаболизмот на шеќерите кај Е. Coli. Оваа бактерија доминантно ја користи гликозата како извор на енергија или како извор на јаглерод при анаболичките реакции. Во состојби кога во средината недостасува гликоза, а е присутна лактоза, оваа бактерија се адаптира, односно почнува да синтетизира ензим β-галактозидаза со која го разложува овој шеќер. За потсетување, лактозата е дисахарид составен од по една молекула гликоза и галактоза. На база на оваа опсервација е заклучено дека лактозата е индуцир на генот за β-галактозидаза. Јакоб (Jacob) и Монод (Monod) во доцните 50-ти години на минатиот век ги откриле гените кои се одговорни за контролата на метаболизмот на лактозата. Овие научници генерирале мутанти на E. Coli кои во услови на недостаток на гликоза, а присуство на лактоза не можеле да се размножуваат (пролиферираат). Помеѓу изолираните мутанти, тие идентификувале бактерии кои не биле во можност воопшто да синтетизираат β-галактозидаза. Овие бактерии имале мутација на генот за β-галактозидаза кој го нарекле lacZ. Кај друга група на мутанти забележале дека не се во можност да ја акумулираат лактозата во себе. Претпоставиле дека овие бактерии имаат недостаток на транспортен систем за лактозата. Генот, кој го синтетизира транспортниот молекул, го нарекле lacY. Интересно, помеѓу Слика 81 Негативна контрола на lac оперонот. протеин се врзува за анализираните бактерии забележале Репресорниот промоторот и ја блокира транскрипцијата на колонии кои, независно дали во средината во која има или нема гените z (β-галактозидаза), y (пермеаза) и a лактоза, тие секогаш синтетизирале (трансацетилаза) (панел, горе). Лактозата се β-галактозидаза. Нормалните врзува за репресорниот протеин, го инактивира и на тој начин ја овозможува транскрипцијата на колонии, во отсуство на лактоза или гените во lac оперонот (панел, долу) во услови кога има глукоза во 75 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски медиумот во кој растат, не синтетизираат β-галактозидаза. За овие бактерии заклучиле дека имаат мутација во генот кој ја регулира активноста на lacZ и го нарекле lacI ген. Подоцна, со мапирање на двата гена lacZ и lacY, е покажано дека се наоѓаат многу блиску на циркуларната молекула на ДНК и се под заедничка контрола на lacI. Покрај овие два гена, понатаму е мапиран и генот lacА, кој кодира протеин трансацетилаза. Овој протеин ја катализира реакцијата на експорт на некои шеќери надвор од клетката кога нивната концентрација е превисока. Од експериментот јасно се гледа дека станува збор за негативна контрола на lacZ и lacY. Односно, генот lacI во случајов е репресор на двата гена со тоа што создава протеин кој ја блокира активноста на РНК полимеразата. Тоа е кога регулаторниот фактор се врзува за промоторот на генот и со тоа ја индуцира генетската активност. Експериментите на Јакоб и Монод дале објаснување на неколку фундаментални процеси: - lacZ, lacY и lacА се три различни гена групирани во една целина, кои се транскриптираат заедно. Притоа, иницијацијата потекнува од еден заеднички промотор. Група од вакви гени формираат оперон. Во овој случај, бидејќи името на поединечните гени почнува со lac, оперонот се нарекува lac оперон. - lacI е репресор на lac оперонот. Тој континуирано е активен произведувајќи протеин кој се врзува за ДНК и ја оневозможува транскрипција на lac оперонот. Местото каде што се врзува репресорот, го нарекле оператор. - Лактозата е активатор кој се врзува за репресорот. Притоа, ја менува неговата форма со што го оневозможува неговото поврзување за операторот. Со тоа се создаваат услови lac оперонот да се транскриптира. Овие заклучоци биле почеток за понатамошни интензивни истражувања во областа на генетската регулација. Подоцнежните резултати потврдиле дека истите принципи не се ограничени само на E. Coli и lac оперонот, туку се едни од основните принципи на генетската регулација кај прокариотите. Покрај гореопишаниот негативен начин на регулација на гените, постои и позитивен начин. Односно, експресија на еден ген овозможува индукција на друг. Оваа врска повторно може да ја објасниме со помош на lac оперонот. Lac оперонот под дејство на катаболички активирачки протеин (catabolite activator protein (CAP)) почнува да се транскриптира. CAP своето дејство го извршува на тој начин што се врзува за специфична секвенција на ДНК, наречена CAP врзувачко место (binding site) кое се наоѓа блиску до lac промоторот. Поврзување е овозможено од cAMP. При зголемено присуство на cAMP во клетката, настанува активен комплекс CAP-cAMP, кој се поврзуваат за CAP поврзувачкото место на lac оперонот. Со ова се иницира транскрипцијата на генот. Доколку сето ова го поврземе со гликозата, би изгледало вака: зголемено количество на гликоза надвор од клетката индуцира намалено количество на cAMP во клетката и обратно, намалено количество на гликоза надвор од клетката индуцира зголемено количество на cAMP клетката. Ова клетката го постигнува со Слика 82 Позитивна контрола на lac оперонот под дејство на ниско количество на гликоза 76 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски конвертирање на ATP во cAMP под дејство на ензимот аденил циклаза, кој, пак, е инхибиран од висока екстраклеточна концентрација на гликоза. Заклучокот од сето ова е дека зголемената концентрација на гликоза во надворешноста, го инхибира создавањето на cAMP, со тоа се намалува создавањето на CAP-cAMP комплексот и како резултат на тоа lac оперонот не е активен и обратно, намалена количина на гликоза, ја зголемува концентрацијата на cAMP, која преку CAP го активира lac оперонот. Механизам на генетска регулација кај еукариотите Исто како и кај бактериите и еукариотските клетки можат да ја контролираат генетската експресија на ниво на транскрипција, транслација и посттранслациона модификација на протеините. Покрај заедничките, еукариотите имаат уште три додатни механизма со кои ја регулираат генетската активност. Првата е со контрола на хроматинско организирање. Кај еукариотите, ДНК се замотува околу протеински структури и го гради хроматинот. За да започне транскрипцијата, потребно е промоторот да се демаскира и ослободи од хроматинските протеини. Овој процес се нарекува хроматинско моделирање. Вториот уникатен систем е при генерирањето на иРНК со модификација на пре-РНК. При овој процес доаѓа до формирање на структури на 3` и 5`-крајот на молекулата, односно формирање на „капа“ и поли(А) опашката, и елиминирање на интроните со процесот наречен сплајсинг. Последниот механизам е со контролирање на животниот век на иРНК. Имено, колку подолго иРНК е присутна во цитоплазмата, толку повеќе протеини можат да се синтетизираат со неа. Со контрола на нејзината стабилност директно се контролира и создавањето на протеините. Хроматинско ремоделирање Накратко да ја објасниме организацијата на ДНК во јадрото. Просечно, една човечка клетка содржи 6 билиони базни парови кои, доколку се подредат еден зад друг, ќе направат ланец долг околу 2m. За да може клетката да собере во себе толку долга молекула, потребно е истата да ја спакува. Тоа го прави со тоа што ја извиткува околу протеини наречени хистони. Група од осум хистонски протеини завиткани двапати со молекулата на ДНК градат нуклеозом. Тесната врска помеѓу ДНК и хистоните е овозможена меѓу другото и поради различниот електричен полнеж кој го поседуваат двете молекули, ДНК е негативен, а хистоните се позитивно наелектризирани. Помеѓу два нуклеозома се наоѓа врзувачка „linker“ ДНК која не е обвиткана околу хистони. Просторот помеѓу два нуклеозоми го детерминира интеракцијата помеѓу H1 хистонските молекули кои влегуваат во нивната градба. Нуклеозомите се поврзуваат помеѓу себе и формираат структура 30-нанометарско влакно (30-nm fiber) наречено според нејзината ширина. Овие структури понатаму се прицврстуваат за протеински скафолд да формираат уште покондензирана форма која, пак, при процесот на клеточна делба е подложна на уште поизразена кондензација. Првите експерименти кои покажале дека хроматинот учествува во контролата на гените, се базирале на дигестија, сечење на молекулата на ДНК со ензим ДНази (DNasa). Овие ензим ја сечат ДНК веригата на случајни места кои не се кондензирани. При дигестија на различни типови на клетки било забележано дека ДНазата ја сече ДНК само на местата каде што се наоѓаат активните гени. На овој начин индиректно е заклучено дека каде што ДНК е во кондензирана форма, таму лоцираните гени не се транскриптираат. Клетката го модифицира хроматинот на неколку начини. Едниот е со помош на хроматин ремоделирачки комплекс (chromatin remodeling complex) кој има способност 77 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски да се врзе за ДНК на местото на нуклеозомот и да ја одвитка од хистонскиот комплекс. Притоа се троши енергија од ATP. Вториот систем е со додавање на мали молекули на хистонските протеини. Како примери се додавањето на ацетил група (CH3COOH) во процес наречен ацетилирање или метил група (CH3) во процес наречен метилирање. Ацетилирањето е поврзано со активирање на гените во тој регион. Ацетил групата се додава на лизинот од хистонот со ензимот хистон ацетил трансфераза. Притоа, на ацетилираниот дел се поврзува хроматин ремоделирачкиот комплекс кој го „отвора“ хроматинот со што се создаваат услови за транскрипција. Кога ќе помине потребата од активност на тој регион, хистон деацетилазата ја отстранува додадената ацетил група и со тоа хроматинот се враќа Слика 83 Активирање на генот при ацелилација на во првобитна кондензирана хроматинот со хистон ацетил трансфераза (HAT) состојба. Метилацијата е додавање на метил група, најчесто на цитозинот. Овој процес е поврзан со инхибицијата на генетската активност. Така X инактивираниот хромозом е високо метилиран. Точниот механизам на кој метилацијата ја инхибира генетската активност сè уште не е познат, меѓутоа како опции кои се наведуваат се: прикачување на протеини за 5-метил цитозинот, кои, пак, привлекуваат репресори на хроматин ремоделирачкиот комплекс, транскрипциони репресори или, пак, го спречуваат поврзувањето на транскрипционите активатори за ДНК. 78 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Cis и Trans генски регулаторни елементи Регулаторните елементи, кои се наоѓаат на истата верига како и генот, се вели дека имаат cis ефект врз неговата експресијата. Притоа, истите се нарекуваат cis активни елементи. За овие ДНК секвенции се врзуваат различни молекули, најчесто протеини, за кои се вели дека имаат trans ефект врз дадениот ген. Во cis елементи спаѓаат промоторот, енхансерот (поттикнувач, enhancer) и пригушувач (silencer). Некои од овие елементи и претходно беа споменати, меѓутоа за полесно да се разбере регулацијата на транскрипцијата и овде ќе бидат накратко објаснети. Промоторот е секвенција на ДНК која се наоѓа блиску до „СТАРТ“ кодонот и служи како место за препознавања и врзување на РНК полимераза II. Притоа ја определува и насоката во која ќе се одвива транскрипцијата. На него се наоѓаат неколку секвенции како TATA, CAAT и GC (GGGCGG) box кои се присутно на скоро сите гени независно од видот на организмот. Различни гени имаа различни сетови од горенаведените промоторни елементи со помош на кои се овозможува базалната генетска експресија. Слика 84 Шематски приказ на генски регулаторни елементи. Прикажан е сложен промотор (TАТА, RE, DPE), три различни енхансери (enhancer), инактиватор (silencer), инсулатор (insulator) За да се овозможи зголемена (максимална) генетска експресија на генот, се делува преку регулаторниот елемент наречен енхансер (enhancer). Овие елементи, за разлика од промоторите, можат да бидат лоцирани и по завршувањето на протеин кодирачката секвенција дури и, пак, да се наоѓаат во интроните на генот. Ориентацијата на енхансерот, исто така, не влијае на неговата функција. За енхансерот се врзуваат повеќе различни фактори преку кои се зголемува активноста на промоторот. Некои гени имаат заеднички енхансер, различни клетки или, пак, енхансер на еден ген, може да ја зголеми функцијата на друг ген доколку се најде во негова близина (при транслокации). Третиот кој припаѓа на cis елементите е пригушувачот (silencer). Ова е секвенција од ДНК за која се врзуваат протеини со кои се намалува или деактивира транскрипцијата на даден ген. Транскрегулаторни елементи се оние кои не се наоѓаат на молекулата на која се наоѓа генот. Тоа се најчесто протеини кои се врзуваат за регулаторните елементи на Слика 85 Интерактивно делување на повеќе енхансери на еден ген. Прикажано е како еден енхансер (со зелено) учествува во регулирање на 3 различни гена и два различни енхансери (зелен и син) на еден ист ген 79 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски генот и на тој начин ја модерираат неговата активност. За ваквите протеини се вели дека се транскрипциони фактори (transcription factors). Овие фактори се експресираат или се активни во зависност од типот на клетката. Некои можат да се детектираат во речиси сите клетки, а некои се специфични само за поодделни типови на клетки. Така едни транскрипциони фактори се присутни во епителното ткиво на кожата, а други во миобластите на мускулите. Нормално, бидејќи различни специфични гени се активни во двата типа на клетки. Понатаму, во една иста клетка за време на нејзиното диференцирање се присутни различни транскрипциони фактори. Повторно, во зависност од тоа кој ген е потребен за диференцирање на клетката, тие фактори ќе се синтетизираат. Транскрипционите фактори понекогаш се присутни во клетката, меѓутоа не се активни додека не се изврши нивно активирање, на пример, со фосфорилиација, или, пак, со нивно сврзување за други молекули, на пример, хормони. Едноставно кажано, типот на транскрипционите фактори кои ќе бидат во клетката, ќе зависат од Слика 86 Видови на транскрипциони фактори. Хомеодомеин транскрипционен фактор (А), HTH транскрипционен фактор (Б), Zink finger транскрипционен фактор (В) видот и состојбата во која се наоѓа клетката како и нејзината интеракција со надворешноста. Притоа, повеќе различни транскрипциони фактори можат да се поврзуваат за едно исто врзувачко место, иста ДНК секвенција, или, пак, за едно исто врзувачко место, во различни ткива може да се врзуваат различни транскрипциони фактори. На транскрипционите фактори најчесто разликуваме два различни дела, едниот е ДНK врзувачки дел (DNA binding domain), а другиот е протеин врзувачки дел кој се однесува како транскативирачки домен (trans-activating domain). Со првиот домеин се поврзува за соодветните cis елементи на генот, а со другиот дел се поврзува директно со РНК полимеразата или, пак, со останатите транскрипциони фактори при што формираат регулаторен комплекс. Врз база на структурата на ДНК врзувачкиот домеин, тие се поделени на неколку групи од кои и: helix-turn-helix (HTH), zinc finger и basic leucin zipper (bZIP). HTH сегмент (motif) се состои од два кратки α-ланци кои помеѓу себе се поврзани со една кривина. Овој сегмент се врзува за ДНК молекулата пред сè поради својата структурна организираност. Притоа, тоа го прави со помош на едниот α-ланец кој најчесто се поврзува за големиот жлеб на ДНК. Остатокот од овој транскрипционен фактор, исто така, учествува во стабилизацијата на Слика 87 Транскрипциони фактори кои учествуврската со ДНК. Голема група на ваат во фортмирањето на преинцијалниот транскрипциони фактори на овој комплекс при транскрипцијата 80 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски принцип (со малку изменет мотиф) се врзуваат за ДНК. Тоа се хомеодомаин (homeodomain) транскрипционите фактори, протеини кои содржат врзувачки домеин изграден од 60 аминокиселини. Овој домеин е изграден од четири α-ланци, при што 2-3 се поврзани со извиткување, третиот учествува во поврзување со големиот жлеб, а првиот се поврзува со малиот. Zink finger транскрипционите фактори се голема група на протеини кои најчесто ги има кај еукариотската клетка. На пример, 1% од геномот на цицачите кодира информација за некој zink finger протеин. Најчесто учествуваат во индуцирање на клеточното растење, развивање и диференцирање. Во градба на мотифот учествуваат по два цистеина и хистидина кои ковалентно се врзуваат за Zn. Притоа, прават извиткувања во форма на прсти кои содржат околу 23 аминокиселини. Со помош на прстеновидните извиткувања, овие транскрипциони фактори се врзуваат за соодветните ДНК секвенции. Слика 88 Инволвираност на дисталните регулаторни елементи (енханцери) при формирање нна транскрипциониот иницијален комплекс Транскрипционите фактори своето индуцирачко или репресирачко дејство најчесто го извршуваат при интеракција со генералните транскрипциони фактори. За потсетување, транскрипциониот преиницијален комплекс се формира со тоа што TBP (ТАТА binding protein) заедно со TFIID факторот се врзува за TATA box. На овој комплекс се надоврзуваат TFIIA, TFIIF,TFIIH и TFIIJ. На вака формираниот комплекс се закачува РНК полимераза II заедно со TFIIF. Кога ќе се оформи стабилна врска помеѓу промоторот и РНК полимераза II, двојниот хеликс се одмотува и транскрипцијата може да започне. Оваа транскипција е на базално ниво и се модулира со помош на дејство на останатите транскрипциони фактори. Механизмот на интеракција може да биде различен. Транскрипционите фактори се поврзуваат за енхансерот со својот ДНК врзувачки домеин, а со протеин врзувачкиот домеин се поврзуваат со компонентите на преиницијалниот комплекс. Доколку транскрипциониот фактор ја индуцира генетската експресија се вика активатор. Активаторот може да има различна структура, од кои позначајни форми се 81 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски киселински домен (аcidic domains), глутамински-богат домен (glutamine-rich domains) и пролин-богат домен (proline-rich domains). Врската помеѓу активаторот и РНК полимераза II може да биде посредувана и од група на протеини наречени медијатори. Некои од овие медијатори имаат својство на протеин кинази, односно да го фосфорилираат C-терминалниот дел на РНК полимераза II. Активаторите, покрај тоа што директно или индиректно делуваат на РНК полимераза II, исто така, делуваат на ремоделирање на хроматинот. Ова го постигнуваат со тоа што служат како место за прикачување на хистон ацетил трансферазата (HATs) или хроматин ремоделирачкиот комплекс. Ваквата интеракција со хроматинот овозможува ДНК да е подостапна за РНК полимеразата, како и за останатите транкрипциони фактори. Транкрипционите фактори можат да делуваат самостојно или синергистички помеѓу себе. Притоа ефектот на ваквата заемна активност е многу поголем отколку збирот на поединечните ефекти на секој од активаторите. Доколку транскрипциониот фактор ја инхибира базалната транскрипција на генот, тој се вика репресор. Репресорите се исто толку значајни за функцијата на една клетка како и активаторите. Репресорите својата активност можат да ја изразат преку повеќе механизми. Така, на пример, репресорот може да се врзува за ДНК и притоа да се натпреварува со активаторот за исти врзувачки места, или, пак, може да го деактивира активаторот со тоа што ќе се блокира неговиот активирачки домеин. Репресорот може да се врзе за инцијалниот комплекс и да не дозволи некои од компонентите да се врзат или ослободат од него. Или репресорот може да делува на хроматинското ремоделирање со тоа што ќе го врати во првобитната кондензирана форма. Некои транскрипциони фактори за едни гени можат да бидат активатори, а за други репресори. Таков е примерот со Pit-1 кој е активатор за пролактинот, а репресор за хормонот за растење. Разликата во функцијата потекнува од различните врски со кои овој фактор се врзува за ДНК молекулата. Контролата на активноста на активаторите и репресорите може да биде на различно ниво. Еден начин е Слика 89 Различни форми на интеракција помеѓу да се контролира нивното создавање активаторите и репресорите на еден ген. Активаторот и репресорот имаат афинитет за и деградирање. Притоа овој систем е исто врзувачко место на ДНК (А). Репресорот го прилично инертен бидејќи е потребно „маскира“ активаторот (Б). Репресорот влегува време истите да се создадат и во интеракција со факторите на разградат. На овој начин се транскрипциониот комплекс (В). Репресорот ги контролираат транскрипционите мобилизира компонен-тите нахроматин фактори кои учествуваат во контрола моделирачкиот комплекс (Г) или, пак, хистон на гените кои перманентно се деацетилазата (Д) 82 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски експресираат. Многу побрз начин на контрола на транскрипционите фактори е со нивна активација или деактивација. Пример за тоа е фосфорилација и врзување на лигандот за протеинот со што истите за многу кратко време можат да се активираат и да влезат во понатамошните реакции. Други форми на регулација на активноста на транскрипционите фактори се: контролата на нивниот пренос низ јадрената мембрана, демаскирање на активниот домеин или, пак, врзување на ДНК врзувачкиот домеин од транскрипциониот фактор со друг протеин кој поседува активирачкиот домеин. Претходно напоменавме дека заеднички регулаторни елементи, како на пример енхансерот, можат да влијаат на функцијата на повеќе различни гени. Оваа способност во некои случаи е добредојдена, како на пример при индукција на група на гени кои учествуваат во иста каскадна реакција (транскрипционите фактори при миогенезата), меѓутоа во некои случаи сериозно може да ѝ наштети на клетката. Пример, доколку во близина се наоѓаат еден многу активен и малку активен ген, тогаш регулаторните елементи на активниот ген можат да индуцираат зголемена Слика 90 Шематски приказ на функција на инсулаторот. Инсулаторот ја спречува интеракцијата на еден енханцер со повеќе гени и го оневозможува ширењето на хетерохроматинот во пределот на актиниот ген транскрипција на помалку активниот ген. За да се спречи ваквото несакано генетско активирање, во пределот помеѓу енхансерот и промоторот, кај некои гени има секвенција која има функција на изолатор (insulator). За оваа секвенција најчесто се врзуваат група на протеини кои го спречуваат комуницирањето на регулаторни елементи од два различни гена. Несоодветно зголемено експресирање на некој ген често се случува при транслокации или генетски инженеринг. Причина е интеграцијата на секвенцијата во активен локус, односно во близина на некој силен промотор и енхансер. 83 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Посттранскрипциона регулација на генетската експресија Откога ќе се формира примарниот транскрипт, истиот претрпува серија на модификации пред да излезе во цитоплазмата и да се врзе со рибозомите за да учествува во синтеза на протеините. Притоа, клетката има механизми да го регулира секој чекор од овој процес. Како позначајни во овој контекст ќе бидат објаснети: формирањето на алтернативни сплајс варијанти на иРНК и контрола на стабилноста, односно животниот век на молекулата. Суштината на алтернативното прекројување на пре-РНК е добивање помалку или повеќе различни протеини од еден ист примарен транскрипт. Со ова, бројот на протеини кој може да се добие од еден ген значително се зголемува. Се претпоставува дека кај луѓето некаде и до 60% од геномот е способен за сплајсинг. Со тоа лесно може да се заклучи дека бројот на гените (геномот) не е идентичен со бројот на протеините (протеом) во една клетка. При сплајсингот можат да се добијат различни форми на протеини од еден ист ген кои, притоа, ќе имаат различни функции. Па така, добиените протеини можат да имаат различна активност, сензитивност и специфичност за поврзување, полуживот или можност за транспорт низ мембраната. Со многу едноставен пример може да се објасни значењето на спајсингот и диверзитетот на продуктите кој може де се добие со него. Да земеме за пример еден транскрипционен фактор кој се состои од неколку елементи. Неговите функционални елементи најчесто се наоѓаат на различни ексони. Во примерот е претставено дека ексонот број 1 кодира секвенција за ДНК врзувачкиот домеин, а ексонот број 3 за активирачкиот домеин. Доколку при спајсингот останат сите 4 ексони во иРНК, тогаш добиениот протеин ќе има функција на активатор. Меѓутоа, доколку дојде до губење на активирачкиот домеин со тоа што ќе настане алтернативен сплајсинг на ексонот 3, добиениот протеин ќе има функција на репресор. Сосема различна од онаа која ја има протеинот кој има целосна должина. Слика 91 Како сплајсингот влијае на функцијата на генот. Една сплајс форма се однесува како активатор, а друга како репресор Сличен е примерот и со генот за структурниот протеин α-тропомиозин. Овој ген со помош на сплајсинг создава различни типови на протеини во зависност од тоа во која клетка се експресира. Сплајсингот може да биде контролиран на позитивен и негативен начин. При негативниот начин доаѓа до врзување на репресорни фактори на местото каде не треба да се изврши сплајсингот, а при позитивниот начин се врзуваат фактори кои треба да го определат местото на сплајсингот. Генерално, се смета дека за да настане 84 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски алтернативен сплајсинг, треба да се деактивира местото каде нормално се случува сплајсингот и како причина на тоа да се активира некое сплајс место кое е помалку активно. Слично како алтернативниот сплајсинг, кај еукариотите се забележува и алтернативна полиаденилација. Имено, доколку еден ген има повеќе полиаденилирачки сигнали при формирањето на поли(А) опашката, можат да се добијат форми кои ќе се разликуваат во 3` крајот на иРНК, а со тоа и на C-терминалниот дел на протеинот. За пример ќе го земеме генот за калцитонин (CALC) кој поради различната полиаденилација се наоѓа во две различни изоформи. Едната е калцитонинот кој се излачува од тироидната жлезда и учествува во хомеостазата на Ca2+ и калцитонин генповрзан протеин (calcitonin gene-related peptide (CGRP)) кој се синтетизира во хипоталамусот и може да биде неуромодулатор. Слика 92 Ткивно специфично постранскрипционо моделирање на калцитонинот Во посттранскриционото регулирање на гените спаѓа и РНК интерференцијата. Централно место во овој процес заземаат малите РНКи (small RNA). Тоа се РНК изградени од 21 до 28 нуклеотида кои имаат способност да интерферираат со иРНК. При оваа интерференција доаѓа до инхибиција на генот кој има секвенца комплементарна на малата молекула. Оваа појава најпрво била забележана кај C. Еlegans. Кога двоверижна мала молекула на РНК, добиена со комплементарно спојување на два сегмента на иРНК била инјектирана во C. Elegans, настанала инхибиција на иРНК од кој била синтетизирана таа мала РНК молекула. Оваа појава е наречена РНК интерференција (RNA interference (RNAi)). Таа се дефинира како посттранскрипциона генетска инхибиција предизвикана од мали двоверижни (doublestranded (ds)) регулаторни РНК молекули. Процесот на RNAi започнува со синтеза на двоверижни РНК молекули (dsRNA). Овие молекули се сечат со ензимот Dicer во кратки, околу 21 bp, dsRNA сегменти наречени siRNAs (small interfering RNA). Функцијата на Dicer е овозможена од R2D2 протеинот (dsRNA-binding protein) кај Drosophila или, пак, од HIV-TRBP (HIVtransactivating response RNA-binding protein (TRBP)) кај цицачите. Двете молекули се 85 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски поврзуваат со RNA-induced silencing complex (RISC). При ова доаѓа до активирање на Argonaute 2 (Ago2), главниот каталитички ензим од RISC. Со врзувањето на Ago2 за siRNA, настанува раздвојување на двоверижната siRNA. Притоа антисенс веригата од siRNA заедно со RISCсе поврзуваат за иРНК на база на комплементарност. На овој начин Ago2 може да ја пресече таргет иРНК и со тоа ќе започне процесот на нејзина деградација. РНК интерференција може да биде посредувана и од некодирачки микроРНКи (microRNA, miRNA) молекули. Се смета дека човечкиот геном има над илјада различни miRNA. Тие можат да се инкорпорирани во самиот ген кој го регулираат, најчесто некој од интроните, или, пак, самостојно да егзистираат на молекулата на ДНК. Се претпоставува дека околу половина од експресијата на гените кај цицачите во одреден степен е контролирана од овие молекули. miRNA се транскриптира со помош на РНК полимеразa II, притоа се формира примарна miРНК која е долга некаде околу 80 нулеотиди и има „капа“ на 5` и поли(А) опашка на 3` крајот. Оваа молекула, поради комплементарноста на базните парови, прави петелка. Двојната верига на pri-miRNA е препозната од нуклеарниот протеин DGCR8 (DiGeorge Syndrome Critical Region 8) кој се поврзува до ензимот Drosha. Droshaја сече петелката од остатокот на pri-miRNA молекулата со што се добива двоверижна pre-miRNA. Pre-miRNA се транспортира во цитоплазмата и е препозната од RNase III ензминот Dicer. Овој ензим го отстранува завиениот дел од петелката, при што останува само двоверижниот дел pre-miRNA молекула, која има вкупно 22 нуклеотида. Вака формираната молекула е конечно оформена и функционална miRNA и се поврзува со рибонуклеопротеинскиот комплекс (ribonucleoprotein (miRNP) complex). Овој комплекс се врзува за 3` на иРНК на база на парцијална комплеметарност и не дозволува иРНК да биде транслатирана во протеин. Во некои случаи, кога miRNA е идеално комплементарна со иРНК, предизвикува нејзина деградација на ист принцип како siRNAs. Слика 93 Регулација на генската експресија со RNK интерференција 86 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски РЕПЛИКАЦИЈА НА ДНК Анализирајќи го сопствениот ДНК модел, Ватсон и Крик заклучиле дека поради специфичното поврзување на базите во комплементарните вериги, истите можат да служат како матрица за репликација. Подоцна предложиле модел на репликација при кој двојниот хеликс се раздвојува и врз основа на секоја раздвоена веригa се синтетизира нова, комплементарна. Во новоформираните двојни хеликси учествуваат по една стара верига и по една новосинтетизирана. Овој модел на репликација го нарекле семиконзервативен. Покрај овој семиконзервативен начин на репликација, теоретски биле предложени уште два други модела. Едниот е конзервативен, кај кој при репликација на ДНК едната молекула е интактна, односно двата хеликса остануваат исти, а новосоздадената молекула има две новосинтетизирани вериги. Другиот е дисперзиран, кај кој двете нови молекули имаат фрагменти и од старата и од новата Слика 94 ДНК репликационен модел предложен од Ватсон и Крик ДНК. Експериментална потврда за семиконзервативниот модел на репликација дошла од истражувањата на Меселсон (Meselson) и Сташ (Stahl). Овие научници во своите експерименти користеле E.Coli одгледувана во средина на тежок азот 15N. Поради ова и азотот, кој учествувал во градбата на ДНК, бил од типот 15N. Кога оваа бактерија ја ставиле во медиум со нормален N, 14N, таа почнала во својата новосинтетизирана ДНК да инкорпорира од него. Со градиентна сепарација, базирана на раздвојување на материите при центрифугирање во зависност од нивната густина, покажала дека во секоја новосинтетизирана молекула на ДНК половината од азотот потекнува од старата верига, а другата половина содржи новоинкорпориран N. Изолираната ДНК, која во себе содржи само 15N при градиeнтно центрифугирање во средина од CsCl, се позиционира секогаш подолу отколку ДНК која во себе содржи само 14N. Меселсон и Сташ користеле Е. Coli која во себе содржи само 15N и ја префрлиле во медиум кој содржи само 14N. Притоа, по секоја клеточна делба земале од E.Coli и ја анализирале. Увиделе дека по првата делба ДНК молекулата при градиентното сепарирање се позиционира помеѓу ДНК која содржи само 15N или само 14N. Од ова заклучиле дека секоја молекула на ДНК има еден ланец кој содржи 15N, односно една стара верига и еден ланец кој содржи 14N односно новосинтетизирана молекула. Бидејќи во оваа молекула има 14N и 15N, истата во однос на тежината е помеѓу ДНК со 15N и ДНК со 14N. Интересно, во втората делба забележале два типа на ДНК: еден кој содржи само 14N, и еден кој содржи два азота, 14N и 15N. При третата делба повторно биле присутни два типа на ДНК, меѓутоа пропорционално 14N била повеќе застапена. Ова единствено можело да се објасни со семиконзервативниот модел на репликација, односно двете вериги при репликација се раздвоиле и притоа онаа која била изградена од 15N била матрица за да се создаде хибридна молекула која содржи 14N и 15N, а, пак, веригата која содржела 14N, била матрица за ДНК која била изградена само од 14N. 87 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 95 Шематски приказ на резултатите добиени од експериментите на Меселсон и Сташ. Сепарирање на ДНК молекулата со ултрацентрифугирање. Разликата во бендовите потекнува од различната тежина на молекулата, односно поради различниот N инкорпориран во неа (панел-горе). Инкорпонирање на 14N и 15N во веригите на ДНК при репликација може да се објасни само со семиконзервативниот модел (панел долу) Репликација на ДНК кај прокариотите Реплицирањето на ДНК молекулата започнува од точно одредени места и најчесто е двонасочно. Тоа значи дека на определено место се формираат две репликациони виљушки кои започнуваат да се движат во спротивен правец, притоа истовремено и двете вериги се реплицираат. Покрај овој начин, кај некои вируси кои имаат линеарна ДНК, репликацијата се одвива еднонасочно. Притоа се случува двете вериги да се реплицираат независно една од друга, или, пак, да се реплицираат истовремено со репликациона виљушка. Кај E. Coli репликацијата започнува на специфично место, кое набљудувано под електронски микроскоп изгледа како меурче. Затоа и се нарекува репликационо меурче. Процесот се одвива двонасочно и е потребно околу 42 минути целиот да заврши, односно од една да се добијат две идентични ДНК молекули. Кај човекот се потребни околу 8 часа за да се реплицира целата ДНК. Притоа е утврдено дека човечкиот геном содржи од 10.000 до 100.000 иницијални репликациони места кои повремено се активни за време на Слика 96 Репликација на циркуларна ДНК ДНК репликацијата. Најчесто се активираат во молекула. Процесот започнува на точно групи од 20 до 80, при што раздвоеноста од определено место (origin) и се одвива во едно до друго место е од 30.000 до 300.000 двете насоки базни парови. 88 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ДНК секвенцијата која се реплицира од едно почетно место, се нарекува репликон. Бидејќи Е. Coli содржи само едно почетно реплицирачко место, ќе претставува еден репликон. Со подетална анализа е утврдено дека репликацијата секогаш започнува од точно определена секвенција (replication origin) која најчесто е лоцирана во средината на репликационото меурче. Кај различни организми оваа секвенција е различна, меѓутоа сите имаат неколку заеднички карактеристики. Се работи за уникатна секвенција која се состои од повеќе повторувачки елементи. Истата е богата со A и Т, што допринесува за полесно раздвојување на двете вериги бидејќи А-Т врската е двојна водородна врска која е послаба од тројната G-C врска. За оваа секвенција се врзуваат протеини кои ја иницираат и контролираат репликацијата. На пример, местото каде што започнува репликацијата кај E. Coli, наречено oriC, е секвенција долга околу 240 базни парови составена од две групи на повторувања со големини од 9 и 13 базни парови. Кај Слика 97 Модел на иницијација на репликацијата кај E. Coli квасците се состои од повторувачка секвенција од 11 базни парови. Синтезата на ДНК молекулата е овозможена од група на пет ензими, ДНК полимераза I, II, III, IV и V. Во доцните 50-ти години на минатиот век е изолиран првиот ензим од E. Coli, ДНК полимераза I (pol I). Корнберг (A. Kornberg) покажал дека овој ензим во in vitro услови е способен да ја реплицира ДНК во присуство на четири дезоксирибонуклеотид три фосфати. Доколку во реакцијата недостасува една од компонентите, ДНК, ДНК полимераза I, некои од нуклеотидите, или, пак, наместо трифосфати се додаваат дифосфати или монофосфати во тој случај синтезата изостанувала. Подоцна било утврдено дека E. Coli мутанти за pol I, исто така, имаат способност да ја реплицираат ДНК, меѓутоа кај овие соеви склоноста кон мутации била многу поголема. Ова довело до заклучок дека мора да има и други ензими кои учествуваат во синтезата на ДНК и дека pol I сигурно е дел од механизмот кој овозможува веродостојно реплицирање на молекулата. Подоцна било утврдено дека во најголем дел синтезата на ДНК молекулата се врши со помош на pol III, а pol I и pol II учествуваат во поправања на грешките кои се јавуваат при синтезата. Ова се должи на нивната егзонуклеозна способност, односно се способни да го отстранат погрешно поврзаниот нуклеотид и на негово место да го прикачат соодветниот. Заедничка особини на сите три ензима е дека за да ја започнат 89 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 98 ДНК синтеза со помош на ДНК полимераза III. Синтезата се врши со додавање на нов нуклеотид на 3` крајот на верига (лево). Целиот процес се одвива во правец од 5` кон 3`. Шематски приказ на ДНК полимераза III (десно) синтезата на ДНК, потребно е да има двоверижна комплементарна секвенција. Ова се обезбедува со тоа што на матрицата на ДНК се закачува малечок комплементарен олигонуклеотид, наречен прајмер (primer). Слична улога во поправање на настанати грешки при репликацијата им се препишува и на pol IV и pol V. Pol III е комплексна молекула со молекулска маса од 900.000 Da и составена од десетина подединици. Телото, или главниот дел кој учествува во каталитичката реакција, го сочинуваат алфа (α) подединиците задолжени за полимеризацијата, епсилон (ϵ) за егзонуклеозната активност, и тета (θ) за стабилизација на ϵ подединицата. Во активна форма pol III е сочинета од два главни дела. По една за репликација на секоја верига. За прицврстување на целиот ензим за ДНК матрицата додека трае репликација е задолжена β подединицата. И оваа единица е димер, односно за секоја верига има по еден дел. Друга група на подединици кои учествуваат во прикачување на ензимот за ДНК молекулата, го образуваат γ комплексот. Во него учествуваат подединици: γ, δ, δ′, χ и ψ. Последната компонента која ги поврзува двата дела (димера) од ензимот прикачени за комплементарните вериги е τ субединицата. Слика 99 Структурни подединици на ДНК полимераза III 90 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски За репликацијата да започне и да се одвива, потребно е двојниот хеликс да се расплете и раздвои. Кај бактериите, иницијалниот чекор во расплетувањето на спирализираната молекула го има DnaA протеинот. Овој протеин се врзува за 9-то мерите на oriC со што го формира иницијалниот комплекс. Овој комплекс ја раздвојува двојната верига на 13-то мерот овозможувајќи поврзување на протеинот DnaB. Во поврзувањето на DnaB со ДНК молекулата посредува уште еден протеин, DnaC. DnaB, уште познат како хеликаза, е од ензимски карактер и е способен да се движи по двојниот хеликс и да ги раскинува водородните врски со кои двете вериги се поврзуваат помеѓу себе. Насоката на движење е од 5` кон 3` крајот. Како и останатите слични ензими кои се движат по одредена матрица и DnaB ја извршува својата функција сè додека не дојде до крајот на молекулата или, пак, се одвои од неа со помош на некој друг фактор. DnaB, исто така, учествува и во закачувањето на прајмерот за местото каде што треба да започне репликацијата, односно да се закачи pol III. Поточно, примазата преку DnaB се поврзува за ДНК молекулата и го прикачува прајмерот. Овој комплекс, хеликазапримаза, се нарекува уште и примозом. Одвоените вериги имаат тенденција повторно да се спојат. За да не дојде до тоа, за секоја верига се прикачуваат SSB протеини (single-strand-binding protein (SSB protein)). При одвојувањето на двојниот хеликс се јавува дополнително извиткување пред репликационата виљушка. Притоа се формира дополнителна ротациона тензија која се намалува со помош на ДНК гираза (DNA gyrase). Ензим кој припаѓа во групата на ДНК топоизомерази. Овој ензим со помош на сечење на едната или двете вериги го Слика 100 ДНК репликација. Шематски е прикажано формирање на репликационата виљушка и синтеза на неводечката верига. Со раздвојување на двојниот хеликс се добиваат две вериги. Едната се синтетизира континуирано (водечка верига, leading stand), а другата дисконтинуирано (неводечка верига, lagging stand) 91 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски намалува дополнителното извиткување и го овозможува континуираното одвивање на процесот на репликација. Претходно напоменавме дека, pol III за да ја започне синтезата, потребно е да има соодветен почеток, кој се состои од двојна верига која на својот 3` крај има слободна хидроксилна група. Ова се овозможува со тоа што на определено место со помош на РНК полимераза, во случајов именувана примаза, се синтетизира комплементарна РНК верига. Оваа верига е долга само 10 до 12 нуклеотида и е доволна за pol III да ја препознае и да се поврзе, со што ќе започне синтезата. Подоцна овој РНК сегмент се отстранува од ДНК молекулата со помош на ДНК полимераза I. Со расплетување и раздвојувањето на двојниот хеликс, се добиваат две антипаралелни вериги. Едната е во насока од 5` кон 3` а другата од 3` кон 5`. И двете вериги се реплицираат со pol III, ензим кој се движи во насока од 5` кон 3`. Според ова, pol III може да го следи движењето на респирационата виљушка само на веригата која е во насока од 3` кон 5`. Оваа верига се реплицира континуирано, односно целиот процес започнува од еден прајмер и се вика водечка верига. При репликацијата на антипаралелната верига, со правец на движење од 5` кон 3`, pol III не може да ја следи репликационата виљушка. Притоа, оваа верига не се синтетизира континуирано, на начин како претходната и се нарекува неводечка. За да може истовремено да се реплицираат и двете вериги од еден ензим, потребно е на неводечката верига да се создадат услови за pol III да може да додава нуклеотиди во 3` правецот. Ова се постигнува со синтеза на РНК прајмер долг до 15 bp со помош на ензимот примаза. Од еден до друг прајмер има од 1000 до 2000 bp кај прокариотите и 100 до 200 bp кај еукариотите. Овие фрагменти се нарекуваат Оказаки фрагменти. Pol III кога ќе ја синтетизира секвенцијата во еден Оказаки фрагмент, прајмерот се отстранува и на негово место се додаваат дезоксирибонуклеотиди со помош на pol I. Крајното спојување на двата краја го врши ензимот ДНК лигаза. Како што се оддалечува репликационата виљушка, така се јавува потреба за формирање на нов Оказаки фрагмент. На овој начин со синтеза и спојување на фрагменти се реплицира целата неводечка верига. Затоа и репликацијата на оваа верига е дисконтинуирана. Се поставува прашањето: Како pol III успева да ги реплицира и двете вериги кога синтезата се одвива во спротивен правец? Најпрво градбата на ензимот го дозволува тоа. Имено pol III е димер кој има две идентични α подединици кои учествуваат во синтеза на двете вериги, понатаму има две β подединици со кои е прицврстен за секоја од веригите. Двата комплекса помеѓу себе ги поврзува τ подединицата. За да може и двата краја на кои се врши синтезата да се во близина, неводечката верига се извиткува во форма на петелка. Притоа, петелката станува сè поголема со зголемувањето на растојанието помеѓу местото на синтезата на водечката и неводечката верига. Кога синтезата на еден Оказаки фрагмент ќе заврши, β подединица се откачува од матрицата. Во исто време примазата синтетизира нов Слика 101 Модел за синтеза на двете прајмер, се формира нов Оказаки вериги истовремено фрагмент и процесот на репликација продолжува. 92 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 102 Терминација на репликацијата кај Е. Coli. Еднонасочното поминување на ДНК полимераза низ Tus протеините е шематски прикажано Терминацијата на транскрипцијата е еден од најмалку разјаснетите етапи од целиот процес. Кај E. Coli се евидентирани 6 терминациони секвенци поставени блиску една до друга на спротивната страна од местото на кое започнува репликацијата. За овие секвенци се поврзува ДНК врзувачкиот протеин, наречен Tus. Дејството на овој протеин се базира на неговата поставеност. Односно, репликационата виљушка може да помине низ него во еден правец, меѓутоа не може истото да го направи во спротивниот. Бидејќи репликацијата на ДНК на Е. Coli е двонасочна и се одвива по циркуларна молекула, двете полимерази се сретнуваат на многу мал простор, и „заробуваат“ од Tus протеините. Притоа, начинот на одвојувување на полимеразите од матрицата и механизмот на спојување на двата краја за повторно формирање циркуларна ДНК молекула, сè уште не се доволно разјаснети. Карактеристика на ДНК молекулата е и нејзиното извиткување во просторот, кое корелира и со нејзината функционалост. За да може ДНК, или попрецизно дел од ДНК, да се транскриптира или реплицира, истата треба да се одмота или да добие „порелаксирана“ состојба. Ензимите, кои ја контролираат извитканоста и топологијата на ДНК молекулата, се викаат топоизомерази. Прв откриен ваков ензим е топоизомеразата од типот I (Тоpo I) кај E. Coli. Овој ензим има способност да го анулира само негативното суперизвиткување со тоа што ја сече едната верига на молекулата. Кога Тоpo I ќе се поврзе за молекулата на ДНК, го сече едниот ланец и притоа за форсфорната група прикачува тирозин. Помеѓу двата пресечени краеви се протнува интактниот ланец со што се анулира едно извиткување. Притоа, тирозинот се отстранува и двата краја повторно се поврзуваат. Со секое сечење и поврзување, Тоpo I го одвиткува хеликсот за едно извиткување. За оваа реакција не е потребна енергија од ATP. Кај еукариотските клетки, топоизомеразите од типот I можaт да делуваат и на негативно и на позитивно супер извиткување. Топоизомеразите од типот II, во кои спаѓа и гиразата, имаат способност да ги пресечат двете вериги на ДНК. Притоа, низ 93 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски прекинатиот ланец поминува останатиот усукан дел од молекулата и двата краја повторно се спојуваат. На овој начин се намалува суперизвиткувањето кое се јавува при движењето на репликационата виљушка. Исто така, со помош на топоизомеразите од типот II се одвојуваат двата усукани хромозоми на крајот на нивната Слика 103 Шематски приказ на дејствувањето на топоизомеразите од типот I (Type I) и тип II (Type II) репликација. На база на сето објаснето погоре, може да прикажеме еден кохерентен модел на репликацијата на ДНК. Како што репликационата виљушка се движи во правец од 5` кон 3`, така двојниот хеликс се деспирализира и раздвојува со ензимот хеликаза. Притоа, ДНК гиразата го контролира дополнителното извиткување на двојниот хеликс на 3` крајот од репликационата виљушка. За раздвоените вериги се прикачуваат протеини кои го оневозможуваат повторното нивно поврзување. Примазата на водечката верига синтетизира краток РНК прајмер за кој се поврзува pol III и континуирано ја синтетизира следејќи ја хеликазата. Неводечката верига се синтетизира дисконтинуирано. Всушност, се формираат мали Оказаки фрагменти кои на почетокот имаат прајмер. Кога нивната синтеза ќе заврши, РНК прајмерот се заменува со ДНК секвенција со помош на pol I. Два фрагмента се поврзуваат помеѓу себе со ензимот ДНК лигаза. Како што може да се види во целиот процес на репликација на ДНК учествуваат многу различни фактори. Секој од овие протеини е кодиран со соодветен ген. Мутација во некој од нив може да предизвика неефикасна или, пак, целосно да ја оневозможи репликацијата. И доколку нема промена во генетскиот код, само координирана експресија помеѓу сите гени инволвирани во целиот процес може да резултира со успешна репликација. 94 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Репликација на ДНК кај еукариотите Принципот на синтеза на ДНК кај еукариотите е идентичен како и кај бактериите. Разликите пред сè се насочени кон предизвикот да се реплицира многу поголемо количество на ДНК, која од друга страна е спакувана во многу посложена хроматинска структура. Така, една од првите разлики е бројот на места од кои почнува репликацијата. Кај еукариотските клетки е многу поголем, и тоа од 250 до 400 кај S. Cerevisiae, па дури и до 25000 кај клетките на цицачите. Слика 104 Шематски приказ на репликациона виљушка кај E. Coli Помеѓу еукариотските организми, местото од каде што започнува репликацијата најдобро е изучен кај S.Cerevisiae. Истите се наречени автономни репликациони секвенции (autonomously replicating sequences (ARSs)) и се составени од повторувачки фрагменти, составени од 11 bp, одделени помеѓу себе со други кратки секвенции. За време на G1 фазата од клеточната делба, настанува врзување на специфични протеини (кај S. Cerevisiae се шест) за ARSs и при што се образува комплекс (origin recognition complex (ORC)), на кој, пак, се надоврзуваат и специфични кинази кои се активираат и овозможуваат репликацијата да започне. Активираниот комплекс создава услови да започне раздвојувањето на двојниот хеликс и ДНК полимеразата да ги препознае местата каде треба да се прикачи за ДНК и да ја започне синтезата. Истовремено вака формираниот комплекс не дозволува повторно формирање на нов репликационен комплекс, со што оневозможува реплицирање на ДНК која веќе еднаш била реплицирана. 95 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски При иницирање на репликацијата доаѓа и до модификација на хроматинската структура. Имено, ДНК треба да се одвои од хистонските протеини за да може да се расплете и раздвои двојниот хеликс. Ова се постигнува со хистон модифицирачките протеини кои ја дестабилизираат врската помеѓу ДНК и хистоните. Веднаш штом фрагментот од новата молекула е синтетизиран, повторно се усука околу старите хистонски молекули. Притоа, бидејќи количеството на ДНК е удвоено, потребно е да се удвои и количеството на хистоните. Ова се постигнува со помош на група на протеини наречени хроматин составувачки фактори (chromatin assembly factors (CAFs)), кои веднаш на новосинтетизираните молекули им додаваат хистонски протеини. Слика 105 Шеметски приказ на компомнентите кои учествуваат во процесот на репликација на ДНК кај цицачите Мала разлика има и во структурата на SSB протеините. Кај еукариотските клетки се составени од 3 подединици, додека кај прокариотските само од една. Следната разлика е во ензимите, ДНК полимерази, кои учествуваат во репликацијата на еукариотската ДНК. ДНК полимераза α, δ и ε се оние кои влегуваат во процесот на синтеза на нуклеарната ДНК. Друга група на ДНК полимерази, вклучувајки ги и β и ζ учествуваат во поправањето на ДНК молекулата. ДНК полимераза γ учествува во синтеза на митохондријалната ДНК. Pol α и δ се главните фактори кои учествуваат во иницијацијата и синтезата на ДНК. ДНК примазата, ензимот кој ги синтетизира РНК прајмерите кај прокариотите, е интегрирана во Pol α ензимот. Имено две подединици на Pol α учествуваат во синтеза на кратките РНК прајмери (10-ина нуклеотида) кои понатаму се надополнуваат со кратки секвенции на ДНК. Кога прајмерите ќе достигнат големина од 30 до 40-ина нуклеотиди, настанува замена на Pol α со Pol Pol δ е ензимот кој го синтетизира најголемиот дел од двете вериги, водечката и неводечката. Овде Слика 106 Додавање на нови хистони треба да се напомене и дека Оказаки позади репликационата виљушка 96 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски фрагментите кај еукариотските клетки се значително помали, некаде околу 100-200 нуклеотиди. Ова е во корелација со поставеноста на нуклеозомите, имено помеѓу два нуклеозоми се наоѓа секвенција од околу 200bp која не е усукана околу хистонските протеини. На краевите на линеарниот хромозом на еукариотската клетка се наоѓаат структури наречени теломери. Овие структури го зачувуваат интегритетот и го стабилизираат целиот хромозом. Доколку оваа структура не постои, тогаш крајните делови на двоверижната молекула имаат тенденција да се спојат и притоа да формираат циркуларна молекула, или, пак, подлежат на деградација. Теломерната секвенција на ДНК е составена од кратки повторувачки елементи кои се поврзани со специфични протеини (telomere-associate proteins). Овој дел од ДНК подлежи на малку поспецифичен процес на репликација. Притоа, разликата е при репликацијата на неводечката верига која се синтетизира на принципот на поврзување на Оказаки фрагментите. Имено, при формирањето на последниот Оказаки фрагмент, делот во кој се наоѓа прајмерот не е во можност да се замени со соодветни дезоксирибонуклеотиди. За ДНК полимеразата да ја изврши оваа замена, потребно и е на 3` крајот да има OH група која вообичаено доаѓа од наредниот Оказаки фрагмент. Бидејќи овој дел не е во можност да се синтетизира, при секоја делба на клетката молекулата на ДНК во пределот на теломерот се скратува за должината на прајмерот. Со самото скратување на теломерот, стабилноста на хромозомот се намалува, а со тоа и можностите за негова дезинтеграција се зголемуваат. За да се заштити теломерот од скратување под некоја критична должина при која би се изгубил дел од генетскиот материјал, истиот се обновува со помош на ензимот теломераза. Овој ензим на крајот на водечката верига ја синтетизира повторувачката секвенција карактеристична за теломерот. Во случај кај човекот тоа е 5`-TTAGGG-3`, а кај протозоата Tetrahymena e 5`-ТТGGGG-3`. Вака додадените секвенции имаат способност да формираат петелка при што доаѓа до поврзување на G со водородни врски. Оваа структура овозможува позиционирање на слободна OH група на 3` крајот од неводечката верига со што ДНК полимеразата ќе може да ја потполни празнината. Откога ќе заврши синтезата на фрагментот кој недостасува, петелката се отсекува и молекулата на ДНК повторно го добива својот линеарен крај. Интересно за теломеразата е дека е рибонуклеопротеин, односно во себе содржи молекула на РНК која има каталитично својство. Притоа, на овој ензим не му е потребна матрица според која ќе ја синтетизира кратката секвенција. Слика 107 Репликација на теломерот Самата РНК ја носи матрицата за синтеза на оваа секвенција. Во овој контекст да се напомене дека од активноста на теломеразата зависи и колку една клетка ќе се размножува. Кај некои соматски клетки теломеразата не е активна и по одреден број делби, истите подлежат на изумирање. Таков пример е кожата каде клетките со секоја делба губат дел од теломерот. Се смета дека со овој механизам организмот се заштитува од постарите клетки кои поради изложеност на различни фактори можат да стекнат одередени мутации кои би биле причина да преминат во 97 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски канцер клетки. Друг убав пример за инволвираноста на теломерот и теломеразата доаѓа од in vitro експерименти со клеточни култури. Изолирани хумани фибробласти култивирани in vitro можат да се реплицираат околу 60-тина пати. Притоа со секое реплицирање доаѓа до намалување на нивниот теломер, што на крај ќе заврши со излегување од клеточниот циклус и клеточна смрт. Доколку во овие фибробласти се вметне или активира теломеразата, нивниот животен век се зголемува, дури можат да се доведат во стадиум на имортални клетки. Слично е и со канцер клетки кои најчесто имаат постојано активна теломераза, а со тоа и можноста неограничено да се размножуваат. Забележана е и корелација на староста на организмот со должината на теломерот. Генерално, се смета дека при раѓањето соматските клетки имаат максимално долг теломер, кој со стареење на организмот станува пократок. 98 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ОШТЕТУВАЊЕ И РЕПАРИРАЊЕ НА ДНК Секвенцата на ДНК за време на репликацијата или под дејство на некои надворешни фактори, може да се промени. Ваквите промени можат да предизвикуваат нарушување во нормалното функционирање на клетката и евентуално да предизвикаат клеточна смрт. Надворешните фактори, кои предизвикуваат промени на ДНК, се поделени на физички (јонизирачко зрачење), хемиски и биолошки. Индуцираните промени, покрај тоа што можат да предизвикаат изумирање на клетката, можат да бидат и причина за настанување на канцер. Агенсите кои индуцираат канцерогени промени се делат на директни и индиректни. Директните имаат способност непосредно да предизвикаат промени на составните делови на ДНК молекулата. Таков е примерот со етилметан сулфонат (EMS). Под дејство на EMS доаѓа до промена на гванинот, при што се добива O6-етилгванин (Et-G) кој, пак, комплементарно се поврзува со тимин наместо со цитозин. Ваквото погрешно спарување во следната генерација ќе се пренесе во форма на стекната мутација. Слика 108 Некои видови на оштетување на молекулата на ДНК При синтеза на ДНК на комплементарната верига, ДНК полимеразата може да полимеризира погрешени нуклеотиди. Овие грешки во синтезата се доста ретки, на пример, кај E.Coli се случува една грешка на секои 104 нуклеотиди. Меѓутоа, доколку се земе предвид брзината на пролиферација, а со тоа и репликација на ДНК, ќе се види дека за многу кратко време би се акумулирале многу грешки во геномот. За да се отстрани оваа аномалија на ДНК полимеразата, постои механизам кај самиот ензим на препознавање и коригирање на грешките кои ги создава. Оваа способност се нарекува „proofreading“. Така, на пример, ε подединицата на ДНК полимераза III е задолжена за корекција на направените грешки. Кога ќе се вметне погрешен нуклеотид, Pol III препознава дека е нарушена комплементарноста на базните парови, односно истите не се поврзуваат адекватно, прави мала пауза, и 3` крајот каде што се наоѓа погрешната база се префрла од делот за полимеризирање во егзонуклеарниот дел. Таму се отстранува погрешно закачениот нуклеотид, најверојатно се отстрануваат и соседните и повторно веригата се враќа во првобитната положба и синтезата продолжува. Ова е само еден од начините како ДНК полимеразата ги отстранува грешките. Покрај способноста ДНК полимераза при синтеза да направи корекција на погрешно поставениот нуклеотид, клетката има и додатни механизми со кои може да ја поправи оштетената ДНК. - Директно поправање (Direct repair systems); Пример за овој систем за корекција е кога има прекин на фосфодиестерската врска помеѓу нуклеотиди и ДНК лигазата врши директно спојување. Најчесто вакви едноставни прекини се јавуваат при јонизирачко зрачење. - Поправање на погрешно спарените нуклеотиди при репликацијата (Mismatch repair). 99 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 109 Различни начини на репарирање ДНК Една од најчестите мутации се базираат на промена на еден нуклеотид (point mutations) во новосоздадената верига. Ова се случува најчесто при репликацијата, рекомбинацијата или дезаминацијата на цитозинот кој преоѓа во урацил. При вакви мутации се добива погрешно спарување на нуклеотидите. Доколку оваа состојба не се поправи, тогаш во наредната клеточна делба веригата, која го носи мутираниот нуклеотид, ќе послужи како матрица за репликација со што мутацијата ќе се пренесе во наредните генерации. Во една ваква состојба кога се има несоодветен пар на нуклеотиди, клетката развила систем со кој ќе препознае кој нуклеотид е мутант и притоа истиот да го замени. Еден од механизмите за поправка на вакви погрешно спарени нуклеотиди кој детално е разработен кај E. Coli, се вика MutHLS систем. Во секвенцијата GATC, аденинот на позиција 6 е метилиран. При репликација на ДНК, во новосинтетизираната верига во еден кус период аденинот не е метилиран. За тоа кратко време додека да се изврши метилацијата, MutH протеинот се врзува за хемиметилираната, новосинтетизираната, верига. Доколку дојде до погрешно базно спарување, тогаш во близина на него се поврзува MutS протеинот. MutH и MutS кога се наоѓаат блиску еден до друг го привлекуваат протеинот MutL, кој се поврзува и за двата протеини формирајќи мост помеѓу нив. Ваквиот комплекс индуцира активација на МutH кој ја сече фосфодиестерската врска веднаш пред гванинот. Вака пресечената верига се одвојува од двојниот хеликс со ДНК хеликазата и се разградува од ендонуклеазите. Местото од кое се отстранети нуклеотидите се потполнува со соодветни, комплементарни, со помош на ДНК полимераза I и ДНК лигазата. Забележано е кај соеви на E. Coli, склоност кон спонтани мутации доколку еден од факторите не е функционален или изостанува, вклучувајќи го и ензимот деоксиаденозине метилаза (deoxyadenosine methylase) кој е задолжен за метилирање на аденинот. Сличен начин на корекција на погрешно спарени базни парови има при депуринација на веригата. Односно, при откинување на аденинот или гванинот од соодветните нуклеотиди, на една од веригите недостасува нуклеотид за да 100 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски се овозможи спарувањето. Ваквите места се препознаваат од апурински ендонуклеази кои ја сечат и разоруваат веригата на местото на мутацијата. Понатаму, поправката повторно се врши по синтеза на разорениот сегмент и негово поврзување за остатокот од веригата. Кај еукариотските клетки постои хомологен систем на поправање на погрешно спарените нуклеотиди. Така MutSα протеинот ја иницира целата реакција со тоа што се припојува кон мутираните секвенции и го регрутира MulL протеинот. Целата реакција продолжува со сечење на мутираната верига од која се отстрануваат од 100 до 200 нуклеотиди, помеѓу кои се погрешно спарените. Притоа формираната празнина се потполнува со помош на ДНК полимераза δ. Слика 110 Репарирање на ДНК со MutHLS системот Поправање со отстранување на оштетените нуклеотоди (Excision repair) Под дејство на надворешните влијанија доаѓа до структурни промени на нуклеотидите, а со тоа и конформациски промени во двојниот хеликс. Типичен пример е формирањето на димер помеѓу два променети тимина под дејство на УВ зраците, или, пак, прикачување нареактивна група на некој нукеотид. Ваквите неправилности можат да се детектираат од група на протеини кои се движат „лизгаат“ по ДНК и детектираат промени во формата и стуктурата на молекулата. Повторно еден од подобро објаснетите механизми за овој тип на поправка е кај E. Coli и се нарекува UvrABC систем. Процесот започнува со прикачување на два UvrA протеини и еден UvrB за молекулата на ДНК. Вака формираниот комплекс движејќи се по молекулата, ќе застане на модифицираното место и ќе се дисоцира. Притоа UvrA ќе го напушти комплексот и на негово место ќе дојде UvrC со што ќе се формира нов димер UvrBC, кој има способност да ја отсече оштетената верига. Овој процес е синхронизиран, така што најпрво UvrB ќе ја пресече веригата на 3` крајот, па потоа UvrC на 5` крајот на оштетениот дел. Притоа се формира отсечок од 12 нуклеотида кој се одвојува со помош на ДНК хеликазата II. Празнината која настанува се заштитува од дополнителни оштетувања од UvrB протеинот сè додека ДНК полимераза I не ја потполни. Од погоре опишаните механизми на поправање, може да се увиди колкава е значајноста на двојниот хеликс како структура во зачувување на информациите. Оваа структура овозможува да се зачува информацијата и при оштетувања на молекулата. Притоа е потребно една од комплементарните бази да е интактна (непроменета) за да може на нејзина база мутираниот дел да се поправи. Овие системи на поправање на 101 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски грешките не може да се искористат кај организмите кои како носител на генетскиот материјал имаат едноверижна молекула на ДНК или пак РНК. Слика 111 Репарација на ДНК со UvrABC механизмот Поправање на прекини на двојната верига со рекомбинација Најопасен вид на оштетување на ДНК е кога двојниот хеликс ќе биде прекинат. Најчесто ова се случува поради јонизирачки зрачења, оксидирачки молекули, грешки во репликацијата или под дејство на некои меѓупродукти при метаболизмот на клетката. Ваков тип на оштетувања можат да доведат до дезинтеграција и фрагментирање на хромозомот. Клетката развила два механизма базирани на хомологна рекомбинација (Recombination repair) да ги поправи овие видови на грешки. Едниот е со помош на рекомбинација на нехомологни краеви. При ова доаѓа до спојување на прекинатите краеви и притоа, најчесто, до губење или погрешно спарување на неколку нуклеотиди кои се наоѓаат на самиот спој. Ваквиот начин на поправање и покрај тоа што не е идеален, сепак е задоволителен доколку прекинот не е во функционалниот дел на генот. Земајќи предвид дека поголемиот дел од геномот не кодира протеини, во тој случај ефикасноста и значајноста на овој механизам во зачувување на интегритетот на хромозомите е голема. Вториот начин на репарација на прекини на двојниот хеликс е со користење на хомологниот неоштетен хромозом како матрица при поправање на оштетениот хромозом. Притоа секвенцијата која е оштетена се презема од неоштетениот хромозом и на база на неа се довршува синтезата. За ова да може да се изведе, потребно е група на специјализирани рекомбинирачки протеини да ги препознаат идентичните сегменти на двата хромозома и да ги доближат еден кон друг. Притоа настанува рекомбинација 102 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски со што оштетениот хромозом добива матрица според која ќе се изврши поправката. Овој механизам овозможува идеална поправка на оштетените делови. Доколку оштетувањето настанало во стадиум кога хромозомите имаат по две хроматиди, односно молекулата на ДНК веќе се поделила, во тој случај нема потреба од рекомбинација помеѓу хомологните хромозоми, туку истата може да настане и помеѓу сестринските хроматиди. Во детали процесот на рекомбинација ќе биде објаснет подолу. Слика 112 Репарирање на ДНК со рекомбинација на хомологни и нехомологни краеви Интересно е да се напомене дека клетката, кога ќе се најде во екстремни состојби кои индуцираат значителни оштетувања на ДНК, има способност да активира алтернативни механизми за поправање на оштетените делови на ДНК. Така на пример, при продолжено изложување на УВ-зрачења или, пак, повисоки температури, клетката E. Coli индуцира група од 15 различни гени кои имаат улога во репарирање на ДНК. Овој таканаречен SOS систем кај Е. Coli покрај тоа што интензивно ги поправа оштетените делови на ДНК, исто така, и е склон кон создавање на додатни мутации. Овие дополнителни мутации ги создаваат ДНК полимерази кои со помала прецизност ја синтетизираат молекулата. На прв поглед ова изгледа контрадикторно, повеќе мутации значи шансите таа клетка да опстане се помали. Меѓутоа, ова е еден одбранбен механизам на организмите со кој со индуцирање на серија од дополнителни мутации, се зголемува можноста да се добијат единки кои ќе бидат поотпорни, поиздржливи или попродуктивни, а со тоа и способни да преживеат на новите екстремни услови. 103 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ДНК рекомбинација Промената на генетскиот материјал е основа за добивање на диверзитет во фенотиповите. Со ова се добива генетски диверзитет во популацијата кој е основа за природната селекција. На овој начин организмите се адаптираат и опстануваат во средина која постојано се менува. Рекомбинација на генетскиот материјал е еден од основните механизми со кој се добиваат организми со различни генетски комбинации. Размената на генетскиот материјал може да биде помеѓу хомологни и нехомологни сегменти. Доколку има размена на две доволно слични ДНК секвенции, кои се наоѓаат на два хомологни хромозоми, станува збор за хомологна рекомбинација. Како пример за овој тип на рекомбинација е онаа која се случува за време на мејотската делба или, пак, при поправање на грешките во молекулата на ДНК. Генерални принципи на хомологната Слика 113 Модел на хомологна рекомбинација која се случува при „crossing рекомбинација over“ за време на мејотската делба се: - Двете хомологни ДНК молекули, сместени на два хомологни хромозома, се прекинуваат и крајот од едната ДНК молекула се спојува со крајот од другата и обратно; - На местото на спојувањето се формира хетеродуплекс „heteroduplex“, односно доаѓа до спарување на комплементарните нуклеотиди на краевите на двете вериги. Хетеродуплексот може да биде и илјадници нуклеотиди долг; Слика 114 Модели на хомологна рекомбинација. Холидеов модел на рекомбинација (лево) и рекомбинација со прекин на едната низа (десно) 104 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски - При сечењето и поврзувањето на краевите на молекулите не доаѓа до промена на секвенцијата на нуклеотидите, односно не се додава, одзема или заменува некој нуклеотид на местото на рекомбинацијата. Еден од иницијалните обиди механички да се објасни хомологната рекомбинација е моделот на Р. Холидеј (R. Holliday) од 1964. Во овој модел е предложено дека рекомбинацијата започнува со прекини на идентични места на две хомологни ДНК молекули. Прекинот е само на по една од веригите на двојните хеликси. Притоа, пресечената верига од едната молекула се спарува со хомологната непресечена верига од другата молекула. Со поврзувањето на комплементарните нуклеотиди се формира хетеродуплексот. Структурата добиена со вкрстување и спојување на двете хомологни молекули се нарекува Холидеово вкрстување „Holliday junction“. Споените вериги можат да ротираат околу оваа структура и да формираат неколку типа на изомери. Со сечење и спојување на вкрстените вериги се добиваат молекули кои имаат рекомбинирани сегменти. На базичниот модел на Holliday предложени се уште неколку модели со кои се објаснуваат различни сценарија како може да се одвива процесот на рекомбинација. Една варијација е во иницијацијата на целиот процес. При ова само една верига од една од молекулите на ДНК иницијално се сече. Така пресечената верига се раздвојува од интактната верига од двојниот хеликс и се поврзува со хомологната нејзина секвенција од другата молекула. Сликовито може да се каже дека единечната верига ја „инвадира“ (напаѓа) хомологната ДНК молекула. Ова создава услови да се пресече и една од веригите на инвадираната молекула која ќе се поврзе со другиот крај од иницијално пресечената верига. На овој начин ќе се формира Холидеово вкрстување кое на крај ќе резултира со рекомбинирани молекули. Слика 115 Изомеризација и Холидеево вкрстување Молекуларниот механизам на хомологната рекомбинација најдобро е објаснет кај Е. Coli. Затоа и како модел во оваа прилика накратко ќе го објасниме, со забелешка дека истите принципи важат и за еукариотската клетка. Централна улога во процесот на хомологна рекомбинација заземаат RecA и RecBCD протеините. RecBCD е комплекс од три протеини, кодирани од три различни гена. Овие протеини на местото каде што треба да започне рекомбинацијата, индуцираат сечење на една од двете вериги. Имено, RecBCD најпрво се прикачува за двојниот хеликс и дејствува како хеликаза, односно движејќи се по него ги распетлува двете вериги. Кога ќе наиде на специфичната секвенција GCTGGTGG, наречена „chi site“, RecBCD делува како нуклеаза, сечејќи ја 105 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски едната верига. Понатаму за оваа верига се врзува RecА протеинот. Овој протеин содржи две врзувачки места за ДНК. За да овозможи формирање на комплекс во кој ќе се случи вкрстувањето, RecA со едниот дел најпрво се поврзува за единечната пресечена верига, а потоа со другиот дел за интактната двоверижна ДНК молекула. Близината на двете молекули и каталитичната особина на RecA овозможуваaт комплементарно поврзување на единечната верига со една од веригите на друга молекула и формирање на хетеродуплекс. Кога ќе се формира Холидеовото вкрстување, два протеина, RuvA и RuvB, се надоврзуваат на комплексот и овозможуваат проширување на хетеродуплексот. Конечното сечење на вкрстените вериги го врши ензимот RuvC, а спојувањето на Слика 116. Иницијација на хомологната рекомбинација со RecBCD комплексот слободните краеви ДНК лигазата. 106 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ОСНОВА НА КЛЕТОЧНА ДЕЛБА Митоза Со оплодувањето на јајце клетката и формирањето на зиготот започнува формирањето на организмот. Од едноклеточна структура се формира адултен организам во кој се проценува дека има околу 1014 клетки. Процесот со кој соматските клетки се делат, односно од една клетка се добиваат две генетски идентични клетки ќерки, се вика митоза. При митозата, од секој хромозом се добиваат два идентични хромозми кои се раздвојуваат во новоформираните клетки ќерки. Притоа бројот на хромозомите секогаш останува константен, односно клетката влегува во митоза со диплоиден број нахромозоми (2n) и излегува од митозата со диплоиден број на хромозоми (2n). Процесот е строго генетски контролиран, со што се овозможува организмот нормално да се развие и функционира. Едноставно животот на организмот зависи од клеточниот циклус и неговата контрола. Доколку клетките недоволно се размножуваат или брзината на размножувањето е забавена, во тој случај организмот нема да се развие соодветно или, пак, ткивото или огранот не може соодветно да се обнови. Спротивно, зголемена и неконтролирана пролиферација создава ткивни структури кои органите ги прават нефункционални, а со тоа и го загрозувааат и опстанокот на организмот. Етапите на клеточниот циклус и начините на неговото регулирање се идентични кај сите еукариотски организми. Клеточниот циклус се дефинира како период од една до друга клеточна делба. Истиот е поделен на М фаза, краток период при кој клетката се дели и интерфаза. Пред да започне митозата секој хромозом се состои од две идентични сестрински хроматиди како резултат на репликацијата на ДНК за време на S фазата од интерфазата. Интерфазата е период помеѓу две М фази. Кај клетките кои интензивно се размножуваат овој период трае од 16 до 24 часа. Се состои од три фази, G1 (Gap1), S (Synthesis), G2 (Gap2). Започнува со G1 фазата во која хромозомите се тенки и долги. За време на оваа фаза клетка е интензивно метаболички активна и ги синтетизира протеините кои се неопходни за нејзината структура и функција. Времетраењето на оваа фаза зависи од видот и состојбата на клетката. Некои клетки можат да бидат неколку часа, додека, пак, други да поминат и неколку дена во G1 фазата. Клетките кои ја изгубиле способноста за пролиферација, како невроните, обично, се наоѓаат во модифицирана форма на оваа фаза, која се нарекува G0 фаза. Клетките Слика 117. Шематски приказ на стадиумите функционираат нормално во G0 фазата сѐ на клеточниот цилус додека не изумрат. Најголем број од клетките во организмот се наоѓаат во оваа фаза. Само мала група на клетки има способност од Gо фазата повторно да влезе во клеточниот циклус, односно да започнат да се делат. Таков пример се адултните матични клетки, кои нормално се наоѓаат во G0, и при одреден стимул се активираат и започниваат да пролиферираат. После G1 доаѓа S фазата при која настанува репликација на ДНК и удвојување на хроматидите во секој хромозом. Удвојувањето, обично, е синхронизирано помеѓу хомологните хромозоми. Бројот на хромозомите во клетката пред и по S фазата останува ист (2n). Разликата е во тоа што пред S фазата хромозомите имата по една 107 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски хроматида, а после S фазата хромозомите содржат по две хроматиди. Двете хроматиди се споени помеѓу себе во пределот на центромерот и се нарекуваат сестрински хроматиди. Интрерфазата се комплетира со релативно кратката G2 фаза. Во оваа фаза хромозомите започнуваат да се кондензираат, а клетката да се подготвува за претстојната клеточна делба. На преодот помеѓу G1 и S, S и G2, и G2 и M се спроведуваат контролни процеси со кои се проверува дали клетката е подготвена да премине во наредната фаза од клеточниот циклус. Овие периоди се викаат контролни точки. M фазата е поделена на 5 потфази: профаза, прометафаза, метафаза, анафаза и телофаза. Со овие потфази се опфатени двата процеса на клеточната делба, кариокинезата и цитокинезата. Кариокинезата е процес при кој се раздвојува хромозомскиот материјал на два еднакви дела кои ќе припаднат на двете клетки ќерки. Цитогенезата е процес со кој се раздвојува цитоплазмата на двете клетки ќерки. При овој процес цитоплзамата, а со тоа компонентите кои се наоѓаат во неа, не секогаш се раздвојуваат подеднакво на клетките ќерки како при кариокинезата. Со започнување на профазата започнува хромозомското спирализирање и формирањето на структурите на делбеното вретено. Со крајот на профазата и почетокот на прометафазата започнува деградацијата на нуклеарната мембрана. Центрозомите од кои радијално се протегаат делови од микротубулите започнуваат да мигрираат кон спротивните краеви на клетката. За време на метафазата хромозомите се локализирани во екваторијалната рамнина. Микротубилите се целосно оформени и преку кинетохорот се прикачени за центромерот. Притоа сестринските хроматиди со микротубулите се споени со центрозомите на спротивните полови на клетката. Во оваа фаза хромозомите се најмногу спирализирани, а со тоа и највидиливи под микроскоп. Со почеткот на анафазата центромерот се дели лонгитудинално и со тоа се создават услови за раздвојување на сестринските хроматдиди. Кинетохорните миктотубули започнуваат да се деполимеризираат, а некинетохорните микротубуили да се полимеризираат со што започнува миграцијата на сестринските хроматиди кон центрозоми на спритивните полови на клетката. Кон крајот на ова фаза хроматидите, сега веќе се нарекуваат хромозоми, се локализирани во близина на центрозомите. Телофаза е проследена со дополнителна полимеризација на некинетохорните микротубули со што клетката се издолжува. Хромозомите започнуваат да се декондензираат и да се формираат структури од нуклеарната мембрана. Со разделување на цитоплазмата и формирањето на клеточното јадро оваа фаза завршува, а со тоа и клеточниот циклус. Мејоза Репродукцијата, односно размножувањето, е една од главните одлики на живите организми. Таа може да се одвива на два начина: асексуално и сексуално. Асексуалнио размножување е процес без посредство на специјализирани клетки за размножување (гамети). При овој тип на размножување се создаваат единки кои се идентична копија на родителот. При сексуалното размножување родителите создаваат гамети кои се спојуваат (оплодување) и генерираат нов организам. Прокариотските организми екслузивно се размножуваат асексуално. Овие организми се хаплоидни и најчесто имаат само еден хромозом. Мултицелуларните еукариотски организми најчесто се размножуваат сексуално. Притоа родителите создават хаплоидни гамети кои при фертилизација формираат диплоиден организам. Гаметите можат да потекнуваат од два различни организми или, пак, да потекнуваат од истиот организам, како, на пример, кај грашокот кој го користел Мендел при своите експерименти. Кај едноклеточните еукариотски организми, како квасецот, размножувањето може да биде и асексуално и сексуално. Мејоза е процесот на нуклеарната делба што се случува за време на финалната фаза при формирањето на гаметите. Покрај тоа што делат идентични процеси (пример 108 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски интерфазата), митозата и мејозата имаат и свои специфичности кои се случуваат при M фазата. Фундаменталните разлики помеѓу мејозата и митозата се: - При митозата се добиваат ќерки клетки кои имаат диплоиден број на хромозоми (2n), а при мејозата се добиваат клетки кои имаат хаплоиден број на хромозоми (n); - Митозата е клеточна делба со која се размножуваат соматските клетки, а мејозата е делба со која се добиваат гаметите и се случува во терминалната фаза од гаметогенезата; - Митозата е процес кој се одвива во една етапа, а мејозата се одвива во две етапи (Мејоза I и Мејоза II). Притоа секоја етапа се состои од: профаза, метафаза, анафаза и телофаза; - При митозата не настанува (или многу ретко) размена на генетскиот материјал помеѓу хомологните хромозоми, додека кај мејозата настанува рекомбинацијана делови од хомологните хромозоми и - При мејозата се добиваат две генетски идентични клетки ќерки, а при мејозата се добиваат четири генетски различни клетки. Генетската варијабилност која се добива со мејозата се должи на два процеса. Едниот е генерирање на разни комбинации на матерни и патерни хромозоми во гаметите. Вториот е со помош на кросинговер (crossing over), кога настанува рекомбинација на гените помеѓу хомологните хромозми. Мејоза I е првата етапа од мејотската делба со која бројот на хромозомите се намалува за половина. Поради тоа се нарекува и редукциона делба. Клетките влегуваат во мејоза I после комплетирана интерфаза. Тоа значи дека кога започнува мејоза I секоја клетка има диплоиден број на Слика 118 Раздвојување на сестринските хромозоми (2n) со по две хроматиди. хроматидите при митоза (лево) и Поделена е во 4 фази: профаза I, хомологните хромозоми при мејоза (десно) метафаза I, анафаза I и телофаза I. Прва фаза е профаза I која поради комплексноста е поделена на 5 потфази. Првата потфаза е лептотен кога започнува кондензирање на хроматинот и хомологните хромозоми се приближуваат еден кон друг. Во зиготниот период хомологните хромозми се поставени паралелно еден на друг по целата должина. Притоа се формираат синапси со помош на протеините од синаптонемалниот комплекс. Синапсите се неопходни за за да може хомологната рекомбинација да се спроведе. Спарените хомологни хромозоми уште се нарекуваат и биваленти. Пахитен е потфаза во која хромозомите се уште повеќе спирализирани, а синапсите се комплетно формирани. Поради изгледот, односно видливоста на четирите хроматиди во еден комплекс, се вика дека бивалентите формираат тетради. Во овој период настанува кросинговерот. Откога ќе заврши рекомбинацијата, започнува диплотниот период. Притоа, започнува разградување на синаптонемалниот комплекс. Хомологните хромозоми се поврзани само на одредени делови кои се викаат хијазми. Се смета дека местото каде што настанала хомологната рекомбинација се хијазмите. Кај хуманиот сперматозоид има некаде околу 50 хијазми, односно по 2-3 хијазми на секој бивалент. Во дијакиназата хромозомите се максимално спирализирани. Во финалниот период од профаза I започнува разградување на нуклерната мембрана и нуклеолусот и формирањето на филаментите на делбеното вретено. Во метазафа I нуклеарната мембрана комплетно исчезнува, а филаментите на делбеното вретено се формирани. Хомологните хромозоми, односно тетрадите, се локализирани во екваторијалната 109 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 119 Шематски приказ на фазите на митоза и мејоза рамнина со центромерите ориентирани кон спротивните полови на клетката. Несестринските хроматиди се поврзани помеѓу себе само со терминалните хијазми. Во анафаза I настанува раздвојување (disjunction) на тетрадите и секој хромозом од бивалентот се придвижува кон спротивниот пол на клетката. Раздвоените хромозоми се состојат од по две хроматиди поврзани во регионот на центромерот. Со ова раздојување на хомологните хромозоми се постигнува хаплоиден број на хромозоми во новодобиени клетки. На база на случајност е сегрегацијата на хромозомите од бивалентот во клетките ќерки. На овој начин се добиваат 8 милиони комбинации од 23-те матерни или патерни хромозоми. Треба да се истакне дека ова е фазата во која настануваат и најмногу грешки кои се причина за нумерички хромозомски аберации. Неправилно раздвојување на бивалентите допринесува два хомологни хромозоми да се локализираат во една од клетките ќерка со што ќе се добијат анеуплоидини клетки. Едната клетка ќе биде моносомична, односно ќе ѝ недостасува еден хромозом, а другата ќе биде трисомична, односно ќе има еден хромозом повеќе. Од друга страна, пак, грешките при кросиноверот се најчеста причина за структурни хромозомски аберации. Телофаза I е период во кој хаплоидните сетови на хромозомите се групирани на половите на клетката. Со завршување на оваа фаза започнува цитокинезата со која се добиваат две клетки. При сперматогенезата се добиваат две клетки кои имаат скоро идентична цитоплазма. Спротивно, кај оогенезата се добива една клетка која ја содржи скоро целата цитоплзама (секундарниот ооцит), а од останатата клетка се формира првото поларно телце. После цитокинезата клетката влегува во кратка мејотска интерфаза при која не настанува репликација на ДНК (хромозомите се веќе дихроматидни). Мејоза II е идентичен процес како и митозата само што клетките кои влегуваат во мејоза II се хаплоидни, наместо диплоидни како кај митозата. Од двете клетки 110 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски добиени при мејоза I, се добиваат четири хаплоидни клетки со мејоза II. Накусо, при профаза II, настанува спирализирање на хромозомите кои се составени од две хроматиди поврзани во пределот на центромерот. Во метафаза II хромозомите се локализраат во екваторијалната рамина (метафазна плоча) и се дооформираат структурите на делбеното вретено. Во анафаза II настанува раздвојување на сестринските хроматиди и нивно мигрирање кон половите на клетката. И во оваа фаза како и кај анафаза I, која хроматида ќе мигрира во кој дел од клетката е на база на случајност. Телофаза II е фаза во која хромозомите се лоцирани на спротивните полови на клетката и со цитокинезта се формираат четири клетки ќерки. 111 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ОСНОВНИ ПРАВИЛА НА МЕНДЕЛОВОТО НАСЛЕДУВАЊЕ Со објавување на првите научни истражувања на Грегор Мендел во 1866 год. започнува една нова научна област која се вика генетика. Со векови претходно се знаело дека некои својства на растенијата, животните и луѓето се пренесуваат од една генерација на друга генерација, меѓутоа според кои правила и законитости истото се случува било мистерија. Грегор Мендел (1822-1884) се школувал на Универзитетот во Виена каде се стекнал со познавања од математика, физика, хемија и ботаника. После студиите работи како свештеник во манастир во Брно, Р. Чешка. Овде ги прави и своите експриемнти со кои се обидува да објасни што и како се наследува и колкава е веројатноста да се наследат некои својства. Како експериментален модел го користи грашокот (Pisum sativum), поради неговите карактеристики: краткиот вегетациски период, анатомските одлики на репродуктивните органи на растението, јасно изразените својства. Краткиот вегетациски период му овозможил да изврши голем број на експрименти со кои можел да добие статистички сигнификантни разултати. Се споменува дека во своите истражувања употребил над 29.000 растенија. Лесната пристапнист на половите органи на грашокот му овозможиле контролирано да ги изведува опрашувањата, а со тоа и вкрстувањето помеѓу растенијата. Јасно изразените карактеристики, на секое растение му овозможиле да изведе недвосмислени заклучоци. Мендел проучувал седум различни каракеристики на грашокот: боја и форма на зрното, боја и форма на мешунките, бојата и поставеност на цветот и висина на стеблото. Притоа, секоја карактеристика била застапена во две форми или како што тој ги нарекувал антагонистични форми. За секоја карактеристика развил посебно растение во чиста линија. На пример, имал растенија кои кога ќе се самоопрашат секогаш ќе имаат зрна со жолта боја или, пак, растенија кои секогаш ќе имаат зрна со зелена боја. Кога ги добил чистите линии на грашок почнал истите да ги вкрстува помеѓу себе. На пример, растение кое има жолто зрно го вкрстувал со она кое има зелено зрно или, пак, растение со виолетови цветови со она кои има бели цветови. Од вака вкрстените родители со спротивни карактеристики ги забележувал карактеристиките добиени кај потомството. Притоа внимавал кое својство потекнува од машките растенија, а кои од женските растенија. Уште на почетокот забележал дека својствата добиени во потомството потекнуваат подеднакво и од двата родитела. Со ова ја побил дотогашната Слика 120 Фенотипови кај грашокот кои ги анализирал Мендел 112 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски догма дека најголем процент од карактеристиките кај потомството потекнуваат од таткото. Процесот на следење на едно својство при вкрстувањето, како бојата на зрното, се нарекува монохибридно вкрстување. Доколку истовремено се набљудуваат две својства, пример боја и форма на зрното, е дихибридно вкрстување, а, пак, доколку се набљудуваат три својства е трихибридно вкрстување. Кога Мендел вкрстувал растенија во чиста линија (се обележуваат со P (parenteral)) со жолта боја на зрната и растенија со зелена боја на зрната секогаш во првата филијална генерација (F1) добивал растенија кои имаат жолта боја на зрната. Доколку дозволил растенијата од F1 генерацијата кои имаат жолти зрна да се самоопрашат во следната F2 генерација добивал растенија кои имаат зрна и со жолта и со зелена боја. Интересно било дека секогаш соодносот помеѓу растенијата со жолта и зелена боја бил 3:1.Односно, од анализирани 8000 растенија, 6022 имале жолта боја, а 2001 имале зелена боја на зрното. Овој тип на вкрстување го применил за сите седум карактеристики и притоа секогаш добивал идентични резултати. Овој експеримент недвосмислено докажал дека карактеристиките добиени во F1 не се мешавина од карактеристиките на родителите од P, туку дека карактеристиката на едниот родител, во примеров жолтата боја, доминира над карактеристиката од другиот родител, зелената боја. Карактеристиката која преовладува во F1 е доминантна, а онаа која повторно се јавува во 25% од потомството во F2 е рецесивна. Мендел ова го објаснил со постоење на две „наследни единици“ за секое својство кај секое растение. Притоа, едната единица се наследува од мајката, а другата од таткото. Дополнително тој навел дека секоја наследна единица може да се манифестира во различни форми, како жолта и зелена во случајот со бојата на семето. Парот од наследните единици присутен во клетките на Слика 121 Монохибридно вкрстуваадултното растение се раздвојуваат при ње. Родителите во P генерацијата формирањето на гаметите, односно само една се хомозиготни (чиста линија) за наследна единица за секое својство е присутна во бојата на зрното гаметата. Денеска предложените наследни едници се викаат гени, а нивните различни форми се викаат алели. Механизмот за разделување на наследните едници во гаметите е основата на првиот Менделов закон за генетска сегрегација. Според овој Закон, сегрегацијата на генските единици се базира на случајност, односно половина од гаметите ја содржат едната генска единица, а останата половина ја содржат другата генска единица. Мендел го проширил изучувањето на сегрегацијата на наследните единици во услови на дихибридното вкрстување. Поточно сакал да објасни на кој принцип настанува раздојувањато и групирањето на наследните единици кои не се поврзани една со друга, како на пример, бојата и формата на зрното грашок. За таа цел обезбедил растенија во чиста линија кои имаат жолти и набрани зрна и растенија со зелени и мазни зрна. Жолта боја е доминантна, па нејзината наследна единица сеобележува со„Y“, за разлика од зелената која која е рецесивна и се обележува со „y“. Мазното семе е доминантно и нејзината наследна единица се обележува со „R“, a рапавото семе е рецесивно и се обележува со „r“. Правило е доминантните гени да се обележуваат со големи букви, а рецесивните со мали. Поради тоа што родителите се во чиста линија обележувањето на наследните единици ќе биде RRYY за растение со мазни и жолти зрна, и rryy за растение со набрани и зелени зрна. Со вкрстување на овие две чисти лини во F1 генерацијата секогаш добивал мазни и жолти зрна (RrYy). Ова е според очекувањата во согласност со првиот Менделов закон и доминантноста на жолтата боја 113 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 122 Дихибридно вкрстување. R= доминантен ген (мазно семе), r=рецесивен ген (набрано семе), Y=доминантен ген (жолто семе), y=рецесивен ген (зелено семе) и мазниот облик на зрното. Интересно, кога дозволил само опрашување на растенијата од F1 генерацијата забележал зрна со различни комбинации на набљудуваните карактеристики во F2 генерацијата. Во еден типичен експеримент во F2 забележал 315 растенија со жолти мазни, 101 со жолти набрани, 108 со зелени и мазни и 32 со зелени и набрани зрна. Од овој експеримент заклучил дека сегрегацијата (раздвојувањето) на еден пар наследни единици е независно, односно не е поврзано, со сегрегацијата на другиот пар наследни единици. Ова е и основата на вториот Менделов закон, односно закон за независна распоредба, според кој генските алели на нехомологните хромозоми се раздвојуваат независно во секоја гамета. Овој механизам најдобро се објаснува со Панетова мрежа. Во наведениот пример, растенијата од F1 генерацијата, независно дали се машки или женски, во однос на двата набљудувани алела можат да формираат 4 различни видови на гамети. Гамети кои ќе содржат алели за мазно и жолто зрно (RY), за мазно и зелено (Ry), за набрано и жолто (rY) и набрано и зелено (ry). При вкрстувањето, секоја женска гамета има еднаква веројатност да се оплоди со еден од четирите типа на машки гамети. Поради тоа, во F2 генерацијата се очекуваат 16 алелни или генотипски комбинации кои ќе продуцираат растенија со 4 различни карактеристики на зрното. Односно ќе се добијат 9 растенија кои имаат мазни и жолти, 3 со набрани и жолти, 3 со мазни и зелени и едно со набрани и зелени зрна. Соодносот на добиените фенотипови е 9:3:3:1. Двата Менделови закона дека алелите се раздвојуваат за време на гаметогенезата и дека раздвојувањето на еден алелен пар е независен од другите се основни принципи 114 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски на наследувањето. Поради своите откритија со право за Мендел се вели дека е татко на генетиката. Само за илустрација колку неговите истражувања и заклучоци биле пред времето во кое работел зборува фактот дека требало да поминат над 35 години за истите да бидат потврдени и препознати од научната јавност. Основни поими кои се користат во генетиката Ген е секвенција од ДНК во која е кодирана информација за синтеза на протеин или функционална РНК молекула. Генот е основна структурна и фунционална единица на наследувањето, со кој одредена карактеристика се пренесува од родителите на потомството. Алел е алтернативна форма на еден ген. Локус е позиција на генот на хромозомот. Кога се зборува за генотип може да се мисли на алелен пар во еден локус, или, пак, на збирот на сите гени кај една индивидуа. Фенотип е манифестација на генотипот, односно биохемиски, структурни и морфолошки карактеристики добиени како последица на генската активност. Хомозиготен е локус во кој двата алела се идентични, а хетерозиготен е локусот во која алелите се различни. За индивидуа која има два идентична алела за некој ген може да се каже дека е хомозиготна за тој ген. Истиот принцип важи и доколку двата алела се различни, во тој случај индивидуата ќе биде хетерозиготна за тој ген. Хомозиготни и хетерозиготни локуси се оние кои се сместени на автосомните хромозоми. За гените кои се сместени на Х хромозомот кај машките се вика дека се хемизиготни, односно има само еден алел наместо два во даден локус. Доминантен ген е оној алел кој се експресира и доаѓа до израз кога е во хетерозиготна состојба. Рецесивниот ген или алел се експресира и доаѓа до израз само во хомозиготна состојба. Фамилијарно или родословно стебло Фамилијарното стебло е дијаграм кој ја прикажува родовата поврзаност и наследувањето на одредена карактеристика низ повеќе генерации во една фамилија. Правењето на фамилијарно стебло е неопходно за детерминирање на генетската компонента на одреден фенотип или, пак, за утврдување на генетската основа на некое заболување. Притоа, колку повеќе инфомации се содржат и колку повеќе генерации се опфатени во фамилијарното стебло, толку подобра анализа и релевантен заклучок може да се добие. При формирањето на фамилијарното стебло се користат унифицирани симболи. За машки индивидуи се користат квадрати, за женски кругови, а доколку полот не е познат се користи ромб. Доколку индивидуите се здрави симболите се празни (не се обоени), а доколку се болни односно со фенотип од интерес симболите се полни (обоени). Симболите на починатите индивидуи се прецртани со една линија. Индивидуите преносители на некој фенотип (болест) кај кои истиот не е изразен (не се заболени) имаат половично обоени симболи. Родовата поврзаност се претставува со хоризонтални, вертикални и коси линии. Така, на пример, родителите се поврзани со хоризонтална линија, а децата добиени од таа врска се поврзуваат со родителите со вертикална линија. Пробант е индивидуа поради која е започната изработката на фамилијарното стебло, односно индивидуа кај која најпрво е забележан фенотипот од интерест. Се обележува со симболот за полот кон кој е вперена коса стрелка. Генерациите се означуваат со римски броеви, при што најстарата генерација започнува со I, а секоја наредна генерација се означува со еден број повеќе, II, III, IV и така натаму. Бројот на децата добиени од една врска се означува со арапски броеви. Роднинската поврзаност од прв степен (first degree) постои помеѓу родителите и децата и помеѓу децата. Поврзаност од втор степен има помеѓу дедото и бабата и внуците, чичковци и тетки со внуци, помеѓу полубраќа и полусестри. Поврзаноста од трет степен има помеѓу први братучеди. 115 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 123. Симболи кои најчесто се користат при формирање на родословното стебло 116 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Видови на Менделово наследување Повеќе од 16000 фенотипски особини (белези) и генетски нарушувања кај човекот се поврзани со експресија на еден ген и подлежат на Менделовите закони за наследување. Доколку генот е лоциран на автосомните хромозоми, станува збор за автосомно наследување, а доколку се наоѓа на половите хромозоми се нарекува Х- или Y-поврзано (полово-поврзано) наследување. Автосомно доминантно наследување Доминантно наследување е кога еден белег доаѓа до израз независно дали генскиот алел е во хомозиготна или хетерозиготна форма. Кога едно заболување се пренесува автосомно доминантно со анализа на родословното стебло, многу лесно може да се лоцира од каде и од кога потекнува мутацијата. Недвосмислено може да се заклучи дека станува збор за автосомно доминантно наследување доколку болеста се пренесува од татко на син. Преносителот на овие мутации генерираат два типа на гамети, 50% од гаметите се нормални, а 50% го содржат мутираниот ген. Притоа, веројатноста потомците да ја добијат генетската мутација, а со тоа и да заболат се 50%. Автосомните доминантни мутации Слика 125 Наследување на автосомно можат да предизвикаат фенотипски доминанто заболување. Со „D“ е претпромени на еден или, пак, на повеќе органи ставен доминантниот мутиран алел, а со и органски системи. Појавата, кога еден ген „d“ нормалниот не мутиран алел предизвикува повеќе промени кои навидум не се поврзани, се вика плеиотрофија (pleiotropy). Одличен пример за оваа појава е мутација на генот LMNA на хромозомот 1q22, кој го кодира протеинот Laminin A/C. Мутација на овој ген може да предизвика Emery-Dreifuss мускуларна дистрофијатип 2 (#181350), Limb-Girdle мускулрната дистрофија тип II (LGMD, LG, #181350), Charcot-Marie-Tooth заболувањето тип 2B1 (OMIM #605588), дилатирана кардиомиопатија тип 1А (dilated 1A, CMD1A, OMIM #115200), Dunnigan-тип на фамилијарна парцијална липодистрофијатип II (Dunnigan type familial partial lipodystrophy, OMIM #151660) и Hutchinson-Gilford прогериа синдромот (OMIM #176670). Клиничката слика и симптомите кај автосомните доминантни заболувања варираат од пациент до пациент. Колку симптомите ќе бидат изразени, зависи од нивото на екпресија на доминантниот мутиран ген. Оваа појава се нарекува варијабилна екпресивност. Во некои случаи мутираниот ген фенотипски слабо или воопшто не доаѓа до израз, а со тоа индивидуата има мали нарушувања или, пак, е сосема нормална. Ова настанува поради интеракција на мутираниот ген со некои други гени или, пак, под дејство заболен на фактори од надворешната средина. Слика 124 Родословно стебло, пример за При поставување на дијагноза кај овие автосомно доминантно наследување заболувања, неопходно е да се земат 117 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски во предвид и можностите за варијабилност. Покрај тоа што доминантните автосомни мутации се пренесуваат од генерација до генерација, истите можат и да се стекнат, односно да се новонастанати (de novo). Така кај Фациоскапуларнохумерална мускуларна дистофија (Facioscapulohumeral muscular dystrophy, FSHD, OMIM#158900) 10-30% од пациените имаат de novo мутации. Кај овие пациенти делецијата на субтеломерниот дел од хромозомот 4 е стекната и истата не е присутна кај нивните родители. Во некои случаи автосомните доминантни заболувања се забележуваат во хомозиготна состојба, односно двата алела се мутирани. Ваквата состојба настанува кога и двата родители се хетерозиготни за мутацијата. Ефектите од хомозиготната состојба можат да бидат изразени со потешки симптоми на болеста и притоа се манифестираат порано од вообичаено. Таков е примерот за ахондроплазија (achondroplasia, OMIM#100800) или фамилијарна хиперхолестеролемија (familial hypercholesterolemia, OMIM #143890). Во некои случи автосомното доминантно наследување зависи од полот. Така, и покрај тоа што болеста се наследува автосомно доминантно, фенотипскиот ефект се забележува најчесто кај машките или, пак, најчесто кај женските индивидуи. Како пример е фамилијарниот канцер на дојката или овариумите од кои најчесто заболуваат жените, а се наследуваат со мутираните BRCA1 или BRCA2 гени. Значи, во овој случај мутираниот ген може да се пренесе од таткото или од мајката, а притоа фенотипски да дојде до израз само кај женските деца. Слично на ова е и со наследувањето на фамилијарниот канцер на простата, каде што и двата родители се преносители, меѓутоа машките деца заболуваат. Автосомно рецесивно наследување Рецесивните белези или заболувања доаѓаат до израз само кога двата мутирани рецесивни гени се во хомозиготна состојба. Индивидуите кои се хетерозиготни се здрави, без видливи знаци дека го поседуваат рецесивен мутиран ген. Ваквите индивидуи се вели дека се преносители на мутацијата, а со тоа и на болеста. За разлика од автосомните доминантни, овие заболувања многу потешко се следат низ родословното стебло на една фамилија. Ризикот за детето да наследи рецесивно автосомно заболување е 25% само доколку родителите се хетерозиготни за таа мутација (преносители). Во случај кога едниот родител е заболен од автосомно рецесивно заболување, а другиот е преносител, веројатноста детето да заболи е 50%. Неретко, мутациите на различни гени се причина за еден ист фенотип. На пример, нарушениот слух со генска етиологија се поврзува со мутација на повеќе од 30 гени. Се работи за рецесивно заболување. Поради социјални причини, дружење и образование во опкружување со останати луѓе со слична попреченост, луѓето со нарушен слух имаат тенденција да склучуваат бракови помеѓу себе. Многу често се случува децата кои потекнуваат од двајца родитела со нарушен сух да имаат нормален слух. Причина за ова е што родителите поседуваат мутации на различни гени, а децата се хетерозиготни за двете мутации. Рецесивните заболувања се јавуваат и кога се присутни Слика 126 Пример за наследување на две различни мутации во еден локус. автосомно рецесивно заболување 118 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Притоа, едниот локус кој потекнува од таткото има една мутација, а другиот локус кој потекнува од мајката има друга мутација. Индивидуата носител на овие две мутации не можеме да кажеме дека е хомозиготна. Како и да е, бидејќи и двете мутации ја нарушуваат функцијата на двата алела, крајниот резултат е идентичен, односно рецесивната мутација доаѓа до израз и е причина за заболувањето. Типичен пример за оваа состојба е β-таласемијата (OMIM #613985), кај која се забележуваат многу различни типови на мутации во β-глобинскиот ген. Автосомните рецесивни болести најчесто се среќаваат кај деца кои потекнуваат од родители кои се во крвно сродство. Тоа е и главната причина за забрана на формирање на семејства на маж и жена кои се во крвно сродство. Полово-врзано наследување (наследување поврзано со гени лоцирани на X или Y хрмомозомот) Својствата кои се наследуваат од гените кои се лоцирани на половите хромозоми Х и Y се вели дека се наследуваат полово-поврзано. Долку генот е на Х хромозомот е Хповрзано наследување, а доколку е на Y е Y-поврзано наследување. Х-поврзаните заболувања, вообичаено, се среќаваат само кај машките индивидуи. Доколку машката индивидуа има мутиран ген на Х хромозомот, тој е хемизоготен за тој алел. Женските индивидуи кои имаат еден мутиран ген се здрави, меѓутоа го пренесуваат мутираниот ген во следната генерација. Затоа често за овој тип на заболување се вели дека женските ја пренесуваат болеста, а машките заболуваат. Доколку таткото е здрав, а мајката преносител, ризикот синовите да бидат заболени се 50%. Женските деца од овие родители ќе бидат здрави, со тоа што 50% од нив ќе бидат преносители. Најчести болести кои се пренесуваат на овој начин се хемофилијата од тип А (OMIM #306700) и Душен мускуларната дистрофија (OMIM #310200). За начинот на пренесување на хемофилијата знаеле Евреите уште пред 2000 години. Во историјата е познат примерот со Слика 127 Разделување на Х-поврзаните англиската кралица Викторија која преку алели при Х-поврзано рецесивно наследување. своите ќерки ја пренела болеста во Со Xr е означен хромозомот на кој се наоѓа шпанската и руската кралска фамилија. мутираниот ген Доколку таткото е заболен, а мајката е преносител и женските деца можат да бидат заболени, како што е прикажано со пример во родословното стебло претставено на слика 128. Многу поретко се среќава женските индивидуи да бидат хомозиготни за некој Х-поврзан мутиран ген, а со тоа и да бидат заболени. Како типичен пример за ова е далтонизмот за зелено и црвено (OMIM #303800 и #303900). Болест која се јавува поради мутации на OPN1MW генот кој го кодира зелениот пигмент и OPN1LW генот кој го кодира црвениот пигмент во фоторецепторите на окото. Поради високата фреквенција на овој мутиран ген во хуманата попиулација, 8% од мажите и 0.5% од жени не можат да ги разликуваат зелената и црвената боја. Оваа болест кај жените се наследува кога двата родители ја поседувале оваа мутација или, пак, еден мутиран алел наследуваат од едниот родител, а другата мутација ја стекнуваат de novo. 119 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Кај женските индивидуи хетерозиготни за Х-поврзани мутации понекогаш се забележува благ или мозаичен фенотип. Таков е примерот со Х поврзаниот окуларен албинизам од тип I (OMIM #300500) кој се јавува пор ади мутација на генот GPR143. Машките, кај кој е мутиран овој ген, имаат недостаток на пигмет во окото, додека женските кои се хетерозиготни, имаат мозаична заболен депигментација. Друг случај на носител манифестација на болеста кај хетерозиготни женски индивидуи Слика 128 Х поврзано наследување. Во примерот е доколку дојде до неправилна таткото е заболен, а мајката преносител на инактивација на Х хромозомот на болеста кој се наоѓа мутираниот ген. Во многу ретки случаи е забележано Х-поврзано рецесивно заболување, како Душен мускуларна дистрофија кај жени кај кои недостасува еден Х хромозом. Х-поврзано доминанто наследување е појава при која мутиран ген на Х хромозомот е доминантен и во хетерозиготна состојба е причина за настанување за одредено заболување. Во случај доколку мајката е преносител на мутација и машките и женските деца имаат 50% шанси да бидат заболени. Ваквиот начин на пренесување многу личи на автосомно доминантно наследување. Разликата е доколку таткото е преносител, тогаш само женските деца имаат 50% шанса да бидат заболени. Машките деца ќе бидат здрави бидејќи го наследуваат Х хромозомот од мајката, која во случајов има нормалел алел. Примери за овој тип на наследување се Х поврзаниот хипофосфатемичен рахитис или уште познат како витамин Д-резистентен рахитис (OMIM #307800) кој настанува поради мутација на PHEX генот, Х поврзаната форма на Charcot-Marie-Tooth болеста CMTX1 (OMIM #302800) поради мутација на GJB1 генот и Rett синдромот (OMIM #312750), кој е поврзан со мутација на MECP2 генот. Кај одреден тип на заболувања, кои се наследуваат на овој начин, се забележува и леталитет кај машките плодови за време на ембриналниот развој проследен со предверемени абортуси. Поради тоа, доколку мајката е носител на дивиот, немутираниот ген, 1/3 од децата ќе бидат женски заболени, 1/3 ќе бидат женски здрави и 1/3 ќе бидат машки здрави. Како пример за ова наследување е Х – поврзаната перивентрикуларна хетеротопија (X-linked periventricular heterotopia, OMIM #300049) како последица на мутација на генот FLNA. Y-врзано наследување е наследување кое е поврзана со ген кој се наоѓа на Y хромозомот. Ова наследување се пренесува само преку таткото, притоа сите синови ќе ја поседуваат мутацијата и ќе бидат заболени, а болеста ќе отсуствува кај сите ќерки. Парцијално полово-поврзано наследување (псеудоавтосомно наследување) се поврзува со гени кои се наоѓаат на хомологните делови од краткиот крак на хромозомот Х и на Y хромозомот. Овој хомологен дел од хромозомите се вика псеудоаутозомен регион и содржи по два генски алела за секој белег. При кросинговер мутираниот ген во овој регион може да преминe од Х на Y хромозомот и обратно. Притоа се овозможува и пренесување на болеста од татко на син, што многу наликува на автосомно доминантно наследување. Пример за овој тип на наследување е многу ретката болест Leri-Weil дисхондростеосис (dyschodrosteosis, OMIM #127300) која настанува со мутација на генот SHOX кој се наоѓа на Х хромозомот или SHOXY на Y хромозомот. 120 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Наследување Автосомно доминантно Автосомно рецесивно Х-поврзано рецесивно Х-поврзано доминантно Y-поврзано заболување Главни карактеристики Еднакво заболуваат и машките и женските Болеста се забележува во повеќе генерации Се пренесува подеднакво и од мајката и од таткото и на машките и на женските деца Еднакво заболуваат и машките и женските Болеста се јавува спорадично, обично, во една генерација Се јавува кај деца од родители кои се во крвно сродство Заболуваат најчесто машките Се пренесува преку здрава мајка Не може да се пренесе од татко на син Заболуваат и машките и женските, притоа поголема е фреквенцијата на болни женски Болеста кај женските е во поблага форма Таткото ја пренесуваат болеста само на ќерките Заболуваат само машките Таткото ја пренесува болеста само на синовите 121 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски АТИПИЧНИ МОДЕЛИ НА НАСЛЕДУВАЊЕТО-НЕМЕНДЕЛОВО НАСЛЕДУВАЊЕ Пенетрантност и експресивност При класичното Менделово наследување фенотипот секогаш го следи генотипот. Меѓутоа, доколку се анализира родовното стебло на една фамилија ќе се забележи дека за некои фенотипови ова правило секогаш не важи. Односно, кај две индивидуи се забележува различен фенотип и покрај тоа што тие имаат исти алели. Притоа фенотипот може потполно да изостанува или, пак, да е изразен во различен интензитет. За да се објаснат различните фенотипови кои потекнуваат од еден ист генотип, се користат поимите пенетрантност и експресивност. Пенетрантност го дефинира процентот од индивидуите со ист генотип кај кои соодветниот фенотип ќе дојде до израз. Како пример за комплетна пенетрантност е Хантингтовата болест. Сите индивидуи со мутација на HTT генот во одреден период од животот ќе развијат карактеристичен фенотип на болеста. Од друга страна кај фамилијарниот рак на дојката, кое е, исто така, доминантно автосомно заболување, има некомплетна пенетрантност. Утврдено е дека кај 80% од женските индивидуи со мутација на BRCA1 генот ќе се развие рак на дојката. Слични пример за парцијална пенетрантност се и автосомно доминантната постакцијална полидактилија која е поврзана со мутација на GLI3 генот и различните типови на остеогенесис имперфекта (osteogenesis imperfecta) кај кои се мутирани COL1A1 и/или COL1A2. За разлика од пенетрантноста каде се набљудува присуството или отсуството на фенотипот, експресивноста го дефинира степенот на изразеност на фенотипот при одреден генотип. Притоа фенотипот или симптомите поврзани со одредена мутација кај едни индивидуи можат да бидат послабо изразени за разлика од други каде што се повеќе изразени. Кај група на пациенти со Марфанов синдром (мутација на FBN1) симтомите се изразени во блага форма која се карактеризира со висок раст и несразмерно долги прсти, а кај други во потешка форма каде се забележуваат и кардиоваскуларни промени. Генетските мутации покрај тоа што можат да се јават со варијабилна пенетрантност, можат истовремено да имаат и варијабилна експресивност. Како пример повторно ќе ја земеме наследната полидактилија кај која покрај варијабилна пенетрантност, се среќава и варијација во симптомите. Односно, полидактилијата може да е присутна на една или двете раце и/или нозе и, притоа, дополнителниот прст може да е потполно развиен или, пак, да е рудиментиран. Варијабилна пенетрантрност Варијабилна експресивност Варијабилна пенетрантност и експресивност Слика 129 Шематски приказ на наследување на гени со варијалбилна пенетрантност, варијабилна експресивност или комибинација на двете 122 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Конкретните причините за варијабилната пенетрантност и експресивност најчесто не можат дирекно да се посочат и нивниот механизам детално да се објасни. Се смета дека најчести причинители за оваа појава е влијанието на дополнителни ген/и (гени модификатори), алелски варијабили и влијанијата од надворешната средина. Некомплетна доминантост (Интермедиерно наследување) Покрај вообичаеното доминанто или рецесивно наследување за некои карактеристики се забележува и интермедиерно наследување. Станува збор за хертерозиготни алели кај кои ни еден од двата гена немаат фенотипска доминантност. Односно хетерозиготната состојба резултира со фенотип кој е помеѓу двата фенотипа кога алелите се во хомозиготна состојба. Интермедерното наследување за првпат е опишано во 1905 год. од Карл Коренс (Carl Corens) кај растението Marabilis jalapa. Доколку хомозиготни растенија од овој вид кои имаат бела боја на цветовите се вкрстат со растенија кои имаат црвена боја на цветовите, во F1 генерацијата ќе се добијат растенија со виолетови цветови. При самоопрашување на растенијата од F1 генерацијата, односно две растенија со виолетова боја на цветовите, во F2 генерацијата ќе се добијат цветови со црвена, виолетова и бела боја на цветовите. Притоа, соодност на овие цеветови ќе биде 1:2:1. Како што може да се забележи, овој сооднос се разликува од 3:1 соодносот на фенотипови кој е карактеристичен во F2 генерацијата Слика 130 Интермедиерно наследување (некомпри класичното Менделово плетна доминантност) монохибридно вкрстување. Некомплетната доминантност на молекуларно ниво се базира на недостаток на функционален протеин поради еден од алелите. Во овој случај станува збор за недостаток на пигментен протеин од алелот кој потекнува од растението кое има цеветови со бела боја (на сликата бр. 130 обележан со CW). Кај хетерозиготно растение (CRCW) има само еден функционален алел (CR) и тој е способен да произведе само 50% од протеинот неопходен да се постигне црвената пигментација на цветот. Поради ова цветовите се виолетово, а не црвени. 123 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Генетска антиципација Генетска антиципација е појава при која симптомите на некое генетско заболување во секоја наредна генерација се јавуваат порано од претходната. Покрај намалувања на возраста на која се забележуваат првите симптоми кај децата од заболени родители, многу често болеста се манифестира и со потешка и покомплексна клиничка слика. Најчесто станува збор за невролошки или невромускуларни заболувања како што се фрагилен Х синдром (fragile X syndrome, OMIM #300624), Хантингтонова болест (Huntington diseases, OMIM #143100), спиноцеребрална атаксија тип I (spinocerebellar Слика 131 Молекуларна основа на заболувањата каде ataxia type I, OMIM #164400), и се забележува генетска антиципација. Зголемување миотонична дистрофија (мyotonic на тринуклеотидните повторувања во секоја последователна генерација dystrophy, OMIM #160900). Сите погоренаведени заболувања во основа имаат заеднички молекуларен механизам. Во близината или во самиот ген, кој е инволвиран во дадената болест, се наоѓа тринуклеотидно повторување кое има тенденција да се зголемува при мејотската делба. Кога повторувањата ќе достигнат одредена големина, целиот локус станува нестабилен и е причина за мутацијата на генот, а со тоа и појавата на патолошкиот фенотип. Кај Хантингтон болеста и спиноцеребралната атаксија се присутни CAG повторувањата лоцирани во протеин кодирачка секвенција на соодветните гени. CAG ја кодира аминокиселина глутамин и со секое зголемување на бројот на CAG повторувањата се зголемува и бројот на глутамини во кодираниот протеин. Кај фрагилниот Х синдромот во 5` UTR на генот FMR1 се наоѓа повторувачка CGG секвенција. Со зголемување на бројот на овие тринуклеотиди настанува репресија на генот, а со тоа и негова нарушена фунција. Кај миотоничната дистрофија тип I, CTG повторувањето, кое е причина за настанување на болеста, се наоѓа во 3` UTR на генот DMPK. Зголемувањето на бројот на ова повторување придонесува да се создаде мутирана формана DMPK, која, пак, од своја страна индуцира неправилен сплајсинг кај неколку таргет гени. Хантингтонова болест е автосомно доминантно заболување кое се каратеризира со хореа, абнормални неволеви грчеви, деменција и прогресивна загуба на способноста за осознавање. Како причина за заболувањето е мутација во првиот ексон на генот HTT предизвикана од амплификација на CAG провторувања. Нормално, секоја здрава индивидуа има од 15 до 20 CAG повторувања. Болеста настанува доколку бројот на повторувањата се зголеми над 35. Притоа, некомплетна пенетрантност се забележува кај индивидуите носители на 36 до 39 повторувања. Интересно е да се напомене дека секвенцијата која се повторува е прилично стабилна, Слика 132 Зависноста на големината на CAG односно не се зголемува, доколку се повторувањата и фенотипот кај Хантингтон наследува од мајката и обратно е болеста. Индивидуата е нормална доколку има нестабилна и има тенденција на помалку од 27 повторувања. Над 35 зголемување доколку потекнува од повторувања се јавуваат патогените ефекти 124 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски таткото. Мутираниот HTT ген продуцира протеин кој поради зголемениот број на глутамин станува нерастворлив и формира токсични агрегати во клетката. Спиноцеребрална атаксија тип I е наследно прогресивно невродегенеративно заболување кое се каратеризира со атаксија, нарушувања на говорот (дисартрија, dysarthria) и прогресивна булбарна дисфункција. Причина е мутација, односно зголемување на CAG повторувањата во генот ATXN1. Вообичаено, здравите индивидуи имаат 19 до 36 повторувања. Симптомите се појавуваат кај пациентите со 42-81 повторувања. Повторувањата се прилично нестабилни и имаат тенденција на зголемување особено кога се пренесуваат од таткото. Симптомите на болеста и времето кога се појавуваат зависат од бројот на повторувањата, колку пациентот има повеќе повторувања толку симптомите се јавуваат порано. Фрагилен Х синдром е често наследно заболување кое се карактеризира со пречки во менталниот развој. Се јавува кај едно во 4000 машки и 1 во 8000 женски деца. Причина е мутација во 5` UTR регионот на FMR1 генот кој е сместен на Х хромозомот. Мутацијата овозможува хиперметилираност на регулаторниот сегмент од генот која ја супресира неговата транскрипција. FMRP се врзува за иРНК и овозможува нејзин транспорт од нуклеусот до дендритите на нервната клетка. Во негова отсутност не доаѓа до формирање и развивање на синапсите помеѓу нервните клетки. Здрави индивидуи, вообичаено, имаат од 5-44 CGG повторувања, а заболувањето доаѓа до израз доколку индивидуата има повеќе од 55 повторувања. Мутацијата со 45 до 54 повторувања се смета за премутација. Кај женските индивидуи носители на целосна мутација доколку симптомите се развијат (во 50% од случаевите) се многи поблаги за разлика од кај машките. Нестабилноста и променливоста на повторувачкиот сегмент кој подлежи на мутации придонесува за нетипични пренесувања на ова Х-поврзано заболување. Притоа доколку мајката е носител на премутиран ген, може истиот да го пренесе на своите ќерки во иста, премутирана соостојба, или, пак, да го пренесе во целосна мутирана состојба (со зголемен број на повторувања). Доколку мајката е носител на целосна мутација (над 55 повторувања) истата ќе ја пренесе на половина од своите синови кои ќе заболат и на половина од своите ќерки, кај кои шансите се 50% да се развие патоген фенотип. Миотонична дистрофија е автосомно доминантно заболување кое се јавува кај 1 на 7500 индивидуи. Станува збор за едно од најчестите наследни невромускуларни заболувања кое се карактеризира со прогресивно мускулна слабост и атрофија, миотонија, катаракта и срцеви проблеми. Генетската основа на ова заболување е зголемен број на CTG повторувања во 3` UTR на генот DMPK. Вака мутираниот ген влијае на сплајсингот на останатите гени вклучувајки го и CLCN1 генот кој, пак, е директно инволвиран во миотонијата кај пациентите. Здравите индивидуи имаат од 5 до 37 повторувања. Индивидуите кои имаат од 37 до 49 се смета дека имаат премутиран алел и истите имаат голема веројатност да пренесат мутиран ген (дополнително експандиран) на своето потомство. Индивидуите со повеќе од 50 повторувачки триплети ќе развијат одредени симптоми на болеста најчесто од 20 до 30 година од животот. 125 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Мозаицизам Генерално, секоја соматска клетка во еден организам поседува иста ДНК, односно ист генотип. Понекогаш група на клетки, клеточни линии, ткива и органи поседуваат клетки кои имаат различен генотип. Состојбата при која организмот поседува клетки со различен генотип се вика мозаицизам. Доколку се земе во предвид фреквенцијата со која настануваат генетските мутации и „неспособоста“ на клетката секогаш да ја репарира (поправи) мутираната ДНК, Слика 133 Мозаицизмот може да биде една од може да се каже дека секој организам во причините за хетерохромија на ирисот кај одреден размер е мозаичен. Како човекот причина за мозаицизмот може да биде мутација на еден ген, промена во поголем генски регион или, пак, аберација на еден или повеќе хромозоми. Доколку соматските мутации настанат рано во ембриналниот развој, тогаш бројот на клетките, ткивата и органите кои содржат мутирани гени ќе биде поголем, а со тоа и мозаицизмот во организмот ќе биде застапен во поголем процент. Колку фенотипски ќе биде изразен мозаицизмот зависи од типот на мутираниот ген, бројот и видот на клетките кои се мутирани и способоста на нормалните клетки да ја компензираат нефункционалноста на мозаичните мутрирани клетки. Нормално, колку е помал бројот на мутираните клетки или со други зборови кажано, колку е помал мозаицизмот толку фенотипски неговиот ефект ќе биде помалку изразени и обратно, колку повеќе клетки се мозаични толку фенотипот ќе биде повеќе изразен. Во некои случаеви мозаицизмот фенотипски воопшто не е изразен. Х- инактивацијата кај женските индивидуи е типичен пример за мозацизам. За време на раната ембриогенеза еден од двата Х хромозоми кај женските индивидуи на база на случајност се инактивира. Притоа, една половина од клетките имаат активен еден Х хромозом кој потекнува од едниот родител, а другата половина од клетките го имаат активен другиот Х хромозом, кој потекнува од другиот родител. Бидејќи двата хромозома можат да носат различни алели од двата родитела, клетките ќе поседуваат различен генотип, а со тоа и организмот ќе биде мозаичен. Доколку има мутација на некој функционален ген на едниот Х хромозом, тогаш инактивацијата е повеќе насочена кон Х ромозомот на кој се наоѓа мутацијата. Друг класичен пример за мозаицизам се туморите, чии клетки содржат бројни мутации споредбено со останатите клетки на организмот. Доколку мозаицизмот е присутен во гаметите, станува збор за гонаден мозацизам. Кај овој тип на мозаицизам фенотипски промени не се забележуваат кај мозаичната индивидуа, туку промените доаѓаат до израз кај потомството кое ќе ги наследи мутациите преку мозаичните гамети. Унипарентерална дисомија Секој дисомичен организам наследува по една хромозомска гарнитура од двајцата родитела. Тоа значи дека во еден хомологен хромозомски пар еден хромозом потекнува од едниот родител, а другиот од другиот родител, а со тоа двата алела на еден ген потекнуваат од двата родитела. Во ретки случаи еден ген, генски регион, цел хромозом или целиот генотип потекнува од еден родител. Таквата појава се нарекува унипарентерална дисомија. Притоа, доколку двата алела се комплетно идентични, односно настануваат со удвојување на еден алел од едниот родител станува збор за изодисомија. Состојбата при која двата алела се различни, меѓутоа сѐ уште потекнуваат од еден родител се нарекува хетеродисомија. Најчест механизам со кој се објаснува оваа појава е автокорекција на трисомична клетка. При трисомија, два од трите 126 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски хромозома потекнуваат од еден родител, а третиот од другиот родител. Во некои случаи клетката има способност да се ослободи од вишокот хромозоми. Притоа, доколку во клетката останат два хромозома кои потекнуваат од едниот родител настанува унипарентерална дисомија. Слика 134 Шематски приказ на унипарентерална дисомија Примери за синдроми кои можат да настанат како резултат на унипарентерална дисомија се Ангелманов синдром (Angelman, OMIM #105830, патернал хромозом 15), Прадер-Вилов синдром (Prader-Willi, OMIM #176270, матернал хромозом 15), БаквитВидеманов синдром (Beckwith-Wiedemann, OMIM #130650, патерналхромозом 11), Расел-Силверов (Russell-Silver, OMIM #180860, матернал хромозом 7) и цистична фиброза (OMIM #219700, хромозом 7). Генетски импринтинг Во 80-те години на 20 век е откриено дека активноста на некои генски алели зависи од тоа дали потекнуваат од мајката или таткото, односно активноста зависи од тоа дали генскиот локус се наоѓа на хромозомот кој потекнува од мајката или од таткото. Процесот при кој настанува селективна активност или инактивност на генот во зависност од кој родител потекнува се вика генетски импринтинг. Генетскиот импринтиг е епигенетски процес карактеристичен за цицачите кој се постигнува со различен степен на метилирање на ДНК или, пак, со модификација на хистонските протеини во гаметите. При формирање на нов организам генетскиот импринтинг се задржува во сите соматски клетки во текот на целиот живот. При формирање на нови гаметите настанува „бришење“ на стариот и создавање на нов генетски импринтинг. За помалку од 100-ина гени кај луѓето се знае дека се импринтирани. Импринтираните гени најчесто се групирани во одредени делови на хромозомот, што наведува дека групно се регулираат. Експресијата на овие гени е моноалелна, односно активен е само едниот неимпринтиран алел. Импринтингот е физиолошка појава која игра улога во регулацијата на развитокот на плацентата, ембригенезата, имуниот систем на фетусот. Дополнително на тоа ја оневозможува партеногенезата, односно развивање на плод од неоплодена јајце клетка. Доколку настане мутација на алелот кој не е импрениран и покрај тоа што мутацијата е рецесивна, истата фенотипски ќе дојде до израз. Нормално при рецесивна мутација, функционалниот ген е генот кој не е мутиран. При импринтингот, немутираниот (дивиот) ген е, исто така, нефункционален и не може да ја 127 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски преземе фукција, а со тоа и појава на абнормален фенотип. Едни од најмногу изучуваните генетски нарушувања кои се должат на импринтингот се синдромите на Ангелман и Прадер-Вили. Пациентите со Ангелмановиот синдром се карактеризираат со пречки во менталниот развој, невромускуларни нарушувања, проблеми со говорот, атаксија и конвулзија. Пациентите се во невообичаено „добро расположение“ проследено со неочекувани интервали на смеење. Прадер-Вили синдромот се карактеризира со хипотонија, низок раст, хиперфагија со зголема телесна тежина, низок раст со изразено помали дланки и стопала, хипогонадизам и блага ментална ретардација. И двата синдрома се карактеризираат со голема варијација во клиничката слика. Генетската основа на двете заболувања е во делецијата на хромозомот 15q1113, со тоа што фенотипот ќе зависи од кој родител потекнува делетираниот хромозом. Доколку делецијата потекнува од татковиот хрмозом, ќе се развие Прадер-Вили синдром, а доколку потекнува од мајката ќе се добие Ангелманов синдром. Кај 50-60% од индивидуите со Прадер-Вили се забележува делеција од околу 2 Мb, 15-ина проценти од пациентите имаат субмикроскопска делеција, а кај останатите 30% се среќава матерна унипарентерална дисомија. Се работи за мултигенетско заболување при кое доминантна инволвираност имаат гените SNRPN и MKRN3. Кај Ангелман синдромот 70% од пациентите имаат делеција на 15q11-13, а кај 5% се забележува патерна унипарентерална дисомија. Кај овој синдром речиси секогаш е инволвиран ICR генот. Слика 135 Наследување на Ангелман и Прадер-Вили синдромите 128 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Полигенo наследување Полигенo наследување е наследување на некое својство во кое учествуваат два или повеќе гени. Притоа, инволвираноста на поединечните гени во целокупниот фенотип може да е еднакво или различно. Доколку два гена учествуваат во фенотипот станува збор за дигено (диалелно) наследување, доколку се три за триалелно наследување, а докoлку се повеќе за полигено наследување. Мултипли алелни форми на еден ген и Кодоминантно наследување Вообичаено, еден ген е застепен во повеќе различни алелни форми во една популација, односно мултипли алели (multiple alleles). Интересен е примерот со алелите кои учествуваат во формирањето на бојата на крзното кај зајаците. На сликата 137 е претставена комбинација на четири ралични алела на генот тирозиназа: C (кафеава боја), cch (чинчила), ch (хималајски) и c (албино). Тирозиназата е првиот ензим во процесот на синтеза на меланинот од аминокиселината тирозин. Може да се формираат два типа на меланин, еумеланин (црн пигмент) и феомеланин (жолт, портокалов). Застапеноста на раличните алелни форми условува различно ниво на синтеза на тирозинот. C алелот е доминантен над сите останати алели, кодира целосно функционална тирозиназа, а со тоа и синтеза на еумеланинот и феомеланин. Како резултат на C алелот се добива крзно со кафеава боја. Чинчила алелот е парцијално нефункционален, поради што се Слика 136 Различна боја на крзното добива за нијанса помала количина на црн кај зајаци во едно потомство пигмент, а синтезата на жолтиот пигмент е значително намалена. Поради ова се добива крзно со сива боја. Кај албино зајците c алелот е целосно нефунционален, со тоа нема синтеза на тирозин и крзното на зајаците е со бела боја. „Хималајскиот“ алел (ch) е типичен пример за температурно сензитивен алел. Мутација во овој ген предизвикува структурални промени на тирозиназата и ја прават функционална само при пониски температури. Поради тоа деловите од телото кои се изложени на пониски температути, како опашката, учите, шепите се темно обоени. Слика 137 Алелните форми кои учествуваат во формирањето на бојата на крзното кај зајаците 129 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Наследување на крвните групи од АBО ситемот е, исто така, карактеристичен пример за мултиалелно наследување. Мембраната на еритроцитите содржи три видови карбохидратни антигени: А, B, и О. Синтезата на овие антигени е поврзана со три различни алалиод кои IA и IBсе доминантни и i кој е рецесивен. Индивидуата која е хомозиготна за ii ќе поседува само О антиген и се класифицира како крвна група О. Индивидуата која има IAIA и IAi алели е крвна група А, а, пак, индивидуата со IBIBи IBi е крвна група B. Доколку, пак, некој ги поседува и двата доминантни алела, IAIB тогаш на Слика 138 Антигени и антитела кои ја детерминираат крвната група од ABО ситемот површината на еритроцитите се присутни и двата антигена, А и B. Овие лица поседуваат крвна група од типот АB. Феноменот кога двата алала се експресираат кога се во хетерозиготна состојба се вика кодоминантност, а видот на наследување на овие карактеристики е кодоминантно наследување. Да разгледаме еден пример на наследување на крвните групи доколку едниот родител е крвна група А и притоа поседува хетерозигони алели IAi, а другиот крвна група B и поседува хетерозиготни алели IBi. Родителот со крвна група А ќе создава гамети кои поседуваат еден од двата алела IA или i алел. Родителот со крвна група B, пак, ќе поседува гамети кои содржат или алел IBили пак алел i. При вкрстување на овие гамети возможни се 4 комбинации односно, комбинација од IAi која ќе резултира со крвна група А, IBi која ќе е крвна група B, IAIB ќе биде крвна група АB и ii која ќе биде крвна група О. Сумирано, во случај од родители со крвна група А и крвна група B, можат да се добијат потомци со четири различни крвни групи, А, B, AB и О. Притоа, нивниот сооднос ќе биде 1:1:1:1. Молекуларна основа во формирањето на крвните групи е во ензимите, гликозил трансферазата, кои се кодираат од овие мултипни алели. Гликозил трансферазата која е кодиран од IA алелот посредува при прикачување на N-ацетил-галактозаминот на карбохидратната основа на антигенот, а, пак, IB алелот ја прикачува галактозата. Кога е присутен само еден вид на алел, тогаш се синтетизира само еден вид на гликозил 130 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски трансфераза, а со тоа се добива и еден вид на антиген. Доколку се присутни двата алела, тогаш двата вида на ензими се синтетизираат, а со тоа на површината на клетките се добиваат два вида на антигени. ii алелите поседуваат мутација во гликозил трансферазата и таа е неактивна. Присуството на антигени на површината на еритоцитите е проследена со присуство на антитела во крвната плазма. Индивидуата која е крвна група А, поседува антитела против крвната група B, односно B антитела, а, пак, индивидуата со крвна група B поседува антитела A. Доколку некој е АB крвна група, во тој случај не поседува антитела ни против А ниту против B и спротивно индивидуата со крвна група О ги поседува и двата типа на антитела А и Б. Ова е особено важно да се знае при трансфузија на крв. Индивидуите можат да примат крв од типот кој го поседуваат, на пример, крвната група А може да се даде на лице кое е крвна група А. Дополнително, крвната група О може да се даде на секој Слика 139 Шематски приказ за наслереципиент бидејќи нејзините еритроцити не дувањето на крвните гупи од ABO поседуваат специфичен антиген, а лицата кои системот се АB можат да примат крв од секој тип бидејќи не поседуваат специфични антитела против ниедна од крвните групи (правилото важи само доколку нема крв од соодветната крвна група). Доколку се трансфузира некомпатибилна крв, на пример, индивидуа која е крвна група А, добие крв од тип B, во тој случај ќе настане интеракција помеѓу антителата (анти B) присутни кај реципиентот со еритроцитите (тип B) од крвта на дарителот. Ова ќе предизвика аглутинација на тренсфузираните еритроцити, а со тоа и до запушување на крвните садови. Мора да се напомене дека постојат и подгрупи на крвните групи и некои од нив, исто така, треба да се земат во предвид при трансфузијата на крв. На пример, крвната група А содржи околу дваесетина подгрупи, од кои А1 и А2 се најчести (99%). Во оваа прилика накратко да се напомене за наследувањето на Rh (Rhesus) факторот. Rh системот на поделба на крвните групи е еден од најкомплексните поради многубројните полиморфни алели кои учествуваат во кодирањето на Rh антигените. Поделбата е базирана од антигените C (C и c), D (D и d) и E (Еи е) кои се кодирани во два различни локуса. Главна улога во детеминирањето на Rh факторот поради неговата имуногеност има D антигенот кој е кодиран од генот D. Поедноставено, индивидуите можат да бидат Rh позитивни (Rh+) доколку го поседуваат антигенот D на површината на своите клетки или Rh негативни (Rh-) доколку не го поседуваат D антигенот. Притоа, D антигенот се наследува доминантно, односно индивидуата ќе биде Rh+ доколку поседува барем еден функционален ген D. Rh факторот има клиничко значење при трансфузија на крв и при хемолитички заболувања кај новороденчињата. Хемолитичка болест кај новороденчињата може да настане поради некомпатибилност во Rh факторот помеѓу мајката и плодот, односно мајката е Rh- , а фетусот е Rh+. Во оваа ситуација, наследувањето на Rh факторот, односно функционалниот ген D е од таткото. Кога Rh негативна мајка е бремена со Rh позитивен плод ќе создаде антитела против антигенот D поради тоа што ќе дојде во контакт со еритоцитите од плодот на кој е присутен D антигенот. Создадените антитела можат да ја поминат плацентата и во крвотокот на на плодот ќе се поврзат со еритоцитите со што ќе предизвикаат хемолитички нарушувања и анемична состојба. Некомпатибилноста на мајката со плодот, а со тоа појавата на хемолитичка болест кај новороденчињата се превенира со администрација на Rh антитела кај мајката за време и веднаш после бременоста. Целта е антителата да реагираат со D анигенот, а со тоа и да спречат имун одговор кај мајката. 131 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Генска интеракција при полигенетското наследување Најголем број од фенотипските карактеристики се под влијание на мултипни гени. Притоа, фенотипот директно зависи од интерекцијата на инволвираните гени. Феноменот кога ефектот на еден ген е маскиран, односно потиснат, од дејството на друг ген се вика епистасис (epistasis). Проширена или адаптирана дефиниција за епистасис е состојба при која ефектот на еден ген е зависен од активноста на друг ген. Еден типичен пример за овој тип на интерекција е наследување на бојата на крзното кај стаорците. На сликата 140 е претставен односот на два гена кои учествуваат во формирањето на бојата на крзното. Генот B ја детерминира бојата на крзното. Притоа, доколку алелот е доминантен (B), тогаш бојата ќе биде црна, а доколку е рецесивен, (b) ќе биде кафеава. Од друга страна, пак, епистатскиот ген C дава информација дали пигментотво влакното ќе биде синтетизиран, односно дали тирозиназата ќе биде активна. Доколку доминантниот алел C е присутен, животните ќе бидат пигментирани. Во спротивно, доколку е застапен рецесивниот алел, c пигментацијата ќе изостане и ќе се добијат албино стаорци. Сумирано во дадениот пример, фенотипот од генот B/b ќе биде присутен само доколку е присутен и еден доминантен алел C. Слика 140 Шематски приказ на епистазис Комплемантација (complementation) е појава кога од родители со рецесивен фенотип се добива потомство со нормален или див фенотип. Ова се случува поради тоа што родителите се рецесиво хомозиготни за различни гени кои учествуваат во формирањето на еден фенотип. При вкрстување на овие родители се добива потомство кое е хетерозиготно за двата алела за кои родителите били хомозиготни. Со добиената хетерозиготност се овозможуваат услови за изразување на нормалниот фенотип. 132 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Во многу случаи на моногенетските фенотипови и заболувања кои се пренесуваат по Менделовите принципи на наследување дополнително влијаат еден или повеќе гени. Овие гени се викаат „гени модификатори“ и најчесто влијаат возраста кога заболувањето ќе се појави, тежината на клиничката слика или брзината со која болеста ќе прогресира. aaBB AAbb Гените модификатори можат да делуваат на транскрипцијата и посттранскрипционата модификација на мутираниот ген или, пак, на транслацијата на протеинот и неговата модификација, транспорт, секреција, активација или пак деградација. Како пример ќе ја наведеме Хантинговата болест кај која, освен мутираниот HTT ген, во крајниот фенотип на заболувањето удел имаат и CtBP, GRIK2, и DCHL1 AaBb гените. Слични се и примерите со цистичната фиброза, кај која во тежината на болста улога игра и TGFβ1, или, пак, кај канцерот на дојката каде покрај Слика 141 Шематски приказ на комплементација BRCA2 важна улога игра и полиморфиозмот на FGFR2 генот. Генетска редундантност (gene redundancy) е појава кога инактивација или мутација на еден од повеќето гени кои учествуваат во формирањето на фенотипот не влијае на истиот, односно функцијата на мутираниот ген ја презема друг ген. Притоа, само доколку настане мутација и на двата различни гена ќе настанат и фенотипски промени. Една од најчестите причини за овој феномен е генската дупликација односно присуство на две или повеќе копии на еден ист ген. Мултипни копии на еден ист ген можат да настанат поради најразлични причини кои претходно ги напоменвме. Многу генетски дупликации настанале и за време на еволуцијата на видовите. Притоа, поради акумулација на случајни мутации, генетските копиите најчесто не се потполно идентични. За ваквите гени во геномот на еден организам се вика дека се паралогни (paralogs). Доколку настане мутација на еден од паралогните гени, другиот може да ја преземе неговата функција. Редундантност може да настане и кога функцијата на еден мутиран ген, односно не функционален протеин, ја презема друг функционален протеин. Притоа, функционалниот протеин за да ја компензира нективноста на мутираниот, најчесто е потребно да се синтетизира во поголеми количини. 133 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Мултифакторијално наследување Мултифакторијалното наследување е комплексно наследување при кое фенотипот зависи од интеракцијата помеѓу повеќе различни гени и факторите од надворешната средина. Подвид на мултифакторијално е полигенеско наследување, при кое фенотипот зависи само од активноста на повеќе гени, а не и од влијанието на животната средина. Овој тип на наследување не подлeжи на типичните Менделови правила за наследување и со класичната анализа на фамилијарното стебло истите не можат да се објаснат. Со помош на мултифакторијалното наследување најчесто се објаснуваат кванитативни својства при кои е застапен кумулативниот ефект од активноста на повеќе гени и влијанието од надворешната средина. Како типични примери кои се наследуваат на овој начин се висината, тежината, интелегенцијата (IQ), отпечатоците на прстите, крвниот притисок, бојата на кожата. Изразеноста на квантитативните мултифакторијални фенотипови е карактеристична популациона одлика. На пример, во САД просечната висина за машка е 174 cm, а за женската популација е 162. Притоа, доколку се направи графикон во кој ќе се престават сите вредности, од највисоките до најниските, ќе се забележиме нормална дистрибуција (Гаусова дистрибуциона крива) во која најголем број од анализираните имаат вредности кои припаѓаат во средината на кривата. Мултифакторијално можат да се наследат и карактеристики кои не се од квантитативен карактер, односно фенотипови кои се присутни или, пак, не се присутни кај индивидуата. Пример за ваков тип на фенотипови се дијабетесот, спина бифида (spina bifida), мултипна склероза, епилепсија, шизофренија, вродени срцеви мани, хипертироидизам и др. Голем придонес за разјаснување на степенот на инволвираност на гените и учеството на факторите од животната средина во еден фенотип имаат анализите направени на монозиготни или дизиготни близнаци. Монозиготни или еднојајчени близнаци поседуваат идентична ДНК бидејќи потекнуваат од еден зигот кој може да се подели во два ембриона во првите 13 дена од развитокот. Сѐ уште не се познати кои предиспозирачки фактори допринесуваат за формирањето на монозиготните близнаци, кои се среќаваат во 3-4 случаи при 1000 породувања. Дизиготни близнаци настануваат при оплодувања на две јајце клетки со два сперматозоида. Генетски гледано, дизиготните близнаци делат ист процент на ДНК, односно 50%, како и секои браќа и сестри кои потекнуваат од исти родители. Потребно е да се напомене дека дизиготните близнаци почесто се јавуваат во фамилии каде што претходно имало близнаци, што наведува на генетска поврзаност. Интресно е дека дизиготни близнаци почесто се јавуваат кај постари мајки кои имале претходно повеќе бремености. Забележан е и тренд на близнаци кај мајки кои се повисоки и со поголем индекс на телесна маса (BMI; >30). Во литературата најчесто се споменуваат мутации на два гена поврзани со зголемување на веројатноста за близнаци, BMP15 и GDF9. Појавата на близнаци е многу поретка во Азија (2-7 близнаци на 1000 новороденчиња) во споредба со субсахарска Африка (45-50 на 1000). Во Европа фреквенцијата на близнаци е од 9-20 на секои 1000 породувања. Доколку една фенотипска карактеристика е присутна кај двата близнака станува збор за конкордантни (concordant) близнаци за таа особина, а доколку е присутна само кај едниот близнак се вика дека близнаците се дискордантни (discordant) за таа особина. При изучување на влијанието на надворешните фактори на одреден фенотипот кај близнаците мора да се земе во предвид дека најчесто близнаците делат иста животна средина и имаат исти животни навики. На пример, поради тоа што близнаците најчесто се заедно доколку едниот заболи од некое заразно заболување шансите и другиот да заболи од истото се многу големи. Поради ова, најрелевантни резултати се добиваат при алализирање на монозиготни близнаци кои израснале во различни животни средини. Ова е случај кога близнаците се раздвоени рано во детството и израснале во различни домови. 134 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Доколку некој фенотип е поврзан со еден ген, или, пак, е поврзан со хромозомска абнормалност, конкорданцијата кај монозиготните близнаци ќе биде 100%, додека кај дизиготните ќе биде иста како и помеѓу секои браќа и сестри. Спротивно од тоа, доколку некоја особина нема генетска основа, како, на пример, белег добиен од механичка повреда во тој случај конкордацијата кај монозиготните близнаци ќе биде иста како и кај дизиготните близнаци. Кај мултифакторијалното наследување за својства кои имаат квантитативен карактер конкордацијата нема да биде 100%, меѓутоа ќе биде поголема од конкордацијата кај дизиготните близнаци. Доколку се работи за фенотип добиен со мутација во соматските клетки (пр. канцер клетката), во тој случај конкорданцијата ќе биде иста кај монозиготни и дизиготните близнаци. Во табелата се наведени конкорданцијата на некои фенотипови и заболувања кај моно и дизиготните близнаци. Фенотип Монозиготни (%) Дизиготни (%) Висина 95 52 IQ 90 60 Отпечатоците на прстите 95 49 Бојата на очите 100 40 Висок крвен притисок 30 10 Дијабетес мелитус тип I 30-40 6 Дијабетес мелитус тип II 90-100 10 Канцер 17 11 Епилепсија 37 10 Хипертиреоидизам 47 3 Мултипна склероза 20-30 6 Ревматски артритис 30 5 Шизофренија 45 12 Сенилна деменција 42 5 Спина бифида 6 3 Биполарно растројство 70 15 Псоријаза 61 13 Колку генетската компонента е повеќе застапена во фенотипот, толку конкордацијата кај монозиготните близнаци ќе биде поголема и обратно колку е помала толку повеќе животната средина има влијание на фенотипот. Покрај анализата на монозиготните близнаци и фамилијарните корелациони студии придонесуваат во осознавањето на влијанието на животната средина врз фенотипските карактеристики. Секој од родителите со своите деца има 50% иста ДНК. Ист е и процентот на генетска сличност помеѓу браќата и сестрите. Процентот на сличност во генетскиот материјал опаѓа за 50% во секоја наредна генерација, односно со секое наредно колено. Па така, идентичноста во ДНК помеѓу дедото или бабата со внуците, односно второ колено е 25%, како што е и сличноста со сличноста помеѓу гените на чичкото/вујкото со неговите внуци. Сличноста на ДНК помеќу првите братучеди е 12.5%. Поради ова, ако во некоја фамилија набљудуваме една од особините која се наследува мултифакторијално, ќе забележиме дека истата е застапена пропорционално на генетската идентичност. Сличноста на даден фенотип помеѓу членовите на една 135 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски фамилија се вика корелација. Таа се изразува со скала од 0 до 1, при која доколку фенотипот е иденичен корелацијата е 1, а доколку е комплетно различен за 0. Корелацијата ќе биде поголема за фенотипови кои имаат доминантно генетска основа кај членовите од поблиско сродство. Доколку две индивидуи не се во сродство, во тој случај корелацијата ќе биде идентична како и во генералната полулација. Како пример на неколку фенотипови со кванитативен карактер кои имаат поголема корелација помеѓу членовите на една фамилија се висината со 0.53, IQ со 0.41, отпечатоците на прстите со 0.49. Дополнителен пример за учеството на генетската компонента во еден мултифакторијален фенотип може да се добие при анализа на фреквенцијата на тој фенотип во една фамилија. Фенотип Фреквенција (%) I колено II колено III колено Популација Спина бифида 4 1.5 0.6 0.3 Епилепсија 5 2.5 1.5 1 Шизофренија 10 4 2 1 Биполарно растројство 15 5 3.5 1 136 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Наследувања на мутации во митоходријалната ДНК Секоја клетка има стотици митохондрии и секоја митохондрија содржи десетици копии од митохондријалната ДНК. Митохондријалната ДНК секогаш се наследува по мајчина линија, поради тоа заболувањата кои настануваат поради мутации на митохондриналната ДНК имаат специфичен начин на наследување. Имено, заболена мајка ќе ја пренесе мутацијата на сите свои деца, независно од тоа дали се женски или машки децата. Спротивно, заболениот татко поради мутација во митохондријалната ДНК не може да ја пренесе истата на своите деца. Митохондријалната ДНК е десетина пати повеќе подложна на мутации од нуклеарната ДНК. Доста често се случува една клетка да има митохондрии со различни мутации, а и една митохондрија на различни ДНК молекули да поседува различни типови на мутации. Како клетката се размножува настанува Слика 142 Наследување по мајчина акумулирање на митохондрии со палета на линија. Наследување на заболувања кои различни мутации. И покрај горенаведеното, се предизвикани поради мутации во митохондријалната ДНК нормална индивидуа поседува релативно малку митохондријални мутации (<1%), кои дел се наследени, а дел се стекнати. Една од причините за ова е што при клеточната делба настанува групирање (сеграгацијата) на митохондриите со мутирана ДНК во една клетка ќерка и спротивно сегрегација на интактните митохондрии во другата клетка ќерка. Со овој процес се добиваат хомоплазмични клетки, односно клетки кои ја содржат митохондријалната мутација и клетки кои не ја содржат. Доколку бројот на мутираните митохондриите е поголем, во тој случај не може секогаш да настане потполна сегрегација, притоа се добиваат хетероплазмични клетки ќерки. Акумулацијата на митохондријални мутации во една клетка многу често е последица на промени во нуклеарната ДНК на таа клетка. Како пример е акумулирање на мутациите со стареење на клетката. Фенотипскиот ефект од мутациите ќе зависи од нивниот вид, обем и колкав процент од митохондриите во една клетка содржат мутации. Централниот нервен систем, мускулите, бубрезите и жлездите со внатрешно лачење се најчести ткива и органи во кои доаѓаат до израз нефункционалните митохондрии. Над 60-тина ретки заболувања се индентификувани како последица на мутации во митохондријалана ДНК. Како пример ќе ја споменеме Лебер хередитарната оптичка неуропатија (Leber hereditary optic neuropathy, LHON, OMIM #535000). Кај ова заболување настанува акутно или субакутно билатерално губење на видот, најчесто во втората или третата декада од животот. Како причина се повеќе видови на точкасти мутации. Болеста е со Слика 143 Сегрегација на митохондриите различна пенетрантности притоа во однос на мутираната ДНК која ја Шематски со сино се веројатноста симптомите да се појават кај содржат. претставени митохондриите кои се машките е 40%, а кај женските само 10%. Кога се зборува за заболувања кои се нормални, а со црвено оние кои содржат поврзани со нарушувања на митохондриите мутација 137 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски мора да се напомене дека многу протеини кои се фунционално неопходни за митохондриите се кодираат во нуклеарната ДНК. Мутациите кај оваа група на гени се наследуваат по Менделовите закони за наследување. 138 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски НУМЕРИЧКИ И СТРУКТУРНИ ХРОМОЗОМСКИ АБНОРМАЛНОСТИ Еуплоидија и Анеуплоидија Секоја нормална клетка од еден организам содржи еден или повеќе хромозомски хаплоидни единици (n), односно еден или повеќе хромозомски гранитури. Карактеристичниот број на хромозоми за еден вид се вика еуплоиден број. Кај човекот гаметите имаат по една хаплоидна единица (n=23), а најголем број на соматските клетки се диплоидни (2n=46). Некои високодиференцирани клетки како хепатоцитите и скелетните мускулни влакна се полиплоидни (4n, 8n, 16n). Организмите со повеќе од три хромозомски сета (хаплоидни единици) се нарекуваат полиплоидни организми. Промената на бројот на еден или повеќе хромозоми во една клетка се вика анеуплоидија. Анеуплоидиите најчесто настануваат поради неможноста хромозомите или сестринските хроматиди да се раздвојат за време на клеточата делба. Притоа, клетка ќерка во којашто останал нераздвоениот хромозом ќе има еден хромозом повеќе (2n+1), a другата ќерка клетка ќе има еден хромозом помалку (2n-1). Клетката која има кариотип 2n+1 се вика трисомична клетка, а онаа на која кариотипот и е 2n-1 се вика моносомична клетка. Недостаток на два хомологни хромозоми во една клетка се вика нулисомија (2n-2), а, пак, недостаток на два различни хромозомa се вика двојна моносомија (2n-1-1). Тетрасомија е присуство на 2 хромозома повеќе (2n+2), а пентасомија на 3 хромозома повеќе (2n+3). Анеуплоидна животинска клетка која се размножува има најчесто намалена сопособност за пролиферација и лимитиран животен век. Ова не важи и за канцер клетките кај кои промена на бројот на хрмозомите е една од најчестите карактеристики. Како и да е, зголемената пролиферативна способност на канцер клетките не се базира само на анеуплоидијата, туку и на различни генетски мутации. Организмите кои имаат анеуплидни клетки се викаат анеуплоидни организми. Притоа, организмот може целосно да е составен од анеуплоидни клетки или, пак, дел од клетките да бидат анеуплодни. Во вториот случај станува збор за мозаицизам. Анеуплодини организми најчесто настануваат поради нераздвојувања на хромозомите за време на мејотската делба. Некои од причините се прекини во микротубулите од делбеното вретено или ненавремено, задоцнето, делење на центромерот кој ги поврзува сестринските хроматиди. Анеуплоидните гамети кога ќе се оплодат со нормални хаплодини гамети се добиваат анеуплидни организми. Промената на бројот на хромозомите е проследена и со Слика 144 Шематски приказ на накои видови на промена на бројот на гените. При анеуплоидии полиплодија настанува зголемување на бројот на сите генски алели соодветно со зголемениот бројот на хаплоидните едници. Кај триплодијата има по 3 генски алела за секој ген, а кај тетраплоидијата ќе има по 4 генски алела за секој ген. При анеуплоидијата се намалува или зголемува бројот на генските алели на гените кои се 139 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски лоцирани на хромозомот кој недостасува или, пак, го има во повеќе копии. Фенотипот на една клетка и на еден организам зависи од генската експресијата. Зголемена или намалена присутност на некои гени се одразуваат и во нивоата на нивната експресија. Соматските клетки на човекот и другите диплоидни организми еволуциски се развиле нормално да фунционираат кога имаат два генски алела. При моносомија, гените кои се застапени само со еден алел се експресираат 50% во споредба со останатите кои се застапени со две копии. Спротивно, кај трисомија, гените кои се застапени со три копии се експресираат 150% во однос на нормалните. Овој дисбаланс на генската експресија, независно дали е зголемена или намалена, е причина за промена на фенотипот на клетката или организмот. Доколку се земе во предвид дека на секој хромозом се лоцирани стотици до илјадници гени, тогаш лесно може да се предвиди дека колку е поголем бројот на зафатените хромозоми толку повеќе фенотипот ќе претрпи промени. Затоа и најчесто нумеричките хромозомски аберации се летални за човекот. Притоа ефектот на моносомијата е многу поизразен отколку на трисомијата. Кај човекот се среќаваат неколку трисомии на соматските хромозоми кои не секогаш Слика 145 Ефект од триплоидија на генската екпресија и хомесотазата на протеините. При нормална генска екпресија клетката го регулира количеството и квалитетот на протеините. Притоа, со помош на протеозомите ги разложува протеините кои се непотребни или, пак, неправилно извиткани. При трисомија поради зголемениот број на генски копии настанува зголемена продукција на протеини. Притоа, клетката ги исцрпува механимите за контрола на квалитетот (QC) на протеините и хомеостазата на протеините се нарушува. Ваквиот дисбаланс предизвикува активација на автолизирачките процеси и клеточна смрт се летални за време на ембрионалниот развиток. Тоа се трисомија на 21 првиот хромозом (47, 21+) која е причина за Дауновиот синдром, трисомија на 13 хромозом (47, 13+) која причина за Патау синдромот и трисомија на 18 хромозом (47, 18+) која е причина за Едвардсовиот синдром. Станува забор за помали хромозоми на кои се лоцирани помалку гени во споредба со останатите поголеми хромозоми. Трисомии на сите останати автосомни хромозоми, освен на хромозомот 1, се детектирани кај предвремено абортирани плодови. Се смета дека на хромозомот 1 се наоѓаат гени кои учествуваат во имплантација на ембрионот. При промената експресија на овие гени е оневозможена имплантацијата, а со тоа и развивање на ембрионот. 140 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Моносомијата на автосомните хромозоми кај човекот е секогаш летална. Наједноставно објаснување за леталитетот при моносомија е дека на хромозомот кој е присутен се наоѓа најмалку еден мутиран ген кој е летален. При нормална диплоидна состојба неактивноста на мутираниот ген се компензира со екпресијата на нормален ген од хомологниот хромозом. Интересно е да се напомене дека кај човекот половината од бременостите завршуваат со предвремен абортус во првиот триместер, а, пак, причината за половината од спонтаните абортуси е некоја нумеричка хромозомска мутација. Од ова произлегува дека грешките во мејозата, пред сѐ поради неправилно раздвојување на хромозомите при формирање на гаметите, се многу честа појава. Се смета дека 15% до 25% од гаметите имаат некоја форма од анеуплоидија. Слика 146 Нераздвојување на хрмозомите при првата (лево) или втората (десно) мејотска делба. И во двата случаи настанува формирање на гамети кои имаат еден хромозом помалку или повеќе. При нивно оплодување со гамета која содржи нормален хаплоиден број на хрозмоми се добиваат зиготи кои се диплоидни (или нормални), моносомични (имаат едне хрмомозом помалку) или трисомични (имаат еден хрмозом повеќе) За разлика од анеуплоидијата на соматските хромозоми, анеуплоидијата на половите хромозоми е многу почеста појава. Притоа, се забележуваат различни комбинации на три, тетра па и полисомии на X и Y хромозомите и еден вид на моносомија 45, XO. За да има баланс во генската експресија на гените кои се наоѓаат на X хромозомот, потребно е едниот од двата Х хромозоми кај жената да е инактивиран. Овој процес се вика Х инактивација, или, пак, лионизација според Мари Лион (Mary Lyon) кој прв го опишал. Доколку има полисомија на Х хромозомот, во тој случај клетката го користи истиот механизам на Х инактивација за да ја намали последицата на хромозомската абнормалност. За време на раниот ембрионален развиток, најверојатно од стадиумот кога ембрионот е составен од 16 клетки, започнува процесот на Х инактивација. Притоа, сосема e случајно кој Х хромозом ќе се инактивира, дали тој кој потекнува од таткото или тој кој потекнува од мајката. Кога еднаш Х хромозомот ќе се инактивира, тој останува интактен во текот на останатите клеточни делби. Значи, ќерката клетка ќе има ист инактивиран Х хромозом како и клетката мајка. Инактивираниот Х хромозом го 141 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски формира Баровото тело, наречено по Мураи Бар (Murray Barr) кој прв го опишал кај женските клетки изолирани од мачка. Слика 147 Инактивација на Х хромозомот. После првите неколку делби настанува случајно Х инактивирање на еден од Х хромозомите Полиплоидијата кај луѓето е многу поретка појава во однос на анеуплоидијата. Триплодија (3n) кај луѓето е забележана во 1-3% од оплодените зиготи, најчесто како резултат на диспермија, оплодување на една јајце клетка со два сперматозоида. Триплоидија може да се јави и при оплодување на диплоидна јаце клетка или при оплодување на нормална јаце клетка со диплоиден сперматозоид. Триплоидниот ембрион ретко го достигнува првиот триместер. Доколку дополнителната хромозомска гарнитура потекнува од сперматозоидот најчесто настанува формирање на абнормална плацента, а, пак, доколку триплоидијата потекнува од ооцитот настанува ран спонтан абортус. Во исклучително ретки случаи е забележана триплоидија кај живородени новороденчиња, кои умираат уште во првите денови од животот. За разлика од животните, кај растенијата полиплоидијата е многу честа појава. Доколку настане зголемување на бројот на хромозомските гарнитури со хромозоми кои потекнуваат од ист вид, станува збор за аутополиплоидија. Доколку хромозомските сетови се од различни видови како последица на хибридизација полиплоидијата се класифицира како алоплоидија. Полиплоидијата кај растенијата настанува поради оплодување на една хаплоидна гамета со повеќе хаплодини гамети, оплодување на хаплоидна гамета со диплоидна или полиплодина гамета или отсуство на цитокинеза при митотските делби на оплодената јаце клетка. Слика 148 Видови на полиплоидија 142 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Синдроми предизвикани од хромозомски абнормалности Досега се регистрирани повеќе од 20.0000 различни видови на хромозомски абнормалности, од кои најголем број се многу ретки. Спонтаните абортуси, ембрионалните малформации и канцерогените заболувања се најчеста последица од хромозомиските абнормалности. Во најмалку 10% од сперматозоидите и 25% од зрелите ооците се забележуваат хромозомски абнормалности. Поради нив некаде околу 15-20% од бременостите завршуваат предвремено. Тешко е точно да се утврди точниот процент, меѓутоа се смета дека процентот на зиготи кои регресираат во првите неколку дена е многу голем поради некој вид на хромозомска абнормалност. Трисомии на автосомните хромозоми Даунов синдром (Трисомија на хромозомот 21) го носи името според Л. Даун (Langdon Down) кој прв го опишал во 1866 година. Скоро еден век подоцна, со развитокот на цитолошките методи, било потврдено дека основата на ова заболување е трисомија на 21 хромозом. Се работи за едно од најчестите нарушувања поврзани со нумеричи хромозомски аберации. Во Велика Британија се забележува еден случај на секои 1000 бремености (1:1000), а во САД е дури и почесто, 1:800. Најчестите симптоми се: мускулна хипотонија, карактеристично косо поставени очи, зарамнет носен корен, плоснато лице, краток врат, мали уши, задебелен јазик, кој има тенденција да испаѓа од устата. На дланките се забележува карактеристична трансверзална бразда и малиот прст е обично пократок. На стапалата има значително поголем простор помеѓу палецот и прстот до него. Кај 45-50% од бебињата се забележуваат конгенитални срцеви малформации, кои се и најчеста причина за рана смртност (15-20%). Лицата со Даунов синдром имаат различен степен на интелектуална попреченост, со IQ кој се движи од 25 до 75. Животниот век на овие индивидуи е од 50-60 години, притоа во подоцнежната доба од животот имаат склоност кон Слика 149. Кариотип на жена со Даунов синдром (47, XX, +21) развивање на Алцхајмерова болест и леукемија. Причината за хромозомската абнормалност се поврзува со мејоза I при формирањето на ооцитите. Трисомијата потекнува од јајце клетката во над 90% од случаите. Важно е да се напомене поврзаноста помеѓу староста на мајката и појавата на Дауновиот синдром. Веројатноста за Даунов синдром е 1:1500 доколку мајката е помлада од 20 години, 1:900 доколку е 30 години, 1:100 на 40 години и 1:30 на 45 години. Поради ова, се препорачува пренатален скрининг на постарите мајки или, пак, доколку се има фамилијарна историја за овој синдром. Покрај трисомија на хромозомот 21 (95%), како причина за Дауновиот синдром (34%) се наведува и Робертсоновата транслокација помеѓу 21 и 14 акроцентрични хромозом. При ова транслокација настанува спојување на долгите q краци на 21 и 14 хромозом и губење на кратките p хромозомски краци. Индивидуите носители на оваа транслокација, доколку е балансирана, се фенотипски нормални, меѓутоа создават гамети кои можат да бидат причина за Даунов синдром во потомството. 143 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 150 Даунов синдром како последица на Робертсонова транслокација. Индивидуа со траслокација 14/21 може да создаде гамети со 6 различни генотипa. Доколку овие гамети се оплодат со нормална гамета се добиваат шест различни фенотипa. Една комбинација е причина и за Даунов синдром Овој синдром се јавува и во мозаична форма (2-3%). Клиничките симптоми зависат од степенот на мозаицизмот. Многу ретко како причина за Даунов синдром е парцијална трисомија на хромозомот 21. При оваа абнормалност само мал дел од долгиот крак на хромозомот 21 е присутен во триплет. Уште поретко се забележани случаи на Даун без никакви видливи хромозомски абнормалности. И покрај интензивните напори, сѐ уште не е утврдено кои гени при трисомијата се причина за синдромот. Интересно е дека трансгенетски глувци, во кои е вграден дел од хуман хромозом 21, демонстрираат проблеми со однесувањето, нарушување во функцијата на ЦНС и конгенитални кардијални проблеми. Покрај трисомија на 21-от хромозом, кај луѓето се среќаваат уште два типа на трисомии на автосомните хромозоми кои не се секогаш ембрионално летални. Едната е трисомијата на хромозомот 13, која е причина за Патау (Patau) синдромот, а другата е трисомија на хромозомот 18 или Едвардсов (Edward) синдром. Треба да се напомене дека зачестеноста, односно ризикот, за појава на овие синдроми, исто така, се зголемува со староста на мајката. Патау синдромот (47,+13) се среќава кај 1:15.000 новороденчиња. Како последица на оваа трисомија се јавуваат изразени развојни проблеми, малформации на централниот нервен систем, проблеми со срцето, очите, дигестивниот тракт, бубрезите, расцеп на устата, непцето, па и вилицата. Новороденчињата со овој синдром најчесто умираат во првите денови или недели од животот. Во 20% од случаите се наведува небалансирана транслокација како причина за овој синдром. Едвардсовиот синдром (47, +18) се среќава кај 1:7.500 новороденчиња, и многу почесто кај абортираните ембриони. Најголем процент (95%) од случаите на трисомија 18 завршува со предвремен абортус. Се карактеризира со изразена ментална 144 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ретардација и кардијални малформации. Дополнително се забележува хипотонична мускулатура, краток стернум, ушите се ниско поставени и неразвиени, дланката е стегната во карактеристичен облик (третиот и четвртиот прст се преклопени со останатите). И овој синдром се јавува во мозаична форма и како целосна или делумна транслокација. Промена во бројот на гоносомните хромозоми Во 40 години на минатиот век за првпат се опишани два синдрома поврзани со промена на бројот на половите хромозоми. Едниот е Клинефелтеровиот (Klinefelter) синдром, кој се карактеризира со присуство на дополнителен еден или повеќе Х хромозоми кај машките индивидуи 47(XXY), 48(XXXY), 49(XXXXY), а другиот е Тарнеров (Tarner) синдром, за кој е карактеристично отсуство на Y хромозомот кај женските индивидуи 45(X). Индивидуите со Клинефелтеров синдром 47(XXY) се карактеризираат со висок раст, долги екстремитети и големи дланки и стопала. Поседуваат значително помали машки полови органи и рудиментирани тестиси неспособни да продуцираат сперматозоиди. Овие индивиди се стерилни. Секундарните полови карактеристики наликуваат повеќе на женски, односно присутна е гинекомастија, заоблени колкови и тесни рамења. Кај пациентите понекогаш се забележува понизок коефициент на интелегенција и абнормални психички и социјални карактеристики. Фенотипот е уште повеќе изразен доколку бројот на дополнителните X хромозоми е поголем. Причина за настанување на оваа хромозомска абнормалност е нераздвојување на половите хромозоми за време на мејозата. Овој синдром се среќава на 1 : 660 родени машки деца. Присуство на Барово телца во клетките на овие индивидуи е добар дијагностички индикатор. Најкарактеристичните фенотипските карактеристики на индивидуите со Тарнеров синдром 45(X) се низок раст, кус врат со изразени кожни набори, широк граден кош и недоволно развиени гради. Женски полови органи се присутни, меѓутоа јајчниците се рудиментирани. Интелегенцијата е вообичаено во нормалните граници. Синдромот лесно се дијагностицира со базична цитогенетска анализа поради отсуството на Барово телце во клетките. Најчеста причина за оваа хромозомска абнормалност е нераздвојување на половите хромозоми во гаметите за време на мејозата. Тарнеровиот синдром се јавува и во мозаична форма, која настанува поради грешки во митозата на соматските клетки. При мозаицизам се забележуваат клетки со кариотип 45(X) и 46(X,Y) или, пак, кариотип 45(X) и 46(X,X). Притоа, фенотипот зависи од процентот на клетките кои се опфатени со хромозомската абнормалност. Тарнеровиот синдром се среќава на 1 во 2000 родени женски деца. Една причина Слика 151 Кариотип на Тарнеров синдром зошто Клинефелтеровиот синдром е почест од Тарнеровиот синдром е дека спонтаните абортуси кај ембрионите со 45(X) кариотип се почести. 145 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски На едно од 1000 новородени женски деца се забележува присуство на еден X хромозом повеќе, односно кариотип 47(XXX). Оваа нумеричка хромозомска абнормалност најчесто нема значајно фенотипско влијание. Носителите, најчесто, не се ни свесни дека поседуваат еден X повеќе. Во поретки случаи се забележува нарушување во развивање на секундарните полови карактеристики, стерилитет, проблеми со говорот и моторните способности на индивидуата и ментална ретардација. Претходно наведените фенотипски промени се уште повеќе изразени доколку бројот на дополнителнии X хромозоми е поголем, како при 48(XXXX) и 49(XXXXX). Јакобсов (P. Jacobs) синдром 47(XYY) се јавува кај машки индивидуи кај кои има еден или повеќе Y хромозоми. Интересно, подетално е опишан од Јакобс во 1956 год. при анализа на кариотипот на затвореници во еден Шкотски затвор. При оваа студија било забележано дека од 315 затвореници за тешки кривични дела 9 имаат кариотип 47(XYY). Овие индивидуи имале изразено висок раст, карактеристично агресивно и насилно однесување, намалена интелегенција и ментални растројства. Треба да се напомене дека оваа хромозомска абнормалност се забележува и кај сосема фенотипски нормални индивидуи. 146 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Структурни хромозомски аберации Поголеми промени во стуктурата на хромозомот проследени со губење или удвојување на дел од хромозомот/те или нивна реогранизација се викаат структурни хромозомски аберации. Структурните нарушувања најчесто настануваат поради еден или повеќе прекини на линераната оска на хромозомите. Краевите на прекинатите делови на хромозомот се нарекуваат реактивни краеви бидејќи имаат тенденција да се спојат со други хромозомски делови. Теломерите се структури на хромозомот кои не дозволуваат вака формираните фрагменти да се спојат со краевите на хромозомот. Доколку настане прекин на хромозомот на едно место, најчесто ензимите кои учествуваат во репарирање на ДНК ќе ги спојат прекинатите делови. Меѓутоа, доколку дојде до истовремен прекин на повеќе делови на хромозомот/ите во тој случај може да дојде до спојување на различни фрагменти и формирање на различни структурни хромозомски промени: делеции, дупликации, инверзии или транслокации. Проценето е дека во просек се случуваат по 55000 прекини на едната верига на ДНК и по 9 прекини на двете вериги на ДНК во текот на 24 часа во секој нуклеус. Делеција е промена при која еден дел од хромозомот недостасува. Доколку недостасува крајниот дел на хромозомот станува збор за терминална делеција. Тие најчесто настануваат поради еден прекин на хромозомот, со што се формираат два фрагмента. Еден фрагмент во кој се наоѓа центромерот и друг помал без центромер. Фрагментот во кој недостсува центромерот понатаму се губи во текот на клеточната делба. Како фенотипски ќе се одрази делецијата зависи од тоа колкав дел од хромозмот е изгубен, колку гени се зафатени и колку истите се важни за функционирање на органзмот. Делециите се релативно честа појава. Едни од покарактеристичните се „cridu-chat“ синдромот кој е предизвикан поради делеција на p кракот на хромозомот 5, „Angelman“ и „Prader-Willi“ синдромите кои се поврзани со делеција на хромозомот 15, а „DiGeorge“ настанува поради делеција на хромозомот 22. Слика 152 Видови на структурни хромозомски аберации 147 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Дупликација е промена при која дел од хромозомот се среќава во повеќе копии. Притоа, дупликациите може да бидат тандемски, кога се лоцирани една до друга или, пак, да бидат дисперзирани кога се одалечени едни од други. Вообичаено, дупликациите фенотипски помалку се изразени од делециите. И овде интензитетот на промените зависи од тоа кој и колкав дел од хромозомот е променет и кои гени се опфатени со аберацијата. Најчесто, ефектот од присуството на три или повеќе копии на еден ген предизвикува помали фенотипски промени отколку недостаток на една копија од тој ист ген. Како пример за дупликација е Charcot-Marie-Tooth (CMT) заболувањето. CMT е периферна невропатија која настанува поради дупликација на краткот крак на хромозомот 17 и во најголем број случаи на генот PMP22. Болеста се карактеризира со губење на сензорните особини проследено со прогресивна мускуларна атрофија во одредени делови на телото (најчесто дисталните делови од ектремитети). Делеците и дупликациите се причина за намален или зголемен број на копии на еден или повеќе гени што, пак, е причина за нарушен баланс во тоталната генска експресија. Инверзиите се класифицираат како хромозомски реорганизации. При овие аберации настанува ротирање на дел од хромозомот за 180°. Според тоа дали е зафатен центромерот при инверзијата се делат на перицентрични и парацентрични. Инверзиите, најчесто, не се проследени со фенотипски промени бидејќи вообичаено не настанува губење на генетскиот материјал. Промени се забележуваат во случај кога местото на прекин на хромозомот е функционален ген или, пак, генот при инверзија се позиционира во поактивен или помалу активен регион. Инверзиите се прилично честа појава, притоа со едноставни цитолошки методи во околу 2% од популацијата лесно можат да се детектираат. И покрај тоа што инверзиите најчесто не предизвикуваат фенотипски промени, можат да бидат причина за создавање на гамети кои содржат палета од различни видови на хромозомски аберации. Доколку при кросиновер-от е инволвиран поголем инвентиран дел, веројатноста да се создадат гамети со хромозомски абнормалии е многу голема. При формирање на синапсите помеѓу хомологните хромозоми настанува Слика 153 Видовина инверзии. Доколку центроформирање на петелка во пределот на мерот не е зафатен со инверзијата станува инверзијата која понатаму е причина за збор за парацентрична инверзија. Периценформирање на абнормални хромозоми. трична инверзија е кога центромерот е дел од инверзијата На сликата 154 е претставена состојба при мејоза во која еден хромозом има парацентрична инверзија. Како последица на тоа, можат да се формираат гамети кај кои се среќаваат ацентричен и дицентричен хромозом. Ацентричниот хромозом понатаму се губи за време на клеточната делба поради неможноста за позиционирање и раздвојување. Дицентричниот хромозом е причина за формирање на дицентричен мост. Притоа двата центромери се движат кон спротивните полови на клетката при што настанува кинење на дицентричниот хромозом и формирање на два хромозома кои содржат делециии од генетскиот материјал кој иницијално бил инвертиран. 148 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Трнаслокација е состојба при која дел од хромозомот ќе се откине и закачи на друг дел од истиот или дуг хромозом. Реципрочна транслокација е кога два различни хромозома ќе си разменат свои делови. Овој тип на транслокација е најчесто балансиран, односно не настанува губење на генетскиот материјал, туку само Слика 154 Инверзии како причина за структурни хромозомски аберации. Поради иницијална инверзија (панелот најгоре) при кросинговер се формира инверзиона петелка поради која се формираат гамети кои се носители на палета на различни хромозомски структурни аберации реорганизирање. Како и кај инверзиите, овој тип на хромозомска абнормалност најчесто не е причина за фенотипски промени. Проблемот настанува при формирање на гаметите, при што се формираат клетки кои содржат небалансирани транслокација, делеции или дупликации. Како најчеста причина за реципрочни транслокации се грешки во мејозата кога се формираат синапсите и помеѓу нехомологни хромозоми. При небалансирана транслокација настанува губење на дел од генетскиот материјал и тие најчесто се фенотипски изразени. Инсерциона транслокација е кога дел од еден хромозом ќе се откине и ќе се спои со некој друг дел од истиот или различен хромозом. За ова се потребни три прекини, два на еден хромозом од каде што ќе се откине дел од хромозомот и еден прекин на местото каде ќе настане инсерцијата. И овие аберации најчесто се балансирани и не се проследени со фенотипски промени. Како и да е, гаметите кои се создаваат од овие индивидуи можат да имаат делеции или дупликции. Робертсонова транслокација настанува со центрична фузија на два нехомологни акроцентрични хромозоми прекинати во близина на центромерот. Притоа, пократките краци од двата хромозома се губат, а подолгите се спојуваат и формираат еден фузиран 149 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски хромозом. Овој тип на транслокација е најчеста кај човекот. Настанува помеѓу хромозомот 13, 14, 15, 21 или 22 и се забележува кај едно во 900 новороденчиња. Слика 155 Робертсонова транслокација помеѓу хромозомите 13 и 14 (rob(13;14) (q10;q10). Во овој пример долгите q краеви се спојувата и формираатеден хибриден хромозом. Кратките акроцентрични фрагменти се губат во тек на делбата. Поради балансираниот карактер на оваа транслокација фенотипскиот ефект изостанува Синдром поврзан со делеција на автосомните хромозоми Има многу примери на дисморфии предизвикана од различни делеции на автосомните хромозоми, меѓутоа само група од нив се класифицирани како генетска основа за некој синдром. За да се вброи како причина за синдром хромозомската абнормалност, потребно е да се јавува во ист хромозомски сегмент, да предизвикува слични промени кај пациентите и да е присутна доволно често во популацијата. Популациски гледано, цитогенетски видливо хромозомски делции се забележуваат кај 1 : 7000 новороденчиња. Еден од почестите синдроми предизвикани од делеција е „Cri du Chat“ синдромот. Името го добил од францускиот израз за мачкино мјаукање бидејќи плачот на бебињата многу наликува на него. Се јавува како терминална или интестицијална делеција на пократкиот крак на хромозомот 5. Оваа е ретка делеција и се јавува кај 1:50.000 новороденчиња. Во 10%-15% е последица на родител носител на транслокација. Слика 156 Делови од хромозомот 5p кои Големината на делецијата е варијабилна и се поврзани со одреден фенотип при „Cri фенотипот зависи од делот хромозомот кој е du Chat“ моносомичен. Многу од клиничките симптоми се должат на хаплоинсуфициенција на гените локализирани на 5p15.2, карактеристичниот плач се поврзува со регионот 5p15.3, а менталната ретардација со 5p14-p15. Пациентите со овој синдром имаат проблеми во психофизичкиот развој. Бебињата имаат проблем да ја примаат храната, со карактеристичен застој во растот и развојот и кранофацијални малформации 150 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски МОЛЕКУЛАРНА ОСНОВА НА ГЕНЕТСКИТЕ МУТАЦИИ Развитокот и функционирањето на секој жив организам е контролиран од неговите гени. Збирот на сите гени во еден организам го претставуваат неговиот генотип. Најмала промена во генетската информација може да доведе до нарушување на функционирањето на организмот или, пак, до стекнување на некои нови супериорни карактеристики. Промената, односно диверзитетот на генетскиот материјал, потекнува од два основни процеса: мутации и рекомбинации. Мутација е перменетна структурна промена во ДНК секвенцијата, а рекомбинација е прегрупирање на алелите од различни гени во нови групни комбинации. За полесно да се разбере молекуларниот механизам на мутациите, најпрво да објасниме некои општи поими поврзани со нивната поделба и наследување. Кај едноставните едноклеточни организми ДНК молекулата е сместена во една хромозомска гарнитура. За овие организми се вика дека се хаплоидни. Сложените организми, вклучувајќи го и човекот, поседуваат две копии од секој хромозом и затоа се нарекуваат диплоидни организми. За хромозомите кои го образуваат парот се вика дека се хомологни хромозоми. Притоа, едниот хромозом потекнува од едниот родител, а другиот хромозом од другиот родител. Различни форми на еден ист ген се викаат алели. Бидејќи диплоидните организми имаат хромозомски гарнитути, тие имаат и две копии од секој ген. На пример, нормален ген, или таканаречен див тип, и мутиран ген. Притоа, доколку копиите се идентични, односно алелите се идентични, се вика дека организмот е хомозиготен за тој ген, односно алел, а, пак, доколку се различни, орагнизмот ќе биде хетерозиготен за тој ген. Под рецесивна мутација се подразбира дека и двата алела треба се мутирани за мутантниот фенотип да дојде до израз. Односно, организмот е хомозиготен за мутираниот ген. Некои мутации се јавуваат во доминантна форма. Кај овие мутации само едниот алел е мутиран, што е доволно да дојде до израз мутантниот фенотип. Бидејќи само едниот ген е мутиран, овие организми се хетерозиготни. Рецесивните мутации се проследени со нарушена или изгубена функција на генот. Притоа, мутација може да избрише дел или целиот ген, да ја попречи транскрипцијата или, пак, да ја промени структурата и функцијата на протеинот. Спротивно на тоа, доминантните мутации најчесто се карактеризираат со зголемена генетска активност. Доколку при мутацијата на еден алел се добие продукт кој интерферира Слика 157 Шематски приказ на хомозиготните и со нормалниот и притоа се добие хетерозиготните мутации и можниот фенотип кој мутантен фенотип, станува збор произлегува од нив за доминантна негативна мутација. За некој фенотип да дојде до израз, односно за нормално функционирање потребно е и двата алела да се активни. Доколку дојде до мутирање или деактивирање на едниот алел, во тој случај се добива мутаген фенотип. За овој тип на гени се вика дека се хаплоинсуфиентни. 151 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Наследување на рецесивните и доминантните мутации Во однос на начинот на кој се наследуваат мутациите, може да се заклучи дали станува збор за доминантна или рецесивна мутација. Најпрво да го разгледаме примерот за доминантна мутација кој шематски е прикажан на сликата 158. Во случајов едниот родител има мутантен фенотип и е херетозиготен за мутираниот алел. Овој родител ќе даде два типа на гамети, едни кои ќе го носат мутираниот алел, а другите ќе бидат со нормалниот алел. Другиот родител е со нормален генотип, така што и гаметите ќе го содржат нормалниот ген. При спојувања гаметите, по правилото на случајност во првата генерација (F1) половина од зиготите ќе го наследат мутираниот ген. Бидејќи станува збор за доминантна мутација, сите зиготи кои го поседуваат мутираниот алел ќе го имаат и мутантниот фенотип. Значи, половината од зиготите ќе имаат мутантен фенотип. Рецесивните мутации се наследуваат на поинаков начин. Во примерот од сликата 158 е објаснето вкрстување на еден родител кој има нормален хомозиготен генотип и друг родител кој е носител на рецесивна мутација со изразен мутаген фенотип. Значи е хомозиготен за таа мутација. Нормалниот родител во своите гамети ќе го има нормалниот ген, додека родителот со мутантен фенотип во сите свои гамети ќе го има мутантниот ген. Во првата генерација со спојување на гаметите од двата родители ќе се добијат хетерозиготни зиготи кои фенотипски ќе бидат нормални. Доколку дојде до спојување на два родителa кои се хетерозиготни за рецесивната мутација во потомството, веројатноста да се добие мутантен фенотип во потомството е 25%. Мутантниот фенотип ќе биде присутен само кај зиготот кој е хомозиготен за рецесивниот мутиран ген. Останатите зиготи ќе бидат фенотипски нормални, од кои два ќе бидат хетерозиготни за мутираниот алел, а еден ќе биде хомозиготен со нормален алел. Слика 158 Шематски приказ за наследувањето на доминантни (лево) и рецесивни мутации (б). Со жолто се обележени мутираните алели. При наследувањето на доминантна мутација во F1 генерацијата сите единки ќе го поседуваат мутираниот фенотип. Во F2 генерација соодносот ќе биде 3:1 во полза на мутираниот фенотип. При наследувањето на рецесивната мутација, мутираниот фенотипот ќе дојде до израз во F2 и тоа во сооднос 1:3 Мутациите можат да зафатат помали или поголеми секвенции од ДНК. Многу чест вид на мутациите се базираат на промена на еден базен пар или таканаречени точкасти мутации (point mutation). При овој тип на мутации настанува промена на кодот, а со тоа и до промена на аминокиселинскиот состав на полипептидната верига. Подрастични 152 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски промени се случуваат кога поголема секвенција од ДНК или дел од хромозомот ќе претрпат мутации. Тогаш поголема група на гени можат да бидат зафатени, а со тоа и повеќе функции во клетката или организмот да бидат нарушени. Промени во ДНК молекулата при точкести мутации (point mutations) На молекуларно ниво има три основни типа на точкасти мутации, со супституција, инсерција или делеција на еден нуклеотид во ДНК верига. При супституциските мутации доаѓа до замена на еден нуклеотид со друг. Во зависност од тоа кој тип на нуклеотиди учествуваат во замената, се поделени на транзициски (transitions) и трансверзални (transversions) мутации. При транзициските мутации доаѓа до замена на нуклеотиди кои припаѓаат на иста хемиска категорија. Односно пурински се заменуваат со пурински (A со G или G со A), или пиримидински со пиримидински нуклеотиди (C со T или T со C). Слика 159. Транзициски и трансверзални Трансверзалната замена е помеѓу точкасти мутации нуклеотиди кои припаѓаат на различна хемиска категорија. Односно, пуринска се заменува со пиримидинска (A со C, A со T, G со C, G со T ) или пиримидинска со пуринска база (C со A, C со G, T со A, T со G). При инсерција или делеција доаѓа до додавање или одземање на еден нуклеотид во ДНК секвенцијата. Во некои случаи и може наеднаш и повеќе нуклеотиди да се вметнат или елиминираат од секвенцијата. Точкастите мутации од супституциски карактер можат да предизвикаат неколку типови на структурни и функционални промени на генот: Тивки мутации (silent mutations); При овој тип на мутации и покрај тоа што се менува структурата на кодонот, кодираната аминокиселина останува иста. Ова се должи на тоа дека повеќе различни кодони кодираат информација за иста аминокиселина. Овие мутации немаат никакво влијание на структурата и функцијата на протеинот кој е кодиран од мутираниот ген. Мис-сенс мутации (missense mutations); Кај овие мутации промената на едниот базен пар доведува до промена на кодонот при што се добива кодон кој Слика 160 Шематски приказ на синонимни дава информација за друга мутации аминокиселина. Како оваа мутација ќе делува на генот, односно протеинот, зависи од многу фактори. Претежно, доколку мутираниот кодон дава информација за аминокиселина која има слични својства како и нормалната, во тој случај ефектот од мутацијата ќе биде помал. Овој тип на замена на аминокиселините се вика синонимна супституција (synonymous substitution).Таков е примерот доколку настане замена на глутаминска киселина со аспартанска киселина. Во случајов и двете аминокиселини имаат негативен полнеж и слични странични ланци. 153 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Доколку супституцијата не предизвика фунционални промени на протеиниот се вика дека мутацијата е неутрална. Спротивно на ова е кога настанува замена на една аминокиселина со друга која има изразено различни својства. Ефектот од замената е многу поголем, а со тоа и функционалноста на протеинот може значително да е променета. Оваа замена се нарекува несинонимна субституција (nonsynonymous substitution). Специфичен вид на мутација е кога е мутиран стоп кодон e заменет со друг код кој кодира некоја аминокиселина. При оваа мутација се Слика 162. Шематски приказ на мис-сенс мутации. добива протеин кој е подолг од нормалниот. Неговата функцијата, исто така, може да е нарушена, пред сè поради влијанието на додатните аминокиселини на посттранслационото извиткување на молекулата. Како и да е, ефектот ќе зависи од типот на протеинот и должината на дополнителниот сегмент. Овој тип на мутации се сретнува под различни имиња: „missense-stopcodon”, „non-stop extension“ или „read-through mutation“. Нон-сенс мутации (nonsense mutations); Со овој тип на мутации кодонот за аминокиселината се заменува со кодон кој ја терминира транслацијата. Притоа се добива протеин кој е пократок од нормалниот. Како прераната терминација ќе влијае Слика 162 Шематски приказ на нон-сенс мутации на функцијата на протеинот зависи од тоа каде истата се случила, односно колкав дел недостасува. Колку е помало скратувањето, толку ефектот е помал. Секако ова зависи и од типот на протеинот, во некои случаи доколку недостасува и само една аминокиселина, односно последната, протеинот може да биде нефункционален. Во точкасти мутации се вбројуваат и мутациите при кои се додава или одзема еден нуклеотид во ДНК секвенцијата. Доколку овие мутации се случат во протеин кодирачката секвенција од генот, ќе дојде до поместување на рамката на читање на кодоните при процесот на транслација. Овој тип на мутации се викаат „frame shift“ мутации. Информацијата за синтеза на полипептидниот ланец е кодирана со триплет на нуклеотиди. При транслацијата, триплетите се читаат последователно еден по друг. Доколку дојде до губење на еден нуклеотид во триплетот, тогаш следниот нукелеотид во рамката ќе учествува во формирањето на кодонот во кој се случила мутацијата. Со тоа, пак, сите кодони кои се во 3` правецот ќе се променат. Истото ќе се случи и доколку се додаде еден нуклеотид во низата, редоследот на читање на целата секвенција од инсерцијата, па натаму, ќе се промени. Со менување на рамката на читање, се менува и аминокиселинскиот состав на протеинот. Колкав ќе биде ефектот од овој тип на мутации зависи на кое место истата се појавила. Колку повеќе е кон 5` крајот, толку промените се подрастични. 154 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Само да напоменеме дека рамката на читање нема да се промени доколку се вметнат или отстранат три нуклеотиди во секвенцијата. При ваква мутација полипептидната верига ќе добие или изгуби една аминокиселина, меѓутоа редоследот на останатите аминокиселини ќе остане непроменет. Точкастите мутации можат да настанат во и надвор од протеинкодирачките делови од генот. Доколку настанат во регулаторните сегмети на генот, како што се промоторот или енхансерот, функцијата на генот повторно може да се наруши. Во регулаторните делови од генот се врзуваат различни транскрипциони фактори кои ја иницираат или контролираат транскрипцијата. При промена во тие делови се оневозможува поврзување на доменот од ДНК врзувачките протеини. При ова, генот може да не се индуцира или инактивира, или, пак, да се индуцира во несоодветни размери. Може да дојде и до активација на генот во клетки во кој тој, нормално, не е активен. Доколку мутацијата настане Слика 163 Шематски приказ на „Frame shift“ во 5`UTR или 3` UTR на генот може да мутациите. Овие мутации ја менуваат предизвика нестабилност на иРНК или, рамката на читање на иРНК при процесот на пак, да ја оневозможи нејзината транслација. Се случуваат поради инсерција транслација. Мутација во делот на или делеција на еден или два нуклеотида во спојувањето на ексонот и интронот ќе протеин кодирачкиот дел на генот предизвика неправилен сплајсинг на нематурираната иРНК. Доколку мутацијата предизвика смрт на клетката или организмот, се вика дека е летална мутација. Спротивно, мутацијата може да биде причина клетката или организмот да опстане или преживее во дадена средина или, пак, да ги подобри репродуктивните карактеристики. Овие мутации се нарекуваат бенифитарни (beneficial) мутации. Одредена мутација во зависност на околностите може да има негативен или позитивен ефект. Класичен пример е мутацијата на глобинскиот ланец на хемоглобинот која е причина за српеста анамија. Оваа мутацијата има негативен ефект кога е во хомозиготна состојба, меѓутоа во хетерозиготна состојба овозможува индивидуата да има зголемена резистентност на маларија, а со тоа зголемена способност за опстанок во предели каде се среќава ова заболување. Кондиционите мутација фенотипски доаѓаат до израз при одреден склоп на околности, на пример, при одередени фактори на влијание од надворешната средина. Пример се мутациите кои предизвикуваат микроорганизмите да се термосензитивни. E. coli со ваков тип на мутација може да живее и размножува на температура од 33 до 38 °C, меѓутоа не и на температура од 40 до 42 °C, за разлика од дивиот тип на E. Coli кој опстојува на температура од 33 до 42 °C. Реверзибилни мутации се оние мутации кои веќе мутираниот алел ќе го вратат во нормален или див алелен тип. Супресорна мутација е секундарна мутацијата која се случила на различна локација од првичната и придизвикала конвертирање на мутираниот фенотип во нормален. Оваа мутација кога е во истиот мутиран ген се вика интрагена супресорна мутација, а кога е во друг ген се вика интергена супресорна мутација. Кај интергената супресорна мутација најчесто се добива секундарен мутиран 155 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски протеин со зголемена функција кој ја заменува функцијата на примарниот мутиран протеин кој е делумно или целосно нефунцкионален. Мутациите можат да настанат во соматските клетки, соматски мутации и во гаметите, јајце клетките и сперматозоидите, гоносомни мутации. Кога мутациите се во гаметите истите можат да се пренесат на наредното поколение и се викаат хередитарни или наследни мутации. Наследените мутации се присутни во секоја клетка од новоформираниот организам. Соматските мутации се стекнати мутации и не се пренесуваат на наредните поколенија. Истите можат да настанат многу рано во време на ембрионалниот разиток и пак постнатално. Колку клетки ќе ја содржат оваа стекната мутација, зависи од тоа во кој период од животот настанала и во кое ткиво. 156 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Мутагени фактори Мутациите се делат на спонатани и индуцирани според причината кои придонесуваат за нивно настанување. Спонтани мутации се оние кои настануваат поради абнормалности на биолошките процеси во клетката, а индуцирани се оние кои се предизвикани од фактори кои потекнуваат од животната средина. Спонтаните мутации во форма на делеции, инверзии, дупликации и транслокации настануваат при неправилен кросинговер. Неправилна сеграгација на хромозомите или неправилно раздвојување на хроматидите при клеточна делба се причина за хромозомски абнормалности. Грешките кои ги прави ДНК полимераза, односно синтеза на погрешна азотна база при процесот на репликација се, исто така, причина за спонтани мутации. При нормалниот метаболизам во клетката се создаваат соединенија, реактивни оксидативни елементи (ROS), кои можат да регираат со ДНК и да предизвикаат нејзино оштетување или модификации. Танспозомалните елементи, исто така, предизвикуваат генетски промени. Каде и кога настануваат спонтаните мутации е работа на случајност. Притоа, некои гени се повеќе подложни на мутација, а некои се помалку. Нормално, колку генот е поголем, толку шансите да се стекне со мутација се поголеми. Интересно е дека мутациите во некои делови од генот се почести во одност на останатите. Покрај големината и локацијата, на генот на хромозомот игра улога во склоноста кон мутациите. Стапката на мутација се дефинира како веројатност да се појави една мутација во еден ген за време од една клеточна генерација. Стапката на мутација на спонтаните мутации се движи од 1 на 105 до 1 на 109. Истата зависи од видот на клетките или организмите. За пример, стапката на мутација е многу поголема кај вирусите кои имаат РНК како носител на наследната информација, помал кај ДНК вирусите, уште помал кај прокариотите и значително најмал кај еукариотите. Дополнително, митохондријалната ДНК има многу повисока стапка на мутација (2.7×10−5) во споредба со нуклерната ДНК (~2.5×10−8 на еден базен пар за време на една генерација). Разликите се и на генетско ниво. Така, утврдено е дека веројатноста да настанат мутации во гените поврзани со хемофилијата А или ретинобластома се 2×10−5 по гамета во една генерација, а со генот инволвиран во Хантиговата болест се 5×10−6. Според анализата на ДНК на Y хромозомот е утврдено дека на секоја наредна генерација се пренесуваат по 100-200 нови мутации. Мора да се напомене дека зачестеноста на мутациите во сперматозоидите е многу поголема отколку во јаце клетките. Според други пресметки во секоја наредна генерација кај човекот се инкорпорираат од 10 -30 нови мутации. Еден од најчестите мехнизми поради кои настануваат спонтаните мутации е депуринацијата. При овој процес настанува отстранување на пуринот, односно аденинот или гванинот, од молекулата на ДНК. Ковалентната врска помеѓу дезоксирибозата и пуринската база во нуклеотидот понекогаш може да биде полабилна и под дејство на молекулата на водата пуринската база да се одвои од пентозниот шеќер и да се формира апуринско место. Се смета дека во тек на 20 часа се формираат околу 104 апурински места на ДНК молекулата. И покрај тоа што овој број е прилично голем, истите се поправаат при процесот на репарација на ДНК. Доколку апуринското место не се потполни, односно поправи при процесот на репликација, ДНК полимераза на тоа место ќе синтетизира нуклеотид на база на случајност, а со тоа и се создаваат и можности да се инкорпорира мутација. 157 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 164 Депуринизација на гванинот и деаминација на цитозинот Деаминацијата на цитозинот е, исто така, честа причина поради која настануваат спонтани мутации. При деаминација настанува отстранување на амино групата од цитозинската азотна база со што се добива урацил. Деаминацијата, исто така, успешно се отстранува при репарација на ДНК, пред сѐ поради тоа што урацилот нормално не е структурна компонента на ДНК. Доколку деаминацијата не се поправи, при репликацијата на ДНК комплементарно на урацилот ќе се синтетизира аденин, а со тоа и ќе се инкорпорира мутација. Само за потсетување, доколку нормално на тоа место се наоѓа цитозинот, на него комплементарно во новата верига се синтетизира гванин. Посериозен проблем е деаминацијата на 5-метилцитозинот при што настанува тимин. Притоа, репарационите ензими не можат лесно да го препознаат новосоздадениот тимин и да го заменат мутираниот нуклеотид. Појавата на таутомерни изоформи на азотните бази е, исто така, причина за настанување на спонтаните мутации. Кето формата е вообичаена стабилна изоформна состојба во која се наоѓаат гванинот и тиминот, додека амино формата е стабилната состојба во која вообичаено се наоѓаат аденинот и цитозинот. Во мал процент G и T се среќаваат во енолна изомерна форма, а A и C во имино форма. Кога азотните бази се во таутомерните изоформи имаат различен афинитет за комплементарно врзување од вообичаеното. Па така, наместо Т да се поврзе со А, енолната форма на Т има афинитет Слика 165 Начин на индуцирање на мутации при депуринизација (лево) и дезаминација (десно). Во примерот со депуринацијата опишана е делеција на еден нуклеотид во молекулата на ДНК која потекнува од депуринираната верига. При дезаминација настанува супституција на еден нуклеотид во молекулата на ДНК која потекнува од деаминираната верига 158 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 166 Стандардно и абнормално базно поврзување. Поради таутомерни форми на азотните бази настанува поврзување на базните парови кое отстапува од стандардните принципи. Имено, тиминот се поврзува со гванинот наместо со аденинот, или, пак, цитозинот се поврзува со аденинот наместо со гванинот кон G. Слична е состојбата и со имино формата на C кој има афинитет да се поврзе со A наместо со G. Ваквото неправилно поврзување настанува при репликацијата на ДНК и доколку не се отстрани односно поправи, ќе биде причина за инкорпорирање на спонтани мутации во наредните клеточни делби. Палета на физички, хемиски и билошки фактори кои потекнуваат од животната средина можат да предизвикаат оштетување на ДНК. Поради способноста да индуцираат генетски мутации, овие фактори се нарекуваат мутагени фактори. Мутагените агенси можат да ја оштетат ДНК на различни начини. Слика 167 Хемиска основа на инудцирање мутации со 5-бромоурацил 159 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Група на хемиски соединенија структурно и хемиски многу наликуваат на азотните бази кои влегуваат во состав на нуклеотидите. Притоа, има аналози на пиримидинските и аналози на пуринските азотни бази. Карактеристичен пример за базни аналози е 5бромоурацил (5-BU) кој може да се инкорпорира во ДНК наместо тиминот. Исто како и тиминот, 5-BU комплементарно може да се поврзе со аденинот. Проблемот е што 5-BU многу почесто се јавува во таутомерна форма, а како таков се поврзува со гванинот. Ваквото погрешно поврзување е причина за стекнување со мутација во наредната репликација на ДНК. Еден од механзмите со кои хемиските агенси делуваат на ДНК е дирекнта интеракција со ковалентните врски во азотната база. Азотестата киселина има способност за дезаминација, односно да ја замени амино групата со кето група. При оваа реакција цитозинот се трансформира во урацил, а аденинот во хипоксантин. При ДНК репликација новоформираните бази комплементарно се поврзуваат со несоодветни бази што е основа за понатамошно акумулирање на генетски мутации. Имено, новоформираниот U се поврзува со А, наместо C со G. Хипоксантинот Слика 168 Примери за алкилација под дејство на EMS (А), деминација предизвикана од азотеста киселина (Б) и хидроксилација со хидроксиламин (В) комплементарно се поврзува со C наместо со T. Хидроксилацијата на амино групата на цитозинот под дејство на хидроксиаминот е, исто така, процес кој придонесува за инкорпорирање на мутации. Новодобиениот хирдоксиамин-цитозин има тенденција за поврзување со аденинот наместо со гванинот. Друг механизам е со алкилација, односно додавање на метил или етил групи за азотните бази. На таков начин делува етил метансулфонатот (EMS). Некои акридински бои, како профлавинот, имаат способност да се вметнат помеѓу водородните врски на комлементарните нуклеотиди, а со тоа и да ја дестабилизираат спиралината форма на ДНК. Доплнително ваквите промени се причина за точкасти мутации при репликацијата на ДНК. 160 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Помеѓу најчестите физички мутагени агенси се различни електромагнетни и јонизирачки зрачења. Посебно јонизирачките зрачења кои имаат кратка бранова должина и голема енергија како X-и γ-зраците имаат особено изразено мутагено дејство на ДНК молекулата. Овие зраци пенетрираат длабоко во ткивото каде формираат слободни јонски радикали. Создадените реактивни соединенија предизвикуваат прекини на ДНК веригата, а со тоа и услови за точкасти мутации, делеции и поголеми хромозомски оштетувања. Нејонизирачките зрачење, како UV светлината, поради тоа што содржат помалку енергија, не се во состојба да пенетрираат длабоко во ткивата. Поради тоа својот мутаген ефект го манифестираат на површинските слоеви на кожата. Под дејство на UV зраците се формираат димери на тиминот кои интрерферираат со транскрипцијата и предизвикуваат мутации за време Слика 169 Мутации предизвикани од УВ светлина репликацијата на ДНК. Неспорна е ната. Под дејство на УВ светлината се корелацијата со појавата на рак на формираат димери на тиминот кои се причина за кожата и експозицијата на UV настанување на мутации при репликација на ДНК зрачењето. 161 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ГЕНЕТСКИ ИНЖЕНЕРИНГ Со почетоците на манипулацијата на ДНК молекулата, во раните 70-ти години на минатиот век, започнува да се развива една нова дисциплина, генетски инженеринг, која од ден на ден зазема сè поголема практична примена во нашето секојдневие. Способноста да се манипулира ДНК, овозможува услови да се создаваат нови соеви на растенија кои се многу поотпорни и попродуктивни, нови карактеристики кај животните, нови дијагностички техники во медицината и нови технологии за производство на фармацевтски продукти. Генетски инженеринг кај растенијата Со помош на генетската манипулација се создаваат соеви на растенија кои имаат соодветни особини да одговорат на потребите на произведувачот. Притоа, генетскиот материјал, кој се инкорпорира во реципиентот, се вика трансген. Тој може да биде целиот ген или, пак, само сегменти од него. Пред да се развие оваа технологија, фармерите на база на контролирано вкрстување и селекција ги одбирале соевите со саканите карактеристики. Ваквите селекции траеле по неколку десетици години и резултатите секогаш не биле задоволителни. Денеска, голем процент од позначајните индустриски одгледувани растенија, одгледувани во развиените земји, се генетски модифицирани. Така, на пример, 75% од сојата и памукот во САД се генетски модифицирани да се постигне резистентност на хербициди. Со воведувањето на хербицид резистентни соеви, приносите на овие култури значително се подобрени. Слика 170 Генетски инженеринг кај растенијата Сојата, за да стане резистентна на хербицидот глифосат (N-(phosphonomethyl)glycine) е генетски модифицирана со додавање на резистентен ген во овој хербицид. Глифосфатот е ефективен хербицид кој покрај тоа што ги уништува несаканите растенија, ја уништува и сојата со тоа што ја инхибира синтезата на EPSP (5enolpyruvylshikimate-3-phosphate) синтетазата. Овој ензим учествува во биосинтезата на аминокиселините кај бактериите и растенијата. За да се генерира резистентна соја на глифосфат, најпрво треба да се изолира и клонира ген на EPSP синтетазата од бактерии резистентни на глифосфат или, пак, да се додадат додатни копии на генот. 162 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Принципот е едноставен, доколку бактеријата е резистентна, тогаш EPSP синтетазата која ја има не е инхибирана од глифосфатот. Истиот ефект може се постигнува со повеќе алелни копии на EPSP синтетаза, со што се зголемува прагот на осетливост. Изолираниот ген е вметнат во плазмид изолиран од бактеријата Agrobacterium tumfaciens. Овој тумор индуцирачки плазмид (Ti) има способност да ги инфицира сојата, тутунот, доматите и притоа да се интегрира во геномот на домаќинот. Со ова се добиени клетки кои се резистентни на глифосфат, од кои, пак, понатаму се генерирани резистентни растенија. На сличен начин се добиени многу различни генетски модифицирани растенија кои се отпорни на инсекти, климатски услови, имаат подобри нутритивни карактеристики или, пак, имаат атрактивен изглед и вкус. Еден од позначајните примери е „златниот“ ориз кој е модифициран да содржи повеќе β каротин, прекурсорот за витамин А. Авитаминозата А е сериозен проблем во Азија и Африка, па со создавање на ориз богат со β каротин се смета дека ќе се надмине овој нутритивен проблем. Недостатокот на храна и нутритивни елементи се еден од најголемите проблеми на денешницата. Само продуктивно и евтино производство може глобално да ги задоволи потребите. Овие цели без генетското инженерство дефинитивно не можат да се постигнат. За разлика од генетското модифицирање кај растенијата, напредокот на генетското инженерство кај животните е со незадоволителен интензитет. Сè уште, продуктите од ниедно генетско модифицирано животно официјално не се прогласени за безбедни за користење во исхраната на луѓето. Најблиску до пуштање во промет е AquAdvantage пастрмката. Таа е генетски модифицирана со цел да може да расте преку целата година, а не само во пролет и лето како дивиот вид. Така соодносот во големината помеѓу модифицираната и дивата е 2:1. Во тек на десетгодишното испитување на ова генетско модифицирано животно сè уште не се пронајдени докази дека истата е штетна за луѓето или еко-системот. Можеби една од најголемите примени на рекомбинираната ДНК технологија е во производството на биофармацевтски производи. Оваа технологија, генерално, се базира на користење на генетски материјал или, пак, продукти од неговата активност. Како пример за користење на генетски продукти се бројните протеини кои се добиваат со клонирање на соодветниот ген во експресиони вектори и негово интегрирање во микроорганизми или животни. Вака генетски модифицираниот организам го создаваат протеинот во големи количини кој со определените методи се изолира и користи како терапевтско средство. На сличен начин се добиваат и хуманизирани антитела или генетски модифицирани вакцини. Добивање на фармацевтски продукти со помош на генетски инженеринг Рекомбинантни протеини Производство на поголема количина на некој специфичен протеин може да се постигне со помош на генетски модифицирани организми. Со оваа постапка во микроорганизмите, растенијата или животните се вметнуваат експресиони плазмиди во кои е интегриран генот од интерес. Притоа, генот од ваквиот плазмид се експресира, континуирано или кондиционо и се добива саканиот протеин. На пример, доколку станува збор за генетски модифицирани бактерии, поради нивната способност да се експандираат, едноставно и брзо за многу кратко време може да се добие големо количество од саканиот протеин. На ваков начин, релативно лесно и евтино можат да се добијат големи количини на рекомбинирани протеини со фармацевтски својства. Овие продукти се многу побезбедни и поефикасни од продуктите добиени со изолација од ткивата на животните и луѓето. Пред да се развие рекомбинантната технологија, инсулинот, коагулирачкиот фактор VIII или, пак, хормонот за раст се изолирале од 163 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 171 Продукција на хуман инсулин животните или луѓето. Инсулинот се добивал од панкреасот на говедата или свињите, факторот VIII се изолирал од крвта на крводарителите, а хормонот за раст од хипофизите добиени од кадеври. Продуктите изолирани од животни, покрај тоа што се количински ограничени, поскапи, или, пак, недоволно ефикасни поради разликата во аминокиселинскиот состав, многу често и предизвикуваат имуна реакција кај луѓето. Од друга страна, продукти добиени од луѓето претставуваат потенцијален извор за заразни заболувања како хепатитис и СИДА. Од иницијалното производството на инсулинот, во раните осумдесетти години, до денес многу болести се третираат со користење на рекомбиниран протеин. Некои од почесто употребуваните се: коагулативните фактори VIII и IX, еритропоетинот, хормонот на раст, α, δ и γ-интерферонот, интерлеукинот 2, вакцината против хепатитис Б. Иницијално, поголемиот број од рекомбинираните протеини се добивале со експресивно клонирање во микроорганизмите. Така на пример, за да се добие рекомбинантен инсулин, најпрво генот за инсулин е изолиран и клониран од β клетките на Лангенхансовите островца на панкреасот. Оваа секвенца понатаму е вметната во експресионен плазмид кој е трансформиран во E. Coli. Со интеграција на плазмидот, бактеријата започнува да го синтетизира протеинот. Попрецизно, првиот инсулин е добиен со независна експресија на двете инсулински подединици А и Б и нивно спојување во функционален протеин. Понекогаш продукти добиени во прокариотите не се адекватни за примена кај луѓето. Една од причините е посттранслационата модификација на протеините, која се разликува кај бактериите од онаа кај цицачите. Притоа и покрај тоа што протеинот добиен кај бактериите има идентичен аминокиселински состав, поради несоодветната модификација истиот може да е помалку активен или, пак, неактивен. Така на пример, бактериите не можат на полипептидниот ланец да му додадат шеќерна или фосфорна група или, пак, соодветно тридимензионално да го извиткаат за да станат биолошки активни. Во некои случаи забележани се и имуни реакции на протеините добиени од 164 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски микроорганизмите. За да се надмине ова, развиени се еукариотски трансгенетски организми, квасци, растенија и животни, кои создаваат адекватни рекомбинирани протеини за хумана употреба. Како еукариотски домаќини може да бидат клетки или цели организми и соодветно рекобинираниот протеин да се изолира директно од клетките или, пак, од продуктите на животните, на пример млекото. Еден од принципите е генот од интерес да се спои (фузира) со некој ген кој синтетизира протеин кој е составен дел од млекото. Во тој случај, хибридниот протеин ќе се експресира само во млечната жлезда и ќе биде застапен во млекото. Понатаму, со соодветна технолошка постапка, саканиот протеин од млекото лесно и ефтино може да се изолира во чиста состојба. Пример за овој тип на трансгенетски животни е овца која е генетски модифицирана за да Слика 172 Продукција на фармацевтски излачува α1-антитрипсин во продукти во трансгенетско животно млекото. Недостаток од α1антитрипсин ензимот е поврзан со развивање на смртоносна емфизема кај луѓето. За да се добие трансгенетската овца, α1-антитрипсин генот е клониран во плазмид на 3` крајот од промоторот на ген активен само во млечната жлезда за време на лактација (βлактоглобулин). Ваквиот плазмид пронуклеарно е инјектиран во оплодена јајце клетка и истата е имплантирана во сурогат мајка. Добиените јагниња се генотипизирани и размножувани со цел да се добијат хомозиготни животни за трансгенот. Со ова е генерирана овца од која од 1 kg млеко може да се изолираат 35g α1-антитрипсин. На сличен начин е генериран и трансгенетски зајак, кој во млекото секретира αгликозидаза. Антитела добиени со генетски инженеринг Антителата се глобуларни протеини синтетизирани од плазма клетки при имун одговор на некој антиген. Бидејќи се дел од имуниот систем, се нарекуваат имуноглобулини. На антителото се разликуваат: варијабилен дел, кој специфично се врзува за епитопот на антигенот и константен дел, за кој се врзуваат некои од останатите елементи на имуниот систем. Кога ќе настане поврзување антиген со антитело, доаѓа до активирање на неколку различни механизми со кои се неутрализира или уништува туѓото тело. Реакцијата помеѓу антителото и антигенот е високо специфична, односно едно антитело најчесто може да препознае само еден вид на антигени. Со помош на генетското инженерство се создаваат услови за вештачко производство на антитела кои се користат против различни патогени или канцер клетки. Принципот на создавање на моноклонски антитела е со спојување на активирана, антитела продуцирачка Б клетка со имортализирана клетка која има неограничени можности за пролиферација. На овој начин се добива хибридна клетка (хибридома) која 165 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски може да се размножува in vitro и притоа да создава антитела. Со клонално селектирање на хибридните клетки, се добиваат клонови кои произведуваат само еден тип на антитела, моноклонски антитела. Има неколку проблеми кои се јавуваат при производство на овој тип на антитела: еден е краткиот животен век кога се аплицираат кај луѓето, а друг е што секој тип на антигени со својот константен дел не може да индуцира каскада на имуна реакција кај луѓето. Притоа, можеби најголемиот проблем е што имуниот систем на реципиентот ги препознава овие антитела како страни тела. Доколку антителата се добиени од Б клетки на глодачи, што во пракса е во најголем број од Слика 173 Видови на анитела добиени со генетски случаите, тогаш човекот кој ги примил инженеринг овие антитела за терапевтски потреби, истовремено ќе почнува да развива антитела против антителата на глодачите. Овие проблеми можат да се надминат со генетско модифицирање на гените кои учествуваат во градба на антителата. Првата генерација на хуманизирање на антителата е со генетско модифицирање на сегментот од генот кој го кодира константниот дел на антителата. Притоа, секвенца од глодачите се заменува со секвенца на луѓето. Ваквите антитела се нарекуваат хибридни. Во втората генерација хуманизирани антитела, покрај константниот и дел од варијабилниот дел од антителата на глодачите е заменет со хуман. Притоа е оставен само високоваријабилниот регион (complementarity determining regions-CDRs) да потекнува од глодачите. Последната генерација е добивање на хумани антитела со помош на генетски инженеринг. Ова може да се направи на повеќе начини. Еден е со помош на презентирање на протеините со помош на бактериофаги (Phage display). Целата техника се одвива in vitro. ДНК секвенци од варијабилниот дел на антителата се изолираат и клонираат од Б-лимфоцитите. Потоа, истите се презентираат на Слика 174 Постапка за добивање на моноклонски антитела 166 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски бактериофагите и се селектираат според нивната специфичност и сензитивност. Клоновите, кои се носители на саканите варијабилни делови, се експандираат и користат за синтеза на хумани антитела. Втората метода е со користење на трансгенетски глодари кај кои целиот ген за тешкиот и за лесниот ланец на имуноглобулините е заменет со човечки. При имунизација на овие трансгенетски глодачи, се добиваат антитела кои се од хуман карактер. Следна метода е со генерирање на имортални Б-лимфоцити кои имаат способност да пролиферираат in vitro и неограничено да продуцираат специфични антитела. Диференцираните лимфоцити имаат мала или никаква способност за пролиферација. Поради тоа и нивната употреба за in vitro продукција на антитела е незначителна. Меѓутоа, мемориски Б-клетки веќе диференцирани за синтеза на антитела, можат да се изолираат од крвта на луѓето кои ја прележале болеста и со помош на Epstein-Barr вирусот (EBV) да се инфицираат и имортализираат. Слика 175 Различни начини за добивање на хумани антитела. Претставено е добивањето на антитела со помош на трансгенетки глувци кои содржат хуман IgG ген (панел лево) и со помош на изолација мемориски B клетки од пациенит претходно инфицирани со причинителот Вакцини добиени со генетски инженеринг Рекомбинантна ДНК технологија се користи и за добивање на вакцини. Така на пример, ДНК секвенца која носи информација за епитоп на некој патоген или канцер клетка, може со помош на вектор да се внесе во организмот. Притоа, генот од интерес се експресира во клетката, создавајќи протеин кој имуниот систем го препознава како туѓ. На тој начин се создава имун одговор кој треба да го заштити организмот од патогенот. Една од првите вакцини која е добиена со помош на генетско инженерство, е вакцината против hepatitis B вирус. Генот, кој кодира површински протеини на вирусот, се експресионира во квасец. Од културата на квасецот протеинот се изолира и користи за вакцинација. Друг, малку поразличен пристап е со формирање на генетски модифицирани вируси. На пример, гените кои ги кодираат протеините на капсидот на herpes simplex вирусот, можат да се фрагментираат и клонираат во геномот на vaccinia вирус. Рекомбинираниот вирус има способност да навлезе и да се размножи во клетките 167 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски на цицачите. Овој вирус на својата површина има протеини карактеристични за herpes simplex вирусот, на база на кои имуниот систем ќе изгради имун одговор. Рекомбинираниот вирус не е опасен за човекот бидејќи содржи многу мал дел од инфективниот herpes simplex вирус. Со генетско модифицирање може патогените карактеристики на вирусот или бактеријата да се отстранат. Притоа се зачувуваат имуногените карактеристики на микроорганизмот. Со тоа се добиваат соеви кои безбедно можат да се користат за вакцинација. Од неодамна се интензивираа истражувањата за синтетизирање на вакцина во хранителни продукти. Оваа идеја потекнува од потребата вакцината да е достапна до сите региони во светот. Во голем дел од неразвиените земји, имунизирањето на населението е скоро невозможно со вакцини за кои се неопходни специфични услови. Некои вакцини бараат транспорт и складирање во ладни услови, кои во руралните региони, каде што има недостиг од електрична енергија и фрижидери, е невозможно. Аплицирањето на некои вакцини бараат обучен медицински персонал и стерилни услови, а, исто така, во услови кои во многу случаи тешко можат да се исполнат. Затоа, со помош на ДНК рекомбинирачката технологија се прават обиди вакцината да се синтетизира во растенија како компири, спанаќ, домати или банани. Принципот се сведува на експресија на дел од вирусни протеин во растението. Тоа се постигнува со вметнување на вирусната или бактериска ДНК во растението. При консумација на трансгенетското растение се внесува туѓиот протеин во организмот со што се активира имуниот систем. Веќе има неколку експериментални обиди за синтетизирање на вакцина против hepatitis B вирусот во листови од тутун, вакцина против бактерии кои предизвикуваат проливи е синтетизирана во компири или, пак, вакцина против беснило синтетизирана во спанаќ. Некои од овие вакцини се вклучени и во клинички студии. Слика 176 Продукција на рекомбинирани вакцини 168 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Генетска терапија Под генетска терапија се подразбира користење на ДНК како фармацевтски продукт за третирање на некоја болест. Основниот принцип на терапијата е нефункционалниот ген да биде заменет со нормален, со чија активност ќе се овозможи нормално функционирање на клетката, односно организмот. Генетската терапија може да се примени in vivо кога во организмот директно се вметнува генот, или, пак, in vitro при што клетки на пациентот се изолираат и генетски модифицираат in vitro, за на крај коригирани да се вратат во пациентот. Доколку болеста е предизвикана од нефункционален ген или, пак, од недоволна експресија на генот, состојбата може да се поправи со директно внесување на соодветниот ген. Ваквиот трансген би требало да одговори на потребите на клетката и да овозможи нормално клеточно функционирање. Овој пристап на генетска терапија најчесто се користи при рецесивни заболувања, кај кои и мала експресија на трансгенот значително може да ја подобри состојбата. Кај доминантните генетски заболувања, кога експресија на мутиран ген е причина за настанување на болеста, потребно е генетската терапија да се насочи кон корекција на причинителот. Во овој случај мутираниот ген треба да се замени со нормален. Ова може да се постигне со хомологна рекомбинација на поголема секвенца во која се наоѓа и мутираниот сегмент. За да се постигне ова, се дизајнира ДНК секвенца која ќе треба да ја замени мутираната и на нејзините два краја, 5` и 3`, се додава доволно долга хомологна секвенција која ќе ја овозможи рекомбинацијата. Генетската терапија може да биде насочена и кон предизвикување на клеточна смрт. Овој пристап екстензивно се истражува за третирање на различни типови на канцер. Гени кои носат информација за токсични продукти или, пак, имаат способност да индуцираат апоптоза, можат специфично да се инкорпорираат во канцер клетките и да предизвикаат клеточна смрт. Со генетски инженеринг може да се сензибилизира имуниот систем при што се создава соодветен имун одговор кон одредени типови на клетки. Доколку, како причина на заболувањето е зголемената експресијата на некој ген, како, на пример, некој онкоген кај канцер клетките, генетската терапија може да се насочи кон негова инхибиција. Ова може да се постигнува со директно инактивирање на ДНК, РНК или, пак, на протеинот, Слика 177 In vivo и ex vivo генетска терапија односно, може да се делува на секоја од етапите при создавањето на протеинот. Почетоците на генетската терапија се поврзани со примена на модифициран ретровирус како вектор. Основата на овој вектор е moloney murine leukemia вирусот 169 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски (MLV) во кој дел од гените се заменети со генот од интерес. Со ваквата модификација зачувана е способноста на вирусот да пенетрира во клетката, меѓутоа отстранети се гените кои ја овозможуваат неговата пролиферација. Овој вирус има способност да навлезе во клеточното јадро и да се интегрира во хромозомите на домаќинот. На овој начин и трансгенот од интерес, кој го носи со себе, ќе се инкорпорира во ДНК на целната клетка. Ова е важно бидејќи трансгенот станува интегрален дел од геномот и со тоа при репликација на клетката, се пренесува во следните генерации. Трансгенот треба да ја замени функцијата на мутираниот ген. Односно, со негова индукција треба да се создаде протеин кој ќе овозможи нормално функционирање на клетката. Како прв обид за генетска терапија кај луѓето се смета третманот на девојче со тешка комбинирана имунодефициенција (severe combined immune deficiency, SCID). Пациентите со SCID немаат функционален имун систем и уште во рано детство умираат поради банални инфекции. Кај ова девојче причина за SCID била мутација на генот аденозин деаминаза (ADA). Генетската терапија се состоела од изолација на Тлимфоцити и нивна трансфекција со ретро вирус во кој бил интегриран ADA генот. Модифицираните Т-клетки биле пролиферирани in vitrо и потоа повторно вратени во крвотокот на пациентот. Некои од трансплантираните клетки мигрирале во коскената срцевина каде што започнале да се размножуваат. Со ова ¼ од Т-клетките на пациентот содржеле нормален ген, што било доволно нејзиниот имун систем да стане функционирален. После оваа охрабрувачка студија започнале интензивни напори за третирање на различни заболувања со генетска терапија. Така во следните десет години над 4000 пациенти биле третирани со генетска терапија. И покрај успешноста на некои од клиничките третмани, многу од нив не покажаа задоволителни резултати. Особен проблем претставуваа наодите дека некои од методите се покажаа како небезбедни за пациентите. За појавата на несаканите последици како причина најчесто се наведува вирусниот вектор. Така се објавени случаи каде модифициран адено-вирус предизвикал силна имуна реакција со смртни последици или, пак, ретровирусен вектор бил причина за појава на леукемија кај три пациенти во една клиничка студија. Ретро и аденовирусот, историски гледано, се едни од најчесто користените вирусни вектори во генетската терапија. Овие вектори, покрај своите добри карактеристики, имаат и серија на недостатоци. На пример, поголеми секвенции, односно гени од 8 kbp, не можат да се транспортираат со нив. Многу од гените ја надминуваат оваа големина. За да се интегрира ретро вирусот во геномот на домаќинот, потребно е клетката да се реплицира. Самата интеграција е случајна, притоа векторот може да се интегрира и мутира некој функционален сегмент на ДНК. И на крај, векторот може да предизвика имуна реакција кај домаќинот. За да се надминат овие недостатоци, интензивно се работи на развивање на нови различни методи за внесување на трансгенот во целните клетки. Така се развиени нови генерации на вирусни вектори, вклучувајќи ги lentivirus, herpes simplex virus, vaccinia, pox virus, и adeno-associatedvirus. Покрај тоа се развиваат методи кои не користат вирусни вектори за внесување на ДНК во целната клетка. Такви методи се: директно инјектирање на линеарна ДНК секвенција, електропорација, сонопорација, мегенетофекција. Некои методи се базираат на хемиски соединенија и партикули кои имаат способност да ја поминат клеточната мембрана и притоа низ неа да ја пренесат саканата ДНК молекула. Од првиот обид за генетска терапија до денеска, направени се повеќе од 1700 различни клинички студии. Како позначајни успеси може да се набројат третманите на Leber's congenital amaurosis, Х-поврзана SCID (X-linked SCID), ADA-SCID, adrenoleukodystrophy, хронична лимфоцитична леуемија (chronic lymphocytic leukemia (CLL)), акутна лимфоцитична леукемија (acute lymphocytic leukemia (ALL)), миелома (myeloma) и Паркинсоновата болест. 170 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Генетскиот инженеринг во медицински дијагностички цели Со секвенцирањето на човечкиот геном, се овозможи на сите физиолошки, а со тоа и патлошки процеси кај човекот, да им се пристапи од генетска перспектива. Сега многу полесно може да се истражува молекуларниот механизам на процесите кои се случуваат во клетката, односно организмот. Доколку се знае молекуларниот механизам на некоја болест, во тој случај многу полесно истата може да се дијагностицира, спречи односно излечи. Генетиката не е основата само на генетските наследни заболувања, со неа може да се разбере зошто едни микроорганизми се патогени, а други не се патогени за човекот, како настанале и како да се третираат малигните заболувања, или, пак, зошто некоја терапија е соодветна за една индивидуа, а токсична или неефективна за друга индивидуа. Во основата на ДНК анализата, односно анализата на структурата и функцијата на гените, стои генетскиот инженеринг, односно рекомбинираната ДНК технологија. Дијагностичките анализи можат да бидат прилично едноставни, кај кои се детектира мутација во еден ген, како кај Душен мускуларна дистрофија, хемофилија и српеста анемија или, пак, посложени анализи кај кои се анализираат мутации на повеќе гени, како кај ракот на дебелото црево. Дијагностиката може да се прошири до анализа на сите гени во геномот на човекот за присуство на мутации или варијации. Во некои состојби не е доволно да се знае дали има или нема одредена мутација, туку е потребно да се анализира и функционалноста на одреден ген. Така, дијагнозата може да се базира на анализа на експресијата на еден или повеќе гени или, пак, анализа на експресијата на сите гени во дадена клетка или ткиво. Еден од најкласичните дијагностички генетски методи e анализа на фрагментите добиени при сечење на ДНК со рестрикциони ензими. Како пример за оваа метода ќе ја објасниме дијагнозата на српеста анемија. Станува збор за автосомно рецесивно заболување кое се базира на мутација, односно супституција, на само еден нуклоеотид во генот за β-глобин. При оваа супституција доаѓа до губење на едно MstII или CvnI рестрикционо место во генот. Со дигестија на ДНК и Southern blot, во зависност од мутацијата, може да се детектираат разлики во фрагмените. Постапката се базира на изолациjа на ДНК од мононуклеарните клетки во крвтa или, пак, доколку се работи за преднатална дијагностика, од клетките од амнионската течност или хорионските ресички. ДНК се дигестира со рестрикциониот ензим MstII и добиените фрагменти се сепарираат на гел со помош на електрофореза. Со помош на Southern blot хибридизација, при која се користи проба специфична за местото на мутацијата се визуализираат дигестираните фрагменти. MstII го сече на три места нормалниот βглобин ген во анализираниот регион, притоа формира два фрагменти кои се детектираат со специфичната проба. Доколку настане мутацијата, едното рестрикционо место се губи и при хибридизација се забележува само еден фрагмент. Така, доколку во тестираната ДНК нема мутација, ќе се забележат два бенда, а доколку се мутирани и двата гена (алела), во тој случај ќе се детектира еден бенд. Доколку едниот алел е 171 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски нормален, а другиот е мутиран, во тој случај ќе се детектираат два помали бенда кои потекнуваат од нормалниот алел и еден поголем кој потекнува од мутираниот. Од сликата 178 може да се заклучи дека и двата родители се хетерозиготни, а во потомството II-1 нема мутација, II-2 има мутација на двата алела, II-3 е хетерозиготен, односно има еден нормален и еден мутиран алел за β-глобин. Само мал број мутации (околу 7%) во еден базен пар можат да се детектираат на овој начин. Причината е едноставна, не сите мутации предизвикуваат промена на рестрикционото место. Методата која се базира на хибридизација со алел специфична хибридизациона проба не зависи од Слика 178 Пример за детекција на мутации во генот на β-глобин со помош на Southern blot различната фрагментација при дигестија со рестрикциони ензими. Во оваа метода се дизајнира проба, кратка ДНК секвенција, која треба специфично, на база на комплементарност, да се поврзе со нормалната или мутираната испитувана секвенција. На овој начин се дијагностицираат многу генетски мутации. Како пример ќе ја наведеме цистичната фиброза. Се работи за автосомно рецесивно заболување кое се карактеризира со нарушен транспорт на Na+ и Cl- јони низ епителните клетки при што се создава вискозна мукозна течност. Ова заболување најмногу е изразено во белите дробови. Генетската основа е мутација во генот „fibrosis transmembrane conductance regulator“ (CFTR). Најчеста мутација е делецијата на три нуклеотиди, позната како Δ508, при што доаѓа до губење на аминокиселината фенилаланин напозиција 508 од протеинот. Еден од начините генетски да се дијагностицира цистична фиброза е примерокот од ДНК да се хибридизира независно со две проби, едната која се хибридизира за нормалната секвенција, а другата за Δ508 делецијата. За да се зголеми специфичноста на методата, испитуваната секвенција од ДНК примерокот, може најпрво да се амплифицира со помош на PCR. Доколку се детектира хибридизацијата само со нормалната проба, може да се заклучи дека во таа ДНК не постои Δ508 мутација. Доколку, пак, и двете проби се хибридизираат, значи дека станува збор за хетерозиготен, односно има еден нормалени еден мутиран алел. Ако се хибридизира само Δ508 пробата, тогаш и двата алела се мутирани, односно се работи за пациент со цистична фиброза. Оваа дијагностичка метода, и покрај тоа што е брза и лесна за изведување, има свои недостатоци. Лимитираноста на оваа техника е тоа што со неа се анализира сегментот за кој е дизајнирана пробата. Само 60-75% од пациентите со цистична фиброза ја имаат Δ508 мутацијата. Притоа, дури 1300 други различни мутации можат исто така да бидат причина за ова заболување. Тоа значи дека голем број од случаевите не може да бидат дијагностицирани со оваа метода. За да се надмине ова, секвенцијата од интерес може да се анализира со помош на ДНК секвенционирање. Најпрво, саканиот регион се амплифицира со PCR, а потоа се секвенционира, односно прецизно се детерминира редоследот на нуклеотидите во анализираната секвенција. На овој начин многу прецизно може да се детектира секаков вид мутација во секвенцијата од интерес. 172 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Генетски тестови на база на микроареј технологија (microarray) Горенаведените методи се употребуваат за анализа на мутации за кои претпоставуваме дека се присутни, односно проверуваме дали одреден вид на мутација е присутна во точно одреден сегемент на ДНК, односно генот. Меѓутоа, многу често мутациите се нови, дотогаш незабележани, или, пак, ги има повеќе на различни делови од некој ген. Само кај тумор супресор генот p53, кој е променет во многу видови на канцер, се забележани над 500 различни мутации. За да може истовремено да се анализираат големи секвенции на ДНК, односно илјадници гени истовремено, е развиена технологија која се вика ДНК микроареј (DNA microarray, или DNA chip). Суштината на оваа технологија е нанесување на илјадници ДНК проби, едноверижни кратки секвенции на ДНК, на некоја платформа. Притоа, пробите се фиксираат на платформата по точно одреден распоред, групирани во полиња. Видот на пробите, кои ќе бидат сместени во секое поле, зависи од потребите на анализата. На пример, во секое поле можат да се сместат различни секвенции на еден ген или, пак, секвенции од различни варијации на еден ист ген. На овој начин, на една платформа која не е поголема од 1cm2, може да се сместат над половина милион различни полиња и притоа во секое поле да се сместат различни ДНК секвенции. Со ова само од една платформа можат да се добијат неколку стотици илјади различни информации за анализираната ДНК. Вакви ДНК чипови се развиени за генотипизација или, пак, детекција на полиморфизам на ниво на еден нуклеотид (single-nucleotide polymorphisms, SNPs). SNP се варијации на еден нуклеотид кои случајно се јавуваат на секои 100-300 базни парови. За некои од нив се знае дека нормално се присутни во одредени популации, меѓутоа некои SNP се поврзуваат со одреден типови на заболувања. Овој тип на микроареј технологија од ден на ден станува сè пософистицирана, покривајќи сè повеќе и повеќе сегменти од човековиот геном. Притоа целата постапка се поедноставува, а цената на апаратурата и самата анализа се намалува. Така за многу кратко време и релативно евтино можат да се анализираат стотици различни алели кои се поврзани со различни типови на заболувања, вклучувајќи ги и малигните и кардиоваскуларните заболувања. Анализа на генетската експресија со микроареј (gene expression microarray) и РНК секвенционирање (RNAseq) Анализата на генетската експресија дава информација кои гени се активни, а кои не се активни во дадена клетка или ткиво. Функцијата на клетката зависи од координираната експресија на гените. Нарушена експресија на само еден ген може да придонесе до нарушена функција на клетката. Доколку има индикации дека експресијата на некој ген е нарушена, многу лесно може истото да се провери, на пример, со RT-PCR. Доколку не се знае кои гени се причина за нарушената состојба на клетката или ткивото, или, пак, треба да се види кои гени учествуваат во некоја состојба, се применува глобална анализа на генетската експресија. Методата повторно се базира на „чип“ технологијата, односно на платформа се нанесуваат олигонуклеотиди кои ги препознаваат кодирачките секвенции на гените. Притоа, чипот може да биде дизајниран за да содржи проби на лимитирана група на гени, пример гени кои се знае дека учествуваат во некој процес (пр. клеточна пролиферација) или, пак, да содржи проби со кои би се анализирале сите гени во геномот на одреден вид. Има неколку варијанти на оваа технологија, за поедноставно овде со пример ќе биде објаснета само една. 173 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Да го споредиме транскрипциониот профил на една канцер клетка со нормална клетка од истиот тип од кој потекнува канцерот. Пример, да споредиме ткиво или клетки изолирани од коска, остеобласти и клетки изолирани остеосаркома. Принципот е во тоа колку повеќе молекули на иРНК има во клетката, толку тој ген е повеќе активен. За да ја спроведеме оваа анализа, најпрво од двата примерока се врши изолација на иРНК. Слика 179 Пример на глобална генска анализа. Шематски приказ на постапката за глобална генска анализа со микроареј на два различни примероци (лево). Споредбена анализа на голем број примероци групигани во две групи (десно). На панелот десно, со црвена боја се претставени гените кои се индуцирани, а со зелена гените кои се супресирани На база на иРНК се синтетизира комплементарна ДНК (cDNA) со реверзибилна транскриптаза. Притоа, една молекула на иРНК ќе биде матрица за синтеза на молекула на cDNA. При оваа синтеза, cDNA молекулите се обележуваат со флуоресцентна боја. За пример, секоја молекула на cDNA од нормалната клетка нека биде обележана со зелена боја, а секоја молекула на cDNA од канцер клетката нека биде обележана со црвена боја. Вака подготвените примероци заедно се нанесуваат на микроареј плочата на која се наоѓаат комплементарни проби за кои можат cDNA молекулите да се хибридизираат. Спектарот и интензитетот на бојата која доаѓа од секое поле се детерминира и притоа се утврдува која cDNA се хибридизирала. Доколку во полето се детектира само зелена боја, значи дека таа cDNA потекнува од нормалната клетка, односно тој ген е активен само кај нормалната клетка. Доколку, пак, во полето се детектира само црвена боја, значи дека тој ген е активен само во канцер клетката. Нормално, некои гени се активни и во нормалната и во канцер клетката. Притоа соодносот на боите ќе биде индикатор кој ген во која клетка е повеќе или помалку индуциран. На овој начин е утврдено дека одредено малигно заболување може да има различен генетски експресионен профил. Профилот може да зависи и од стадиумот во кој се наоѓа и видот на терапијата која се спроведува. Практичната примена на оваа технологија е диференцијацијата на два различна типа на diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL). При споредбена анализа на пациентите со DLBCL кај кои хемотерапијата имала или немала ефект, биле забележани два комплетно различни генетски експресиони профили. На база на тоа било заклучено дека станува збор за две различни заболувања со два различни резултата, GC B-like DLBCL и activated B-like 174 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски DLBCL. На сликата 179 е претставена микроареј анализа на примероци од пациенти со GC B-like DLBCL и activated B-like DLBCL. Резултатите се нормализирани кон контролните групи. Секој ред претставува нивото на генетската експресија, а секоја колона е различен пациент. Интензитетот на бојата претставува релативна квантификација на експресијата на генот. Притоа, црвената боја е индикатор за зголемена експресија споредбено со контролната група, а зелената боја е намалена експресија споредено со контролната група. Со портокалово се обележани GC B-like DLBCL, а со сино примероците од activated B-like DLBCL пациенти. Директно РНК секвенционирање (RNAseq) е најнова технологија која ја заменува микроареј технологијата за анализа на глобална генска експресија. Ова технологија се базира на новата генерација на секвенционирање на ДНК. Принципот на подготовка на РНК примероците и конвертирање во cDNA е сличен како кај миркоареј технологијата. Разликата е што наместо хибридизација на cDNA на веќе претходно дизајнирани проби се врши нејзино директно секвенционирање. Со помош на нормализирање на добиените резултати може да се пресмета кој ген е екпресиран, а кој инхибиран во даден примерок. Оваа технологија има многу предности пред микроареј технологијата, вклучувајќи детекција на досега непознати транскрипти (како долги некодирачки РНКи (lnRNA), и мирко (РНКи) и детекција на сплајсинг варијанти од еден ист ген. Примена на ДНК за одредување на идентитетот Со помош на типизацијата на ДНК (DNA profiling, DNA fingerprinting, DNA typing), може да се утврди идентитетот на луѓето при форензичките испитувања, да се анализира потеклото на индивидуата, да се користи за разграничување помеѓу хумани и животински остатоци или, пак, да се користи при археолошки антрополошки истражувања. Методите, најчесто, се базираат на споредување на различни примероци на ДНК. Доколку дојде до совпаѓање на две анализирани молекули, тогаш може да се заклучи дека потекнуваат од иста индивидуа. ДНК типизацијата започнала да се користи во форензички цели во средината на 80тите години на минатиот век. Како маркери во типизацијата се користеле секвенци од ДНК кои се составени од повторувања. Некаде околу 30% од ДНК на човекот се состои од повторувачки елементи. Првите испитувања се базирале на испитување на минисателитските повторувања (minisatelites или variable numbers of tandem repeats (VNTRs)). VNTRs се група на повторувања составени од 10 до 100 нуклеотиди. Пример за едно тројно повторување на секвенција од 16 нуклеотиди е: 5`GACTGCCTGCTAAGAT GACTGCCTGCTAAGAT GACTGCCTGCTAAGAT-3`. Ваквите повторувачки секвенци можат да бидат во група од две до стотина. За да се утврди ДНК профилот со помош на VNTRs, потребно е ДНК примерокот да се фрагментира со рестрикциони ензими кои ги сечат краевите на секој алел (група на повторувања). Фрагментираната ДНК се сепарира со електрофореза и со помош на Southern blot хибридизација се визуизираат саканите фрагменти. Пробите за хибридизација се дизајнираат да бидат специфични за секој VNTR. При анализа на фрагментите од секоја индивидуа се добива различен профил, освен ако не станува збор за еднојајчени близнаци. Доколку се утврдат два идентични распореди на дигестираните фрагменти, тогаш со голема сигурност може да се каже дека потекнуваат од иста ДНК, односно од иста индивидуа. На сликата 180 е претставена ДНК типизација со помош на VNTR фрагменти. Притоа, се анализирани два локуса (А и B). Стрелките го покажуваат местото на дигестија. Со дигестијата е добиен специфичен распоред на фрагментите за секоја индивидуа. Притоа индивидуата 1 во локусот А има два алела, едниот има 5, а другиот 2 повторувања, а индивидуата 2 во истиот локус има еден алел со 3 и еден со 4 повторувања. Може да се забележи дека и двете индивидуи имаат ист алел (B2) во локусот B. 175 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Недостаток на ова метода е дека за една анализа потребно е поголемо количество на ДНК и истата треба да е неоштетена. Слика 180 Пример за ДНК типизација со помош на VNTR фрагменти 176 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ДНК типизација со помош на анализа на микросателитски повторувања За да се надминат недостатоците на претходната анализа, развиена е техника со која може да се анализираат многу мали количества на ДНК. Таа се базира на карактеризирања на микросателитски повторувања (microsatellites или short tandem repeats (STR)) во молекулата на ДНК. STR се секвенци од 2 до 9 нуклеотиди кои се повторуваат од 7 до 40 пати во секој локус. Во човечкиот геном постојат стотици STR локуси од кои рутински за форензички потреби се користат 13. Анализата се состои од изолација на ДНК и амплификација на STR локусите со PCR. Притоа, за сите 13 различни локуси се дизајнирани специјални прајмери кои се наоѓаат на почетокот и крајот на секој локус. Притоа, секој сет од прајмер е конјугиран со специфична флуоресцентна боја, со што се овозможува секој од 13-те локуси да флуоресцира со различна боја. Крајниот резултат од амплификацијата се анализира со капиларна гел електрофореза. Слика 181 ДНК типизација со анализа на анализа на STR. ДНК типизација на 5 примероци на ДНК. Типизацијата е извршена со PCR, а фрагментите се сепарирани со електрофореза на агарозен гел. Може да сe забележи дека ДНК профилот најден на место на злосторството (примерок) е идентичен со профилот на осомничениот А Исто и како кај VNTR, анализата на база на големината на секој STR локус се прави типизација на ДНК. Направени се напори оваа техника да се стандардизира и сите лаборатории, кои типизираат ДНК за форензички потреби, да работат по исти протоколи. Со ова се овозможени услови за формирање на база на податоци во која се сместени сите извршени ДНК типизации. Федералното истражно биро (FBI) на САД развило софтвер со кој сите дати на податоци на профилите на ДНК добиени од различните лаборатории се собираат на едно место и потоа низ нив лесно се пребарува. Овој таканаречен Комбиниран ДНК индексен систем (Combined DNA index system (CODIS)), е едно од најмоќните алатки во користењето на ДНК типизацијата за форензички потреби. Како што претходно беше напоменато, докажувањето на идентитетот се базира на споредбена анализа. Со анализата на два примерока може само да се каже дали станува збор за иста или различна молекула, односно индивидуа. Анализа само на еден примерок не значи ништо, доколку нема со што да се спореди. Таа споредба ја овозможува CODIS. На пример, на местото на злосторството е најдена ДНК за која се смета дека е на злосторникот. Доколку не може да се земе ДНК примерок од злосторникот, на база на анализираната ДНК не може да се докаже неговиот идентитет. Меѓутоа, ако злосторникот претходно во некоја друга прилика бил или, пак, во иднина поради нешто друго биде ДНК типизиран, неговиот ДНК профил ќе влезе во CODIS. Со споредбена анализа на податоците и покрај тоа што во дадениот момент злосторникот не е достапен, ќе може да се идентификува. Комбинација на првите три STR, создава фреквенција на појавување од 1 во 5000, а комбинација на првите девет дава 1 во една милијарда. Комбинација од сите 13 создава фреквенција на појавување од 1 во 10 билиони. Мора да се напоменe дека шансите да се добие поголемо совпаѓање на два примерока се зголемуваат доколку се 177 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски работи за примероци добиени од исто семејство. Еден од недостатоците на оваа метода е дека мешавина од повеќе различни ДНК молекули во еден примерок ја отежнуваат анализата или можат да дадат погрешни резултати. Трансгенетски животни, анимални модели за хумани заболувања Со комплетирање на секвенционирање на геномот на луѓето и повеќето лабораториски животни и фармски животни, логична беше следната етапа: да се разбере функцијата на секоја протеин-кодирачка секвенција. Два основни модела се применуваат кога се изучува функцијата на некој ген. Едниот е да се направи нефункционален, со мутација или целосна делеција, а другиот е да се индуцира, односно да се зголеми неговата експресија. И во двата случаја се опсервираат фенотипските промени и се анализираат молекуларните механизми поврзани со алтерација на генот. Овие анализи може да се направат во in vivo и in vitro услови. Резултатите и заклучоците добиени in vitro се од големо значење, меѓутоа истите треба да се потврдат и во in vivo услови. Не секогаш она што се случува in vitro, значи дека се случува и во организмот. Поради ова во 2006 година започна еден мегапроект кој има за цел да генерира анимален модел со кој ќе се изучува секој протеин-кодирачки ген. Значи, потребно е поединечно секој од 20.000 гени кај глушецот да се мутираат in vitro и последователно да се создаде глушец кој ќе го содржи мутираниот ген. Организмот или, пак, клетката со така специфично мутиран ген, при што истиот станува нефункционален, се вика „gene-targeted knockout“ или едноставно „knockout”. Спротивно на тоа, кога во геномот се внесува дополнителна копија на некој ген, станува збор за генерирање на трансгенетски организам. Ова најчесто се прави со цел да се добие зголемена експресија на анализираниот ген. Животните кај кои со манипулација на генот/гените се добива фенотип кој соодествува со заболувањето кај човекот, се викаат анимални модели на дадената хумана болест. Како пример за полезноста на генетското инженерство кај лабораториските животни, ќе наведеме неколку примери. Pax7 „кnock out“ глушецот се раѓа со нормално развиена скелетна мускулатура, меѓутоа има недостаток на сателитски клетки во мускулите. Овие клетки учествуваат во развивањето и регенерацијата на мускулите. Уште во првите недели од животот, бројот на сателитски клетки сè повеќе се намалува, а мускулите заостануваат во постнаталното развивање и при повреда имаат помала способност за регенерација. Само од овие едноставни опсервации може да се заклучи дека Pax7 е ген кој има функција во одржување и активирање на сателитските клетки, односно функционално е поврзан со развивањето и регенерирањето на скелетната мускулатура. Во tp53 „knock out“ стаорецот уште во раната возраст, од 4-та недела, спонтано започнуваат да се развиваат тумори. Тp53 е ген кој го кодира p53 протеинот и учествува во контрола на клеточниот циклус и клеточните мутации. Во повеќето од половината различни малигни заболувања кај човекот детектирана е мутација во tp53. Како пример за трансгенетски анимален модел накратко ќе го објасниме DUX4 индусибилниот (iDUX4) глушец. DUX4 е ген кој е сместен во D4Z4 повторувањата на субтеломерниот регион на долгиот крак на хромозомот 4 кај луѓето. Делеција на овој дел од хромозомот е поврзана со Фациоскапуларна мускуларна дистрофија (Facioscapulohumeral Muscular Dystrophy, FSHD). Покажано е дека DUX4 специфично се експресира во одредени клеточни типови кај пациентите со оваа мускуларна дистрофија. Притоа, ваквата експресија на РНК или протеинско ниво не е забележана кај здрави индивидуи. Покрај тоа, in vitro истражувањата покажале дека DUX4 интерферира со миогените регулаторни фактори. Повеќето наоди сугерираат дека DUX4 е иницијалниот фактор во серијата на патолошки промени кои се детектирани во мускулите од FSHD пациенти, меѓутоа молекуларниот механизам на болеста сè уште 178 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски не е познат. Како и за секоја болест, за да се разјасни молекуларниот механизам и да се развие соодветна терапија, неопходно е да се создаде соодветен анимален модел. Како разумен пристап кон генерирање на анимален модел за FSHD би бил глушец во кој би се индуцирал DUX4. iDUX4 глушецот е генериран со инкорпорирање на DUX4 генот во локус на Y кој обезбедува непречена експресија на трансгенот. Воедно, целиот систем е иженериран да може контролирано да се индуцира, односно промоторот кој ја контролира експресијата на трансгенот, може да се вклучи или исклучи со доксицилин. Анализата на трансгенетскиот iDUX4 Слика 182 Трансгенетски глушец анимален глушец покажала дека клетките во кои е модел за FSHD. iDUX4 глушецот (десно) индуциран DUX4, рапидно изумираат. Од покажува видливи фенотипски разлики оваа првична анализа може да се заклучи споредбено со нормалниот глушец (лево) дека DUX4 е цитотоксичен ген, кој доколку се експресира во диференцираните мускулни влакна, ќе предизвика мускулна дегенерација, а доколку се индуцира во сателитските клетки или миобластите, ќе ја оневозможи мускулната регенерација. Резултатите наведуваат дека iDUX4 глушецот може да се користи како модел за FSHD. Со генерирање на овој модел се отвораат можности за разоткривање на патогенезата на болеста и развивање и тестирање на соодветна терапија. Друг пристап во изучувањето на гените е да се следи кога и зошто се индуцираат, кога и зошто се супресираат, во кои клетки тоа го прават, како се менува фенотипот на клетките во зависност од нивната функција. И на овој тип на истражувања може да се користат трансгенетските животни. Во овој случај генетски не се модифицира животното за да се индуцира промена на експресијата на генот, туку се моделира на начин со кој ќе може полесно да се следи генетската активност. Ова може да се постигне на неколку начина, еден е да се употреби промоторот на генот од интерес и после него да се стави некој маркер од типот на флуоресцентен протеин, кој лесно може да се детектира. Принципот е прилично едноставен, генот од интерес (ендогениот ген) за да се активира, специфични транскрипциони фактори се врзуваат за неговите регулаторни елементи, пред сè за промоторот. Бидејќи репортер генот (флуоресцентниот ген) има Слика 183 Pax7-ZsGreen2 трансгенетски ист промотор како и ендогениот ген, би глушец. Прикажани се ембриони на возраст требало истите транскрипциони фактори од 9.5, 10.5, 11.5 и 12.5 дена. Се забележува зелено маркирање на сомитите. да се врзат и за него. Притоа, кога Флуоресценцијата е поради активноста на ендогениот ген ќе се индуцира, Pax7 генот истовремено ќе се индуцира и репортер 179 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски генот. Ова ќе го објасниме со примерот за трансгенетскиот глушец Pax7-ZsGreen2. За да се одговори на прашањата од типот како и кога скелетните мускули се создаваат, од што се создаваат, како се регенерираат, зошто со стареење мускулната маса се намалува, што се случува при зголемен мускулен напор, како надворешните влијанија делуваат на мускулите, потребно е да се имаат соодветни истражувачки алатки. Еден од пристапните начини кон проучување на мускулната физиологија е да се генерираат анимални модели со кои ќе може да се следат експресирањата на клучните миогени гени. Како што погоре напомнавме Pax7 е еден од клучните гени за нормалната функција на сателитските клетки во мускулите. Поради тоа е генериран трансгенетски репортер глушец во кој е вметнат ДНК фрагмент кој ги има сите регулаторни елементи на Pax7, a самиот ген е заменет со ZsGreen2 генот. ZsGreen2 е модификација на ген изолиран од морските корали и кодира зелен флуоресцентен протеин. Анализата на мускулите од овој трансгенетски глушец покажала дека мала популација на мононуклеарни клетки прилепени до ламината на миофибрилите, флуоресцираат зелено кога се набљудувани под флуоресцентен микроскоп. Со дополнителна анализа е потврдено дека овие клетки се активираат при повреда на мускулот и учествуваат во создавањето на нови мускулни влакна. Со овие првични резултати е покажано дека успешно е генериран трансгенетски глушец со маркирани сателитски клетки и миобласти. Накратко да ја објасниме техниката на генерирање на „knock out“ глувци. Се базира на замена на функционалниот ген со помош на хомологна ДНК рекомбинација во ембрионални матични (ES) клетки од глувци. Од добиените knock out ES клетки се добива саканиот глушец. Најпрво се генерира таргетинг вектор. Овој вектор е секвенца од ДНК составена од неколку неопходни сегменти. За да може да се случи хомологната рекомбинација помеѓу векторот и ДНК на клетката, потребно е во векторот да се инкорпорираат хомологни секвенци. И тоа една секвенција која ќе биде хомологна со 5` крајот на генот и другата која ќе биде хомологна со 3` крајот на генот. На овој начин, при рекомбинацијата ќе се рекомбинира целиот ген. Доколку генот е многу голем, во тој случај рекомбинацијата може де се изведе само во почетниот дел од генот. Покрај рекомбинационите краеви, во векторот треба да се вметнат селекциони маркери. На овој начин може да се знае дали векторот успешно се интегрирал и воедно со помош на него да се селектираат „knock out“-клетките. Еден од најчесто употребуваните селекциони маркери е неомицин-резистентниот ген NeoR. Антибиотикот неомицин е токсичен за ембрионалните матични (ES) клетките и со интегрирање на NeoR генот во нив стануваат резистентни. NeoR се сместува помеѓу двете хомологни рекомбинирачки секвенции на векторот. Покрај NeoR-генот, кој служи за позитивна селекција, на векторот се додава уште еден ген, тимидин киназа (thymidine kinase (TK)) кој потекнува од herpes simplex вирусот и служи за негативна селекција. ES клетките се резистентни на антивирусниот лек ганцикловир „ganciclovir“, меѓутоа кога во себе го содржат ТКгенот, стануваат осетливи, односно изумираат. ТК-генот се сместува после 3` рекомбинирачката секвенција. При внесување на векторот во ES клетките, истиот може да се интегрира на два начина, со хомологна рекомбинација или случајно некаде низ геномот. Доколку се случи хомологна рекомбинација, бидејќи NeoR генот е помеѓу двата рекомбинирачки секвенции, тогаш и тој ќе се интегрира во геномот со што клетките ќе станат неомицин-резистентни. Доколку дојде до случајна интеграција, тогаш целиот вектор ќе стане дел од геномот на клетката, односно двата маркера NeoR и TK ќе се интегрираат. Така клетката ќе биде резистентна на неомицин, а осетлива на ганцикловир. Следниот чекор е таргетирачкиот вектор да се внесе во ES клетки од глушец. Се користат овие клеточни линии бидејќи само тие и индуцираните плурипотентни матични (IPS) клетки имаат способност да се диференцираат во сите типови на клетки во организмот. Или едноставно кажано, од ЕS клетките идентично како и од зиготот, може да се развие цел организам. Со тоа од генетски модифицираните ЕS клетките, може понатаму да се добие идентичен генетски модифициран глушец. Начинот на кој може 180 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски да се внесат ДНК векторите во клетката, претходно го дискутиравме. Еден од најчесто користените начини за вметнување на ДНК вектори во ES клетките од глушец е електропорацијата. Набрзо со внесување на векторот во клетките започнува и селекцијата, најпрво позитивната, а потоа негативната за да се добијат само клетките во кои успешно се случила рекомбинацијата. Притоа се врши клонална селекција, со која се генерираат клеточни линии кои потекнуваат од една клетка. Ова е важно бидејќи во една клеточна линија сите клетки ќе имаат ист генотип. Со помош на PCR или Southern blot дополнително се проверува успешноста на рекомбинацијата и селекцијата во изолираните клонови. ЕS покрај тоа што имаат способност за тутипотентна диференција, тие сами од себе не можат да создадат ембрион. За да се формира трансгенетски глушец, ES клетките се инјектираат во морула или бластула, претходно изолирана од утерусот на бремен глушец. Потоа инјектираната бластула се враќа назад во утерусот каде што се развива ембрионот. Притоа „knock out“ ЕS клетките во поголем или помал процент влегуваат во состав на новоразвиениот организам. Новиот глушец потекнува од нормални и од генетски модифицираните клетки и се нарекува химерен глушец. Тоа значи дека дел од клетките ќе имаат мутација, а дел ќе ја немаат. За да се добие глушец кој во сите клетки ќе ја има мутацијата, химерниот глушец се вкрстува со нормален глушец. Доколку дојде до оплодување на нормална јајце клетка со сперматозоид кој ја носи мутацијата, односно потекнува од ES клетките, ќе се развие животно кое ќе биде хетерозиготно за мутираниот алел. Нормално, може и да е обратно, јајце клетката да потекнува од химерниот глушец. Слика 184 Шематски приказ на постапка за генерирање трансгенетски глувци 181 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ГЕНЕТИКА НА РАКОТ Ракот (канцер) е генетско заболување од кое заболуваат сите возрасни категории и една од најчестите причини за смртоност во Европа и Америка. Секоја година само во САД 500.000 луѓе умираат поради канцерогени заболувања, а се дијагностицираат 1.000.000 нови случаи. Генерална каракетристика за секој канцер е присуство на соматски клетки кои неконтролирано се размоножуваат и распространуваат во околното ткиво и организмот. Причина за неконтролираната клеточна пролиферација се генетски мутации и/или епигенетски промени проследени со нарушена генска експресија. За разлика од најголемиот број на генетски заболувања кои се наследуваат, најчесто канцерот настанува поради индуцирани, односно стекнати мутации, во соматските клетки. Само мал број на канцери (помалку од 1%) се поврзани со мутации во гаметите кои, воглавно, допринесуваат еден организам да биде повеќе склон кон развивање на тој тип на канцер. Мутациите можат да бидат од едноставни точкасти мутации, при кои настанува промена на еден базен пар во генот, до масивни хромозомски реорганизации, амплификации или делеции. Многу ретко мутација на еден ген е причина за настанување на канцер. Најчесто се детектираат мултипни мутации кои заедно предизвикуваат нарушувања на повеќе клеточни процеси меѓу кои клеточна пролиферација, репарација на оштетени делови на ДНК, апоптоза, клеточна диференцијација како и нарушена клеточна контактна инхибиција и миграција. Клинички канцерот се дефинира како голем број, повеќе од стотина, комплексни хетерогени заболувања предизвикани од клетки кои некотролирано растат и се размножуваат и имаат способност за инвазија на околното ткиво и ширење низ целиот организам. Слика 185 Кариотип на нормална (лево) и кенцер клетка од канцер на мочниот меур (десно). Забележи ги бројните хромозомски абереации во кариотипот на канцер клетката Канцерите се разликуваат во однос на многу карактеристики вклучувајќи ги и старосната граница кога настануваат, брзината со која растат, инвазивноста во околното ткиво, начинот на кој се распространуваат низ организмот, прогнозата и третманот. И покрај многу разлики, заедничко за сите канцери се две карактеристики: ненормална клеточна пролиферација и метастазирање и способност за ширење низ останатите делови на организмот. Во нормалната клетка овие два процеса се строго контролирани од кординирана екпресија на групи на гени. Кај канцерот оваа контрола е нарушена поради мутираните гени или нивната неадекватна експресија. Токму овие две карактериситки го прават канцерот опасен за организмот. Доколку настане само нарушување на клеточниот циклус на една клетка, таа со време формира помала или поголема клеточна маса составена од мутирани клетки ќерки (туморогена клеточна формација) кои во голем дел наликуваат на клетката од која потекнуваат, масата е јасно ограничена и е локализирана на местото од каде потекнува во организмот (бенигнен тумор). Ваквите тумори можат лесно и најчесто успешно хируршки да се отстранат. Работите се комплицираат кога туморозните клетките ќе стекнат способност за саморепликација надвор од контролата на нормалниот клеточен циклус, морфолошки и функционално отстапуваат од нормалната клетка од која потекнуваат, со способност 182 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски за инвазивност на околното ткиво и ширење низ лимфната и крвната циркулација низ останатите делови од телото каде формираат секундарни тумори (метастази). Овие тумори се нарекуваат малигни тумори и многу потешко се третираат за разлика од бенигните. Потекло на канцерот Класификацијата и номенклатурата на туморите се детерминира во однос на тоа од кои клетки потекнуваат и какви се нивните карактеристики. Така, бенигнен тумор кој потекнува од мускулното ткиво, е миом, од коскеното ткиво е остеом, од жлездениот епител е аденом. Доколку туморот е малиген, а потекнува од коскеното ткиво е остеосарком, од напречно-пругастото мускулно ткиво е рабдомиосарком или, пак, од жлезденото епителното ткиво е аденокарцином. Се смета дека неопластични (туморогени) промени можат да настанат на секој вид на клетки во организмот, со тоа што некои видови се повеќе склони кон малигна трансформација отколку други. Независно колку е голем канцерот, од колку клетки е изграден и во колку делови од телото се проширил, сите негови клетки потекнуваат од една клетка во која се случиле специфичните мутации. Неколку примери ќе наведеме како непобитен доказ за оваа клонално потекло на канцерот. Канцер клетките на Буркитовиот лимфом (Burkitt`s lymphoma) се карактеризираат со реципрочна транслокација помеѓу хромозомот 8 и хромозомите 2, 14, или 22. Прекинот на хромозомот 8 се случува близу c-myc генот, а на хромозомите 2,14 и 22 во близина или во самиот имуноглобулински ген. Кај секој пациент сите канцер клетки имаат исто место на кое хромозомите се прекинати, односно ист тип на транслокација. Доколку се направи споредба помеѓу транслокацијата кај различни пациенти, ќе се увиди дека секоја е уникатна и потекнува од различно место на кое се случил прекинот на хромозомите. Друг пример е со канцерите кај женските индивидуи. Кај жената секоја клетка има инактивиран еден Х хромозом. Инактивацијата е случајна и 50% од клетките имаат инактивиран Х фромозом кој потекнува од таткото и 50% од клетките имаат инактивиран хромозом кој потекнува од мајката. Доколку се анализира еден канцер кај жената, ќе се увиди дека сите клетки на тој канцер имаат ист инактивиран Х хромозом. Самиот канцер, пак, од своја страна е составен од хетерогена полуплација на канцер клетки кои имаат различна морфологија, способност за пролиферација и растење. Генерално се прифатени два модела како настануваат, растат и метастазираат канцерите. Првиот модел се базира на постоење на матични клетки на канцерот (cancer stem cells) од кои потекнуваат сите останатити канцер клетки. Матичните клетки на канцерот како и останатите матични клетки се карактеризираат со две главни особини: самообновување и диференцијација. Делба на матичната клетка е, обично, асиметрична, при што се добива една клетка со исти карактеристики како и клетката од која потекнува (самообновување) и друга клетка со ограничена способност за разможување (диференцирана прогениторна клетка). Способноста за неограничено растење на канцерот и метастазирање се должи на матичните клетки на канцерот. Прогеноторните канцер клетки имаат ограничена способност за размножување, лимитиран животен век, меѓутоа имаат значајна улога во растењето и формирањето на волуменот на канцерот. Фенотипски овие клетки се разликуваат бидејќи стекнуваат дополнителни мутации во процесот на интензивна пролиферација. За голем број на канцери експериментално е докажано дека само канцер матичните клетки имаат способност да се развијат во нов канцер доколку се трансплатираат во експериментални животни. Матичните канцер клетки се идентификувани кај леукемиите, канцерите на мозокот, дојката, дебелото црево, панкреасот, овариумите и простата. Застапеноста на матичните клетки во канцерот кај различни канцери е различна. На пример, кај акутната миелоидна леукемија на секои 10.000 канцер клетки една е канцер матична клетка. За разлика од тоа, кај некои други канцери овие клетки се застапени и 183 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски до 40% од сите канцер клетки. Сѐ уште со сигурност не се знае од кој тип на клетки потекнуваат матичните клетки на канцерот. Една претпоставка е дека потекнуваат од нормална матична клетка на ткивото, а друга е дека потекнува од диференцирана клетка која се репрограмира под дејство на стекнатите мутации. Досегашните истражувањата ги поткрепуваат и двете теории. Моделот на постоење на матични клетки на канцерот ја објаснува појавата зошто некои канцери повторно релапсираат и покрај тоа што хируршки се острануваат и радикално третираат со хемотерапија и радиотерапија. Само една матична канцер клетка доколку остане во организмот е доволна од неа да се развие нов канцер. Вториот модел се базира на клоналната еволуција на канцер клетките. Под дејство на генетските и епигенетските промени клетките се стекнуваат со способност за неконтролирано размножување и компетиција. Притоа, само клетките кои имаат стекнато супериорни карактеристики над останатите ќе продолжат да се размножуваат и да бидат основа за формирање на туморозното ткиво. Колку туморозните клетки повеќе се размножуваат толку се поголеми шансите истите да стекнат дополнителни мутации. Овие мутации можат да ги зголемат малигните карактеристики на клетката како зголемена пролиферативност, инвазивност и метастаза или, пак, да ги намалат па и да индуцираат клеточна смрт. Само клетките со супериорни карактеристики ќе опстанат, клонално ќе се развијат и ќе учествуваат во формирањето на канцерот. Овој концепт предвидува секоја канцер клетка да има или стекне неограничен пролиферациски капацитет, а со тоа да може да иницира формирање на нов канцер. Фенотипските разлики помеѓу клетките на еден канцер, односно хетерогеноста, потекнуваат од дополнителни генетски мутации или различни влијанија од средина во која се наоѓаат. Слика 186 Модели на настанување и растење на канцерот. Хиерархискиот модел (лево) се базира на постоење на матични клетки на канцерот (обележани со црвено (CST)). Матичната канцер клетка има способност да се самообновува и диференцира во канцер прогениторни клетки. Моделот на клонална еволуција (десно) се базира на селекција, односно опстојување на клонови на канцер клетки со супериорни карактеристики 184 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Геномска нестабилност кај канцерот Генетските промени неопходни за малигната трансформација се акумулираат за време на животниот век на клетката, пред сѐ во период на репликација на ДНК. Колку клетката е постара и поминала низ повеќе клеточни циклуси (делби) толку веројатноста да стекне мутации се поголеми. Притоа, гените кои се мутираат се случајни, па така шансите клетката да стекне комбинација од канцерогени генетски мутации се малечки. Ова е и една од причината зошто канцерот е почесто дијагностициран кај повозрасните отколку кај децата. Во стекнувањето на мутациите влијаат и изложеноста на организмот на мутагени односно канцерогени фактори. Колку почесто и подолго организмот е изложен на овие фактори толку можноста за стекнување на критичните малигни мутации се поголеми. При споредба на геномот на нормална и канцер клетка на еден организам може да се утврди присуство на повеќе илјади генетски мутации во канцер клетката. Како и да е, сите овие мутации не се критичен фактор за канцерогените особини на клетката. Само мал број од мутации се причина и движечки фактор на малигнитетот на канцер клетката. Неопходниот број на круцијалните малигни мутации е различен за различни типови на канцери, меѓутоа се смета дека не надминува дванаесетина. Фактот дека во канцер клетката има многу мутации наведува на заклучокот дека во овие клетки механизмот за репарација, односно поправка на мутираната, оштетената или прекинатата ДНК е нарушен или воопшто недостаува. Ова придонесува за глобална нестабилност на геномот која се карактеризира со голем број на генски мутации и стуктурни и нумерички хромозомски абнормалности. Притоа, бројот на абнормалностите се зголемува при понатамошните клеточни делби. Ваквата нестабилна сосојба на геномот на канцер клетката се нарекува мутатор фенотип. За инволвираноста, поточно нефункционалноста, на системот за репарирање на ДНК во малигната трансформација потврдуваат зголемената зачестеност на канцер кај пациенти со генетски заболувања кај кои овој систем е нарушен. Ксеродерма пигментосум (Xeroderma pigmentosum; OMIM #278700) е автосомно рецесивно заолување кај кое е мутиран генот XPA на хромозомот 9. Пациентите со ова заболување имаат намалена или ја немаат способноста да ја репарираат ДНК која се оштетува под дејство на UV зраците. Поради ова, уште на рана возраст кај овие пациенти се развиваат различни карциноми на деловите од кожата кои биле изложени на сонце. Друг пример е доминантното наследно заболување, наследен неполипоиден колоректален канцер (hereditary nonpolyposis colorectal cancer, HNPCC) во чија основа е мутација на еден од неколкуте гени кои учествуваат во заменување на погрешно инкорпорирани нуклеотиди во молекулата на ДНК. Кај овие пациенти има зголемен ризик да се развие колоректален канцер, канцер на овариумите, ендометриумот, уретрите или бубрезите. 185 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Покрај големиот број на мутации кај различни типови на канцер се препознаваат и карактеристични генетски абнормалности за тој канцер. Специфичните генетски абормалности се користат за дијагностицирање, класифицирање и утврдување на степенот на малигнитет на одреден карцином. Така, на пример, канцер клетките кај хроничната миелоидна леукемија имаат транслокација на c-ABL генот од хромозомот 9 во BCR генот на хромозомот 22. Оваа транслокација формира стуктура позната како Филаделфија хромозом (Philadelphia chromosome). ALB генот кодира протеин тирозин киназа која учествува во пренесување на сигналот добиен од цитокините на клеточната мебрана до нуклеусот. Овој сигнален пат учествува во многу клеточни процеси вклучувајќи клеточно растење, пролиферација, мобилитет, адхезија како и апоптоза. Неговата активност зависи од сигналот кој го добива клетката од цитокините. При транслокација на c-ABL во BCR генот се добива фузиран ген кој е постојано активен независно од цитогената стимулација. Слика 187 Формирање на Филаделфија хромозомом Нарушената генска функција е карактеристичен за хронична миелоидна леукемија. причина клетката да ја загуби Претставена е реципрочна транслокација на контролата над клеточниот долгите краци на хромозомот 9 и 22 циклус и да се стекне со малигни карактеристики. Во формирањетона геномската нестабилност кај канцерот учествуваат и епигенетските фактори кои дејствуваат на ДНК и хроматинските протеини. Генерално, ДНК хипометилацијата е карактеристика за сите канцерогени клетки. Притоа, гените кои учествуваат во активацијата на клеточниот циклус, миграцијата и слично, стануваат уште повеќе активни. Покрај глобалната хипометилација кај некои канцери се забележува и хиперметилација во промоторот на одредени гени. На овој начин се супресираат или инактивираат тумор-супресор гените или гени кои индуцираат апоптоза. Регулација на клеточниот циклус и апоптозата кај карциномите Клеточен циклус е процес во кој клетката поминува од една клеточна делба до друга клетона делба. Поделен е во два потстадиума, интерфаза и митоза, кои, пак, од своја страна се поделени на повеќе потстадиуми. Интерфазата е стадиум во кој клетката се подгодтува за клеточната делба, во која се случува и круцијалната репликација на ДНК. Митозата е, пак, стадиум во кој настанува делбата на клетката, односно од една се добиваат две ќерки клетки. Една од основните одлики на канцер клетките е губитокот на контролата на клеточниот циклус, а со тоа и способноста за екстензивна пролиферација. Во адултниот организам има клетки кои постојано се размножуваат со цел да ги заменат оштетените или изумрените клетки, а со тоа да го обноват ткивото во кое се сместени. Од овој тип на клетки се епителните клетки на кожата и хематопоетските клетки во коскената срцевина. Има и клетки кои се високодиференцирани и немаат способност за пролиферација. Најголем број од клетките кај адултниот организам се од овој тип. При оштетување на ткиво кое доминантно е составено од клетки кои не се размножуваат, 186 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски како мускулното ткиво, нови миофибрили се генерираат од резидентните сателитски клетки, еден вид матични клетки на мускулите. Во нормални услови матичните клетки се во G0 стадиум од клеточниот циклус и под дејство на стимулс од околината се активираат, започнуваат да пролиферираат, за на крај да се диференцираат во функционални клетки на тоа ткиво. Сите погоренаведените процеси се под строга генетска контрола. Доколку пролиферацијата, диференцијацијата и апоптозата не се контролирани и синхронизирани, тогаш интегритетот и функцијата на ткивото ќе биде нарушен од присуство на неадекватни видови на клетки. Нормалната контрола на клеточната пролиферација инволвира над стотина гени кои го регулираат клеточниот циклус, апоптозата или клеточниот одговор на сигналите кои доаѓаат од средината во која клетката се наоѓа. Во канцер клетката многу од овие гени се мутирани или несоодветно експресирани со што контролата на клеточната пролиферација е нарушена или изгубена. Така, за разлика од најголемиот број на соматски клетки кои се во G0, канцер клетките никогаш не влегуваат во оваа фаза, а со тоа и постојано пролиферираат. Еден од факторите кои придонесуваат клетката да влезе или излезе во G0 фазата се сигналите кои доаѓаат од надворешната средина од факторите за растење и хормоните. Сигналните молекули, преку интрацелуларните сигнални патишта, ја пренесуваат информацијата до нуклеосот, каде се активираат или супресираат различни гени кои учествуваат во контрола на клеточниот циклус. Поради мутациите на инволвираните гени, кај канцер клетката овие сигнални патишта се нарушени и тие несоодветно реагираат на сигналните молекули кои доаѓаат од средината. Така, клетката пролиферира под дејство на активиран сигнален пат и покрај тоа што од околината прима спротивни сигнали. Прогресијата на клетката низ клеточниот циклус се одвива со синхронизирана активност на две групи на протеини, циклини и циклин зависни кинази (CDK). Притоа, циклините се врзуваат за циклни зависните кинази и формираат комплекси кои имаат способност за фосфорилација на други протеини кои се неопходна алка во каскадната реакција на клеточната пролиферација. На пример, во G1 фазата CDK4/циклин D комплексот активира гени кои создаваат протеини неопходни (ДНК полимераза и ДНК лигази) за синтеза на ДНК во наредната S фаза. Друг пример е присуството на CDK1/циклин D кои фосфорилираат протеини кои учествуваат во лиза на нуклеарната мебрана, спирализацијата на хромозомите и реогранизација на цитоскелетот. Периодот на индукцијата и нивото на екпсресија на циклините е Слика 188 Комплекси на циклин и циклин зависни генетски регулиран процес, кој доколку кинази (CDK) кои учествуваат во одредени се наруши, клетката ќе ја изгуби периоди на клеточниот циклус контролата над клеточниот циклус. Кај нормалната клетка транзицијата низ клеточниот циклус е строго регулиран процес кој е зависи од информациите кои се добиваат од средината во која се ноаѓа и нејзината хомеостаза. Притоа, има најмалку три контролни точки во кои клетката евалуира дали е потребо и дали е подготвена да продолжи во наредната фаза од клеточниот циклус. Тоа се G1/S, G2/M и M контролни точка. Во G1/S контролната точка клетката ја проверува нејзината големина и дали и до кој степен ДНК молекулата е оштетена. Доклку клетката не достигнала одредена големина или, пак, ДНК е оштетена, клетката ќе остане во G1 периодот сѐ додека условите не се исполнат. Доколку клетката утврди дека ги исполнува условите, тогаш преоѓа во наредната S фаза каде што настанува синтеза, односно репликација на ДНК. Следната контролна точка, G2/M, 187 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски служи да се монитира дали ДНК успешно се реплицирала, односно дали репликацијата е комплетна, дали грешките кои настанале при репликацијата се отстранети и дали клетката е во физиолошка кондиција да премине во наредната фаза, односно митозата. За време на самата митотска делба има уште една значајна контролна точка, М контролната точка. Во овој стадиум клетката контролира дали хромозомите се соодветно спирализирани и поставени во екваторијалната рамнина, дали нишките на делбеното вретено се правилно оформени и прикачени за кинетохорот. Доколку некој од Слика 189 Контролни точки на клеточовие услови не е исполнет, процесот на ниот циклус митоза се прекинува сѐ до моментот додека не се исполнат условите истата да продолжи. Нарушување на кој и да е дел од контролните етапи на клеточниот циклус ќе придонесе клетката неконтролирано да се реплицира и притоа уште повеќе да акумулира генетски мутации или хромозомски аберации. Доколку ДНК оштетувањето и хромозомските абнормалности се во тој степен што клетката не може да ги поправи, се активира уште еден одбранбен механизам кој се вика апоптоза. Апотозата е генетски програмиран процес со кој клетката индуцира клеточна смрт. Овој процес е неопходен за елиминација на клетките кои поради генетските мутации има опасност да се трансформираат во канцер клетки. Исто така, е неопходен процес при ембриогенезата, кога еден вид на клетки се заменува со друг вид на клетки или, пак, при одржување на хомеостазата на ткивата, кога непотребните и нефункционални клетки се елиминираат за да се заменат со нови. Накратко, при апопотозата настанува кондензирање на клетката и хромозомите, фрагментирање на ДНК, промени во клеточните органери и клеточната мембрана за, на крај, клетката да се дезинтегрира во карактеристични апоптотични телца кои се фагоцитираат од клетките на имуниот систем. Апоптозата може да биде активирана под дејство на надворешни сигнални молекули кои клетката ги прима преку соодветни рецептори (death receptor) на клеточната мембрана или, пак, по внатрешен митохондриски пат при кој настанува оштетување на мембраната на митохондријата и ослободување на цитохром C. Независно како апоптозата е иницирана, истата е ефектуирана преку активација на група на лизирачки ензими меѓу кои главна улога имаат каспазите. Апоптозата може да се активира од истите гени кои учествуваат во контролните точки на клеточниот циклус. Бидејќи некои од овие гени најчесто се мутирани кај канцер клетките, истите не се способни и да ја Слика 190 Шематски приказ на апоптозата индуцираат апоптозата, а со тоа се 188 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски овозможува акумулација на клетки со уште повеќе генетски абнормалности. Онкогени и тумор-супресор гени Генерално, две круцијални категории на гени се мутирани или неправилно екпресни кај канцер клетките, протоонкогени и тумор-супресор гени. Протоонкогените кодираат транскипциски фактори кои ја стимулираат клеточната делба. Овие гени се неопходни за нормално функционирање на клетката, особено за одвивање на процесот на клеточната пролиферација. Кога клетката е во стадиум на мирување (G0), протоонкогените се супресираат или инактивираат. Кај канцер клетките најмалку еден протоонкоген е неправилно индуциран и придонесува за неконтролиран клеточен циклус. Причина за тоа може да биде мутација или, пак, зголемена екпсресија во период од клеточниот циклус кога, вообичаено, протоонкогените не се активни. Кај канцер клетките многу често протоонкогените или, пак, некои од неговите мутирани форми постојано се екпресираат. Кога еден прото-онкоген е мутиран или неприродно екпресиран и придонесува за малигна трансормација на клетката, се вика онкоген или ген кој предизвикува канцер. Доволно е еден алел од двата алела на протоонкогенот да биде мутиран или неправилно експресиран за да го изрази својот ефект на клетката. Со тоа онкогените се доминантни гени при формирањето на канцерот. Слика 191 Најчести модификации на проонкогените при онкогенезата. Протоонкогенот може да се транслоцира во близина на активен промотор, да се мултиплицира или, пак, да подлежи на мутации. Мутациите може да се во регулаторните елементи на протоонкогенот или во самиот ген. Мутацијата во протеин кодирачка секвенција може да го модифицира протеинот во поактивен или постабилен Тумор-супресор гените се гени кои нормално ги контролираат контролните точки на клеточниот циклус или индуцираат апоптоза. Кај нормалните клетки овие гени се индуцираат при оштетување на ДНК или, пак, под дејство на пролиферативно инхибирачки сигнални молекули од средината. Кога нивната функција е нарушена, контролата над клеточниот циклус е непотполна или воопшто недостасува, а и иницирањето на апоптозата отсуствува. Поради тоа, клетката акумулира дополнителни мутации и станува неспособна да излезе од клеточниот циклус и да стане митотички неактивна. За разлика од онкогените и двата алела на тумор супресор генот потребно е да се мутирани за комплетно да отсуствува неговата функција, а со тоа да учествува во формирањето на канцерогениот фенотип. Бројот на гени со онкогени и туморспересор карактеристики во геномот на човекот е голем. За над 400 гени досега е потврдено дака имаат помал или поголем удел во канцерогената трансформација на клетката. Во табелта се наведени примери на неколку онкогени и тумор-супресор гени кои се среќваат почесто кај еден или повеќе видови на канцери. 189 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Протоонкоген c-myc c-kit RARα E6 Cyclins Туморсупресор RB1 P53 Промени при канцер Поврзаност со канцер Транслокација, дупликација, точкаста мутација Лимфома, леукемија, канцер на бели дробови, и др. Мутација Саркома Хромозомска транслокација, фузиран ген Акутна промиелоцитна леукемија HPV инфекција Канцер на грлото на матката и др. Дупликација, зголемена експресија Канцер на белите дробови, езофагусот, многу др. Промена при канцер Поврзаност со канцер Мутација, делеција, инактивација Ретинобластома, остеосаркома, др. Нормална функција Транскрипционен фактор, клеточен циклус, апоптоза Тиросин киназа, сиганален пат Хормон-зависен сигнален пат, диференцијација Хуман папилома вирус кодиран онкоген, го инактивира p53 Се врзуваат за CDKs, регулација на клеточниот циклус Нормална функција Регулација на контролните точки на кл. циклус, се поврзува со E2F Трнскрипционен регулатор Мутација, делеција BRCA1, BRCA2 Репарација на ДНК Точкасти мутации APC Меѓуклеточна комуникација Мутација Мутиран кај 50% од канцерите Канцер на дојка, овариуми и простата Колоректален канцер, канцери во мозокот, тироидеа и др. Онкогените од Ras генската фамилија Еден од најчесто мутираните гени кај различните видови на канцер се гените од Ras генската фамилија. Се смета дека и до 30% од канцерите кај човекот имаат мутација во Ras. Кај некои канцери, како канцерот на панкреасот, Ras е мутиран во 90% од случаите. Овие гени кодираат G вид на протеини кои учествуваат во сигналните патишта поврзани со клеточното растење и размножување. Ras протеините се активираат кога некои од факторите на растење од надворешната средина (пр. PDGF, EGF) ќе се поврзат со рецепторите на клеточната мебрана. Кога Ras e активиран, тој се поврзува со гванозин трифосфат (GTP) и како комплекс учествува во каскадна фосфорилација на интрацелуларни протеини со кои се пренесуваат сигналот до нуклеусот. Вака активираниот сигнален пат индуцира гени кои ја стимулираат клетката Слика 192 Активација на RAS сигналниот пат со што настанува специфична генска да расте, да се размножува и адаптира на активација условите на надорешната средина. Кога Ras 190 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски не е активен, тој е поврзан со гуанозин дифосфат (GDP), односно GTP се хидролизира до GDP, а со тоа иитрацелуларниот сигнален пат е неактивен. Поради мутација на Ras се добива протеин кој е постојано активен, односно хридролизата на GTP до GDP е оневозможена. Во ваква состојба нуклеусот постојано, независно од факторите на растење во надворешната средина, прима сигнали за растење и размножување, а со тоа се создават услови за малигна трансформација на клетката. p53 тумор-супресор генот Повеќе од 50% од хуманите канцери имаат мутиран p53 ген. p53 e ген кој кодира транскрипционен фактор кој учествува во контрола на експресијата на повеќе од 50 гени инволвирани во клеточниот циклус, апоптозата, репарација на ДНК, оксидативен стрес. На пример, при оштетување на ДНК, p53 ја оневозможува транзицијата на клетката од G1 во S или, пак, од G2 во M фазата од клеточниот циклус сѐ додека не настане репарирање на оштетените делови. Доколку оштетувањата се иреверзибилни, p53 индуцира апоптоза. При нормални услови, вообичаено, p53 протеинот е неактивен и брзо се деградира. p53 се активира и акумулира при експозиција на клетката на хемиски, физички и билошки фактори кои предизвикуваат клеточен стрес и оштетувања на ДНК. Некои од факторите кои предизвикуваат активирање на p53 се јонизирачките и UV зрачења, топлотен и оксидативниот стрес, вирусни инфекции. При нефункционален и/или мутиран p53, клетката не е способна да го контолира оштетувањето на ДНК, односно контролните точки при клеточниот циклус се неактивни. Со тоа клетката непречено се реплицира и акумулира дополнителни мутации со секоја наредна делба. Ваквата состојба овозможува клетката да се трансформира во канцер клетка. Генетската поврзаност на инвазивната и метастатска способност на канцерот Канцерите се карактеризираат со способноста да метастазираат. Односно канцер клетките да се дезинтегрираат од иницијалната туморен продукт и по крвен, лимфен или друг начин да се прошират во други ткива и органи на организмот и да формираат секундарни тумори. За да го постигнат тоа, тие најпрво го дисоцираат екстрацелуларниот матркис и базалната ламина со кој ткивата се ограничени. Овие структури, доминантно изградени од протеини и јаглехидрати, претставуваат матрикс во кој нормално клетките се сместени и бариера со која се лимитира нивната миграција. Метастазирањето е контролирано од поголема група на гени, вклучувајќи гени кои кодираат клеточни адхезиони молекули, цитоскелетни компоненти и протеолитички ензими. На пример, епителијалните туморни клетки на својата површина имаат помалку во споредба со нормалните епителни клетки рецептори од типот на Е-катхерин (Ecatherin). Овие рецептори се неопходни за меѓуклеточна адхезија. Дополнително на тоа, канцер клетки содржат многу повеќе протеолитички ензими, металопротеинази, со кои го разградуваат меѓуклеточниот матркс. За некои видови на тумори е воспоставена позитивна корелација помеѓу нивото на металопротеиназите и способноста за метастазирање. Имено, колку повеќе се присутни металопротеиназите, толку повеќе тој тумор ќе биде агресивен. За да се долови комплексноста на генетската поврзаност и способноста за матастазирање, ќе го напоменеме примерот со канцер клетките кои имаат афинитет да метастазираат во белите дробови. Кај овие клетки е забележан специфичен генски еспреснионен профил во кои се инволвирани ID1, MMP1, CXCL1, PTGS2, VCAM1, и EREG гените. Слично на ова, метастатскиот потенцијал на клетките на канцерот на дебелото црево се поврзани со SMAD4, DCC, TP53, TPD52, FABP5, MAP2K4, LLGL1, и FBLN1 гените. Во клетките, исто така, постојат група од десетина кодирачки секвенции кои функционално се групирани како метастаза-супресирачки гени. Овие гени немаат 191 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски способност да влијаат на растењето на примарниот тумор, туку се поврзани само сометастазирањето на клетката. Нивната експресија, обично, е супресирана од епигенетски фактори, а не поради мутација. Овој податок дава надеж на развивање специфична епигентска терапија која би ја инхибирала или оневозможила метастазатна одредени канцери. Истата се базира на молекули кои имаат способност да ги менуваат епигенетските состојби, во овој случај да придонесат до активација на метастазасупресирачките гени. Примери за метастаза-супресирачки гени се NM23 и BRMS1 кои се активни кај меланомот, ракот на дојката, овариумите, дебелото црево и др., и MKK4, кој е активен кај канцерот на простата. Наследна предиспозиција кон одредени видови на канцер Само за околу 50 видови канцери, што претставува само 1% до 2% од сите малигнитети, се знае дека наследните предиспозирачки фактори имаат улога во нивната појава. Примери за тоа се поврзаноста на фамилијарниот рак на дојка и BRCA1 генот, фамилијарната меланома и CDKN2, неурофиброматоза тип 1 и NF1, неурофирброматоза тип 2 и NF2, ретинобластома и RB1, Горлин синдромот (Gorlin syndrome) и PTCH1, или Вилмс туморот (Wilms tumor) и WT1 генот. RB1 генот е тумор-супресор ген кој учествува во формирањето на многу канцери вклучувајќи канцер на дојката, коските, белите дробови и мочниот меур. Овој ген е најмногу познат како причина за развивање на ретинобластома, тумор на ретината на окото кај децата. Доколку се наследи еден мутиран алел на RB1, ризикот да се развие ретинобластома е 85%. Покрај овој канцер, индивидуите се склони кон развивање и на другите видови на канцер. Притоа, мора да се напомене дека само 25% од ретинобластомите се поврзани со наследување на мутиран RB1. Како што претходно напоменавме и двата алела на некој тумор-супресор ген потребно е да се инактивни за фенотипот да дојде до израз. Кога се наследува еден мутиран алел потребно е и останатиот нормален алел да стекне мутација за клетката за да биде хомозиготена рецесивна за тој ген. Таа појава се вика губиток на хетерозиготност. Дополнително на тоа, потребна е мутација и на останат ген/и за клетката да добие малигни карактеристики. Најчесто станува збор за дополнителна промена на некој протоонкоген или друг тумор-супресор ген. Принципот на наследување на еден мутиран ген, преку губење на хетерозиготноста, па до стекнување на дополнителни мутации до конечниот канцероген фенотип пластично ќе го објасниме со еден вид на канцер на дебелото црево, фамилијарна аденоматозна полипоза (familial adenomatous polyposis, FAP). При FAP, индивидуите наследуваат еден мутиран алел на APC генот лоциран на хромозомот 5. Мутацијата може да е од различен вид, вклучувајќи точкаста мутација, делеција или мутација со нарушување на рамката на читање. APC е тумор супресор ген кој меѓу другото инхибиторниот ефект на клеточната пролиферација го остварува преку интеракција со β-катенинот. Хетерозиготноста за APC придонесува епителните клеки повеќе да пролиферираат и притоа да формираат туморозни продукти, полипи. Овие полипи се класифицираат како бенигни тумори, односно аденоми. Во клетките на полипите може, а и не мора, да се појават мутација на нормалниот алел на APC генот. Круцијална промена за прогресирање на аденомата во интермедиерна аденома е мутација на Ras протоонкогенот. Клетките кои ги содржат двете мутации, веќе немаат способност да се диференцираат и ниту, пак, да ја инхибираат пролиферација при контакт со останатите клетки. Наредниот чекор во малигната трансформација е губење на двете копии на DCC генот. Овој ген учествува во процесот на клеточната адхезија и 192 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски диференцирање. За на крај аденомазните клетки да карактеристики потребно е да дојде и до губење на p53 генот. добијат канцерогени Слика 193 Шематски приказ на развојните етапи и генската инволвираност при фамилијарна аденоматозна полипоза (familial adenomatous polyposis, FAP) Улогата на вирусите во разитокот на канцер Се смета дека 15% од канцерите кај луѓето се поврзани со вирусни инфекции. Овој податок ги става вирусите втори, после чадот од цигарите, како најчести канцерогени причинители. Слично со останатите предиспозирачки фактори за развивање на канцер, така и кај вирусната инфекција, самата вирусна честичка не е доволна да предизвика кацер. Покрај вирусниот фактор, потребно е да се акумулираат дополнителни мутации, како во онкогените така и во тумор супресорните гени за да се создадат услови за малигна трансформација. Накратко, вирусот е структура изградена од два основна дела, капсид и нуклеински киселини. Капсидот го заштитува генетскиот материјал и овозможува негов пренос до целната клетка. Нуклеинските киселини се носители на генетската информација и може да се во форма на ДНК или РНК. За да може вирусот да се размножи, потребно е да се наоѓа во жива клетка, со чија помош вирусот ги синтетизира неопходните елементи за создавање нови вирусни честички, нови нуклеински киселини и капсиди. За да може да се одвива синтезата, потребно е клетката домаќин да е во стадиум на растење. Поради ова, некои ДНК вируси носат генетска информација која ја стимулира инфицираната клетка да расте и да се размножува. Овој вирусен генетски продукт често влијае на тумор-супресор гени или протеини и притоа ја инактивира нивната функција. Доколку вирусната инфекција не ја уништи клетката домаќин, се создаваат услови под дејство на вирусот истата да ја изгуби контролата над клеточниот циклус. Некои ДНК вируси кои се поврзани со канцер се: хуманиот папилома вирус е поврзан со цервикалниот канцер, хепатитис Б вирусот може да е причинител за хепатоцелуларен карцином, Епстеин-Бар вирусот (Epstein-Barr) може да предизвика Буркит лимфом (Burkitt`s lymphoma), B и T клеточна лимфом, хуман херпес вирус 8 има улога во Капоси саркома (Kaposi sarcoma) или лимфом. РНК вирусите се типови на вируси кај кои вирусната генетска информација е кодирана во единечна или двоверижна молекула на РНК. Ретровирусите припаѓаат на оваа група на вируси. Тие канцерогениот ефект можат да го предизвикаат на неколку начина. Кога ќе влезе во клетката, РНК-ата на вирусот се конвертира во ДНК, која, пак, од своја страна се интегрира во геномската ДНК на клетката домаќин. Доколку 193 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски вирусната нуклеинска киселина се интегрира во близина на некој протоонко ген, може да предизвика негова активација, зголемена експресија или, пак, мутација. Како што преходно објаснивме, сите ови алтерации во протоонкогените можат да бидат причина истите да станат онкогени. Вториот начин е доколку вирусот во себе носи некоја копија на онкоген. Неретко се случува онкоген од клетката домаќин да се интегрира во новосоздадената вирусна нуклеинска киселина, односно во новоформираниот вирус. Ваквиот вирус кога ќе инфицира некоја интактна клетка со себе носи онкогена информација која, доколку се експресира, може директно да ја трансформира клетката во канцер клетка. Последниот начин е кога вирусната нуклеинска киселина поседува информација со која директно стимулира клеточна пролиферација и/или индукција на различни вирусни и клеточни гени. Поради ова, клетката може да почне неправилно да расте или, пак, да екпресира гени кои можат да иницираат малигна трансформација. Некои РНК вируси кои можат да предизвикаат канцер се хуман Т лимфотропичен вирус тип 1 (human T lymphotropic virus type 1), кој може да учествува во адултна Т клеточна леукемија и хепатитис C вирусот, кој може да е причина за хепатоцелуларен карцином. Влијанието на надворешните фактори на малигната трансформација Секое влијание кое предизвикува оштетување на ДНК е потенцијален канцероген фактор. Оштетувањето на ДНК е проследено со обид на клетката да ги репарира оштетените делови. Доколку репарирањето е непотполно, различни типови на мутации се инкорпорираат во ДНК. Притоа, мутации во протоонкогените или тумор-супресор гените можат да бидат проследени со направилности во клеточниот циклус и апоптозата. Животна средина изобилува со канцерогени фактори, кои според карактерот се делат на: хемиски (палета на хемиски соедненија, тешки метали, пестициди, синтетски бои), физички (радијациски зрачења, УВ светлина) и биолошки (вируси). Типичен пример и можеби најсигнификантен, канцероген фактор кој потекнува од животната средина е чадот кој потекнува од цигарите. Епидемиолошките студии покажуваат дека 30% од смртните случаи поради канцер се поврзани со пушењето цигари. За најмалку 60 различни хемиски компоненти од чадот се знае дека имаат потенцијал да ја оштетат ДНК. Некои типови на храна, исто така, се поврзуваат со канцер. Црвеното месо и мастите од животинско потекло се поврзуваат со канцер на дебелото црево, простата и канцер на дојката. Точниот механизам како влијаат на развивањето на канцер не се знае. Некои од претпоставките се дека присуството на анимални хормони можат да предизвикаат неправилна стимулација на клеточната пролиферација или, пак, хемиски канцерогени соедниенија кои се создаваат при термичка обработка на овој тип на хранливи продукти. Дополнителен проблем претставуваат хемиските материи кои се користат за конзервирање на хранителните продукти. Како пример се нитрозамините, кои настануваат при термичко третирање на нитритите. Нитритите, исто така, можат да се трансформираат во нитрозамини во средина на висока киселост каква што е во желудникот. За алкохолот, исто така, се смета дека има канцероген ефект. Еден од канцерогените ефекти на алкохолот е преку индукцијата на хронична инфламација на црниот дроб. Хронична инфламација на останатите ткива, како кожата, белите дробови, дигестивниот тракт, од различни агенси е, исто така, потврден канцероген причинител. Голема група на карценогени соединенија се природните продукти кои се создаваат во растенијата и микроорганизмите. Така еден од најпотентните познати канцерогени материи е афлатоксионот, продукт на некои мувли кои се развиваат на житариците и јаткастите плодови. Дополнително на факторите кои потекнуваат од надворешната средина, мутагени способности имаат и продуктите кои се создаваат при метаболичката активност на 194 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски клетката. Карактеристичен пример за тоа се слободните оксидативни радикали кои ја оштетуваат ДНК и вршат деградација на протеините и липидите во клетката. Се смета дека дневно под дејство на слободните кислородни радикали се индуцираат најмалку 10.000 оштетувања на ДНК. 195 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ЕПИГЕНЕТИКА Во човековото тело има повеќе од 200 различни видови на соматски клетки во кои се сместени околу 25.000 гени. Кои гени ќе бидат активни, односно транскриптирани, зависи од типот на клетката и стадиумот во кој се наоѓа. За време на ембрионалниот развиток кога клетките се помалку диференцирани и се во прогениторна состојба, бројот на гените кои се индуцираат е поголем. Како клетките се диференцираат и добиваат фенотипски карактеристики на адултна клетка бројот на гените кои во неа се активни е лимитиран и карактеристичен за тој тип на клетка. Регулацијата на генската активност ќе зависи од многу фактори кои делуваат во различни периоди и со различен интензитет во процесот на транскрипција и транслација. Овие фактори можат да бидат од генетска и епигенетска природа. Епигенетски особини се стабилни митотски и мејотски наследни фенотипови кои произлегуваат од различната експресија на интактни немутирани гени, односно ДНК секвенции. Епигенетското регулирање на генетската експресија се базира на реверзибилна модификација на ДНК и хроматинот како последица на интеракција на геномот со надоврешната средина. Со помош на овој тип на генетска регулација се овозможува соодветен одговор и адаптација на клетката во средината во која се наоѓа. Под епигеном се подразбира епигенетската сосојба на клетката. Сите соматски клетки во еден организам имаат ист геном кој во текот на животниот век во различни клетки претрпува различни епигенетски модификации, продуцирајќи различни епигеноми. Науката која го изучува епигеномот и епигеномските модификации се вика епигенетика. Епигенетиката се стреми да објасни зошто еднојајчени близнаци и покрај тоа што имаат ист генотип, имаат некои ралични фенотипски белези или, пак, зошто некои заболувања се наследуваат само од алелот кој потекнува од мајката, а други само од алелот кој потекнува од таткото. Како приоритетни цели на епигенетиката се да објасни на кој начин и под кои услови настануваат епигенетските промени и како истите остануваат наследни карактеристики. Многу актуелни се проучувањата на инволвираноста на епигеномот во молекуларниот механизам на заболувањата, пред сѐ неговата инволвираност во различни типови на канцер, астма, дијабетес и слично. Паралено се вршат Слика 194 Влијание на надворешните фактори на интензивни истражувања за епигеномот. Претставен е пример на монозипронаоѓање молекули кои готни близнаци кои имаат идентичен епигеном специфично таргетираат делови на кога ќе се родат. Под влијание на различни фактори епигеномот поврзан со одредени од животната средина епигеномоти на двете заболувања, а со тоа и развивање индивидуи се менува, а со тоа и фенотипот на нов тип на лекови за многу болести. Во основата на епигеномските промени лежат три главни механизма: 1. Реверзибилна модификација на ДНК, при која се додава или одзема метил група, односно метилација и деметилацијна на ДНК; 2. Реверзибилни промени, кои се случуваат во хроматинот, односно додавање или одземање на хемиски групи (метил, ацетил) на хистонските молекули; 3. Регулација на генетската експресија со помош на мали некодирачки РНК молекули. 196 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Метилација на ДНК молекулата настанува после нејзината репликацијата или во стадиумот на диференцирање на клетката. Процесот се базира на додавање на метил група (-CH3) на цитозинот со помош на група на метилтрансферазни ензими. Скоро без исклучок се метилира цитозинот кој е сместен до гванин во структурата наречена CpG динуклеотид. Во модификацијата на активноста на некој ген најчесто имаат CpG групи кои се лоцирани во промоторот на генот. Доколку истите не се метилирани, Слика 195 ДНК метилација. Со посредство на ДНК генот ќе биде активен и метилтрансфераза, метилгрупата од S-аденосилспротивно, доколку се метионин (SAM-CH3) се пренесува до цитозинот и се метилирани, генот ќе биде формира S-аденосилхомоцистеин (SAH) и 5неактивен. Метил групите го метилцитозин оневозможуваат поврзувањето на транскрипционите фактори за промоторот, а со тоа и ја блокираат транскрипцијата. Хистонската модификација се овозможува со додавање на ацетилни, метилни или фосфорни групи на N-терминалниот дел на хистонските протеини. Вака додадените групи на хистонските протеини структурно и просторно го менуваат хроматинот, а со тоа и пристапноста на генити за транскрипционите фактор. На пример, ацетилирање на H3K27 под дејство на хистон ацетил трансферазите го релаксира хроматинот и ја овозможува транскрипцијата. Овој процес е реверзибилен, па под дејство на хистон деацетилазите ацетил групите може да се отстрант од хистоните и притоа, хроматинот се кондезира и се оневозможува транскрипцијата. При контрола на генската активност истовремено се одвиваат повеќе различни хистонски промени кои придонесуваат до менување на хроматинската состојба во пределот каде е сместен генот. Притоа, дали лизинот 9 на H3 ќе биде метилиран зависи од тоа дали истовремено H3 е фосфорилиран или ацетилиран. Доколку серинот 10 е фосфорилиран, метилацијата на лизинот 9 е инхибирана или, пак, доколку лизинот 14 е деацетилиран, се создаваат услови лизинот 9 да се метилира. Ваквата состојба добиена со комплексна модификација на хистонските молекули кои придонесуваат за Слика 196 Хиперметилацијата ја инхибира генеската експресија. Хипометилација на промоторот е предуслов за РНК полимераза II да може да се поврзе и започне трансктипцијата (лево). На хиперметилираниот промоторот метил CpG- врзувачките протеини (MBD) и хистон деацетилазите (HDAC) се врзуваат и оневозможуваат трансктипционите фактори да се поврзат за промоторот (панел десно). Поради тоа транскрипцијата е оневозможена. 197 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски промена на генската активност се вика хистонски код. Комбинации од хистонски модификации овозможуваат секој тип на клетка да има специфичен генетски транскрипционен профил кој е неопходен за клеточната адаптација во дадените услови. На овој начин клетката соодветно реагира и се адаптира на влијанијата од надоврешната средина, а притоа молекулата на ДНК останува непроменета. Слика 197 Епигенетски промени кои се јавуваат на хистонските протеини. Обележани се аминокуселините кои се опфатени со специфичните процеси МикроРНКи (miRNA) Покрај ДНК метилацијата и хистон модификацијата различни кратко некодирачки РНК молекули (miRNAs) учествуваат во епигенетската регулација на генската експресија. Кај човекот се детектирани над 1100 различни миркоРНК молекули кои се неопходни за одвивање на многу клеточни процеси. Нивната инволвираност во биолошките процеси и патофизиологијата на многу болести се предмет на опсежни истражувања. miRNAs се транскиптираат како прекурсорни молекули од 70-100 нуклеотиди кои содржат двоверижна петелка. Прекурсорната молекула со посредство на протеинот dicer се модифицира во едноверижни молекули (siRNAa) кои во цитолазмата се поврзуваат со група на протеини од аргонаут фамилијата и формираат РНК-индуциран инхибирачки комплекс (RISC, RNA-induced silencing complex). RISC делува како посттранскрипционен репресор со тоа што ја деградира целната иРНК. siRNA на база на комплементаронст и го овозможуваат поврзувањето на RISC со целната иРНК и нејзина деградација. Дополнителен алтернативен механизам со кој miRNA делуваат на епигеномот е со посредство на група од аргонаут протеини со кој го формира РНК-индуциран транскрипционен репресирачки комплекс (RITS, RNA-induced transcriptional silencing complex). RITS комплексот ја деградира насцентната иРНК додека сѐ уште е прикачена на РНК полимераза II, односно на ДНК молекулата. На местото каде се одвива овој процес се регрутира метилтрансферазата и дуги протеини кои посредуваат при метилација на лизионот 9 на H3 (H3K9). Покрај метилација на хроматинот, најверојатно, настанува и метилација на цитозинот. Овие промени го конвертираат еухроматинот во факултативен хетерохроматин, притоа гените лоцирани во модифицираниот регион на 198 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски хромозомот се инактивираат. За разлика од вистинскиот хетерохроматин, факултативниот хетерохроматин е реверзибилен и, во зависност од потребите, се трансформира повторно во еухроматин. Епигенетиката и генетскиот импринтинг Цицачите наследуваат по една функционална копија од секој автосомен ген од мајката и од таткото. Некои гени подлежат на генетски импринтиг, при што еден од алелите е неактивен. Притоа, може да станува збор за матернал импринтинг кога не е активен алелот кој потекнува од мајката или за патернал импринтиг кога не е активен алелот наследен од таткото. Генетскиот импринтинг настанува за време на гаметогенезата и тој понатаму се пренесува во останатите соматски клетки по пат на митозата. Како причина за генетскиот импринтинг и инактивирање на некој ген е метилација на CpG регионите во делот на промоторот од тој ген. Кога еден ген ќе се импринтира, тој останува постојано неактивен, независно дали е во периодот на ембриогенезата или постнатално. Најголем број на импринтираните гени имаат улога при формирањето на плодот за време на ембриогенезата. На пример, кај глувчињата, гените кои се сместени на Х хромозомот кој потекнува од мајката се експресираат во плацентата, за разлика од гените кои потекнуваат од хромозомот кој потекнува од таткото. Поради тоа што при генетскиот импринтинг само едниот алел се екпресира, секоја мутација во него фенотипски ќе дојде до израз, односно ќе се однесуваат како доминантни мутации. Дополнителени проблеми настануваат поради тоа што импринтираните гени најчесто се групирани во одреден делови од хромозомот, па кога ќе настане мутација на еден од нив ефектот може да се пренесе и на соседните гени. Промените во импринтираните гени можеат да настанат поради мутацијана во самиот ген, односно ДНК или, пак, поради дисфункционална епигенетска промена (епимутација). Двата типа на мутации предизвикуваат наследни промени во генеската експресија. Со оплодувањето јајце клетката наследува импринтирани гени, кои потекнуваат од мајката и импринтирани гени, кои потекнуваат од таткото. Овие импринтирани гени остануваат во соматските клетки во текот на целиот живот на организмот. За разлика од соматските клетки, во гаметите настанува бришење на стекнатиот генетски импринтинг и индуцирање, односно репрограмирање на нов кој ќе се пренесе во следната генерација. Притоа, во јајце клетката ќе настане репрограмирање кое во новиот организам ќе се пренесе како матерен импринтинг, а, пак, по истиот пример во сперматозоидите ќе се формира патерниот импринтинг. Репрограмирањето настанува во два стадиума: едниот е при формирање на гаметите, а другиот во раната ембриогенеза. Во гаметите, најпрво настанува деметилација со што се брише стариот импринтинг, после кое следува реметилација, односно се формира новиот импринтинг. Пред имплантација на ембрионот кога истиот се наоѓа во стадиум до 16 клетки настанува масивна деметилација. Во периодот на имплантација започнува повторна реметилација со која дефинитивно се формира метилираниот статус на импринтиранионите матерни и патерни гени. Инактивацијата на гените при импринтингот се разликува од класичната епигенетска инактивација на гените со метилација на ДНК. При импринтигот, инактивацијата останува за време на целиот живот, за разлика од класичната метилација која е реверзибилен процес. Најчести заболувања кај човекот со генетска импринтирана етиологија се Ангелмановиот синдом, Прадер-Вили синдром и Беквит-Видеман синдромот (BeckwithWiedemann Syndrome, BWS; OMIM #130650) и Силвер-Расел синдромот (Silver-Russell syndrome; OMIM #180860). Кај овој тип на болести најчесто настануваат промени во импринтираните гени кои кодираат информации за факторите и развивање на клетката. Поради карактерот на гените кои се зафатени, патолошките промени се видливи уште за време на ембрионалниот развиток. Класичен пример е автосомното доминанто заболување Беквит-Видеман синдромот. BWS се карактеризра со прекумерно растење 199 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 198 ДНК метилација за време на ембриогенезата и раниот ембрионален развиток на плодот, дефекти во абдоминалниот ѕид, зголемени органи, голема родилна тежина, и предиспозиции за канцерогени заболувања. Причината за настанување на BWS не се генетски мутации или хромозомски аберации, туку неправилна метилација на неколку импринтирани гени на p кракот на хромозомот 11 (11p15) кои учествуваат во пренаталниот развиток. Помеѓу нив се IGF2 генот, кој се експресира од парениот хромозом и H19 генот, кој се експресира од мајчиниот хромозом. Кај BWS, IGF2 покрај од патерниот, се експресира и од алелот од мајчиниот хромозом, кој нормално е импринтиран. Поради ова, има зголемна експресија на IGF2 која, пак, е причина за зголемено несразмерно растење на плодот или на некои негови делови. Епигенетика и канцер Епидемиолошките проучувања покажуваат висока корелација помеѓу некои комплексни заболувања и факторите од надоврешната средина, како, на пример, поврзаноста на ракот на белите дробови и пушењето. Знаејќи дека дел од епигенетските модификации се во дирекна корелација со стимулансите кои доаѓаат од надоврешната средина, се отвора прашањето за инволвираноста на епигеномот во овој тип на заболувања. Поради ова, денеска се преиспитува или подобро да се каже надградува, класичната теорија за настанување на канцерот поради мутација на еден или повеќе тумор супресор и/или прото-онкоген во одередена клетка која поради тоа ја губи контролата на клеточниот циклус и станува канцер клетка. Сѐ повеќе нови научни истражувања покажуваат дека епигенетските промени во голема мера, ако не и примарна, учествуваат во настанувањето и малигнитетот на канцерот. Така, денеска на канцерот се гледа како заболување во кое се инволвирани како генетски така и епигенетски промени кои придонесуваат за нарушена генетска експресија како основа за развивање на малигнитет. 200 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Првите индикации за инволвираноста на епигеномот во малигнитетот на канцерот се забележани во раните 80-ти од минатиот век. Имено, било утврдено дека ДНК во клетките на канцерот на дебелото црево е значително помалку метилирана отколку во останатите неканцерогени клетки во дебелото црево. Серија од дополнителни испитувања подоцна детерминираат дека глобална хипометилацијата на ДНК е една од основните карактеристики на сите типови на канцер. Глобалната ДНК хипометилацијата предизвикува активација на вообичаено инактивни гени вклучувајќи ги и онкогените. Дополнително дејствува и на активација на импринтираните гени, со што клетката добива дополнителни иноформации за растење и размножување. Хипометлицијата на повторувачките ДНК секвенции, кои се, вообичаено, во хетеророматинските делови на хромозомот, се причина за активација на транспозомните елементи како LINE и SINE кои ја зголемуваат генетската нестабилоност. Последица на тоа се различни типови на хромозомски реорганизации и/или анеуплоидии. Покрај генералната хипометилација, кај различни видови на канцер се среќава и специфична инхибиција на одредени гени со помош на селективна хиперметилација. Како пример е хиперметилацијата, а со тоа и супресијата на BRCA1 кај ракот на дојката и овариумите, APC и MLH1 кај некои форми на колон канцер, RB1 кај ретинобластома и остеосаркома или AR кај канцер на простата. Дополнително на мутацијата на тумор- Слика 199 ДНК метилација во нормална и канцер клетка. (А) Во нормална клетка (горен панел) регионите богати со C и G (CpG остовата), вообичаено, не се метилирани со што се овозможува нормална транскрипција. Спротивно на тоа, алтернативните транскрипцинони почетоци (TSSs) сместени во генот се инактивирани поради метилираност. Кај канцер клетките (долен панел) CpG островцата може да се метилирани, а самите гени да не се метилирани. Тоа е причина за алтернативна транскрипција од алтернативните TSSs. (Б) Во нормалните клетки репетативните елементи и танспозомите се метилирани, а со тоа и инактивни, за разлика од канцер клетките каде овие елементи активно се транскиптираат 201 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски супресор гените, нивната хиперметилација игра важна комплементарна улога во појавата на канцерот. Кај канцерот на мочниот меур често се среќава еден од гените кои го контролираат клеточниот циклус, CDKN2A да е мутиран, а другиот да е нормален меѓутоа хиперметилиран. Поради тоа двата алела се неактивни, а со тоа и клетката ја губи контролата на клеточниот циклус и започнува постојано да се размножува. Ваквата појава на комбинација на еден мутиран и еден хиперметилиран алел е многу честа форма кај фамилијарните типови на канцер. Покрај гените кои го контролираат клеточниот циклус, кај многу типови на канцер се забележуваат и хиперметилирани гени кои учествуваат во клеточното диференцирање, репарирање на ДНК и апоптоза. Во молекуларниот механизам на некои канцери се вклучени и мутација на гени кои го модифицираат епигеномот. Станува збор за гени кои ги кодираат хистон ацетилтрансферазите (HDAC) и хистон деацетилазите (HAT). Пациентите со Рубинстеин-Тајби синдромот (Rubinstein-Taybi syndrome, OMIM#180849) имаат мутација на CREBBP или EP300 кои кодираат ензими со хистон деацетилазна карактеристика. Овие пациенти имаат 300 пати поголеми шанси да развијат одреден тип на канцер споредбено со останатите. Понекогаш од некои онкогени се забележува регрутирање на HDAC во делот на промоторот на некој тумор-супресор ген, а со тоа и негово инактивирање. Механизмот на кој епигенетските фактори ја индуцираат малигната трансформација и видот на клетките во кои истото се случува сѐ уште не е доволно разјаснет. Една од претпоставиките, која сѐ повеќе се поткрепуваат со научни докази, е дека епигенетските промени кои предизвикуваат канцер се случуваат на ниво на матичните клетки на одредени ткива. Како механизми се наведуваат појавата на епигенетско активирање на онкогени или инактивирање на тумор-супресор гени, епигенетско индуцирање на хипометилација, која е појдовна основа за генетска и хромозомска нестабилност и способноста на епигенетските фактори истовремено да ја модифицираат експресијата на повеќе гени кои учестуваат во клеточната пролиферација или диференцијација. Познавајќи ја инволвираноста на епигенетските фактори и епигенетските механизми во канцерогенезата овозможува развивање на антиканцер терапии кои специфично го таргетираат епигеномот. Фокусот на епигенетските терапии е реактивација на гените кои се инактивирани при хиперметилација или хистонската модификација, со што се воспоставува нормална генска екпресија во канцер клетките. Палета од различни молекули кои го таргетираат епигеномот се во претклинички или клинички испитувања за третман на различни видови на канцер. Притоа, целта е да се пронајдат и развијат лекови кои специфично, а не глобално, дејствуваат на епигеномот. Така се развиваат еден тип на лекови кои ќе индуцираат метилација на одредени гени кои се хипометилирани кај одредени видови канцери или, пак, други лекови кои специфично ќе индуцираат деметилација на други гени присутни кај друг тип на канцери. Едни од првите лекови одобрени да се користат во третман на миелодиспластичен синдром и акутната миеолоидна леукемија е децитабинот (decitabine, Vizada). Овој лек е аналог на цитидинот и се инкорпорира во ДНК при нејзината репликација во S фазата од Слика 200 Епигенетски модификатори. Нивото и клеточниот циклус. активноста на протеини кои учестуваат во Метилтрансферазите иреверзибилно формирањето на епигеномот фармаколошки се поврзуваат за децитабинот, со што можат да се модифицираат 202 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски се намалува или оневозможува метилирањето на останатите делови на ДНК, а со тоа и се намалува севкупната метилација во канцер клетката. Инхибиторите на HDAC, исто така, се атрактивна и надежна област за истражување. Овие инхибитори ја оневозможуваат деацетилацијата на тумор-супресор гените, а со тоа непречена експресија на тумор-супресор гените. Вериностат (verinostat, Zolinza) е еден од првите HDAC инхибитори пуштен во употреба кој успешно се користи за лекувања на некои форми на лимфом. Епигенетиката и надворешната средина Надворешните фактори од физичка, хемиска и биолошка природа преку модификација на епигеномот на клетката влијаат на генетската екпресија на клетката. Истражувањата за влијанието на надворешните фактори на епигеномот се базираат на епидемиолошки студии. Така, на пример, децата кои се родени од мајки кои биле бремени во Холандија во период 1944-45 годиниа или во Кина од 1956-61 година имаат поголеми шанси да бидат дијабетичари, да имаат зголемена телесна тежина или да имаат заболувања на коронарните крвни садови. Шизофренијата и други типови на невропсихијатриски заболувања се, исто така, почести кај овие личности во споредба со останатите. Интересно е дека слични симптоми се забележани не само во првата, туку и во втората генерација F2. Заедничко за двете земји е дека во тие периоди имало сериозен недедостаток на храна за исхрана на населението. Директни докази за влијание на надворешните фактори на епигеномот доаѓаат од истражувањата кои се вршат на експериментални животни. Како пример ќе ја земеме бојата на крзното кај лабораториските глувчиња која е под контрола на доминантен ген aguti (А). Кај хомозиготно глувче овој ген (AA) е активен во одреден период од развитокот на влакното. За време на активноста на генот, влакното кое нормално е црно добива жолта линија, а глувчето карактеристичен „агути“ фенотип. Мутација на еден алел на aguti генотип (Avy) предизвикува целото влакно да биде жолто, а со тоа и глувчето да има жолта боја на крзното. Мутацијата на генот настанува поради инсерција на транспозомен елемент во близината на стартниот кодон на aguti генот. Притоа, степенот на метилираност на транспозомниот елемент диктира колку генот ќе биде активен, а со тоа и каква боја ќе има глувчето. Колку транспозомот ќе биде помалку метилиран, толку влакното ќе има повеќе жолта боја и спротивно, колку е пометилиран толку бојата на крзното ќе биде потемна. Интересно, бојата на крзното е и во корелација со телесната маса на глувчињата, па жолтите имаат поголема телесна маса од темните глувчиња. Според ова, глувчиња со идентичен генотип имаат различна боја на крзното и различна тежина која зависни од степенот на метилираност на aguti генот. Идентичен генски алел кој покажува варијабилна експресивност поради влијание на епигенетски фактори се вика метастабилен епиалел (metastable epiallel). Метастабилен означува дека истиот е експресивно променилв, а епиалел дека е епигенетскиот статус е наследен. Доколку хетерозиготни глувчиња кога се бремени се хранат со храна која е богата со метилирачки агенси (фолна киселина, Витамин Б12, или холин) глувчињата кои ќе се родат ќе имаат потемна боја на крзното. Доколку се направи анализа на промоторот на aguti кај новородените глувчиња, ќе се Слика 201 Влијание н аепигенетските забележи поголем степен на метилација. фактори на бојата и големината на глувчињата 203 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ФАРМАКОГЕНЕТИКА Фармакогенетикa е наука која го проучува делувањето на некој лек (ефикасноста, метаболизмот, токсичноста) во зависност од некој специфичен генски алел. Фармакогеномика го проучува делувањето на лекот во зависност од целиот геном. Почетоците на фармакогенетиката започнуваат во доцните 50-те годнини на 20-от век кога подетално се опишуваат различните ефекти на дадени лекови во една популација. Со развивањето на новите молекуларно-биолошки техники и фармакогенетиката бележи брз развиток. Денес, на база на брзо и едноставно генетско испитување на еден или повеќе генски алели, може со голема веројатност да се предвиди позитивниот или токсичниот ефек на некој лек за дадена индивидуа. На овој начин, за секој пациент посебно може да се се одреди соодветната ефективна доза, а притоа да се избегнат несакани споредни или токсични ефекти. Само во САД годишно се пријавуваат повеќе од 200.0000 случаи на споредни несакани ефекти предизвикани од употреба на лекови од кои 100.000 завршуваат со смртоносни последици. Овој податок несомнено говори за неопходноста од фармакогенетиката при третман на секоја индивиуа, односно од имплементацијата на персоналната медицина. Фармакогенетиката најчесто е насочена кон детерминирање на поврзаноста на алелните варијации со фармакокинетиката и фармакодинамиката на лекот. При првиот случај се испитува генетската поврзаност со брзината и ефикасноста со која организмот го абсорбира, транспортира, метаболизира и екскретира одреден лек или неговите метаболити. При детерминирање на фармакодинамичките варијабилности се анализира генетската поврзност и ефектот на некој лек и механизмот на неговото делување. Варијации во фармакокинетскиот одговор во фазата I од метаболизмот на лековите Хуманите цитохром P450 (cytochrome P450) протеини се кодирани од 56 CYP гени групирани во генски фамилии. Заедничко за сите цитохром P450 ензими е дека содржат Fe+2 кое има способност да прима електрон, како, на пример, од NADPH, а со тоа понатаму да катализира различни биохемиски реакци. Една од најчестите реакции во кои учествуваат овие ензими е додавање на еден O атом на јаглеродниот, азотниот или сулфурниот атом. Во фаза I од метаболизмот на лекот со посредсво на цитохром P450 Слика 202 Ензими кои учестуваат во фазата I и II од метаболизмот на лековите 204 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ензими липофилните и хидрофобни молекули се конвертираат во хидрофилни, растворливи молекули во вода. Генерално, три процеса учествуваат во модификацијата: оксидација, редукција и хидролиза. Примарен орган каде се одвива фазата I од метаболизмот на лекот е црниот дроб. Дополнително лекот се метаболизира во дигестивниот тракт, бубрезите, кожата и белите дробови. Доминантна улога во првата фаза од метаболизмот на лековите имаат 6 гени, CYP1A1, CYP1A2, CYP2Y9, CYP2C19 CYP2D6 и CYP3A4. Повеќе од 90% од лековите се метаболизираат од ензимите кодирани од погоре наведените гени (слика бр. 202). Карактеристично за овие гени е дека се јавуваат во различна алелна форма. Полиморфизмот влијае на ензимската активност која може да биде зголемена, намалена или сосема да изостанува, а со тоа се јавуваат и индивидуалните разлики во метаблозимот на лековите. Како за пример, само CYP2D6 се јавува во 26 алелни форми кои влијаат на неговата активност. Помеѓу алелните форми кои ја инактивираат или намалуваат генската активност се точкасти мутации, мутации кои влијаат на сплајсингот или рамката на читање на иРНК. Од друга страна и дупликации на генот се причина за зголемена продукција на ензимот, а со тоа и забрзана метаболична активност. Комбинација од различните генски алели придонесува до различна метаболична активност кон даден лек. Односно, индивидуата може нормално, побавно или побрзо да го метаболизира лекот. Доколку индивидуата побавно го метаболизира, лекот може многу лесно да се интоксицира со зголемена акумулација на истиот. Од друга страна, пак, доколу индивидуата побрзо го метаболизира лекот, во тој случај вообичаената доза за него ќе биде субоптимална. Слика 203 Концентрација на лекот во серумот за време на негова последователна администрација кај пациенти со разлина метаболична способност за даден лек. Кај индивидуата која побавно го метаболизира лекот (левиот панел) неговата концентрација во серумот набрзо ќе постигне токсични вредности. Спротивно, концентрацијата на лекот во плазмата ќе биде во субоптимални вредности кај индивиуата која побрзо го метаболизра лекот (десен панел). Стрелките го прикажуваат времето на администрација на лекот CYP ензимите покрај тоа што играат улога во детоксикација на лековите, тие можат да учествуваат и во активација на истите. Како пример повторно ќе го земеме CYP2D6, кој има спосоност да го конвертира слабиот аналгетик кодеин во 10 пати поактивната форма морфин. Доколку индивидуата има намалена метаболична способност за кодеинот, тогаш неговата улога како аналгетик ќе биде намалена или незначителна. Спротивно, доколку индивидута брзо го конвертира кодеинот во морфин, тогаш и при мали дози на кодеин може да дојде до интоксикација. Алелната варијабилност е популацино специфична, со тоа што е изразена повеќе кај една популација, а помалку или воопшто кај друга. Кај 1 во 14 белци се јавува намалена метаболична активност поврзана со CYP2D6. Од друга страна, алелна 205 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски функционална разлика воопшто не се забележува кај азијатите или нативните Американци. Слична е и популационата разлика и во однос на CYP2C19. Намалена метаболична активност се јавува кај 16% од азијатите додека само 3% кај белците. Ген Дополнителен алелен ефект Лек CYP1A2 ↑и↓ кофеин, пропранолол CYP2C9 ↑, ↓ и 0 ангиотензин II блокери, НСАИЛ, метронидазол, варфарин CYP2C19 ↑и0 антиепилептици, антидепресанти CYP2D6 ↑, ↓ и 0 антиартмици, антидепресанти, антипсихотропни, β- адренергични блокатори, аналгетици CYP3A4 ↑, ↓ и 0 ацетаминофен, антимикотици, кокаин, кодеин, циклоспорин А, диазепам, еритромицин, варфарин Варијации во фармакокинетскиот одговор во фазата II од метаболизмот на лековите Гените кои се вклучени во Фаза II од метаболизмот на лековите, исто така, се застапени со алелна варијабилност. Еден од важните метаболички процеси во оваа фаза е глукоронидацијата со помош на UDP-гликозил-трансферазата (UDP-glycosyltransferase),метаболички процес кој се случува при екскрецијата на билирубинот. Како пример ќе биде наведен камптотецинот (Camptothecin), растителен алкалоид чиј активен метаболит има инхибиторна способност на ДНК топоизомераза I. Поради своите особини да ја инхибира репликацијата на ДНК, камптотцинот се користи како антиканцер хемотерапевт. Под дејство на глукоронат трансферазата, ензим кодиран од UGT1A1 генот, 7-ethyl-10-hydroxycamptothecin се глукоронидира и екскретира во жолчката. UGT1A1 генот се јавува во повеќе алелни форми и притоа, полиморфизмот најчесто е присутен во промоторот на генот. Индивидуите носители на ваквите варијации имаат намалена способност да го метаболизираа ткамптотецинот, а со тоа и ризикот за интоксикација при вообичаена хемотерапија со овој лек е зголемен. Друг карактеристичен метаболички процес во втората фаза од метаболизмот на лековите е ацетилацијата. Ацетилацијата е поврзана со ензимот N-ацетил трансвераза (N-acetil transferase) кој е кодиран од генот NAT2. Еден од првите опишани случаи за индивидуална разлика поради степенот на ацетилацијата на лековите е при третман на туберкулоза со изониазид (isoniazid). Третирани пациенти со изониазид кои имале намалена способност за N-ацетил трансвераза развивале перифени невропатии и имале оштетувања на коскената срцевина. Спротивно, пак, кај пациентите кои имале зголемена активност на ензимот ефектот од терапевтикот во третманот на болеста бил незадоволителен. Како причина за брзото и бавното ацетилирање на изониазидот е полиморфимот во NAT2 генот. Полиморфизам кој предизвикува забавена ацетилација е забележан кај 58% од белата раса, додека само 10-22% во Јапонија и Кина. Сличен е примерот со генот TPMT и ензимот кој го кодира тиопурин метилтрансфераза (thiopurine methyltransferase). Алелната варијација на овој ген 206 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски придонесува за различна активност на ензимот кој го метаболизира 6-меркаптопуринот (6-mercaptopurine), лек кој се користи при третман на леукемија кај детската популација. 207 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Варијација во фармакодинамиката на лекот Глукоза-6-фостат дехидрогеназа (G6PD) е ген кој се наоѓа на Х-хромозомот и го кодира протеинот глукоза-6-фостат дехидрогеназа. Овој ензим има функција да продуцира NADPH, неопходно соединение при неутрализација на оксидативниот стрес во клетката. Недостатокот на G6PD е најчесто ензимско заболување, од кое се зафатени повеќе од 400 милиони луѓе, доминантно мажи, во светот. Еден од десет мажи од африканско-американската полулација се дефициентни за овој ензим. Како причина за G6PD деифициенција се објаснети повеќе од 400 различни алелни форми на G6PD кои, најчесто, потекнуваат од missense мутации. Ваквата алелна разновидност е причина за уште поголема варијабилност во ензимската продукција, а со тоа и во клиничките симтоми. При недостаток на G6PD настанува акумулација на оксидативни радикали во еритриоцитите, и нивно лизирање. Во клиничката слика доминира анемија, жолтица, слабост и малаксаност проследени со тахикардија. Хемолитичка анемија, како последица на G6PD, може да биде иницирана од различни бактериски или вирусни инфекции, некои типови на храна или, пак, некои типови на лекови (primaquine, сулфонамиди). Примаквинот се користи при третман на маларија. Овој лек има оксидативни својства. Доколку во еритроцитите има недостаток од G6PD настанува намалување на редуцираниот глутатион, со тоа способноста на клетката да се справи со оксидативниот стрес се намалува и настанува хемолиза. Кај лица со многу ниски нивоа на G6PD може да се индуцира хемолитичка анемија и со консумација на храна како гравот (Vicia faba) која е богата со оксидативни соединенија. Овој тип на индуцирана анемија е доста честа во Медитеранскиот регион и истата е опишана уште од Питагора, во времето на античка Грција. Треба да се напомене дека во многу случаи носителите на мутацијата G6PD не манифестираат никакви симтоми во текот на целиот живот. Малигна хипертермија е ретка компликација која настанува при анестезија со испарливите анестетици (halothane) и невромускулниот блокирачки агенси (succinylcholine). Се карактеризира со мускулен спазам и покачена телесна температура која достигнува и до 42.3 °C. Доколку навреме не се преземе соодветна терапија и ладење на телото, состојбата е летална. Малигната хипертемија се наследува автосомно доминанто со зачестеност од 1:10.000 до 1:50.000 индивидуи. Заболувањето се поврзува со мутации на повеќе од седум гени. Во 50% од случаите станува збор за мутацијата на RYR1 генот. Овој ген го кодира ријанодин рецепторот кој учествува во транспортот на Ca2+. Покрај RYR1 генот, мутација во CACNA1S, исто така, може да биде прична за малигна хипертермија. Доколку има сомневање и фамилијарна историја за малигна хипертермија, се врши генетско тестирање и in vitro „caffeine-halothane“ контрактилен тест на мускулно ткиво добиено со биопсија. Варфарин (warfarin) е антикоагулант кој го блокира дејството на ензимот витамин К епоксид редуктаза комплекс I (vitamin K epoxide reductase complex I) и се користи за превенција на тромбоемболизам. Витаминот К е есенцијален кофактор при посттанслационата модификација на факторот II, VII, IX и X при коагулацијата на крвта. Само во САД на 20 милиони пациенти годишно им се препишува варфарин. Како споредни несакани ефекти при терапијата со овој лек се јавуваат обилни крварења кои можат да бидат летални кај 0.1% до 1% од пациентите. На терапевсткото дејство, како и на несаканите ефекти од варфаринот, влијаат многу фактори од генетска природа и надорешната средина (исхрана, лекови, микрофлора во дигестивниот тракт). Поради тоа, неопходно е внимателно дозирање на лекот и ригорозен мониторинг на антикоагулантниот статус на пациентите. 208 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ГЕНОМСКИ ВАРИЈАЦИИ И ИНДИВИДУАЛНИ ГЕНЕТСКИ РАЗЛИКИ Секоја индивидуа изгледа и се однесува уникатно. Едноставно е невозможно да се најдат две идентични инвивидуи. Дури и да се анализаират монозиготни близнаци ќе зе забележат бројни разлики. Прашањето е на што се должи уникатноста на секоја индивиуа. Поедноставено, уникатноста и специфичноста на секој производ на генетската активност и влијанието на животната средина. Како и да е, сѐ уште сме далеку од прецизен одговор кој ќе ги идентификува сите генетски варијации и сите надворешни фактори кои придонесуваат за индивидуалните разлики. Интензивните генетски анализи потикнати од новите технологии, кои овозможуваат евтино и брзо секвенционирање, секојдневно откриваат нови одговори, меѓутоа истовремено и поставуваат нови загатки поврзани со уникатноста на индивидуата. Еден од најголемите проекти, чија основна цел беше да се утврди генетската разлика во хуманата популација, е „1000 Геном проектот“ (1000 Genomes Projec). Во склоп на овој Проект од 2008 до 2015 се секвенционирани ДНК примероци од 2504 индивидуи кои припаѓаат на 26 различни популации од целиот свет. Со оваа анализа се идентификувани 84.7 милиони полиморфизми во еден нуклеотид (SNPs), 3.6 милиони различни инсерции и делеции (INDELs) и 60.000 структурални варијации. Притоа се идентификувани >99% SNPs варијации кои се застапени со >1% во популацијата. Полиморфизам во еден базен пар (Single Nucleotid Polymorphisms, SNP) Разликите во еден базен пар распространети низ целиот геном се забележуваат на секои 500 базни парови (1:500). Доколку полиморфизмот на одерен нуклеотид е присутен во повеќе од 1% од поплуацијата станува збор за SNP. Доколку е помал од 1% и притоа истиот е причина за промена на функцијата на таа секвенција станува збор за мутација на еден базен пар или точкаста мутација. Популационите истражувања покажуваат дека секои две индивидуи имаат 0.1% разлика во своите SNP или тоа е некаде околу 6.000.000 различни базни парови. Мора да се напомене декa овие разлики се најчесто во интроните или, пак, во протеин некодирачките делови од геномот. Со тоа нивната функција, најчесто, е незначителена или никаква. Спротивно, SNP кои се лоцирани во протеин кодирачките секвениции можат да имаат значителна фенотипска улога. За синонимен SNP станува збор кога полиморфизмот не придонесува за промена на аминокиселината, за разлика од несинонимните SNP при Слика 204 Шематски приказ на полиморфизам во кои настанува промена на еден базен пар (SNP) аминокиселината. Инсерции и делеции (INDELs (INsertion/DELetion) INDELs се кратки ДНК секвенциикои содржат инсерции, делеции или инверзии. Според некои класификации можат да бидат големи од 1 до 1000 bp, а кон други можат да бидат и многу поголеми. Интересно е дека индивидуите се разликуваат повеќе во однос на INDELs отколку според SNP. Разликата помеѓу две индивидуи во INDELs е некаде одколку 0.5%, односно 30.000.000 bp. INDELs најчесто се јавуваат во повторувачките секвенции на ДНК. Доколку истите се во протеин кодирачката 209 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски секвенција, можат да предизвикуваат нарушувања на рамката на читање при транслацијата, а со тоа и предизвикаат драстична промена на структурата на протеинот. Варијација во бројот на копиите на гените (Copy Number Variation, CNVs) CNV е бројот на копиите на одреден ген во генотипот на дадена индивидуа. До неодамна, генерално, беше прифатено дека најголем број од 25.000-30.000 гени кои сесодржат во хуманиот геном се застапени во две копии, односно два алела. Најновите резлутати од секвенционирањето на ДНК покажуваат дека големи сегменити од ДНК, од неколку илјади до неколку милиони bp, се среќаваат во повеќе копии. Овие се ДНК варијации кои настануваат поради дупликација или делеција на одреден сегмент. Повторувањата можат да бидат кратки, составени од два или три нуклеотида, или подолги. Притоа, во поголемите CNVs можат да се инкорпорираат еден или повеќе гени. Со тоа се добиваат варијација и во копиите, односно бројот, на еден гените. Така еден ген наместо да биде застапен во две копии, може да се сретне во три, четири, па и повеќе. Во поретки случаи CNVs се исто причина за единечно присуство на некој ген. Поради CNVs може да дојде до различно ниво на експресија на некој ген, кое, пак, од своја страна може да е причина за фенотипски варијации или одредени заболувања. Се проценува дека некаде околу 5-10% од геномот се состои од CNVs. Како и останатите генетски мутации, така и CNVs можат да се наследат, меѓутоа и да се стекнат de novo. Моментално се истражуваaт ефектите од CNVs во дефинирање на индивидуалните разлики, ефектите на фенотипот и како и Слика 205 Пример за варијација во бројот на нивна поврзаност со некои генетски копиите на гените (Copy Number Variation, заболувања. (CNVs)) во геномот 210 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски МАТИЧНИ КЛЕТКИ (STEM CELLS) Матични клетки се вид на клетки кои имаат спосност за самообновување (selfrenewal) и диференцирање во различни видови на клетки. Овие клетки имаат теоретска способност неограничено митотски да се размножуваат и притоа дел од новодобиените клетки да ги задржат карактеристиките на клетката мајка, односно карактеристиките на матичните клетки. При одредени услови матичните клетки се диференцираат, односно специјализираат за вршење на одредена функција. Процесот на диференцијација опфаќа серија на контролирани процеси при кои одредени гени се активираат, а други инактивираат. Сигналот за диференцијација најчесто потекнува од микросредината во која клетката се наоѓа, односно од меѓуклеточната интеракција, интеракцијата со екстраклеточниот матрикс, факторите на растење или хормоните. Некои матични клетки имаат спосбност за диференцијација во многу различни видови на клетки за разлика од други кои имаат повеќе лимитиран потенцијал. Така на пример, зиготот или оплодената јаце клетка има способност да се диференцира во сите клетки на организмот вклучувајќи ги и екстраембриналните ткива како плацентата. За ваквите клетки се вели дека се тотипотентни (totipotent). Матичните клетки се плурипотенти (pluripotent) кога можат да се диференцираат во сите типови на клетки на организмот, некаде околку 220 видови во човековото тело. Таков е примерот со ембрионалните матични клетки. Кога клетките можат да се диференцираат во лимитирана група на клетки, на пример во клетки од мезенхимално потекло, станува збор за мултипотентни (multipotent) клетки. Едни од најмногу проучуваните клетки од овој вид се мезенхималните клетки од коскената срцевина кои лесно се диференцираат во хондробласти, остеобласти или адипоцити. Унипотентни (unipotent) клетки се оние кои се диференцираат во еден тип на клетки. Овде најчесто спаѓаат ткивно специфичните матични клетки, на пример, сателитските клетки на мускулите кои нормално се диференцираат само во миобласти. Уникатните карактеристики за самообновување, екстензивно размножување и плурипотенција ги детерминира матичните клетки како клучен фактор во регенерацијата на ткивата. Нивната улога во обновување, одржување и стареењето на ткивата и органите, а со тоа и на организмот е неспорно. Дополнително на тоа, матичните клетки се посочуваат како клучен клеточен извор во регенеративната медицина. Интензивно се откриваат нови механизми и се Слика 206 Уникатни карактеристики на развиваат нови технологии за матичните клетки. Самообновувањето и генерирање на клетки, ткива и органи од способноста да се диференцираат во одреден матични клетки кои се користат за тип на клетки се главната одлика на матичните клетки регенерација или замена на оштетени ткива или органи. Хуманите ембринални матични клетки (Human Embryonic Stem Cells; hESCs) Со оплодување на јаце клетката се формира зиготот, кој за 5 до 7 дена се развива во бластоциста. Од ембриналниот диск (inner cell mass) на бластоцистата може да се изолираат ESCs. Овие клетки имаат плурипотентен потенцијал да се диференцираат. Како најчест извор на бластоцисти за изолација на hESCs се ембриони кои се генерираат при in vitro фертилизација (IVF). Вообичаено, само мал број на ембриони добиени за потребите на IVF се користат за имплантација, а останатите се уништуваат 211 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски или криопрезервираат. Се проценува дека само во САД има над 400.000 криопрезервирани ембриони. Една од одликите на ESCs е способноста екстензивно да се размножуваат без да ги изгубат своите карактеристики. Притоа, една клетка во период од неколку години поминува и над илјада клеточни циклуси. Оваа способност во дел се должи на зголемената теломеразна активност. Дополнително важна одлика е што овие клетките можат лесно да се криопрезервираат и како такви да се чуваат долги периоди без притоа да претрпат позначителни промени. Слика 207 Генерирање на ембрионални матични клетки од ембрионалниот диск на балстоциста добиени при in vitro фертилизација (IVF) Под дејство на специфично детерминирани фактори ESCs можат да се диференцираат in vitro во палета на различни типови на клетки. Дефинирањето на фактрорите за диферецијација е клучен чекор во добивање на соодветени клеточни линии. Комплексноста се зголемува со фактот дека за генерирање на секој тип на клетки потребни се специфични улсови за таа линија. Поради тоа, факторите кои индуцираат диференцијација на ESCs во хондроцити не се истите со факторите кои индуцираат остеогенеза. При диференцијација поркај физичките фактори, неопходно влијание имаат и факторите на растење, хормоните, пептидите или малите молекули кои се додаваат во хранливиот медиум. Кои сигнални молекули во кој период од диференцирањето ќе се користат најчесто се одредува на база на податоците добиени од истражувањата направени на ембриогените процеси. Во суштина, процесот на диференцирањето на ESCs in vitro е потребно да ја стимулира диференцијацијата на овие клетки in vivo. Слично е и влијанието на физичките фактори при генерирање на одредени видови на клетки. Еден од важните фактори кои треба секогаш да се земе во предвид е начинот на култивирање на клетките. Клетките најчесто се размножуваат во еден слој прикачени на одредена површина (специфично третирана пластика). За стимулирање на диференцијацијата подобро е клетките да се култивираат во повеќе слојни култури односно во 3 димензионалнен матрикс (3D culture). 3D структурите најчесто се постигнуваат со одредени скафолди, кои можат да бидат од органска или неорганска природа и имаат специфична градба, тврдост, еластичност и порозност. 212 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Хидростатичките и хидродинамичните притисоци, температурата и гасовите кои ги опкружуваат клетките се, исто така, важен фактор при нивна диференцијација. За соодветна контрола на овие фактори клетките се култивираат во специфично дизајнирани биореактори. Како за пример, доколку се сака да се индуцира хондрогенеза, потребно е клетките да се култивираат во 3D култура со што ќе се обезбеди соодветна клеточна интеракција и ткивна кондензација, и истовремено да се стимулираат со факторите за растење од фамилијата на TFGβ. Овие услови во одреден степен ја симулираат хондогенезата која се случува во енходријалната плоча. Доколку клетките ги примат соодветните сигнали ќе ги индуцираат специфичните каскадни хондрогени процеси при кои клетката од ембрионална плурипотентна ќе прејдат во високо специјализиран хондроцит. Покрај хуманите, во последните 20-на години се генерирани ESCs од различни животни вклучувајќи глувци, зајаци, говеда, коњи, кучиња и мачиња. За овие клетки се развиени успешно протоколи за екстензивна експанзија и диференцирање. ESCs многу лесно се диференцираат во хематопоетски клетки, неврони и неуроглија, остеобласти, хондобласти, адипоцити, миобласти, кардиомиобласти, ендотелни клетки, гамети, хепатоци, инсулин секретирачки β клетки, и многу други. Покрај способноста за диференцијација in vitro, овие клетки покажуваат и способност за диференцијација in vivo а со тоа и за функционална ткивна регенерација. Адултни матични клетки Колку и да е голем клиничкиот потенцијал ESCs во склоп на регенеративната медицина, сепак нивната употреба е лимитирана од неколку причини. Една од најконтраверзните причини е изворот на овие клетки. Според многу, користењето на бластоцисти односно ембриони не е етички и се коси со религиозните сфаќања и убедувања. Како алтернатива на ESC се адултните матични клетки кои се сместени во различни ткива во адултниот организам. Нивниот број е лимитиран и пролиферативните и мултипотентните способнотите им се органичени во однос на ESCs. Како и да е, овие клетки се успешно изолирани од скоро сите ткива, вклучувајќи ги коскената срцевина, адипозното ткиво, пулпата на млечните заби, крвта во папочната врвца, амнионската течност, мозокот, срцевиот мускул, пакнреасот. Притоа, за изолација е доволно само мал примерок на ткиво добиен со биопсија. При изолација на овие клетки се прават напори истите да се добијат во што е можно почиста култура. Односно, изолираната клеточна линија од атултни матични клетки да не е контаминирана со друг вид на клетки, најчесто фибробласти. За оваа цел се користат антитела кои препознаваат специфични маркери кои се наоѓаат на површината на клеточната мембрана. Како за примери, кај луѓето и глувците SSEA4 рецепторот може да се користи за изолација на мезенхималните матични клетки од коскената срцевина, а CD34 за изолација на хематопоетски матични клетки. Некои маркери се присутни само кај одредени видови, така CD56 се користи за излоација на сателитските клетки од мускулите кај луѓето, а VCAM/α7-int за изолација на истите клетки кај глувците. После изолацијата, следен предизвик е нивна експанзија in vitro без да го изгубат потенцијалот за диференцирање. Способноста да пролиферираат in vitro е различна и зависи од видот на клетките. На пример, мезенхималните клетки од коскената срцевина имаат способност екстензивно да се размножуваат in vitro и притоа да го задржат мултипотентниот карактер. Спротивно, таа способност ја немаат мускулните клетки, кои после неколку репликации in vitro ја губат способноста за фунционално регенерирање на мускулното ткиво при трансплантација. 213 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Слика 208 Шематски приказ на поставеноста на мезенхималните матични клетки (MSCs) и хематопоетските матични клетки (HSCs) во коскената срцевина Индуцирани плурипотентни матични клетки Поради етичките причини поврзани со користење на ембрионалните матични клетки и лимитираниот дифернцирачки потенцијал на адултните матични клетки неопходно беше развивање на нова технологија која ќе генерира клетки се со слични особини како ESCs, а притоа истите нема да потекнуваат од ембриони. Интензивните истражувања резултираа со епохално откритие кое овозможи нуклеарно репрограмирање на соматските клетки. Претходно се сметаше дека диференцирана клетка до одреден степен не може да се врати во недиференцирана или помалку диференцирана состојба (дедиференцира). Техологијата, која овозможува репрограмирање на клетките, се состои од менување на транскрипциониот профил на соматските клетки од различни ткива, најчесто фибробласти, со што истите добиваат карактеристики на плурипотентни матични клетки. Првата опишана метода на репрограмирање за која Јаманака (S. Yamanaka) ја доби Нобеловата награда за медицина и физиологија во 2012 година се базира на четири гени кои функционално припаѓаат во групата на транскрипциони фактори. Неговата лабораторија ги генерира првите индуцирани плурипотентни матични клетки (induced Pluripotent Stem Cells; Слика 209 Постапка на репрограмирање на iPSCs) од фибробласти изолирани од соматските клетки во IPSc и можноста за глушец со помош на гените c-myc, Oct4, нивна диференцијација Sox2 и Klf4 инкорпорирани во 214 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ретровирусни вектори. Истовремената експресија на овие четири гени придонесува до репрограмирање на фибробластите до клетки кои наликуваат на ембрионални матични клетки. Добиените iPSCs се способни за неограничена пролиферација и плурипотентна дифренцијаја in vitro и in vivo. Степенот на репрограмирање каj овие клетки е во тој размер што од нив дури може да се генерираат и трансгенетски глувци на ист начин како што се генерираат од ESCs. После иницијалното откритие, iPSCs се генерирани од клетки кои потекнуваат од различни ткива (адипоцити, миобласти, невроглија...) и организми (човек, куче, маче, зајак...). Во последните години се прават напори да се генерираат iPSCs со помош на што е можно помала генетска манипулација. Имено, кога се користат ретро вируси истите се интегрираат во геномот на клетката која се репрограмира. За да се избегне ова, репрограмирачките фактори се внесуваат во клетките со помош на вектори кои привремено се екпресираат и не се интегрираат во геномот. Нови опишани начини се и со помош на иРНКи или протеини од погоре споменатите транскрипциони фактори. Слика 210 Морфологија на клетките за време на репрограмирањето. Првите видливи морфолошки клеточни промени се забележуваат после 5-6 дена од трансформацијата со репрограмирачките фактори. После две недели се добиваат потполно репрограмирани iPSCs. На 14 ден е видлива една карактеристична клеточна колонија составена од стотици iPSCs Потенцијална апликација на матичните клетки Сознанијата стекнати за матичните клетки во последните 20-тина години ветуваат многу за нивната потенцијална клиничка употреба. Истражувањата во кои се инволвирани матичните клетки се едни од најмасовните во областа на клеточната биологија и регенеративната медицина, така што нема ден, а да не се објави некое ново истражување поврзано со нив. Потенцијлната употреба на матичните клетки секојднeвно сѐ повеќе се проширува. Матичните клетки се користат за генерирање на клетки in vitro кои би се користеле за регенерација на ткива in vivo, се користат за изучување на механизмите инволвирани во ембрионалниот развиток, се користат за истражување на механизми на генетските заболувања, се користат како клеточни модели за испитување и пронаоѓање нови активни молекули кои би се користеле како лекови, се користат како носачи на генетска терапија или, пак, за генерирање на ткива и/или органи во биореактори. Се смета дека матичните клетки се едни од најнадежните за третман на Алцхајмерова болест, амиотрофична латерална склероза (ALS), дијабетес, хронични повреди на рбетниот мозок. Листата на болести кои потенцијално можат да се третираат со матични клетки е голема, меѓутоа бројот на одобрени третмани сѐ уште е многу мал. 215 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски Се смета дека дневно само во САД умираат 3.000 луѓе кои би можеле да се третираат со матични клетки. Едни од најчесто употребуваните клетки за клинички потреби се хематопоетските матични клетки и мезенхималните матични клетки од коскената срцевина. На пример, хематопоетските матични клетки рутински се користат при третман на леукемии или како неопходна придружна терапија после радијација и хемотерапии. Матичните клетки од крвта на папочната врвца се употребуваат за третман на пациенти со српеста анемија или други проблеми со крвта. Студиите за регенерација на оштетен срцевиот мускул од инфаркт сѐ уште се во стадиум на претклинички и клинички студии. Овие истражувања покажуваат дека матичните клетки од коскената срцевина или адипозното ткиво имаат способност да ја подобрат регенерацијата на оштетеното срцево мускулно ткиво. Тие најчесто делуваат индиректно како имуномодулатори во зоната на инфарктот. Интересно е да се напомене дека матичните клетки имаат способност да мигрираат и да се локализраат во оштетените ткива. Доколку ове клетки се инјектираат во крвотокот многу брзо ќе се локализираат во периферната зона на инфарктот. Дополнително, има докази дека одредени видови на матични клетки имаат способност да се диференцираат и во кардиомиоцити со што директно можат да учествуваат во регенерација на оштетениот срцев мускул. Интересни се клиничките студии во кои се користат ESCs за третман на ретинална дегенерација и за третман на ALS. Особено е важен неурогениот потенцијал на Слика 211 Можна примена на индуцираните плурипотентни матични клетки (iPSCs). Соматски клетки изолирани од пациент (пр. фибробласти) се репрограмираат со помош на Oct4, Sox2, Klf4 и cMyc. Овие клетки имаат ист генотип како и пациентот од кои се изолирани. Генерираните iPSCs можат екстензивно да се размножуваат во недиференцирана состојба или, пак, да се диференцираат во одреден тип на прогениторни клетки. Добиените клетки можат генетски да се корегираат, односно да им се отстрани мутацијата која ја поседуваат и да се употребат за клеточна терапија. IPSc носители на мутацијата можат да се употребат како клеточен модел на кој ќе се изучува на болеста или, пак, ќе скенираат молекули кои би се користеле како потенцијални лекови 216 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ембрионалните матични клетки бидејќи нервното ткиво е тоа кое има најмала способност за регенерација. Како пример, глувци со повреда на рбетниот мозок со помош на трансплантирани неуропрогениторни клетки добиени од ESCs повторно ја враќаат способноста за движење. Еден од приоритетите на истражувањата со ESCs е генерирањето на цели органи in vitro кои понатаму би се користеле за трансплантација. Проблемот од недостаток на органи за трансплантација е неспорен, со тоа придобивката да се има технологија со кој ќе можат да се создадат пациент-специфични органи е бесценета. Моментално истражувањата се одвиваа во неколку правци. Едниот е со помош на биорекатори и соодветни скафолди да се создадат услови за формирање на специфични органи. Скафолдот создава услови клетките да се размножуваат и диференцираат во 3D средина. Како скафолди се користат различни природни (колаген, еластин) и/или синтетски молекули (нано честички) кои на еден или друг начин допринесуваат за формирањето на ткивото. Интересен е пристапот со користење на децелуларизирани органи како скафолди. Оваа технологија се базира на хемиски третман со кој се остарнуваат клетките, а останува само екстрацелуларниот матрикс од органите добиени од кадаври. На вака подготвените органи се нанесуваат пациент специфични матични клетки. Клетките се размножуваат, диференцираат и стануваат функционални, со што и органот станува функционален. На ваков начин е генерирана коска, срце, мочен меур, скелетен мускул и др. Вториот пристап, кој сѐ повеќе е популарен, е генерирање на органи од пациент специфични iPCs во животни. При ова матичните клетки од пациентите се инјектираат во саканиот орган за време на ферталниот развиток на животното. Трансплантираните клетки, поради својата потентност, ќе учествуваат во формирањето на тој орган. Интересно е дека вака формираниот химерен орган може да има карактеристики на органот на донорот. Истражувањата покажуваат дека ако на глушец, кој е генетски модифициран за да не може да му се развие панкреас, му се инјектираат iPSCs од стаорец во пределот каде треба да се развие панкреас за време на ембриогенезата, ќе се генерира панкреас. Овој панкреас добиен од трансплантираните клетки морфолошки и функционално ќе наликува на панкреасот од стаорец и покрај тоа што се наоѓа во глушец. Истиот принцип се користи и за добивање на хумани или хуманизирани органи, притоа како реципиенти се користат трансгенетски свињи. Дополнителна придобивка за iPSC технологијата е можноста за генерирање на пациент специфични клетки. Овие клетки можат да се употребат за клеточна терапија и за изучување на болеста на пациентот. Доколку се користат за клеточна терапија, се овозможува автологна трансплантација, а со тоа и минимална веројатност за имнуоотфрлање на графтираните клетки или ткива. При клеточна терапија доколку има потреба iPSCs, можат и генетски да се модифицираат пред да се трансплантираат. На пример, од пациент со Душен мускуларна дистрофија многу лесно можат да се добијат iPSCs со репрограмирање на која и да е соматска клетка. Добиените iPSCs ја носат истата мутација во генот на дистрофин како и паценитот од кој се добиени. Со генетска манипулација, мутацијата во дистрофинот може да се се коригира. Вака коригираните IPSCs можат да се размножат во голем број и од нив да се добијат миобласти кои би се трансплантирале назад во пациентот. Многу важна придобивка од пациент специфичните iPSCs е нивната употреба како клеточен модел во изучување на генетските заболувања. Овие клетки поседуваат идентичен генотип како и индивидуата од која се добиени. Исто толку значајно е што овие клетки може да се користат и како модел на кој ќе се тестираат различни молекули или лекови за развивање на специфична терапија. 217 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски КОРИСТЕНА ЛИТЕРАТУРА 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Tropp B., Molecular Biology, 4th edition, Jones & Bartlett Learning; 2011. Tropp B., Principles of Molecular Biology, Jones & Bartlett Learning; 2012. Tobias S.E., Essentials Medical Genetics, 6thedition.Wiley-Blackwell; 2011. Turnpenny P., Emery`s Elements of Medical Genetics, 14 edition, Elsevier 2012. Schaefer B. G., Medical Genetics: An Integrated Approach, McGraw-Hill; 2014. Brooker J. R., Genetics: Analyses & Principles, 5th edition, McGraw-Hill; 2014. Rosenberg E. L., Human genes and genom, 1th edition, Elsevier 2012. Sanders F. M., Genetics analyses: an integrative approach, Pearson Education; 2012. Watson D. J., Molecular Biology of the Gene, 7th edition, Pearson; 2013. Brown T. A.,Genomes, 2nd edition, Oxford: Wiley-Liss; 2002. William S. K., Essentials of Genetics, 8thedition, Benjamin Cummings; 2012. Lodish H., Molecular Cell Biology, 8th edition, New York: W. H. Freeman; 2016. Alberts B.,Molecular Biology of the Cell, 6th edition, New York: Garland Science; 2014. Berg J. M., Biochemistry, 5th edition,New York: W H Freeman; 2002. Cooper G. M., The Cell: A Molecular Approach, 6nd edition, Sinauer Associates; 2013. Weaver R., Molecular Biology, 5th edition, McGraw-Hill Higher Education; 2011. 218 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски БИОГРАФСКИ ПОДАТОЦИ Дарко Бошнаковски е вонреден професор на Факултетот за медицински науки на Универзитетот „Гоце Делчев“- Штип и визитинг професор на Медицинскиот факултет на Универзитетот од Минесота, САД. Неговите научни истражување се во областа на генетскиот инженеринг и регенерацијата на ткива со употребна на адулни и ембрионални матичните клетки. Во последните петнаесетина години интензивно работи на проучување на молекуларниот механизам на FSHD, како и на пронаоѓање на специфична терапија за овој тип на мускуларна дистрофија. 219 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски 220 Молекуларна биологија со генетика | Дарко Бошнаковски ISBN 978-608-244-513-7 221 ОСНОВИ НА ХУМАНА ГЕНЕТИКАПРАКТИКУМ Даниела Тодосиева Емилиа Андова Марија Караколевска-Илова Дарко Бошнаковски 0 Даниела Тодосиева, Емилиа Андова, Марија Караколевска-Илова, Дарко Бошнаковски ОСНОВИ НА ХУМАНА ГЕНЕТИКАПРАКТИКУМ Штип, 2018 м-р Даниела Тодосиева, д-р Емилиа Андова, асс. м-р д-р Марија Караколевска-Илова ОСНОВИ НА ХУМАНА ГЕНЕТИКА- ПРАКТИКУМ Автори: м-р Даниела Тодосиева д-р Емилиа Андова асс. м-р д-р Марија Караколевска-Илова проф. д-р Дарко Бошнаковски ОСНОВИ НА ХУМАНА ГЕНЕТИКА-ПРАКТИКУМ Рецензенти: проф. д-р Татјана Рушковска проф. д-р Невенка Величкова Лектор: Виолета Каракунова Уредник: Техничко уредување: м-р Даниела Тодосиева д-р Емилиа Андова асс. м-р д-р Марија Караколевска-Илова Издавач: Универзитет „Гоце Длечев“ – Штип Објавено во е-библиотека: https://e-lib.ugd.edu.mk CIP - Каталогизација во публикација Национална и универзитетска библиотека "Св. Климент Охридски", Скопје 575.1:61(035) ОСНОВИ на хумана генетика [Електронски извор] : практикум / автори Даниела Тодосиева ... и др. - Штип : Универзитет "Гоце Делчев", Факултет за медицински работи, 2018 Начин на пристап (URL): https://e-lib.ugd.edu.mk/717. - Текст во PDF формат, содржи 99 стр., илустр. Наслов преземен од екранот. - Опис на изворот на ден 13.04.2018. - Автори: Даниела Тодосиева, Емилиа Андова, Марија Караколевска - Илова, Дарко Бошнаковски. Библиографија: стр. 99 ISBN 978-608-244-514-4 1. Тодосиева, Даниела [автор] 2. Андова, Емилиа [автор] 3. Караколевска - Илова, Марија [автор] 4. Бошнаковски, Дарко [автор] а) Хумана генетика – Прирачници COBISS.MK-ID 106952970 2 УНИВЕРЗИТЕТ „ ГОЦЕ ДЕЛЧЕВ “-ШТИП ФАКУЛТЕТ ЗА МЕДИЦИНСКИ РАБОТИ Автори м-р Даниела Тодосиева, д-р Емилиа Андова, асс. м-р д-р Марија Караколевска-Илова, проф. д-р Дарко Бошнаковски ОСНОВИ НА ХУМАНА ГЕНЕТИКА-ПРАКТИКУМ Штип, 2018 3 ПРЕДГОВОР Практикумот „Основи на хумана генетика“ е учебно помагало потребно за изучување на наставната програма на предметот „Основи на хумана генетика“ кој е во склоп на студиската програма на стручните студии на Факултетот за медицински науки при Универзитетот „Гоце Делчев“ Штип. Истиот е во согласност со предвидената Наставна програма и е прилагоден во однос на лабораториите и можностите за изведување на практична настава на Факултетот за медицински науки-Штип. Од авторите 4 Содржина Вежба бр.1 ................................................................................................................ 7 Морфологија на хромозоми ................................................................................. 7 Морфолошки диференцијации на хромозомите................................................. 8 Метод на анализа ............................................................................................... 10 Цитогенетска номенклатура ............................................................................... 14 Кариотип, кариограм, идиограм ......................................................................... 14 Прашања: ............................................................................................................ 16 Вежба бр.2 .............................................................................................................. 18 FISH (Fluorescence in situ hybridisation, Флуоресцентна in situ хибридизација) .............................................................................................................................. 18 Прашања: ............................................................................................................ 23 Вежба бр.3 .............................................................................................................. 24 Хромозомски аберации ...................................................................................... 24 Нумерички хромозомски аберации .................................................................... 25 Автосомни хромозомски аберации .................................................................... 26 Aнеуплоидија на половите хромозоми .............................................................. 28 Прашања: ............................................................................................................ 31 Вежба бр.4 .............................................................................................................. 33 Наследување на својства ................................................................................... 33 Монохибридно и дихибридно вкрстување ........................................................ 33 Мултифакториелно наследување ..................................................................... 37 Прашања: ............................................................................................................ 39 Вежба бр. 5 ............................................................................................................. 40 Популациона генетика ........................................................................................ 40 Прашања: ............................................................................................................ 44 Вежба бр.6 .............................................................................................................. 45 Родословно стебло – хередограм ..................................................................... 45 Автосомно доминантно наследување ............................................................... 47 Автосомно- рецесивно наследување ................................................................ 48 X-врзано наследување ....................................................................................... 50 Прашања: ............................................................................................................ 54 Вежба бр.7 .............................................................................................................. 55 Наследување на крвни групи ............................................................................. 55 Одредување на крвна група ............................................................................... 56 5 Наследување на крвна крупа од ABO сиетсмот ............................................... 57 Наследување на Rh (Резус) факторот .............................................................. 58 Вежба бр.8 .............................................................................................................. 61 Пренатална дијагностика и генетско советување ............................................ 61 Неонатален скрининг .......................................................................................... 64 Генетско советување .......................................................................................... 64 Прашања: ............................................................................................................ 67 Вежба бр.9 .............................................................................................................. 68 Електрофореза ................................................................................................... 68 Гел електрофореза ............................................................................................. 68 Полиакриламид гел електрофореза (PAGE) .................................................... 68 Полиакриламид гел електрофореза (PAGE) SDS-PAGE ................................. 69 Раздвојување на протеините врз основа на нивната изоелектрична точка ... 70 Дводимензионална гел електрофореза ............................................................ 71 Гел електрофореза во пулсирачко поле – PFGE ............................................. 71 Електрофореза на агарозен гел ........................................................................ 72 Прашања: ............................................................................................................ 74 Вежба бр.10 ............................................................................................................ 75 Изолација на нуклеински киселини ................................................................... 75 Изолација на ДНК од различни биолошки материјали .................................... 77 Мерење на концентрацијата и чистотата на нуклеинските киселини ............. 78 Изолација на РНК ............................................................................................... 80 Прашања: ............................................................................................................ 82 Вежба бр.11 ............................................................................................................ 83 Екстракција на протеини .................................................................................... 83 Јоноизменувачка хроматографија ..................................................................... 83 Гел филтрациска хроматографија ..................................................................... 84 Афинитетна хроматографија ............................................................................. 85 Прашања: ............................................................................................................ 87 Вежба бр.12 ............................................................................................................ 88 Блотирачки (blotting) техники ............................................................................. 88 Прашања: ............................................................................................................ 92 Вежба бр.13 ............................................................................................................ 93 Полимераза верижна реакција (Polymerase chain reaction (PCR)) .................. 93 Видови на полимераза верижна реакција ......................................................... 96 Прашања: ............................................................................................................ 98 Користена литература: ........................................................................................... 99 6 Вежба бр.1 Морфологија на хромозоми Хромозомите претставуваат структурни елементи на јадрото. Изградени се од хроматин кој е доминантно составен од ДНК и протеини. Хромозомите се носители на генетските информации на секоја клеткa. Имаат карактеристична форма (најчесто стапчеста) која лесно се забележува за време на клеточната делба поради максималната кондензација. Во текот на клеточниот циклус изгледот на хромозомите се менува. Помеѓу две клеточни делби во период на интерфаза хроматинот е распространет низ целото јадро. Во оваа фаза хромозомите се во деспирализирана состојба и изгледаат како долги тенки конци. За време на интерфазата клетката е во интензивна биохемискофизиолошка активност. Во ова фаза настанува и репликација на ДНК, при што хромозомите стануваат двохроматидни. Во почетокот на клеточната делба, во профаза, секој хромозом е составен од две меѓусебно поврзани хроматиди (сестрински хроматиди) во делот на центромерот. Една ДНК молекула се протега низ една хроматида во хромозомот. ДНК молекулата е различно организирана и кондензирана во хромозомот во форма на еухроматин и хетерохроматин. Еухроматинот се наоѓа повеќе на краците на хромозомот, а хетерохроматинот околу центромерот и теломерот. Количината на ДНК во хромозомот е околу 20%, останатиот дел отпаѓа на протеини и РНК. Еухроматинските региони се дисперзни, посветли сегменти во кои гените се транскрипциски активни. Хетерохроматинските региони се покондензирани, потемни, подоцна се реплицираат и најчесто се транскрипционо неактивни секвенци на ДНК. За време на одредени фази од клеточната делба поради можноста лесно да се обојуваат поради нивната кондензираност хромозомите лесно можат да се набљудуваат со помош на микроскоп. Бројот и големината на хромозомите се специфични за секој организам и можат да послужат како таксономски карактеристики. Телесните (соматски) клетки имаат диплоиден број на хромозоми кој се бележи со 2n. Диплоидниот број претставува две гарнитури на хромозоми идентични по својата градба. Едната гарнитура потекнува од мајката, а другата од таткото. Идентичните хромозоми, кои потекнуваат од двата родитела, се викаат хомологни хромозоми. Човекот има 23 пара хомологни хромозоми, односно вкупно 46 хромозоми. Половите клетки или гамети содржат половина помал број на хромозоми во однос на телесните клетки, односно хаплоиден број на хромозоми (n). Човекот има 23 хромозома во половите клетки. Морфологијата на хромозомите најдобро може да се набљудува за време на клеточната делба, и тоа во метафаза кога хромозомите се максимално спирализирани. 7 Морфолошки диференцијации на хромозомите На хромозомите во метафаза се разликуваат неколку морфо-функционални делови: констрикции (стеснувања), хетерохроматински и еухроматински сегменти (региони). Констрикциите, односно стеснувања, се најкарактеристична морфолошка карактеристика на хромозомите. Можат да бидат примарни и секундарни. Примарна (центромерна, кинетичка) констрикција е карактеристична за сите хромозоми. Со неа хромозомите се поделени на два исти или различни по големина крака. Во примарното стеснување се наоѓаат центромерен регион (центромер). За време на клеточната делба на центромерот се формира кинетохор за кого се поврзуваат тубулите на делбеното вретено. Слика 1. Структурни елементи на хромозомот Центромерниот регион на хромозомот за време на митозата и втората мејотска делба се дели надолжно, при што хроматидите стануваат независни и се движат спротивно кон половите на клетката. Според местоположбата на примарното стеснување (центромерот) хромозомите се класифицирани во следниве групи: - Метацентричен тип на хромозоми: кога центромерното стеснување се наоѓа точно во средината или околу средината (медијална положба) и хромозомот го дели на два еднакви или приближно еднакви крака; - Субметацентричен тип на хромозоми: центромерното стеснување е оддалечено од средината односно има субмедијална положба и хромозомот го дели на два нееднакви крака; - Акроцентричен тип на хромозоми: центромерното стеснување е субтерминално и едниот крак има изразито помали димензии од другиот крак; - Телоцентричен тип на хромозоми: немаат два крака бидејќи центромерот е терминално поставен на самиот крај. Некои хромозоми имаат и секундарно стеснување (констрикција), за кои нишките на делбеното вретено не се врзуваат. За ова стеснување најчесто е поврзан мал топчест по форма додаток на хромозомот означен како сателит. Поради ова и хромозомите што поседуваат сателит се нарекуваат сателитски хромозоми (SAT хромозоми). Сателитите, обично, се наоѓаат на кратките односно на помалите хромозомски краци. За време на телофазата на секундарното стеснување од SAT хромозомите, се образува јадренцето поради што оваа констрикција е позната уште 8 како нуклеоларен организатор. Секоја диплоидна хромозомска гарнитура има најмалку еден пар хомологни SAT хромозоми. Во овие сегменти се сместени гените кои ја кодираат информацијата за синтеза на рибозомалната РНК. Слика 2. Класификација на хромозомите според местоположбата на центромерот. Телоцентричен, акроцентричен, субметацентричен и метацентричен Хетерохроматински региони (сегменти) – Хетерохроматинот во интерфаза останува силно кондензиран (спирализиран) односно генетски (транскрипциски) неактивен или слабо активен. Хетерохроматинската ДНК се одликува со висока содржина на повторувачки нуклеотидни секвенци. Со примена на техниките за диференцијално обојување, можат лесно да се идентификуваат хетерохроматинските региони. Едно од најчесто користените диференцијални обојувања на хромозомите е обојување со Гимза (Giemsa). Теломери - Терминалните делови на хромозомските краци се нарекуваат теломери. Овие структури се исклучиво локализирани на краевите на хромозомите. Во интерфаза секогаш се појавуваат како кондензирани хетерохроматински делови на хромозомите. Теломерите, како специфични делови, овозможуваат заштита на интегритетот и индивидуалноста на хромозомите во тек на делбениот циклус. Благодарение на теломерите отсуствува спојување на хромозомите. 9 Кариотипизација Цитогенетска анализа на хромозомите може да се изведе на секоја клетка што има јадро и може да се дели. Целта на методата е хромозомите да се доведат до метафаза или прометафаза кога се најкондензирани и можат да се препознаат, избројат и морфолошки да се карактеризираат. Најчесто се користи методот за добивање на препарати од култура на лимфоцити од периферна крв. Лимфоцитите се диференцирани клетки кои во крвотокот не се делат. Поради тоа се применува постапка која ќе предизвика делба, при што се добиваат доволен број на метафазни клетки за кариолошка анализа. Како митоген фактор се користи фитохемаглутинин (супстанца која се екстрахира од Phaseolus). За стопирање на делбата на клетките се употребува цитостатик кој го деполимеризира делбеното вретено. Со помош на хипотоничен раствор на KCl се предизвикува дезинтеграција на клетките и ослободување на хромозомите. Најдостапни клетки за анализа се: лимфоцитите од периферна крв, клетки од коскената срцевина, фибробласти, амниоцити, ткивни примероци добиени со биопсија. Кариотиповите се приготвуваат со стандардни процедури на обојување коишто ги откриваат структурните карактеристики на секој хромозом. Индикации за изработка на кариотип: - препознатливи знаци на некој синдром, - амбивалентни гениталии, - ментална ретардација со малформации, - стерилитет, - спонтан абортус и - мртвороденост. Метод на анализа Анализата се одвива во неколку чекори: 1. Венепункција - Откако ќе се дезинфицира местото за венепункција се зема периферна венска крв (1ml со 0,2 ml хепарин да не дојде до коагулација). 2. Култивирање - За успешен раст на клетките потребни се неколку услови: - Соодветен стерилен контејнер-пластично шише со затворач; Подлога за раст на клетките-хранлив медиум збогатен со бовин фетален серум; Стимулатор на клеточна делба (фитохемаглутинин). Во стерилни услови се капнуваат 10-15 капки хепаринизирана венска крв во 5ml медиум за растење на клетките (обично се користат две пластични шишенца со соодветен медиум). Во медиумот се додава митоген фактор-фитохемаглутинин. Клетките се инкубираат на 37ºC, 72 часа (период во кој се случуваат неколку клеточни делби), при стерилни услови во инкубатор со воздух кој содржи 5% СО2. За да се запре пролиферацијата се додава цитостатик (Colhicin, Vinblastin) во последните 2 часа од инкубацијата. 3. Обработка на културата - Шишенцата се вадат од инкубатор и содржината се префрла во нумерирани епрувети кои се центрифугираат 10 мин. /3000 вртежи. Се вади најголемитот дел од супернатантот (се остава 1ml од примерокот) и се промешува талогот во кој се наоѓаат клетките во митоза. Се додава хипотоничен раствор КCL, се инкубира 60 мин. и повторно се центрифугира уште 8 мин. со цел да се отстранат додатните материи: еритроцити, делови од клеточните мембрани, масти. Се вади супернатантот. Се додава 10ml фиксатив (метанол-оцетна киселина 3:1) за 10 хромозомите да можат подобро да се обојат. Се остава 15 мин. на собна температура. Потоа се центрифугира 8 мин, се вади супернатанот, се става нов фикстатив, се остава на собна температура 30 мин. Постапката се повторува до 3 пати. Вака подготвен препарат стои до наредниот ден. 4. Подготовка на препаратот за обојување - Се вади фикстивот, талогот се меша и на означено микроскопско стакло се капнува од растворот, лесно се разлева и се суши. 5. Обојување на препаратот по Гимза (Giemsa) - Гимза растворот е составен од неколку агенси за обојување: неутрални бои како што се: метиленско сино и метил азурно кои се комбинираат и еозин како кисела боја која обезбедува широк спектар на бои. Како растворувач се користи метанол и глицерин како стабилизатор. Метиленско сино е метахроматска боја која структурите ги бои пурпурно. Обојувањето се одвива во следниве чекори: - Се подготвува свежо разблажен гимза раствор (1ml основен гимза раствор разреден со 50ml дестилирана вода која е подготвена со фосфатен пуфер со pH 7,2 во однос 1:10). - Фиксираниот препарат се остава во вака подготвената гимза боја од 2-12 часа. - Потоа обоениот препарат се измива со дестилирана вода, и се диференцира во 1% оцетна киселина неколку секунди. - Препаратот се суши и се дехидрира двапати во 100% етанол. - На крај препаратот се чисти со ксилен. Слика 3. Кариотипизација. Се изведува во неколку чекори: венепункција, култивирање во хранлив медиум, обработка на примерокот и подготовка за обојување, обојување по Giemsa и анализа на примерокот со микроскоп 11 6. Анализа на препаратот - Од подготвениот препарат се прави снимка која е подложна на компјутерска обработка, т.е маркирање на пооделните хромозоми, по што софтверот автоматски ги реди хромозомите и се образува кариотипот за соодветниот пациент. На овој начин се создава и датотека од сите обработени кариотипови која, по потреба, може дополнително да се анализира. Најчесто употребуван начин на обојување на хромозомите е со методот по Гимза, кој овозможува анализа на препаратот со светлосен микроскоп. Со ова обојување овозможува подобра резолуција на индивидуалните бендови и поинтензивно обојување. Во исто време, овој метод на обојување не влијае врз стабилноста на препаратот Слика 4. Кариотип во кој е прикажан Gи не предизвикува промени на Banding. Темни ленти – хетерохроматински регион, светли ленти – еухроматински неговите основни својства. регион. с Најупотребувана варијанта на Гимза обојување е G-banding. Со оваа метода најпрво метафазните хромозоми се третирани со трипсин, ензим што ги разградува хромозомалните протеини. Со ова се постигнува релаксација на хроматинската структура, а со тоа се овозможува Гимза бојата полесно да се врзе со ДНК. Генерално, хетерохроматинските региони, кои претежно се богати со А-Т, се пребојуваат како темни ленти, додека помалку кондензираниот хроматин е составен од C-G региони кои, имаат послаб афинитет за Гимза боја и затоа се прикажува како светли линии (слика 4). Спротивна од G-banding техниката е R-banding, која образува реверзна слика од G-banding. Имено, пред да се обои со Гимза, ДНК молекулата е подложна на висока температура која го раздвојува ДНК хеликсот во А-Т богатите региони, овозможувајќи им на Ц-Г регионите повеќе да ја врзат бојата со што сега тие стануваат потемно обоени. R-banding овозможува идентификација на богатите делови со гени во близина на теломерите кои често се зафатени со помали структурни промени (слика 5). Слика 5. R-banding во однос на G – Banding 12 Поретко користена техника е С-banding, која ги обојува хетерохроматинските делови или генетски инактивната ДНК во подрачјето на центромерата и на секундарната констрикција (слика 6). Слика 6. C – Banding. Се обојуваат хетерохроматинските региони во пределот на центромерот Q-banding е техника при која се користи флуоресцентната боја. Оваа боја врши алкилирање на ДНК и ги обојува аденин-тимин богатите делови на хромозомот кои можат да се набљудуваат на ултравиолетова светлина под флуоресцентен микроскоп (слика 7). Недостаток на техниката е тоа што флуоресцентниот ефект брзо исчезнува заради што е потребно фотографиите да се направат неколку минути по обојувањето. Слика 7. Q-banding. Се обојуваат деловите богати со аденин-тимин 13 Цитогенетска номенклатура Секој хромозом е поделен на два крака: p – краток крак и q – долг крак одделени со центромер. Секој хромозомски крак е поделен на региони или цитогенетски бендови, кои можат да се видат под микроскоп. При повисока резолуција суббендовите можат да се видат во рамките на бендовите. Постои стандарден начин за означување на бендовите на хромозомите. Секој хромозомски крак е нумериран почнувајќи од центромерот кон теломерот. Со нумерирањето на хромозомот се означува на колку региони е поделен хромозомот, односно секој крак (p и q) од хромозомот и колку бендови и Слика 8. Цитогенетска Banding номенклатура суббендови има секој крак. Регионите се означени со броевите 1,2,3 итн., а потоа следува бројот на поголемиот бенд. Суббендовите се означени со децимални единици кои го следат бендот. На пример 3p22.1 се чита: прв суббенд на вториот бенд во вториот регион на р-кракот на 3 хромозом (слика 8). Кариотип, кариограм, идиограм Збирот на сите хромозоми во една клетка претставува кариотип. Кариограмот претставува систематско подредување на хромозомите од дадениот кариотип по големина и морфологија (слика 9). Кариотипот на човекот го сочинуваат 46 хромозома, односно 22 пара на автосомни хромозоми кои по состав и градба се исти кај двата пола, и еден пар на полови хромозоми (гоносоми) кои кај женскиот пол се исти, означени како XX, додека кај машкиот пол се различни и се означуваат како XY. Според интернационалните конвенции, хуманите автосоми хромозоми се означани со броевите од 1 до 22. Подреденоста е според големина, од најголемиот кон најмалиот. Половите хромозоми се сместени на крајот од кариограмот. Класификација на хромозомите се врши: - според нивната големина (најголем е првиот, а најмал е дваесет и вториот хромозом); - според местоположбата на центромерниот регион (1, 3, 16, 19, и 20-от хромозом се метацетрични, а 13, 14, 15, 21, 22, и Y хромозомот се акроцентрични); - според присуството на сателит (13,14,15,21 и 22 пар имаат сателити). Хромозомите кај човекот се групирани во 7 групи означени како A,B,C,D,E,F и G. А - или прва група ја сочинуваат три пара најголеми хромозоми. Првиот и третиот хромозом се метацентрични, а вториот е субметацентричен. Досега е утврдено дека на хромозомот број 1 се лоцирани околу 1961 протеин кодирачки гени. B - или втора група ја сочинуваат два пара субметацентрични хромозоми со нешто помали димензии. Утврдено е дека на четвртиот пар од хромозоми се наоѓаат лоцирани генетските локуси кои ја детерминираат молекулата на хемоглобинот. 14 C - или трета група ја сочинуваат седум пара субметацентрични хромозоми со средни димензии меѓу кои спаѓа и X-хромозомот. На деветтиот хромозом од оваа група се наоѓа генот одговорен за ABO - системот. D - или четврта група ја сочинуваат три пара акроцентрични хромозоми кои најчесто поседуваат сателити на кратките краци. Е - или петта група ја сочинуваат три пара субметацентрични хромозоми со помали димензии од претходните. F - или шеста група ја сочинуваат два пара најмали метацентрични хромозоми. G - или седма група ја сочинуваат два пара акроцентрични најмали хромозоми, меѓу кои спаѓа и Y-хромозомот и кој од другите хромозоми се разликува по тоа што нема сателити. Слика 9. Кариограм - систематско подредување на хромозомите од даден кариотип по морфологија и големина (панел лево). Идиограм - шематски приказ на хромозомите со сите морфолошки карактеристики (панел десно) Шематскиот приказ на хромозомите при кој се користат сите морфолошки карактеристики на хромозомите: должина на хромозомот, должината на секој крак, положбата на примарната констрикција и односот со двата крака, со цел појасно да се прикажат морфометриските карактеристики на хромозомите се нарекува идиограм (слика 9). Со идиограмот, всушност, можат појасно да се истакнат карактеристиките и разликите помеѓу поедини хромозоми, како и да се идентификуваат одредени структурни аберации. 15 Прашања: 1. Што претставува хетерохроматин, а што еухроматин? 2. Означи го хетерохроматинот и еухроматинот на подолу прикажаниот пресек: 3. Нацртај акроцентричен, телоцентричен, метацентричен и субметацентричен хромозом! 16 4. Објасни ги поимите: - Хаплоиден број на хромозоми - Диплоиден број на хромозоми - Хомологни хромозоми - Сестрински хроматиди 5. Како се групирани хромозомите кај човекот? 6. Наброј ги индикациите за изработка на кариотип! 7. Кои видови на клетки можат да се употребат за цитогенетска анализа? 8. Наброј ги бендинг техниките што се користат за обојување на хромозоми! 9. Наброј ги чекорите во кои се одвива цитогенетската анализа на хромозоми! 17 Вежба бр.2 FISH (Fluorescence in situ hybridisation, Флуоресцентна in situ хибридизација) Флуоресцентна in situ хибридизација е техника која овозможува детекција на нуклеинските киселини, односно детекција на специфични целни секвенци во клетката, со истовремено зачувување на морфологијата на ткивата и клетките. Овој дијагностички метод се заснова на принципот на комплементарноста, односно можноста одбележана денатурираната проба да хибридизира со комплементарната целна секвенца на нуклеинската киселина (најчесто ДНК молекулата). Целниот регион, кој се испитува, може да биде: ген, хромозомски регион или цел хромозом. Проба е краток сегмент од нуклеинската киселина кој е обележан со некоја флуоресцентна боја. Овој сегмент е комплементарен со целната секвенца која треба да се детектира. Пробата треба да биде обележана за да може да се визуелизира местото на хибридизација. Имајќи во предвид дека во нормалните клетки (освен гените кои се наоѓаат на X и Y хромозомот кај мажите), вообичаено, се присутни по две копии од секој ген, со FISH методата се добиваат по два сигнала. Со помош на FISH се овозможува идентификација на нумерички аберации (вишок или недостаток на хромозоми), амплификација или делеција на одреден ген и структурни хромозомски промени (транслокации). За разлика од класичните цитогенетски анализи, FISH методата може да се примени директно и на клетките во интерфаза. Исто така, FISH анализа може да се примени на широк спектар на примероци од клеточни култури, свежи или смрзнти примероци, цитолошки примероци, ткива фиксирани во формалин и вметнати во парафин. Постојат неколку видови на проби кои се користат за FISH методата. За детекција на ДНК фрагменти се користат ДНК проби. Овие проби релативно лесно можат да се произведат во големи количини. Големината на ДНК пробата може да биде од кратки олигонуклеотидни фрагменти до големи мегабазни фрагменти. РНК пробите се синтетизираат со помош на РНК полимераза. Бидејќи РНК пробите се едноверижни (за разлика од ДНК пробите), не е потребно да ги подложуваме на денатурација (раздвојување) и се хибридизираат нешто подобро од ДНК пробите. Големината на РНК пробите може да биде од кратки олигонуклеотидни фрагменти до неколку килобази. Главен недостаток кај РНК пробите е нивната нестабилност поради присуството на рибонуклеазите. За обележување на пробите може да се користи флуорохром (директно обележување) или диоксигенин кој се детектира со ензимска реакција (индиректно обележување) (слика 10). Постојат комерцијални FISH китови (dual color),кои имаат проба специфична за генот и контролна центромерна проба обележана со различни флуорохроми. Според тоа, во нормална клетка би требало да има по два сигнала специфични за еден ген и два контролни сигнала. 18 Слика 10. Обележување на пробите. Индиректно обележување на пробата со хаптен (панел лево). Кај овој вид проби се користи ензимски или имунолошки систем за детекција. Директно обележување на пробата со флуорофор (панел десно), овозможува директна детекција со формирање на обоен сигнал на местото на хибридизација визуелизирано со флуоресцентен микроскоп 19 Принцип на FISH – методата Постапката на FISH анализата се одвива во неколку чекора: предтретман на примерокот, денатурација на целната ДНК молекула и на пробата, хибридизација и евалуација (слика 11). Предтретман на примерокот за анализа е клучен чекор со кој примерокот се подготвува за хибридизација, односно се овозможува ДНК да станат достапни за пробата која ќе се употреби. Примерокот се подготвува со протеинска денатурација и протеинска дигестија. Протеинска денатурација - во предтретманот на ткивата се користи натриумизотиоцијанат (NaSCN), кој ги разградува протеините со што ќе се олесни хибридизацијата. Протеинска дигестија - примерокот се инкубира со рибонуклеази и протеиназа К на 37°С околу 10 минути, со што ќе се разгради РНК и присутните протеини во примерокот. Инкубацијата со ензимите треба да е внимателно контролирана бидејќи, доколку трае предолго, може да настане деградација на ткивото, а доколку е пократка, пробата не ќе може да стигне до целното место. Фиксација - примерокот се фиксира со фиксатив метанол-оцетна киселина (3:1), со што се овозможува стабилизација на целната молекула во примерокот и ќе се спречи нејзино лизирање за време на хибридизацијата. Дехидратација - со етанол во неколку чекори, примерокот се инкубира по 2 минути во 70%, 80%, 90% и 100% етанол. Слика 11. Шематски приказ на Флуоресцентна in situ хибридизација. ДНК пробата е обележана со флуоресцентен маркер. Пробата и целната ДНК се денатурираат потоа пробата се хибридизира со комплементарната верига од целната ДНК и се детектира под флуоресцентен микроскоп 20 Подготовка на пробата - постапката за подготовка на ДНК пробата започнува со дигестија на ДНК со рестрикциони ензими. Зависно од тоа кој фрагмент од ДНК ни е потребен, користиме соодветен рестрикционен ензим, кој е специфичен за тој фрагмент. Фрагментираната ДНК може да се амплифицира и со полимераза верижна реакција (PCR) за да се добијат голем број копии. Од добиените копии можат да се изработат проби за одреден фрагмент на ДНК кои се означуваат индиректно со хаптен или директно преку вградување на флуорофор. РНК пробите се синтетизираат со вектор со помош на РНК полимераза, а потоа се означуваат со хаптен или флуорофор. 1. Денатурација – примерокот и пробата се денатурираат така што се загреваат 10 минути на 70-80°С, потоа бавно се ладат на 37°С. За тоа време настанува раскинување на водородните врски помеѓу комплементарните бази во двојниот хеликс при што се добиваат едноверижни нишки од целната ДНК молекула и соодветната проба. 2. Хибридизација – пробата се додава на примерокот, се инкубира заедно со примерокот на 37°С, 12-36 часа во раствор од формамид за да настане хибридизација. Една верига од ДНК молекулата се хибридизира со комплементарната верига од денатурираната проба. Во овој чекор мора да се внимава на температурата од која зависи успешноста на врзувањето за целното место. Доколку е прениска температурата, пробата нема да се врзе на целното место на хромозомот и под микроскоп ќе се гледаат само слаби сигнали или ќе ги нема воопшто. После хибридизацијата се пристапува кон миење на препаратот со раствор од натриум цитрат за да се отстрани нехибридизираната проба. 3. Анализа на сликите со флуоресцентен микроскоп. ДНК – проби Три главни категории на ДНК - молекули се употребуваат како проби за обележување на хромозомите во FISH методата: - Центромерни проби (centromere specific probes), - Проби за цел хромозом или дел од хромозомот (whole/partial chromosome paint probes-WCP/PCP) и - Проби за мали специфични подрачја на еухроматинот (single copy или unique sequence probes). Центромерни проби - содржат кратки повторувачки делови од нуклеотидот таканаречени сателитски ДНК, кои не кодираат генетски продукти. Секоја индивидуа има различен број на копии од сателитската ДНК – молекула. Алфа – сателитската ДНК е составена од мономери со големина околу 170 bp, кои се повторуваат повеќе пати. Скоро кај сите хумани хромозоми таквите повторувачки ДНК секвенци се идентични со тоа што само околу 2-3% се специфични за поедини хромозоми па врз основа на тоа се разликуваат. Овој вид на проби дава јасен и интензивен сигнал и кај метафазните хромозоми и кај интерфазното јадро. Јасниот сигнал е последица на големината на целната ДНК чиишто секвенци се повторуваат повеќе пати. Затоа примената на овој вид на проби се погодни за детекција на промените во бројот на хромозомите. Пробите за цел хромозом или за дел од хромозомот - се составени од специфични повторувачки делови, кои потекнуваат од цел хромозом или само од еден дел на хромозомот. Овој вид на проби се добиваат со микродисекција или со проточно флуоресцентно сортирање на специфичниот хромозом од хибридни соматски клетки, а потоа се умножува изолираната ДНК молекула со PCR техника. Овие проби се користат само за метафазни хромозоми бидејќи поради кондензираноста на интерфазниот хроматин сигналот нема да биде доволно јасен. Недостаток се јавува поради недоволната хибридизација на хромозомот, најчесто во подрачјето на 21 теломерот или центромерот па може да се случи со нивна употреба да не се детектираат промените кои ги зафаќаат овие делови од хромозозмот. Проби за мали подрачја на еухроматин – се хибридизираат со специфичен дел од ДНК кој не се повторува во геномот и може да кодира генетски продукт. Пробата може да содржи еден ген или фрагмент од ДНК со позната локација. Во оваа група спаѓаат и субтеломерните проби кои хибридизираат со теломерните региони на хромозомот. Теломерните делеции многу тешко се детектираат со стандардните техники, особено кога откинатиот дел од хромозомот е помал од 500 kb. За детекција на такви промени употребата на овие проби ги надополнува класичните методи за обојување на хромозомот бидејќи со нивната примена се детектираат делеции со величина од 100 до 300 kb. Слика 12. Проби за обележување на хромозомит: а. Ген-специфична проба насочена кон специфични нуклеинско-киселински секвенци на хромозомот; б. Центромерна проба се врзува за повторувачките секвенци кои се специфични за центромерните региони; в.Теломерна проба ја препознава повторувачката секвенца ТТАGGG и може да се користи за визуелизација на сите теломери истовремено. г. Проби за обојување на целиот хромозом FISH техниката во клиничката пракса се користи при: - точна диференцијација на секс хромозомите при нејасна сексуална диференцијација, - мозaични линии во кариотипот, - испитување на хромозомските промени кај малигни неоплазми и - пренатално откривање на анеуплоидии кај плодот. 22 Прашања: 1. Што e FISH? 2. Кои се предностите на FISH? 3. На кој начин можат да се обележат пробите? 4. Што може да се детектитра со FISH? 5. Објасни ја постапката за изведба на FISH техниката! 23 Вежба бр.3 Хромозомски аберации Нормалниот кариотип кај човекот содржи 46 хромозома од кои 22 пара се автосомни и еден пар полови хромозоми (46,XX или 46,XY). Хромозомските аберации (абнормалности) се мутации на ниво на хромозомите, кои доведуваат до отстапување во бројот или формата на хромозомите. Овие промени можат да настанат во текот на митозата или мејозата. Хромозомските аберации се една од причините за интраутерина смрт на плодот, за морталитетот кај новороденчињата, како и го зголемуваат детскиот морбидитет и морталитет. Се смета дека едно од 200 новородени носи некоја детектибилна хромозомска аберација. Хромозомските аберации имаат своја соодветна клиничка манифестација во зависност од видот на мутацијата (структурна или нумеричка) како и за тоа дали се зафатени автосомните или половите хромозоми. Видови на хромозомски аберации Хромозомските аберации можат да бидат вродени или стекнати. Истите можат да се поделат во две групи. Нумерички хромозомски аберации (промена на бројот на хромозомите): - анеуплоидија (моносомија, трисомија, тетрасомија) и полиплоидија (триплоидија, тетраплоидија) Структурни хромозомски хромозомите): - аберации (промена на формата/структурата на транслокации (реципрочни, Робертсонови), делеции, дупликации, инверзии (перицентрични/ парацентрични) и останати (изохромозоми, ринг хромозом). 24 Нумерички хромозомски аберации Нумеричките хромозомски аберации се однесуваат на промената во бројот на автосомните или половите хромозоми (слика 13). Слика 13. Полиплоидија – зголемување на бројот на хромозомите во цела хромозомска гарнитура и Анеуплоидија промена на бројот на хромозоми во еден хромозомски пар Промената во бројот на хромозомите може да биде: полиплоидија (состојба кога постои зголемување на цела хромозомска гарнитура, 3n-69 хромозоми, 4n-92 хромозоми) и анеуплоидија (промена во бројот на хромозоми во еден пар со што се променува и бројот на хромозоми во една хромозомска гарнитура). Полиплоидијата е карактеристична за растителните организми, додека за човекот таа е штетна и, главно, летална. Кај човекот полиплоидијата како нормална појава се сретнува во одредени клетки како кај хепатоцитите, мегакариоцитите, скелетните мускулни влакна и туморските клетки. Типови на полиплоидија се: Триплоидија – настанува како резултат на нарушување во митоза, мејоза 1 и мејоза 2 или, пак, поради диспермија, оплодување со два сперматозоида (се смета за најчеста причина за триплоидија). Тетраплоидија - главно, настанува во постзиготен стадиум, со супресија на делбата на зиготот, кога хромозомите се удвоени, а не настанува делбата на цитоплазмата. Не се исклучува можноста и на оплодување со 3 сперматозоида. Доколку диплоидниот или хаплоидниот број од хромозомската гарнитура е зголемен или намален за некој хромозом тогаш се зборува за анеуплоидија, па разликуваме: хиперплоидија и хипоплоидија. Промените се резултат на грешки во митозата или мејозата поради нераздвојување на сестринските хроматиди или хомологните хромозоми. 25 Автосомни хромозомски аберации Карактеристики на автосомните хромозомски аберации: - Повеќето од автосомните хромозомски аберации се поврзани со значајна ментална ретардација. Се смета дека причина за оваа појава е големиот број на гени кои учествуваат во развојот на ЦНС (централен нервен систем), па голема е веројатноста при која било хромозомска аберација да биде засегнат еден дел од гените што учествуваат во обезбедување на нормален ментален развој; - Повеќето синдроми имаат фацијална дисморфија која се карактеризира со повеќе минорни или мајорни аномалии кои даваат типичен изглед, а со тоа можност за интраутерина детекција уште во првиот триместар од бременоста; - Застој во физичкиот раст и развој, како интраутерино, така и во подоцнежниот живот; - Хромозомските аберации често се придружени со типични висцерални аномалии. (пр. трисомија на 21 хромозом е придружена со срцеви аномалии (атрио-вентрикуларен канал, атрезија на црева и сл.). Трисомија 21 (Даун-ов синдром); 47,ХХ+21 или 47, ХУ+21 Трисомија 21 е најчестата хромозомска аберација во хуманата популација со инциденца од 1/700-1000 новородени деца. Трисомијата на хромозом 21 (слика 14), е позната како Даунов синдром. Овој синдром е последица од нераздвојување на хромозомите во текот на митозата, мејоза 1 или мејоза 2. Синдромот може да биде последица и на секундарна трисомија која настанува како резултат на транслокација меѓу 14 и 21 хромозом. Дауновиот синдром може да се појави и во мозаична форма. Притоа, симптомите, односно фенотипската изразеност, ќе зависи од застапеноста на клеточните линии со абнормален кариотип во однос на клетките со нормален кариотип. Со зголемување на возраста на мајката при забременување се зголемува и инциденцата, така што кај жени под 30 годишна возраст таа изнесува помалку од 1 на 1000, на 40 години 1/63 новородени, на 49 години 1/8 новородени. Животниот век на лицата со трисомија на хромозом 21 е во сооднос со степенот на изразеноста на низата висцерални промени кои се во склоп на заболувањето. До првата година од животот умираат 25-30% од лицата со Даунов синдром, 50% умираат пред петата година од животот, а останатите можат да живеат од 40-50 години. Пренаталниот скрининг кај сите жени во тек на одредена гестациска недела на плодот овозможува навремено откривање на ризикот од појава на Даунов синдром како што е „тројниот тест“ (со анализа на алфа фетопротеинот во 15-20 недела), Ехо на плодот во тек на 11-13 гестациска недела, па сѐ до дефинитивна дијагноза Слика 14.Трисомија на 21 хромозом.(кариотип) со амниоцентеза од 16-21 гестациска недела. 26 Карактеристики на Даунов синдром Физички карактеристики: - пократки екстремитети, изгледот на дланката е карактеристичен (набрчкани дланки, кратки прсти, трансверзална бразда (мајмунска бразда) присутна во околу 80% од случаите, малиот прст е свиткан кон внатре, на стапалото има повеќе кожни набори на плантарната страна и поголемо растојание меѓу палецот и вториот прст); - карактеристичен монголоиден изглед, косо поставени очи, зарамнет носен корен, плоснато лице, краток врат, мали уши; - јазикот честопати е зголемен со протрузија (испаѓа од устата). Висцерални промени: - аномалии на внатрешните органи како што се: атрио-вентрикуларен канал со комуникација меѓу срцевите комори и преткомори,аномалии на црева (дуоденална атрезија), на очи (глауком), на слухот (наглувост). Интелектуална попреченост: - интелектуалната попреченост кај Дауновиот сидром најчесто се движи од блага (IQ=50-70) до умерена (IQ=35-50), особено е засегната долгорочната меморија. Трисомија 18 ( Едвардс-ов синдром ); 47,ХХ+18 или 47,ХУ +18 Едвардс-ов синдром е автосомно генетско нарушување предизвикано од нумеричка хромозомска аберација на хромозом 18. Оваа трисомија се јавува со инциденца од 1/6000 новородени. Во кариотипот кај овие лица се среќава еден хромозом повеќе или 2n=47,+18, додека во 5% од случаите може да се појави во мозаична форма или транслокација на долгиот крак на хромозом 18. Причината за оваа трисомија е неразделување на хромозомите во текот на делбата на клетките. Трисомијата на хромозом 18 се карактеризира со низа малформации коишто го намалуваат преживувањето, при што поголем дел умираат интраутерино, додека преживувањето на новородените е од 6 до 12 месеца. Пренаталниот скрининг овозможува рано откривање на ризикот за појава на Слика 15. Трисомија на 18 хромозом (кариотип) оваа хромозомска аберација (крвниот „троен тест“ и Ехо на плодот), како и дефинитивна дијагноза со амниоцентеза. Карактеристики на Едвардсов синдром: Физички карактеристики: - интраутерина ретардација на растот, смалена активност на плодот, микроцефалија, мала мандибула и уста, краток стернум, широко поставени очи, проминентна окципитална регија и пета, малформирани ушни школки, стисната дланка,прекрстени нозе. Висцерални промени: - срцеви аномалии (вентрикуларен септален дефект),бубрежни аномалии, дигестивни аномалии (умбиликална хернија). 27 Трисомија 13 (Патау синдром); 47,ХХ+13 или 47, ХУ+13 Овој синдром се јавува како трисомија на хромозом 13 или на еден негов дел со инциденца од 1/10000 новородени. Настанува како резултат на нераздвојување на хромзомите во текот на делбата на клетката при што настанува прекуброен хромозом 13. Во мал процент може да се појави како резултат на небалансирана транслокација на хромозом 13 или, пак, во мозаична форма. Благодарение на неонаталниот скриниг и неинвазивните и инвазивни методи, може навремено да се процени ризикот и да се потврди појавата на Патау синдром. Синдромот се карактеризира со низа физички и органски малформации кои го попречуваат преживувањето кое што е само еден месец, и со само Слика 16.Трисомија на 13 хромозом ( кариотип) 10% -тно преживување од една година. Карактеристики на Патау синдром: Физички карактеристики: - мал интраутерин раст и мала родилна тежина, холопросенцефалија – мозокот не се равива на две половини што доведува до појава на низа лицеви малформации (микроцефалија, микрофталмија, анофталмија, хипотелоризам или циклопизам, расцеп на горната уста со /без расцеп на тврдото непце, малформиран нос), полидактилија на раце и нозе, деформирани уши. Висцерални промени: - гастроинтестинални малформации, уринарни малформации (полицистични бубрези, микропенис), тешко оштетување на слухот. Aнеуплоидија на половите хромозоми Хромозомските нумерички аберации можат да ги зафатат и половите хромозоми – анеуплоидија на половите хромозоми. Моносомија на X хромозомот (Тарнер-ов синдром); 45,XO Моносомија претстава загуба на еден хромозом во клетката. Тарнеровиот синдром претставува моносомија на половиот X хромозом со инциденца од 1:2500 новородени деца. Настанува како резултат на губење на хромозомот во текот на делбата на клетката, а во редок број случаи може да се појави и како мозаична форма. Тарнеровот синдром е ненаследен бидејќи настанува како случајна појава во текот на формирањето на гаметите кај родителите на засегнатата личност. Слика 17. Тарнер-ов синдром (кариотип) Се среќава исклучително кај женските индивидуи. 28 Пренаталните неинвазивни и инвазивни техники можат да го покажат ризикот и да го потврдат постоењето на Тарнеров синдром. Кај овие индивидуи со цитогенетските анализи може да се утврди отсуство на барово телце во клетките изолирани од букалната слузокожа. Во 10% од единките со Тарнеров синдром може да се јави и мозаицизам со присуство на едно или две барови тела. Фенотипските карактеристики мoжат да бидат најразлични, но најкарактеристичен е тријасот (гонадална дисгенеза), низок раст и специфичен изглед (градниот кош е широк како штит, брадавиците се раздалечени, постои птеригиум - кожен набор на вратот, мала долна вилица и тесна карлица). Од висцералните аномалии почести се: аномалии на аортниот лак, коарктација на аорта, потковичест бубрег и сл. Трисомија на X-хромозом (Троен X Синдром ); 47, XXX Трисомијата на Х хромозомот може да настане со нераздвојување на Х хромозомот во мејоза I или II од делбата кај мајката или во мејоза II кај таткото. Инциденцата за појава на овој синдром се зголемува со староста на мајката. Овие индивидуи фенотипски не се разликуваат од жените со нормален кариотип, клинички се здрави и, воглавно, фертилни со нормален ментален развој. Слика 18. Трисомија на X хромозомот (кариотип) Клинефелтер-ов синдром; 47,XXY Клинефелтеровиот синдром е предизвикан од случајна промена-неразделување на X и Y хромозомите во процесот на сперматогенезата, а при оплодување на нормална јајце клетка. Лицата со овој синдром имаат 3 полови хромозома XXY (трисомија на полови хромозоми). Синдромот се јавува кај лицата од машки пол и е причина за примарниот хипогонадизам кај мажите. Во раното детство ретко се препознаваат и се открива кај мажи кои се лечат од неплодност, а во поголем број случаи водат нормален живот. Фенотипски се работи за високи мажи кои во пубертетот имаат хипогонадизам (мали тестиси, крипторхизам) и гинекомастија (развој на млечни жлезди), недостаток на брада, женски тип на пубична Слика 19. Клинефелтер-ов синдром (кариотип) влакнатост. 29 Јакобс-ов Синдром; 47, XYY Јакобс-овиот синдром се јавува како резултат на неразделување на хромозомите во првата и втората мејотска делба од анафазата. Индивидуите со овој синдром до пубертетот имаат нормален развој, а потоа забрзано растат и се развиваат и покажуваат склоност кон агресивност и деликвенција и тешко се вклопуваат во социјалниот живот. Клинички знаци се: висок раст, аномалии во гениталиите, хиперактивност, агресивност, со ретка ментална ретардација. Слика 20. Јакобс-ов синдром (кариотип) 30 Прашања: 1.Што претставуваат хромозомските аберации? 2. Напиши го кариотипот на: Down синдром (машко)_______________. Edwards синдром (женско)_____________. Turner синдром ______________________. Klinefelter синдром ___________________. Patau синдром (женско)_______________. 3. Наведи ги физичките карактеристики на лицата со Даун-ов синдром: . 4.Заокружи каде е промената. За кое нарушување се работи? 5.Под долунаведените слики напиши за кој синдром станува збор: 31 a) б) в) 32 Вежба бр.4 Наследување на својства Гените како основни структурни и функционални единици на наследувањето во молекуларна смисла се секвенци на нуклеотидни бази кои кодираат информација за синтеза на одредена функционална РНК молекула (иРНК, тРНК, рРНК). Имаат линеарен распоред по должината на хромозомите. Секој ген има определена положба во локусот на хромозомот, па оттаму генски локус е физичкото место на алелната форма на генот. Обично, секој ген посредува два алела кои се, всушност, алтернативни, функционални форми на генот кои се наоѓаат во исти локуси. Диплоидните организми имаат два алела во два генски локуса на двата хомологни хромозома, со исклучок на алелите сместени на половите хромозоми кај машките единки. Комбинацијата на алелите ја дава генотипската основа за одредено својство. Доколку двата алела на генот кој организмот ги наследил од двата родитела се идентични, тогаш организмот е хомозигот за тоа својство, а ако алелите се разликуваат, организмот е хетерозигот. При вкрстување на растенијата кои се хомозиготни за доминантни или рецесивни гени се добиваат повторно хомозиготни единки при што се одржуваат чисти линии за даденото својство. Хемизиготи се организмите кои содржат само по еден од двата алтернативни алела во нормална состојба, тоа се одредени гени на половите хромозоми, X и Y, или, пак, во случаи на делеции организмите се хемизиготни бидејќи содржат единечни гени за сметка на делетираните. Доминантен ген е немутирана (дива) алелна форма на генот, по дефиниција е неадитивна интраалелна интеракција, што значи се изразува во хомозиготна и хетерозиготна состојба на генотипот и се одбележува со голема буква. Рецесивен ген е мутирана алелна форма, се изразува само во хомозиготни организми и се одбележува со мала буква. Генотип: генетска конституција на еден организам. Фенотип: збир на сите особини на еден организам. Монохибридно и дихибридно вкрстување Основните закони за наследувањето на особините се откриени и поставени од Грегор Мендел (1822-1884 год). Неговите истражувања и публикации претставуваат примери на необична аналитичка способност во научните испитувања. Одредени дисциплини во генетиката се базираат на веќе поставените принципи и модели на наследувањето од страна на Мендел со цел да се предвидат резултатите во истражувањата или да се определи веројатноста одреден ген да се појави во потомството. Обично, притоа се врши меѓусебно вкрстување на единките кај кои одредена особина се изразува на различни начини, а потоа се следи појавата на овие разлики кај потомците во текот на неколку генерации. Мендел го проучувал наследувањето на некои морфолошки особини кај диплоидниот грашок кој како самооплодно растение се покажал како извонреден модел за експериментирање. Мендел одгледувал и вкрстувал чисти линии на грашок за одредена особина и следејќи како тие особини се пренесуваат од родителската генерација на следните генерации ги поставил основните принципи на наследувањето и пренесувањето на особините од една на друга генерација. Притоа, тој работел само со такви својства кои се изразуваат алтернативно, односно се јавуваат во еден од два постоечки фенотипа. 33 На база на своите истражувања ги втемелил основните наследувањето, познати како Менделови закони на наследувањето: - правила на Правило на раздвојување на наследните фактори и Правило на слободно комбинирање на наследните фактори. Монохибридното, односно моногенетско наследување е модел кога се анализира наследувањето на само една особина која е условена со еден пар гени. Генските алели се означуваат со азбучни симболи, поточно доминантниот алел секогаш се означува со голема латинска буква (А), додека рецесивниот алел со иста меѓутоа мала буква (а). Пример 1: Aлелот за розова боја на цветот на одредено растение можеме да го означиме со (А), а алелот за бела боја на цветот на растението со (а). Во овој случај генетскиот состав на растението е следниов: хомозиготни растенија со розови цветови се (АА), а хомозиготните растенија со бела боја на цветот се (аа), кои во F1 (првата филијална генерација) даваат хибриди, односно хетерозиготи (Аа) кои ќе имаат розова боја на цветот. F1 хетерозиготите продуцираат два типа на гамети во еднаков однос ½ со доминантен (А) и ½ со рецесивен (а) алел. При вкрстување на монохибридите (Аа) од F1 генерација, во F2 генерацијата се добива потомство од три типа на растенија (генотипови) во квантитативен однос (1:2:1) или поконкретно ¼ се хомозиготи по доминантниот алел (АА), кои даваат розови цветови, ¼ се хомозиготи по рецесивниот алел (аа) и даваат бели цветови, овие две групи се наследно стабилни, додека ½ од F2 потомство се Слика 21. Монохибридно наследување хетерозиготи (Аа), со розова боја на цветови каде се манифестира доминантниот алел. Со самооплодување на овие хетерозиготи во F3 генерацијата ќе се добијат растенија со розови и со бели цветови. Пример 2: Едниот родител има црна боја на косата и е доминантен хомозигот, а другиот родител е со црвена боја на косата и е рецесивен хомозигот. Анализирај ја F1 и F2 генерација. P: AA (црна коса) x аа (црвена коса). G: A A x a a- бидејќи родителите се хомозиготи создаваат само еден тип на гамети. F1: Aa – потомството има само црна коса (фенотип) и сите се хетерозиготи (генотип). G: A a x A a – втората генерација на потомци се добива со вкрстување на две единки. F2: AA Aa Aa aa, Генотипски однос: 1:2:1, Фенотипски однос: 3:1. Слика 22. Панетова мрежа: F1 (панел лево) и F2 (панел десно) 34 Интермедиерно вкрстување/наследување се среќава при парцијална доминантност, односно рецесивност на гените во детерминирањето на својството. Во вакви случаи целосната експресија на генот се реализира само кај хомозиготните организми додека хетерозиготните фенотипски отстапуваат и се помеѓу двете алтернативни карактеристики. Aко се вкрстат две единки чии особини се, речиси, подеднакво фентотипски експресивни, настанува таканаречено наследување со непотполна доминантност или интермедиерно наследување кога нема доминација на едниот ген туку и двата алела подеднакво придонесуваат за одредување на некоја особина. Фенотипски тие заземаат средна положба во однос на двата родитела. Пример1: Едниот родител е со рамна коса (А1А1), а другиот родител е со кадрава коса (А2А2). Во првата генерација сите потомци се со брановидна коса (нова особина). Р: А1А1 (рамна коса) х А2А2 (кадрава коса). G: A1 x A2. F1: A1A2 (брановидна коса). G: A1A2 x A1A2. F2: A1A1 A1A2 A1A2 A2A2. Во овој случај односот на генотиповите и на фенотиповите е 1:2:1. Пример 2: Монозиготни цветови со црвени ливчиња (AA) и монозиготни цветови со бели ливчиња (aa), во првата генерација продуцираат хетерозиготни цветови со розови ливчиња (Аа). Понатаму во наредната генерација овие хетерозиготни розови цветови ќе продуцираат цветови со црвени ливчиња, розови ливчиња и бели ливчиња, во однос 1:2:1. Дихибридно вкрстување - се следи наследувањето на две потполно независни особини кои се под контрола на два пара гени лоцирани на различни хромозоми (слика 23), односно гените се лоцирани на нехомологни хромозоми, така што независно се распределуваат во гаметите и слободно се комбинираат во хибридите. Дихибридното вкрстување можеме да го анализираме со вкрстување на две чисти линии од грашок, кои меѓу себе се разликуваат по две алтернативни особини боја и форма на семе. Вкрстување на два хомозигота и тоа, растение кое фенотипски е со мазно и жолто семе (доминантна особина), со друго растение кое фенотипски е со зелено и набрано семе. Дихибридите во F1 генерацијата (АаBb), според генотипот можат да продуцираат четири типа на гамети во еднаков сооднос (1:1:1:1). Со случајно комбинирање на четирите типа машки и женски гамети, при оплодувањето се добиваат растенија на втора филијална генерација (F2), кои формираат плодови што носат семиња и припаѓаат на девет различни генетички класи (генотипови), а според фенотипот на семето припаѓаат на четири фенотипски форми и тоа во квантитативен однос 9:3:3:1. Од овие резултати можеме да заклучиме дека гените кои детерминираат различни ососбини се пренесуваат независно. Од друга страна, оваа анализа го потврдува законот за распаѓање бидејќи односот 3:1 е добиен за секоја особина поодделно. 35 Слика 23. Дихибридно вкрстување на две чисти линии за две различни особини Пример1: Вкрстување на заморче со црна боја на крзното (АА) и виткани влакна (ВВ) и заморче со бела боја на крзното (аа) и со рамни влакна (bb). Р: АА ВВ х аа bb. G: AB AB x ab ab или G: AB x ab. F1: AaBb AaBb AaBb AaBb. G: AB Ab aB ab. Во F1 генерацијата сите единки ќе бидат хетерозиготни за двата пара гени, а во F2 генерацијата односот на фенотиповите е 9:3:3:1. F2: Во F2 генерацијата 9 заморчиња се со црна боја на крзно и виткани влакна, 3 се со црна боја на крзно и рамни влакна, 3 заморчиња имаат бела боја на крзно и виткани влакна и само 1 заморче со бела боја на крзно и рамни влакна. 36 Мултифакториелно наследување Мултифакториелно (полигено или комплексно) наследување – тип на наследување на одредени фенотипски карактеристики, особини или заболувања кои се условени од комбинација на дејство на генетски и околински фактори или, пак, присутно е содејство на повеќе гени. Голем број фенотипски карактеристики кај човекот се резултат на делувањето на повеќе гени најчесто локализирани на различни хромозоми. Гените кои ги детерминираат овие особини се наречени полигени и нивното влијание е статистички независно, адитивно и со приближно еднаква вредност, а особините полигени особини или квантитативни особини. На поголемиот дел на квантитативни особини влијанието на средината и начинот на живот се многу битни за нивно изразување, што, од друга страна, ги отежнува проучувањата на начинот на пренесување и наследување. Полигени особини што се наследуваат под влијание на комбинација на гените и надворешните фактори се: висина, тежина, боја на косата, боја на кожата итн., како и интелегенција, дебелеење итн. Мултифакториелното наследување е и причина за развој на повеќе видови на заболувања (табела 1). Овие заболувања се многу потешки за анализа и за предвидување на ризикот на одреден член на семејството. Мултифакториелни нарушувања Дефекти при раѓање: дефекти на неуралната туба-спина бифида, расцеп на горна уста и непце Карциноми: дојка, простата, оваријален, дигестивниот тракт, меланом Кардиоваскуларни состојби: хипертензија, заболувања Метаболички нарушувања: дијабет тип 2, високо ниво на холестерол, дебелина Неуролошко-психијатриски нарушувања: Алцхајмерова болест, биполарни растројства Мускуло-скелетни: артритис, промени Респираторни: астма, алергии, емфизем Дерматолошки: псоријаза, екзем, брадавици коронарни остеопороза, и на срцеви шизофренија, ревмтаски Табела 1: Видови на мултифакториелни нарушувања 37 Карактеристики на мултифакториелните заболувања: Мултифакториелната болест/состојба има комбинација на посебни карактеристики кои можат да се разликуваат од јасни Менделови или полово-условени наследувања. Овие карактеристики го вклучуваат следново: - Болеста може да се појави изолирано, со засегнати деца родени од здрави родители. Иако фамилијарната агрегација е, исто така, честа (т.е. може да има повеќе случаи во исто семејство), не постои јасен Менделов модел на наследување; - Влијанието на животната средина може да го зголеми или намали ризикот од болеста; - Болеста се јавува почесто во еден пол отколку во другиот, но тоа не е сексуално ограничена особина. Покрај тоа, роднини од прв степен на лица кои припаѓаат на поретко зафатениот пол имаат поголем ризик да се носители на болеста; - Стапките на усогласеност кај монозиготните и дизиготните близнаци се во спротивност со Менделовите пропорции. Стапката на конкорданција е мерка за стапката на која двата близнака носат специфична болест; - Болеста се јавува почесто во одредена етничка група (т.е.белци, Африканци, Азијци). Пример за мултифакториелно предизвикана болест: Коронарна артериска болест со зголемена инциденца во светски размери условена од низа ризик фактори: обезност, дијабет тип 2, хипертензија, високо ниво на холестерол и триглицериди. Коронарната артериска болест може да биде присутна кај повеќе членови од семејството, но и покрај тоа не ги следи Менделовите закони на наследување и може да се појави како поединечен случај. Ова заболување има поголема инциденца кај мажите и со поголем ризик се Афроамериканците отколку Европејците или Азијците. Сите овие карактеристики се конзистентни во вбројувањето на коронарната артериска болест во мултифакторијално нарушување. Мултифакторијалните наследувања не секогаш се појавуваат и покрај мутацијата на одреден ген кој го зголемува ризикот на засегнатата личност. На пример, не сите жени со мутација на генот за карцином на дојка и овариален карцином ги развиваат заболувањата. Што значи дека мутацијата сама за себе не е доволно пенентрантна. Причината за ваква некомплетна пенетрантност на мутацијата најверојатно е резултат на интеракцијата помеѓу информацијата од самата мутација со оние на еден или повеќе други гени и со останати фактори (ендогени пр., дебелината и начин на живот) и егзогени (фактори на околината). 38 Прашања: 1. Едниот родител има жолти заби и е доминантен хомозигот, а вториот родител е со бели заби и е рецесивен хомозигот. Анализирај ја F1 и F2 генерацијата! 2. Генот за кафеава боја на коса е доминантен над генот за руса боја на коса. Ако таткото е русокос, а мајката со кафеава коса каква коса ќе има нивното дете ? 3. Каква боја на крзното ќе имаат потомството на глувците ако се познати генотиповите на родителите:   Сс х сс Сс х СС СС- кафена боја на крзното сс- црвена боја на крзното 4. Брак помеѓу деснорака кратковида особа (ААbb) и леворака особа со нормален вид. Анализирај ја F1 генерација! 5. Брак помеѓу особа со црна боја на косата (АА) и вдлабнатинка на брадата (BB) и особа со црвена коса (аа) и без вдлабнатина на брадата. Анализирај ја F1 и F2 генерација! 39 Вежба бр. 5 Популациона генетика Популацијата претставува збир на единки од ист вид кои живеат на одреден простор, репродуктивно се поврзани, активно разменуваат генетски материјал и даваат свое потомство. Секоја популација има одредени карактеристики како што се: полиморфност, слободно движење, меѓусебни интеракции со биотички и абиотички фактори и специфична генетичка структура. Под поимот генетичка структура на популацијата се подразбира зачестеноста на генските алели и нивните комбинации во одреден временски период. Генетската структура на една популација ја сочинуват: - Фреквенцијата на гените (алелите) - влијанието на различните гени (алели) во една популација и Фреквенцијата на генотиповите - влијанието на различните генотипови во една популација. Популационата генетика ја проучува генетската структура на една популација, односно ги анализира фреквенцијата на генските алели и генотиповите во една популација. Дополнително, популационата генетика ја проучува промената на застапеноста на гените и генотиповите низ временски период под влијание на пет главни еволуциски сили: природната селекција, генетското отстапување (genetic drift), мутациите, движењето на гените (genetic flow) и кога не постои случајно спарување на единките. За утврдување на сличностите и разликите помеѓу две хумани популации како и причината за создавање на нови видови, потребно е да се направи споредба на фреквенцијата на генските алели на голем, случајно одбран примерок, односно да се анализира популацијата, а не единките поединечно. Генетската структура на една популација е одредена со сите алелни форми на гените во таа популација. Вкупниот број на гени во половите клетки кај полово зрели индивидуи во една популација ја сочинува генетската залиха (gene pool). Причината е тоа што секој член во таа популација има можност за оплодување со кој било друг член од таа популација, па според тоа, сите гени во гаметите припаѓаат на генетската залиха. Англискиот математичар Харди (Hardy) и германскиот лекар Винберг (Weinberg) во 1908 година дошле до заклучок дека организмите во една популација во одредени услови би требало да одржуваат иста генетска структура од генерација во генерација, односно да постои одредена генетска рамнотежа. Популацијата се наоѓа во генетска рамнотежа, ако во неа делуваат само факторите на наследувањето. Таа генетска рамнотежа во популацијата се формулира со Харди-Винберговиот принцип, кој претставува најважен принцип во популационата генетика бидејќи го објаснува правилото за константна фреквенција на алелите и генотиповите. Харди-Винбергова-та формула: p = фреквенција на алелот А; q = фреквенција на алелот а pA + qa = 1; 1 = целата популација која се набљудува (pA + qa) x (pA +qa) = p2 AA + 2pqAa + q2aa (p +q)2 = p2 +2pq + q2Харди-Винбергово изедначување 40 Харди-Винбергов закон: Во бесконечно голема популација, чиишто единки се вкрстуваат по принцип на случајност и во која не се случуваат мутации, миграции и природна селекција, фреквенциите на генските алели и генотиповите не се менуваат во текот на времето. Сѐ додека нивното вкрстување е случајно, фреквенцијата на генотиповите ќе остане p2 (фреквенција на генотип АА), 2pq (фреквенција на генотип Аа), и q2 (фреквенција на генотип аа). (p е фреквенција на алелот А, а q е фревенција на алелот а). Харди-Винберговото правило важи само за популациите кои се во генетска рамнотежа, односно популацијата која ги има следниве особини: - - - Популацијата е неограничено голема. Кога станува збор за мала популација доаѓа до израз генетското отстапување – збир на случајни промени кои заедно влијаат на тоа кој алел односно ген ќе се задржи кај единките, а кој ќе се изгуби низ популацијата. Генетското отстапување не влијае воопшто или е сосема занемарливо кај голема популација. Сите членови на популацијата можат да се вкрстуваат, а изборот на партнерот е сосема случаен. Во популацијата нема мутации, односно не се создаваат нови алели, нема миграција, во популацијата не влегуваат нови алели ниту од неа излегуваат постоечките. Во популацијата нема природна селекција, односно ниту една единка поради својот генотип нема помала или поголема репродукциска моќ. Утврдување на зачестеноста на алелите во една популација Зачестеноста на алелите во една популација можеме да ја одредиме на два начина: - Ако испитуваните алели се во кодоминантен или во кој било друг однос каде од фенотипот можеме да го видиме генотипот, во тој случај зачестеноста на алелите се одредува така што бројот на поединечните алели го делиме со вкупниот број на алели. - Доколку алелите се во доминантно – рецесивен однос, каде што единствено за рецесивните хомозиготи според фенотипот можеме да го одредиме и генотипот, зачестеноста на алелите во популацијата можеме да ја одредиме со Харди-Винберговo изедначување. Утврдување на зачестеност кај кодоминантни алели Пример 1: Да се утврди зачестеноста на MN крвно-групниот систем кој се наследува кодоминантно кај една популација Австралиски домородци. MN составот на крвните групи е одреден од два алела M и N, па според тоа можни се три различни генотипа: MN, MM и NN. Вкупниот број на домородци е 730, MM – 22 единки; f(MM) = 22/730 = 0.03 (3%) MN – 220 единки;f(MN) = 220/730 = 0.30 (30%) NN – 480 единки; f(NN) = 480/730 = 0.67 (67%) Збирот на фреквенциите на сите можни генотипови мора да биде 1 или 100%. f(MM) + f(MN) + f(NN) = 0,03+0.30+0.67 = 1 Бидејќи MN составот на крвните групи има две алелни форми на генот, секоја единка во популацијата ќе има некоја од можните комбинации на тие два алела. Вкупниот број на алели во популацијата ќе биде 730x2 = 1460 бидејќи сите единки се диплоидни и имаат по два алела. За да се одреди зачестеноста на поедини алели во популацијата, 41 треба едноставно да се пребројат M и N алелите и тој број да се подели со вкупниот број на алели: f(M) = [(2x22) + 220] / 1460 = 0.18 (18%) f(N) = [(2x488) + 220] / 1460 = 0.82 (82%) Збирот на фреквенциите на сите можни алели мора да биде 1 односно 100%. f(M) + f(N) = 0.18 +0.82 = 1 Утврдување на зачестеност на алели кои се во доминантно – рецесивен однос Пример 2:Доколку се следи фреквенцијата на алелите за некое моногенетско својство кое се јавува во два облика, тогаш тие својства се детерминирани со доминантен алел А и рецесивен алел а. Со p се оначува фреквенцијата на алелот А -[f(A)], со q се означува фреквенцијата на алелот а – [f(a)]. Во тој случај во таа популација се можни три вида на генотипови: АА – доминантни хомозиготи; аа – рецесивни хомозиготи и Аа – хетерозиготи. Збирот на гените во оваа популација ќе изнесува 1. pA + qa = 1 (100%) Доколку станува збор за генетска рамнотежа во таа популација, за неа важи ХардиВинберговиот закон. f(AA) = (p x p) = p2- фреквенција на доминантниот хомозигот f(aa) = (q x q) = q2- фреквенција на рецесивниот хомозогот f(Aa) = (p x q) + (q x p) = 2pq – фреквенција на хетерозигот Односот на машките и женските гамети во една популација е ист, односно имаат исти алелни гени (pи q), како што е во целата популација. Кај доминантно рецесивниот однос на алелите што е многу почест за единките со доминантен фенотип не можеме да знаеме каков генотип имаат (се работи или за хетерозигот (2pq) или за доминантен хомозигот (p2)). Од фенотипот првично можеме да заклучиме каков е генотипот на рецесивниот хомозигот (q2). Пример 3: Да се утврди зачестеноста на различните генотипови и алели на индивидуи со албинизам кај една популација. Албинизмот е ретка наследна болест, која фенотипски се експресира само кај рецесивни хомозиготи (аа). Во кожата и косата кај албино-индивидуите недостасува пигментот меланин. Во Северна Америка и Европа се јавува во просек кај 5 индивидуи на 100.000 жители. Со помош на Харди-Винбергово изедначување може да се пресмета колкава е фреквенцијата на поедини алели и генотипови во популацијата. При решавање на вакви примери се тргнува од рецесивните хомозиготи бидејќи кај нив врз основа на фенотипот го знаеме генотипот. Според Харди-Винберговото изедначување фреквенцијата на рецесивните хомозиготи (аа) во случајов албино – индивидуи е q2. Зачестеноста на алелот лесно може да се пресмета: q2 = 5/100.000 = 0.00005 q = √0.00005 = 0.007 Значи зачестеноста на рецесивниот алел за албинизам е 0.007, оттаму може да се пресмета зачестеноста на алелот p. p= 1- q p = 1 – 0.007 = 0.993 Зачестеноста на доминантниот, нормалниот алел (А) е 0.993 или околу 99 алела на 100. Со помош на познатите вредности за p и q и Харди-Винберговото изедначување можеме да ја пресметаме зачестеноста на различните генотипови во популацијата. p2 + 2pq + q2 0.9932 + 2 x 0.993 x 0.007 + 0.0072 = 1 0.986 + 0.014 + 0.00005 = 1 Фреквенцијата на доминантниот хетерозигот (p) е 0.986 (98,6%) 42 Фреквенцијата на хетерозиготот (2pq) е 0.014 (1,4%) Фреквенцијата на рецесивниот хомозигот (q) е 0.00005 (0,005%) Со фреквенција од 0,005% ( 1 на 20000), албино - индивидуите се ретки случаи во популацијата, меѓутоа хетерозиготните носители за оваа особина имаат фреквенција од 1,4% (приближно 1 на 72 индивидуи). Во популацијта има отприлика 278 пати повеќе носители на болеста од заболени индивидуи. Пример 4: Ако се познати фреквенциите на алелите во некоја популација (R и r), под претпоставка дека три можни генотипови еднакво придонесуваат на генската залиха, тогаш можеме да ја пресметаме фреквенцијата на генотиповите низ неколку генерации. f(R) = 0,8 f( r) = 0,2 R + r = 0,8 + 0,2 = 1 Фреквенција на генотиповите ќе биде 0,82 (RR) + 2 x 0,8 x 0,2 (Rr) + 0,22 (rr) = 0,64 + 0,32 + 0,04 = 1 Овие родителски генотипови во следната генерација ја даваат следнава фреквенција на гамети: R = RR + ½ Rr = 0,64 + 0,32/2 = 0,64 + 0,16 = 0,8 r = rr + ½ Rr = 0,4 +0,16/2 = 0,4 + 0,08 = 0,2 Од ова се гледа дека фреквенцијата на гените и генотиповите не се променила низ две генерации. Примена на Харди-Винберговото изедначување - - При анализа на генетската структура на популацијата и тестирање дали популацијата е во рамнотежа. При тестирање на фреквенцијата на гените и генотиповите во случај кога поради потполната доминација невозможно е на основа на фенотипот да се разликува хомозигот од хетерозигот. За изработка на модели кои покажуваат како се менуваат фреквенциите на гените и генотиповите како резултат на природната селекција. 43 Прашања: 1. Да се одреди зачестеноста на генските алели преку зачестеноста на генотиповите на генскиот локус за MN крвниот систем. Генотип: MM, MN, NN зачестеност: p2 = 0,36; 2pq = 0,48; q2 = 0,163! 2. Да се одреди фреквенцјата на алелот А и а доколку е популацијата во генетска рамнотежа и е позната фреквенцијата на генотипот АА кој а изнесува 0,49! 3. Во една популација од 2000 единки, која е во рамнотежа 720 единки се доминантни хомозиготи а 960 се хетерозиготи. Пресметај го вкупниот број на рецесивни алели! 4. Ако 84% од луѓето во една популација имаат одвоена ушна ресичка, пресметајте колку од нив се хомозиготи, а колку хетерозиготи! 5. Белата волна кај овците е одредена од доминантен алел В, а црната волна од рецесивен алел b. Во примерок од 900 овци, 891 се со бела волна, а 9 со црна волна. Одреди ја фреквенцијата на алелите В и b! 44 Вежба бр.6 Родословно стебло – хередограм Еден од класичните генетски методи за откривање на разни патолошки и нормални карактеристики е изработката на родословни стебла или хередограми. Во класичните генетички методи, кои се карактеристични за Менделовата анализа, спаѓаат најразлични вкрстувања на животни и растенија, експерименти кои, секако, не се можни во хуманата генетика, не само поради фактот што човекот не може да биде експериментален објект (од хумани причини), туку и поради самото репродукциско време кај човекот, кое е многу подолго од животот на еден експериментатор. Поради тоа, хуманата генетика користи многу поедноставен метод како што е генеалошкиот, односно изработката на хередограми, во кои, со помош на унифицирани симболи, се внесуваат податоци за најразлични карактеристики кои се следат во повеќе генерации, користејќи ги принципите кои ги поставил Мендел. Студиите на следење на едно својство секогаш започнуваат со ,,афицираната” индивидуа, која се означува како пробант, додека лицето кое бара совет и учествува во составување на хредограмот се нарекува консултант. Генетската историја на пациентот и сите информации поврзани со наследувањето овозможуваат да се конструира родословно стебло или хередограм. Тоа се формира со одредени симболи кои претставуваат универзални знаци за исцртување на шеми за семејни стебла. Потоа следи пополнувањето на деталите во хередограмот од машката и женската страна. Вообичаено, татковата линиjа се црта од лева страна, а мајчината од десна страна. Притоа, различните генерации се бележат со римски броеви (I,II,II…), а индивидуите со арапски броеви (1,2,3...) и тоа од лево кон десно по хронологија на раѓање. Во текот на изработувањето на хередограмот можни се и некои проблеми кои потекнуваат од неискреноста на консултантот, односно намерно да се премолчат некои информации како прељуба или абортус, како и неможност да се добијат информации за дадената карактеристика доколку одредена индивиуа е почината, со што хередограмот може да биде и неуспешен. Слика 24. Универзални симболи за прикажување на родословно стебло 45 При анализата, со помош на родословното стебло врз основа на тоа колку често се манифестира одредено заболување и на кој начин се пренесува од родител на потомок, може да се утврди дали станува збор за доминантна или рецесивна мутација, како и тоа дали мутираниот ген е сместен на автосомните хромозоми, на X хромозомот, на Y хромозомот или на митохондријалната ДНА. Типот на наследување на една генетска болест зависи од типот на мутацијата, дали таа е доминантна или рецесивна или полово врзана (Mенделово наследување) или се работи за сосема други правила на наследување (Неменделово наследување). Поделбата на типовите на наследување е претставена на табела 2. Табела 2. ТИПОВИ НАСЛЕДУВАЊА 1. АВТОСОМНО  Автосомно доминантно  Автосомно рецесивно 2. ПОЛОВО ВРЗАНО  X - Врзано рецесицно  X - Врзано доминантно  Y –врзано 3. НЕМЕНДЕЛОВИ НАСЛЕДУВАЊА 46 Автосомно доминантно наследување Ова наследување настанува кога постои фенотипска експресија на мутираниот алел кај хетерозиготот. Како што напоменавме, доминантното својство се добива кога двата наследни фактора со различен фенотип ќе се најдат во зиготот, a фенотипски ќе се изрази само едното својство. При анализа на хередограми, еден од главните аргументи при констатацијата дека се работи за доминантно автосомно наследување може да биде: - носителот на мутација е болен; - фактот дека мутираниот ген се пројавува во секоја генерација и дека афектираните татковци и мајки го пренесуваат и на ќерките и синовите; - присутноста на двата пола од кои дел се заболени, а дел се здрави, укажува на поврзаноста за автосомите, а не за гоносомите; - доволно е само едниот родител да има еден доминантен алел за во потомството да се јави болно дете. Слика 25. Родословно стебло типично за пренесување доминантна мутација. Се гледа верикална трансмисија и засегнатост на двата пола Болести и особини кои се детерминирани од автосомно - доминантните гени Кај автосомно доминантното наследување барем еден од родителите боледува од истата болест. Автосомните доминантни заболувања понекогаш не се јавуваат веднаш по раѓање, туку се јавуваат подоцна во текот на животот и клиничката експресивност се разликува од човек до човек. Панетова мрежа: претставува збир од секоја можна комбинација на еден алел од мајката и еден алел од таткото од хомолгниот пар на гени. Со неа се овозможува одредување на евентуалниот генотип на потомството. Во првиот пример е прикажано еден заболен родител (Аа) и еден здрав (аа), може да имаат 50% здраво потомство. Во вториот пример имаме двајца афектирани родитела (хетерозиготи, Аа), имаат 75% болно потомство и 25% се шансите да имаат здраво дете. 47 Слика 26. Пример за Панетова мрежа. Во семејство каде едниот родител е заболен хетерозигот (Аа), другиот е здрав хомозигот (аа) 50% од потомството ќе биде заболено, 50% здраво (панел лево). Во семејство каде двајцата родители се афектирани хетерозиготи постои можност 25% од потомството да бидат здрави индивидуи (панел десно) Автосомно- доминантно се наследуваат следниве болести кај човекот: - Полидактилија – повеќе прсти; - Брахидактилија- скратени прсти; - Синдактилија – сраснати прсти; - Аходроплазија – џуџест раст (кој треба да се разликува од џуџест раст кој е предизвикан поради недоволно лачење на хормонот за раст односно поради хипофункција на аденохипофизата); - Астигматизам; - Марфанов синдром. Хантингтонова хореа е невролошка и невродегенеративна болест. Прво се манифестира како благо намалување на интелектуалните способности, губење на рамнотежата, неконтролирани движења. Обично се јавува во средна возраст, а во наредните 15-20 години доаѓа до целосно губење на моторната контрола и менталните функции. Причина е мутација на генот кој се наоѓа на краткиот крак на хромозомот 4 при што доаѓа до повеќекратно повторување на триплетот од бази CAG, кој кодира синтеза на аминокиселината глутамин. Автосомно- рецесивно наследување За разлика од автосомното доминантно наследување, кај автосомното рецесивно наследување мора да се зафатени двата алела, односно мора да се заболени двата родитела. Болестите со ова наследување се пренесуваат хоризонтално низ родословното стебло (слика 27). Најчести болести се оние кај кои се јавуваат промени во метаболизмот на протеини, јаглехидрти и масти, поради неможност за создавање на ензими. 48 Слика 27. Родословно стебло - автосомна рецесивна болест. Двајцата родители се фенотипски здрави, хетерозиготни преносители на автозомна рецесивна болест. 25% од нивните потомци се здрави хомозиготи, 50% се здрави хетерозиготипреносители и 25% се заболени хомозиготи Болестите, кои се наследуваат автосомно рецесивно, се појавуваат само ако лицето е хомозиготно за мутираниот ген, односно кога мутацијата се наоѓа на двата генски алела. Индивидуите, кои се хетерозиготни за рецесивниот мутиран ген, не покажуваат знаци на заболување и тие се клинички здрави т.е. тие се носители. Во родословното стебло заболени се лица од иста генерација браќа и сестри, додека двајцата родитела се здрави носители на мутацијата во еден генски алел. Кога двајцата родитела се хетерозиготни носители, 25% од децата ќе бидат здрави хомозиготи, 50% ќе бидат здрави хетерозиготи, но носители на мутиран ген и 25% ќе бидат заболени хомозиготи. Автосомно рецесивно се наследуваат следниве болести: - Фенилкетонурија, Албинизам, Тирозинози, Wilson-ова болест, Цистична фиброза и Хемоглобинопатии. Албинизам - Оваа болест е предизвикана со недостаток на меланин, пигмент во кожата, косата и окото, а е резултат на мутации во гените кои се вклучени во биосинтезата на меланинот. Недостаток на пигментот води кон хипоплазија на фовеата. Овие промени се одговорни за нистагмус, страбизам и намалување на визуелната острина, оштетувања кои се карактеристични за сите видови на албинизам. Албинизмот е наследно генетско нарушување, кое се карактеризира со Слика 28. Пример на Панетова мрежа кога двајцата родитела се фенотипски здрави, но носители на мутиран ген. Кај 25% од потомството ќе се појави рецесивната особина 49 делумно или целосно отсуство на пигментација на кожата, косата и очите. Меланинот е црн или кафеав пигмент кој се произведува во клетките на меланоцитите во кожата косата и очите. Албинизмот подеднакво е распростанет и кај мажите и кај жените, се наследува преку рецесивни гени, што значи дека и двајцата родитела треба да имаат нарушување (што не мора да биде видливо) за оваа болест да се пренесе на детето. Ако само едиот родител го има овој ген, многу ретко може да се добие оваа болест, но, сепак, е можно. Физички симптоми: светол тен, светла или бела коса и многу светли очи, кои можат да бидат дури црвени или розови. Фенилкетонурија Дефицитот на фенилаланин хидроксилазата т.е фенилкетонуријата е автосомно рецесивно заболување кое најчесто се наследува од хетерозиготни клинички здрави носители. Генот за овој ензим (RAH генот) се наоѓа во долниот крак од хромозомот 12. Заболувања предизвикани од гени локализирани на половите хромозоми Различната хромозомска конституција кај мажите (46,XY) и кај жените (46,XX) влијае на специфичното изразување на мутациите за X хромозомот. Машката индивидуа е со ХУ хромозоми и се нарекува хемизигот, а жената е хомозигот бидејќи има два Х хромозома. У-хромозомот носи помал број на активни гени од кои најважни се генот за машка сексуална диференцијација на кусиот крак, генот за сперматогенеза на долгиот крак, генот за инхибиторот на Милеровите канали и неколку други. За разлика од У-хромозомот, Х-хромозомот е носител на голем број гени кои влијаат на различни органи и системи, па и оттаму произлегуваат и многубројните Хврзани заболувања. X-врзано наследување Ова наследување е врзано за Х- хромозомот и најчесто има рецесивен карактер. Во најголем број на случаи болеста се манифестира кај машки единки, додека кај женски единки болестите се манифестираат доколку мутираниот ген е присутен во хомозиготна состојба. Овие болести таткото не може да ги пренесе на своите синови, туку исклучиво на своите ќерки, кои претставуваат преносители на оваа болест. - Ако здрави родители имаат болно дете, двајцата родители се хетерозиготи, па во просек ¼ од нивните деца се болни, ½ се хетерозиготи, а ¼ се здрави. - Сите деца на еден болен и еден здрав родител се фенотипски нормални хетерозиготи. - Во просек ½ од децата на еден болен и еден родител кој е хетерозигот се болни, а ½ се хетерозиготи. - Кога се болни двајцата родители сите деца се болни. - Веројатноста за заболување и кај машки и кај женски деца е еднаква. Хетерозиготите се фенотипски здрави, но се носители на заболувањето. Ако се знае за кој тип на мутација се работи со помош на методите на молекуларната генетика можат да се откријат фенотипски здрави хетерозиготи. Наследувањето врзано за Х хромозот се пренесува од мајката на синовите. 50 Слика 29.Мајка носител на мутиран ген и татко здрав. Се добива 25 % болен син, 25% здрав син, 25% ќерка носител, 25% здрава ќерка. Слика 30.Мајка носител на мутиран ген и болен татко. Се добива 25% болна ќерка, 25% ќерка носител на мутиран ген, 25% болен син и 25% здрав син. Слика 31.Болна мајка и здрав татко. Во ваква ситуација се добива 50% ќерки преносители и 50% болни синови. Слика 32.Трансмисија низ родословното стебло на патолошкиот ген низ генерациите. Женската индивидуа носител на патолошкиот ген кога ќе стапи во брак со здрав маж секогаш има 25% веројтност да го пренесе генот на нејзините ќерки, како и веројатност 25% за заболено машко дете 51 X – врзано рецесивни заболувања Нарушувања кои се врзани за гените од Х хромозомот се: - Хемофилија (неспособност за згрутчување на крвта); Далтонизам (слепило за бои); Душенова мускулна дистрифија (мускулна слабост) и Ихтиозис (кожата наликува на лушпи од риба). Далтонизмот - е рецесивна мутација на генот кој е сместен на Х хромозомот, а носителите на оваа мутација не разликуваат црвена од зелена боја. Жените се најчесто преносители на мутираниот ген и се фенотипски здрави. Додека машките единки почесто заболуваат бидејќи имаат само еден Х хромозом и доволно е тој да биде носител на мутиранот ген и болеста ќе се манифестира. Ако двајцата родитела се фенотипски здрави, но мајката е носител на рецесивниот ген за далтонизам: P: Х Х – Х Y F1: Х Х;Х Х; ХY; ХY Постои можност да имаат по едно машко и женско дете кои ќе бидат здрави, едно женско дете кое ќе биде носител на рецесивен ген за далтонизам и едно заболено машко дете. За женското дете да биде далтонист, потребно е мајката да е рецесивен носител, а таткото заболен од далтонизам. P: Х Х –ХY F1: Х Х; ХХ; Х Y; ХY Хемофилија - Хемофилија спаѓа во групата на коагулопатии поради тоа што станува збор за неможност за запирање на крварење – коагулација поради недостаток на одредени протеини во крвната плазма. Најчестиот тип на хемофилија е хемофилија А, односно постои недостаток на коагулационен фактор осум (VIII), додека хемофилија Б е поредок тип на хемофилија, при што постои недостаток на фактор за коагулација девет (IX). Хемофилијата е Х – врзано заболување кое се наследува рецесивно.Тоа значи дека заболуваат само машки единки, а жените се само преносители на оваа болест. - Маж заболен од хемофилија ќе го пренесе заболувањето на сите свои ќерки кои ќе бидат преносители, додека сите негови синови ќе бидат здрави доколку мајката е здрава и не е преносител на заболувањето. - Доколку таткото е здрав, а мајката преносител на хемофилија, постои можност 50% од синовите да бидат заболени, 50% здрави и 50% од ќерките ќе бидат преносители, а 50% здрави. - Во многу редок број на случаи, само ако ќерката потекнува од татко заболен од хемофилија и мајка преносител на оваа болест, женската единка може да заболи од оваа болест. Душен мускулна дистрофија е Х врзано рецесивно заболување. Причина за ова заболување е еден од најголемите гени во човечкиот организам одговорен за синтеза на протеинот дистрофин, кој е клучен за функцијата на сите мускули во човечкиот организам. Се манифестира со нарушување на мускулната функција на сите мускули при што се јавува мускулна слабост, неможност за самостојно движење. Болеста е летална поради атрофија на мускулите кои учествуваат во процесот на респирација, пред сѐ дијафрагмата. Пред сѐ заболуваат машки единки, а жените се, главно, преносители. Во ретки случаи женските деца можат да заболат доколку потекнуваат од болен татко и мајка преносител. 52 Y врзано (холандрично) наследување За гените кои се сместени на едниот полов хромозом (X или Y) индивидуите се хемизиготни бидејќи немаат соодветен алел на другиот гоносом и се експресираат дури и во рецесивна состојба. За таквите гени велиме дека се псевдодоминантни. Во хуманата популација машките единки се хетерогаметни, Y хромозомот се предава од таткото на синовите, па оттаму гените кои се само во Y хромозомот ќе покажат холандрично наследување (слика 33). Тие се предаваат само на машките потомци и лесно можат да се следат низ генерациите. Y – хромозомот е најмал хромозом и содржи најмалку гени. Заболувањата врзани со гените на У-хромозомот се ретки и се однесуваат, главно, на машки стерилитет. Идентификувани се околу 27 болести кои се пренесуваат преку У-хромозомот, а меѓу нив спаѓаат: азоспермија, retinitis pigmetnosa, grow control Y factor и други. Слика 33.Y- врзано (холандрично) наследување. Се пренесува од таткото на сите машки потомци 53 Прашања: 1.Ако кај таткото е присутна влакнатост на ушниот канал веројатноста кај неговите синови да биде присутна оваа болест е: А) 70% Б) 25% В) 100% Г) 0% 2. Дали двајца болни родитела од ахондроплазија можат да имаат здраво дете? 3. Ако таткото боледува од хемофилија, а мајката е фенотипски здрава, веројатноста дека нивниот син ќе боледува од хемофилија е: А) 75% Б) 25% В) 100% Г) 0% 4. Доколку мајката е здрав хетерозигот, а таткото е здрав хомозигот колку од нивните четири деца ќе бидат со фенилкетонурија? 5.Дијагноза за хемофилија А е потврдена кај некои членови во семејството со помош на молекуларна дијагностика. Што се советува во следната бременост кај мајката која носи женски плод, колкав е ризикот внукот да ја наследи болеста? 54 Вежба бр.7 Наследување на крвни групи Крвта е течно ткиво кое ги исполнува крвните садови и срцето и преку циркулацијата ги поврзува сите органи меѓу себе. Составена од 45% крвни елементи (еритроцити, леукоцити и тромбоцити) и 55% крвна плазма (90% вода, 10% протеини, витамини, масти, јаглехидрати и др.). Како примерок на крв за анализа најчесто се зема венска крв, артериска се зема поретко единствено во болнички услови, капиларна крв од прст се зема доколку е потребно да се направи брза анализа на одредени параметри во крвта. Плазма – е течен дел од крвта во која се наоѓаат коагулационите фактори. За испитување на плазма, се зема примерок од крв во епрувета во која има додадено антикоагулационен фактор (хепарин, цитрати) за да се спречи коагулација. Потоа земениот примерок се центрифугира при што се издвојуваат три слоја (слика 34). - плазма – најгорниот слој, најлесен, жолтеникав; - тенок белузлав слој од леукоцити и тромбоцити на средина; - на дното се таложат еритроцитите кои се најбројни и најтешки. Слика 34. Состав на крвта: крвна плазма 55%, леукоцити и тромбоцити < 1%, еритроцити 45% од вкупната крв Кога се правени првите обиди со трансфузија на крв од едно лице на друго, често се јавувала моментална или одложена аглутинација и хемолиза на црвените крвни клетки што често резултирало со смрт. Набргу е откриено дека крвта од различни лица има различни антигенски и имунолошки својства, така што антителата од крвната плазма од едната крв ќе реагираат со антигените кои се наоѓаат на површината на црвените крвни клетки од другата крв. На површината на клеточната мембрана на еритроцитите се идентификувани околу 30 антигени и секој од нив може да предизвика понекогаш реакција антиген антитело. Повеќето антигени се слаби и предизвикуваат слаба и минлива реакција. Два типа на антигени се особено значајни при трансфузија на крвта. Тоа се антигените кои се класифицирани во ABO системот и на антигените од Rh системот. АBО – крвниот систем е пример за појава позната како мултипли алелизам појава на повеќе форми на генски алели сместени на ист генски локус и одговорни за исто фенотипско својство во популацијата. Крвната група е класификација која се базира на присуство или отсуство на антигени супстанции на површината на црвените крвни клетки (еритроцитите). 55 Најважни антигени се A, B и Rh. Според нивното присуство се одредува дали некој е А, B, AB или О крвна група, со + (позитивен) или – (негативен) Rh статус. Според АBO системот, во хуманата популација постојат четири крвни групи O, A, AB, и B. Поделбата се прави врз основа на присуство на А и В антигени на површината на еритроцитите (слика 35). Слика 35. ABO систем на крвни групи. Поделба на крвните групи врз основа на присуството на А и В антигени на површината на еритроцитите Антигените се нарекуваат и аглутиногени бидејќи во присуство на соодветни антитела вршат реакција на аглутинација. - Антителата (аглутинини) кои се наоѓаат во крвната плазма се - анти-А (α) и анти-В (β) антитела. - Аглутинација (слепување) - иреверзибилна, специфична реакција помеѓу растворливите антитела и нерастворливите антигени, при што се формираат аглутинати (агрегати) видливи со голо око. Нормално,истовремено присуство на антиген и соодветно антитело (антиген и антитело со иста буква) нема во крвта на човекот- Ландштајнеров закон. - Одредување на крвна група Индикации за одредување на крвната група се: - пред трансфузија на крв и - при првиот преглед на трудниците за да се одреди Rh факторот. Најчесто крвната група се определува со две методи: - одредување на крвна група на плочка и - одредување на крвна група во епрувета. И во двата случаја се користи венска крв, а кај бебињата може да се земе крв од петата или од ресичката на увото. Одредување на крвна група на плочка - Потребни се плочки со вдлабнатинки обележани со А, B и Rh, шишенца со готови тест серуми – Анти-А, Анти-B и Анти-D, стаклени цевки за мешање на крвта со серумот како и стерилна игла. 56 Се зема крв од пациентот, се капнуваат неколку капки на вдлабнатинките од плочката каде претходно се ставени серумите, се меша со стаклено стапче и се следи каде ќе настане аглутинација. Одредување на крва група во епрувета - Се прави суспензија од еритроцити (кои сме ги добиле со претходно центрифугирање на крвта и нивно одвојување во долниот дел од епруветата) со NaCl. Потоа од суспензијата се става во различни епрувети и во едната се додава серум анти-А, а во другата серум анти-В, врз основа на тоа каде настанува аглутинација се одредува за која крвна група станува збор. Наследување на крвна крупа од ABO сиетсмот АВО системот на крвни групи го одредува генот (I) кој е сместен на хромозом 9 претставен во популацијата со три алелни форми (IA), (IB), (i). Алелите IА и IB се функционални и одредуваат синтеза на одредени антигени на површината на еритроцитите. Алелот IА одредува синтеза на антигени А на површината на еритроцитите, алелот IB одредува синтеза на антигени В на површината на еритроцитите, алелот i е нефункционален и не одредува синтеза на антигени на површината на еритроцитите. Алелите IА и IB секогаш се доминантни кон алелот (i) и се наследуваат доминантно во однос на алелот i. Mеѓусебно IА и IB се кодоминантни, додека алелот i е рецесивен и се наследува само кога е во хомозиготна состојба. Овие три алела даваат шест можни генотипа, меѓутоа заради рецесивноста на алелот i, даваат четири фенотипа односно четири крвни групи: - крвна група А – (IА IА), (IАi) –генотип; крвна група В – (IB IB), (IBi) – генотип; крвна група АВ – (IАIB) – генотип и крвна група О – (ii) – генотип. Крвната група А се наследува доминантно и може да се јави во хомозиготна доминантна (АА) и хетерозиготна (АО) состојба. Исто така, се наследува и крвната група B (BB,BO), додека крвната група AB се наследува кодоминантно. Нулта крвната група се наследува рецесивно-хомозиготно (слика 36). Слика 36.Наследување на крвните групи 57 Наследување на Rh (Резус) факторот Составен е од 6 антигени (C, c, D, d, E, e). D-антигенот има најизразени антигени својства, па кога зборуваме за припадност во Rh-крвно-групниот систем се мисли на присуство или отсуство на D-антигенот на површината на еритроцитите. Природно, во крвта на Rh (-) луѓе, нема анти-D антитела. Само Rh (-) луѓе, кои ќе дојдат во допир со Rh (+) крв (пр., при несоодветна трансфузија на крв, при бременост со Rh (+) плод и др.), создаваат анти-D антитела. Rh-инкомпатибилија Кога Rh (-) мајка, при прва бременост, носи Rh (+) плод, тоа не прави никаков проблем бидејќи еритроцитите на плодот не ја минуваат фето-плацентарната бариера. Контактот настанува при породување, кога бебето поминува низ родилните патишта и Rh (-) крв на мајката ќе дојде во допир со Rh (+) крв од бебето, при што во нејзината плазма ќе се создадат анти-D антитела. Ризикот настанува при наредната бременост, ако таа жена повторно носи Rh (+) плод. Тогаш, анти-D антителата од крвта на мајката преку фето-плацентарната мембрана ќе преминат во плодот и ќе извршат хемолиза (распаѓање) на неговите еритроцити. Тоа доведува до појава на хемолитична болест на новороденото, која може да се манифестира на повеќе начини, зависно од јачината на реакцијата (застој во развојот, невролошки нарушувања, зголемена слезинка и црн дроб, жолтица, па сѐ до смрт на плодот). Слика 37. Rh инкомпатибилија. Сензибилизирање на Rh- мајка со антигените од Rh+ плод при прва бременост и реакција на создадените антитела при втора бременост 58 Одредување на Rh – фактор На стакленце се става една капка капиларна крв. Врз неа се става анти-D серум. Се мешаат со стаклено стапче и се отчитува дали настанала реакција на аглутинација. Слика 38. Одредување на Rh факторот со реакција на аглутинација. Наследување на Rh фактор Rh факторот го одредува генот кој е лоциран на првиот хромозом. Постои во две алелни форми D и d. D-алелот означува присуство на антиген на мембраната на еритроцитот, а алелот-d не продуцира антиген. Кога ќе се оствари хомозиготност на рецесивнот алел d (dd), само тогаш индивидуата ќе има Rh- (негативна крвна група). Rh+- (Dd), (DD) – генотип Rh- - (dd) – генотип Слика 39. Наследување на Rh факторот од родители кои се хетерозиготни.Веројатноста децата да се Rh+ позитивни е 75%. 59 Прашања: 1. Мајката е Rh+(хетерозигот), а таткото Rh-. Дали во потомството може да има Rh- индивидуи? 2. Мајката е А крвна група (хетерозигот), а таткото АВ. Кои се можни крвни групи на потомството? 3. Во случај на спорно татковство да се одреди таткото на детето чија крвна група е A Rh-, aко мајката е АВ Rh+. Првиот можен татко е со А Rh+, а вториот е В Rh-. 4. Во болница случајно се измешани 4 бебиња. АВО крвните групи на четирите бебиња се знае дека се: О, А, В, и АВ. АВО типовите на крвите групи се детерминирани. Наведете кое бебе на кој родителски пар му припаѓа: а) АВ х О б) А х О в) А х АВ г) О х О 5. Во случај на спорно татковство определете кој е татко на детето со О-та крвна група ако се знае дека мајката е со Б крвна група, едниот можен татко е со А крвна група, а вториот со АБ крвна група? 60 Вежба бр.8 Пренатална дијагностика и генетско советување Пренаталната дијагностика (ПД) подразбира серија на постапки и методи со кои можат да се идентификуваат одредени малформации и наследни болести уште во текот на бременоста. Пренаталната дијагноза е особено важна за идните родители, со цел навреме да бидат иформирани за ембрионалниот развиток на нивното неродено дете. Пренатална дијагноза се врши со цел доколку постои одредена малформација идните родители да направат избор дали ќе ја продолжат или ќе ја прекинат бременоста. Скрининг тестовите не служат во дијагностички цели за утврдување на одредена конгенитална малформација или хромозомопатија, туку само укажуваат на постоење на зголемен ризик. Резултатот едноставно укажува на потребата на понатамошни дијагностички тестови за потврда дали се работи за конгенитална аномалија. Со помош на скрининг методите може да се открие плод со дефект на неврална туба (спина бифида, аненцефалија), абдоминални дефекти (гастрошиза, омфалоцела), трисомија 21, 18 и други хромозомопатии. Инвазивните дијагностички тестови можат да се понудат на бремени жени со висок ризик. Важно е да се знае дека никој од овие тестови не гарантира раѓање на здраво бебе. Пренаталната дијагноза може да биде неинвазивна и инвазивна. Неинвазивната ПД (ултразвучен преглед, мајчин троен тест) може и треба да се примени на секоја бремена жена. Инвазивната ПД е индицирана само при одредени состојби со оглед на ризикот што истата го носи по здравјето на плодот и мајката. Индикации за инвазивна ПД се: - жена или нејзиниот партнер за кои се знае дека се носители на генетска болест; - брачни другари со семејна историја за дефекти на неврална туба; - кај мајка постара од 35 години; - во семејство каде се родени деца со одредени малформации; - жени со позитивен троен тест или аномалија видена на ултразвук; - слаб развиток на плодот доколку идната мајка покажува загриженост за развојот на своето бебе и инсистира на пренатална дијагностика; - при повеќе спонтани абортуси или мртвородени деца. Неинвазивни пренатални дијагностички методи – техники кои не носат ризик ниту за мајката ниту за плодот се: - ултразвук, - фетална ехокардиографија и - тестирање на мајчина крв преку биохемиски маркери. Ултразвук е неинвазивна метода во пренаталната дијагностика која не носи ризик ниту за плодот ниту за мајката. Ултразвукот денеска е рутинска метода за следење на бременоста. Вообичаена е дводимензионалната ехографија која ја одредува возраста на плодот според феталните мерки (обем на глава, должина на рбет, бутна коска). Исто така, со ултразвукот може да се детектира постоење на мултипна бременост, позицијата на плодот, протокот на крв низ папочната врвка, причини за крварење како и детекција на малформации. Најважна мерка, која влегува во алгоритамот за зголемен ризик, е нухалната транслуценција, односно наборот на кожата на задниот дел од вратот на плодот (слика 40). Ултрасонографијата се користи и како помошна метода при изведување на инва- 61 зивна пренатална дијагностика (амниоцентеза, биопсија на хорионски ресички). Слика 40. Пренатална ехо дијагностика: разлика меѓу нормален плод (лево) и плод со ризик за трисомија 21(присуство на зголемена нухална транслуценција – десно) Фетална ехокардиографија е основна дијагностичка метода која детално ја прикажува морфологијата и функцијата на срцето на фетусот, најдобро во 24 недела од бременоста. Се изведува со помош на ултразвучен апарат и користење на ултразвучни кардиолошки сонди. Биохемиски маркери од крвта на мајката се користат за пренатален скрининг на генетски аномалии во почеток на второто тримесечје од бременоста. Оптимално време за изведување на овој тест е помеѓу 15 и 18 недела од бременоста. Табела 3. Абнормалност Дефект на неврална туба AFP hCG ─ E3 ─ Трисомија 21 Трисомија 18 Троен тест (“Triple test“) скрининг преку испитување на супстанци во серумот кај бремена жена - алфа фетопротеин, хуман хорионски гонадотропин, естриол чии покачени вредности сугерираат постоење на дефекти на неврална туба, гастрошиза како и за Даун-ов синдром ( табела 3). Инвазивни пренатални дијагностички методи се методи со кои се добиваат фетални ткива за пренатална дијагностика. Со добивање на примерок од ткивото на фетусот (клетки или течности) можат да се дијагностицираат хромозомски и генетски аномалии, болести на метаболизмот, нарушувања и болести на крвта и фетални инфекции. Овие техники носат ризик и за мајката и за плодот. Најчесто користени инвазивни методи се: - амниоцентеза, биопсија на хорионските ресички, фетоскопија, хордоцентеза и радиографија. Слика 41. Приказ амниоцентеза на постапката на 62 Амниоцентеза е постапка на трансабдоминална пункција и земање на амнионска течност низ абдоминалниот ѕид на бремената жена меѓу 16-18 гестациска недела (рана амниоцентеза) или подоцна (доцна амниоцентеза) со помош на игла за амниоцентеза водена под ултразвук (слика 41). Се аспирира амнионска течност (составена од фетална урина и фетални десквамирани клетки од кожата). Истата се центрифугира за да се одвојат клетките (кои паѓаат во вид на талог) од течноста. Клетките се користат за култивирање (кариотип и ДНК анализа), додека течноста се користи за биохемиска анализа (одредување на алфа фетопротеин). Амниоцентезата се изведува во операциона сала. Со голема игла се врши аспирација на амнионска течност. Добиениот примерок треба да биде бистар, да не е хеморагичен и да содржи 98-99% вода и 1-2% на клетки. При изведување на амниоцентезата, постои ризик од абортус како и ризик од истекување на амнионската течност, а, исто така, постои опасност да не се добие доволна количина на амнионска течност. Биопсијата на хорионските ресички е најраниот пренатален дијагностички метод и, обично, се применува меѓу 10-12 гестациска недела. Може да се изведе трансвагинално (со помош на катетер) и трансабдоминално (со помош на игла) под водство на ултразвук при што се зема примерок од плацентарните ресички (слика 42). Предност на овој метод е тоа што одредени кондиции можат да се откријат многу рано, уште додека самата бременост не е манифестна, меѓутоа некои метаболопатии сѐ уште немаат експресија во оваа гестациска старост, па резултатот може да биде лажно негативен. Потенцијалните ризици вклучуваат компликации од типот на абортус, Слика 42. Приказ на трансцервикален и трансабдоминален начин на земање на биопсија од хориноските ресички за пренатлна дијагноза мешање на мајчините и феталните клетки, нарушување на циркулацијата во плацентата. Оваа техника има и одредени ограничувања со оглед на тоа дека хромозомите добиени на овој начин се пократки, можно е да се промашат одредени транслокации или делеции. Радиографијата сѐ помалку се користи поради ризикот од озрачување на плодот. Фетоскопија е метод со кој се овозможува визуелизација на фетусот со помош на ендоскоп. Ендоскопот се внесува во амнионскиот простор со што се утврдуваат одредени аномалии кај плодот (полидактилија, промени на кожата и др.) Слика 43. Фетоскопија (слика 43). Методот се изведува во подоцнежните месеци од бременоста и носи висок ризик од абортус. И покрај тоа што во денешно време се надминува со употреба на тродимензионална ултрасонографија, овој метод е сè уште неприкосновен за детектирање на суптилни фетални аномалии кои можат да упатат на постоење на сериозна кондиција. 63 Хордоцентеза е метод при кој со трансабдоминална пункција под контрола на ултразвук се зема фетална крв. Се изведува од 20 до 22 гестациска недела и носи голем ризик за плодот. Метод сличен на амниоцентезата, при што, наместо амнионска течност се пунктира умбиликалната врвка и се добива крв од умбиликалните крвни садови (слика 44). Овој метод се применува само во специјални состојби кога е добиен невообичаен резултат од амниоцентезата. Слика 44. Приказ на земање на фетална крв од умбиликалните крвни садовиХордоцентеза Неонатален скрининг Под неонатален скрининг се подразбираат постапки во рамките на превентивната медицина, кои имаат за цел откривање на болести кај новороденчињата кај кои соодветната дијагноза и лекување резултираат со значително намалување на смртноста, морбидитетот и инвалидноста. Една од најчесто применуваните во светот, а воедно и задолжителна скрининг програма во нашата земја, е скринингот на конгениталниот хипотироидизам. Конгениталниот хипотироидизам е заболување при кое постои недоволна синтеза или неадекватно дејство на хормоните на штитната жлезда. Непрепознат и нелечен навреме, конгениталниот хипотироидизам има тешки последици врз психофизичкиот развој на новороденчето кои се манифестираат во вид на ментална и физичка ретардација од различен степен. Со воведување на навремена суплементациона терапија (тироксин) на новороденчињата со конгенитален хипотироидизам им се обезбедува нормален психофизички развој што го потврдува значењето на неонаталниот скрининг во дијагностицирањето на ова заболување. Скринингот на конгениталниот хипотироидизам се врши преку одредување на концентрацијата на hTSH (хуман тиреостимулирачки хормон) во сува капка крв на филтер хартија со методот на имунофлуоресценција (DELFIA). Генетско советување Постојат повеќе скрининг методи кои се користат за пренатална дијагноза поради тоа што одредени болести, доколку се откријат во првите недели по раѓањето, можат успешно да се превенираат. Конгенитален хипотироидизам доколку се открие веднаш после раѓањето и веднаш се започне со терапија, може да се избегне тешка ментална ретардација која би се развила доколку не се третира соодветно новороденото. Раното откривање на фенилкетонурија може да се превенира доколку детето се храни со храна без фенилаланин. Потребата од детални информации за различни аспекти на наследните болести овозможи развој на генетското советување како посебна дисциплина на генетиката. Семејството кое има дете со малформации секогаш има потреба од следниве информации: - Дали појавата е наследна или случајна? Дали и кој ја пренесел болеста на потомството и дали постои ризик за појава на болеста и кај другите деца во семејството кои дотогаш не пројавиле симптоми? Дали постои ризик за повторување на малформацијата во семејството? Доколку постои ризик, дали истиот може да се намали? 64 - Кои се можностите за лекување? По дефиниција, генетското советување претставува процес на комуникација кој се однесува на загриженоста на единките за појава и/или пренесување на наследни болести. Во основа, генетското советување треба да му овозможи на семејството да ја разбере болеста, нејзините знаци, идниот развој како и можноста за лекување, да го разбере начинот на наследување и ризиците за пренесување на болеста и да ги разбере можностите што ги нуди современата медицина за намалување на ризиците. Генетското советување треба да има и силни елементи на поддршка што ќе му овозможат на семејството одреден сопствен избор без никакви притисоци или чувство на вина за неправилен избор. Генетското советување се состои од неколку важни чекори: - дијагноза, утврдување на ризиците, комуникација, дискусија за можностите и долготраен контакт и поддршка. Генетското советување може да дојде во предвид само ако може да се постави точна дијагноза, а да се изостави доколку не постои сигурност во дијагнозата бидејќи таквиот пристап на груба проценка без факти може да доведе до трагични грешки. Земањето анамнеза кај наследните болести е многу деликатен и пресуден чекор за сигурна дијагноза на овие болести. Најчесто семејството, и покрај тоа што бара генетско советување, не е подготвено да ги даде сите податоци неопходни за процесот на дијагноза. За наследните болести потребно е клиничкиот преглед да биде многу детален, да се прегледа секој дел од телото, да се нотираат неправилностите или деформитетите. Лабораториските анализи, ехо - дијагностиката, другите техники на визуелизација, цитогенетиката и молекуларните техники придонесуваат за конечната дијагноза. Откако ќе се постави дијагнозата, семејството треба да биде информирано за сите идни опции. Изборот на постапката секогаш им припаѓа на родителите. Оној што го врши генетското советување треба колку што е можно помалку да влијае на конечната одлука. Многу често, родителите, исправени пред тешка одлука, бараат совет од генетичарот што би направил тој во слична ситуација. Ваквиот одговор треба да се избегнува по секоја цена, а да се остави време за созревање на сопствената одлука на оние коишто со таа одлука ќе живеат понатаму. Исто така, генетското советување треба да биде неутрално, што подразбира дека, советникот не треба да суди за одлуката на брачната двојка, иако нивната одлука не се совпаѓа со неговото мислење. Информацијата, која генетичарот ќе ја даде на семејството, мора да биде јасна, во соодветна форма, која покажува сочувство, да биде дадена на соодветно место и соодветни услови. Често, првата информација е примена лошо, со неверување и со потреба од време за да се размисли. Затоа, на семејството секогаш му се нуди понатамошен разговор, по потреба за доразјаснување на некои од прашањата. Поддршката е особено важна кога ќе дојде следната бременост на истата брачна двојка. Тогаш се потребни многу манипулации околу пренаталната дијагноза и околу одлуката кој избор да се направи за таа бременост. Потребно е да се стекне довербата на родителите, како и почитување на приватноста и автономијата на личноста. Одлуката на семејството во врска со судбината на неродениот плод е збир на тешки решенија (дали да се прифати ризикот, дали да се елеминира долгоочекуваната рожба, дали да се каже целата вистина на поширокото потомство во интерес на 65 роднините и нивното потомство). Одлуките не се тешки само за индивидуите коишто бараат совет, туку и за лекарот, истражувачот или опшеството. Исходот од генетското советување зависи од многу фактори: фамилијарни, економски, социјални, едукативни, религиозни и др., како и од типот на болеста, можностите за лекување, квалитетот на живот на засегнатото дете. Во голема мера изборот зависи и од желбата на родителите да имаат дете. Секако, но не најмногу важно, одлуката зависи и од етничката припадност на семејството. 66 Прашања: 1. Откриена е ретка комбинација на малформации кај едно новородено за која се знае дека е вродена, но генот причинител не е познат. Докторот е одушевен и решава случајот да го објави во медицинско списание и не барајќи дозвола од родителите, испраќа слики преку интернет до неколку врвни центри за генетика. Дали постапил правилно? 2. При ДНК анализа, докторот открил дека таткото не е биолошки татко на детето. Како треба да постапи, дали да ја соопшти информацијата на таткото? 3. Ако кај бремена жена се добие висока вредност на алфа фетопротеинот при изведување на тројниот тест, дали тоа значи дека бебето има spina bifida? 4. Ако Тројниот тест за Даун-ов синдром кај бремена жена е позитивен, додека кариотипот на амниоцентезата покажал нормални резултати, дали бременоста ќе се води како нормална? 5. Кои се чекорите кои треба да ги преземат партнерите при планирање на семејството доколку постои генетско фамилијарно оптоварување кај еден од нив? 67 Вежба бр.9 Електрофореза Електрофорезата претставува процес на движење на наелектизирани молекули под дејство на електрично поле при што не се менуваат нивните физичко-хемиски особини. Поради тоа што во електрично поле различните молекули се движат со различна брзина која зависи од нивната големина, облик и набој, електрофоретските методи можат да се користат за раздвојување на макромолекули од смеса. Брзината на движење на честичката во електричното поле зависи од: - количеството на полнежот што го носи таа, - коефициентот на триење (кој зависи од големината и обликот на молекулот), - јачината на електричното поле, - природата на носачот во кој се одвива електрофорезата и - разликата помеѓу изоелектричната точка на примерокот и рН на средината во која се изведува електрофорезата. Како матрикси за раздвојување најчесто се користат вкрстено-поврзани агарозни и полиакриламидни гелови, кои можат да бидат во облик на хоризонтална или вертикална плоча. Големината на порите на овие гелови е варијабилна во зависност од концентрацијата на употребените мономери, што овозможува приготвување на гелови со различна резолуциска моќ и раздвојување на макромолекули со различни молекулски маси. Од аспект на раздвојување на протеини, многу почесто се користат полиакриламидните гелови бидејќи тие имаат помали пори во однос на агарозните. Агарозните гелови почесто се користат за раздвојување на нуклеински киселини, многу големи протеини и протеински комплекси. Гел електрофореза Во овој тип на електрофореза се користи гел како носач, кој треба да има правилна и добро дефинирана големина на порите, да е хемиски инертен и да не покажува електро-осмоза. Гелот може да се постави вертикално во цилиндрични садови или на хоризонтални плочки. Молекулите се движат преку порозната тродимензионална мрежа од гел и притоа наидуваат на отпор кој зависи од нивната големина и форма. Поголемите молекули наидуваат на поголем отпор и поради тоа се движат побавно – ефект на молекулско сито. Значи, функцијата на гелот не е само да го спречи мешањето и разлевањето на раздвоените ленти, туку и да го подобри раздвојувањето на молекулите преку ефектот на молекулско сито. Гел електрофорезата користи различни гелови, и тоа: - Скробен гел, - Агарозен гел и - Полиакриламиден гел. Полиакриламид гел електрофореза (PAGE) Полиакриламидниот гел се подготвува со ко-полимеризација на акриламид и N,N'метилен бисакриламид како вкрстен-поврзувач во присуство на амониум персулфат, кој служи како иницијатор на полимеризацијата, и N,N,N’,N’- тетраметилетилендиамин, како катализатор. Полиакриламидниот гел може да се подготви така што ќе има константна концентрација на акриламид, а со тоа и хомогена дистрибуција на порите низ целиот гел. Освен тоа, се користат и гелови со градиент на концентрација на акриламидот. Во 68 овој случај гелот се подготвува со помош на „градиент мејкер“, а концентрацијата на акриламидот расте линеарно или експоненцијално од почетокот до крајот на гелот. На тој начин и големината на порите се намалува, така што протеинските молекули при движењето наидуваат на сè поголем отпор. Ова овозможува подобро раздвојување на протеините. Разделувањето на протеините врз основа на бројот на пуфери кои се употребуваат при една протеинска гел електрофореза, може да биде во континуиран или дисконтинуиран систем. Во континуираниот систем се користи само еден пуфер и за изработка на гелот и како медиум за течење на електрофорезата, додека во дисконтинуираниот систем се користат повеќе различни пуфери со различна pH. Иако првиот е многу полесен за изведба, дисконтинуираниот систем е многу подобар бидејќи на овој начин се избегнуваат многу проблеми поврзани со преципитација и агрегација на примероците и има многу поголема резолуциска моќ. Геловите кои се користат при дисконтинуирани системи се составени од два дела: - - сепарациски гел, кој има помали пори и во кој се врши разделувањето на протеините. pH средината во овој гел овозможува одржување на негативниот полнеж на протеините, а со тоа и нивна подвижност и апликациски гел, кој е нерестриктивен и се излева над сепарацискиот гел. pH средината во овој гел делумно го поништува негативниот полнеж и електрофоретската подвижност со што се овозможува концентрирање на протеините во облик на лента на допирната површина меѓу двата гела. Освен за протеини, овие гелови можат да се користат и за разделување на кратки фрагменти од нуклеински киселини (помали од 2 kb), а посебно се значајни за разделување на олигонуклеотидни фрагменти кои настануваат при секвенционирање и чија должина се разликува за еден нуклеотид. За визуелизација на протеините се применува обојување со соли на сребро. Полиакриламид гел електрофореза (PAGE) SDS-PAGE Многу почесто раздвојувањето на протеините се изведува во денатурирачки услови, при што доаѓа до губење на нивната секундарна и терциерна структура. Во овој случај обликот на молекулата повеќе не претставува фактор кој го ограничува движењето на протеините при елктрофореза. Денатурацијата на протеините најчесто се изведува со користење на анјонски детергенти како натриум додецил сулфатот (SDS - sodium dodecyl sulphat). Овој вид на електрофореза се нарекува SDS-PAGE. Натриум додецил сулфат ги денатурира протеините преку нарушување на хидрофобните интеракции, раскинување на водородните врски и формирање на стабилни комплекси со молекулите, на тој начин што ги обвиткува полипептидните вериги со својата хидрофобна опашка. Количината на SDS, која се комплексира со протеините, не зависи од нивниот полнеж и аминокиселинска секвенца, туку само од нивната големина. Високиот негативен полнеж на SDS од комплексот ги маскира разликите во pI (полнежот) помеѓу различните протеини кои влијаат на електрофоретската подвижност. Обработени на овој начин, сите протеини ќе имаат негативен полнеж и притоа големината на негативниот полнеж претставува функција од нивната големина. Како последица на ова, единствениот фактор од кој зависи електрофоретската подвижност на протеините при SDS-PAGE претставува молекулската маса. 69 Слика 45. Принцип на SDS-PAGE електрофореза.Сепарација на протеини од смеса врз основа на нивната молекулска маса Раздвојување на протеините врз основа на нивната изоелектрична точка Протеините претставуваат молекули изградени од 20 различни аминокиселини кои го прават јадрото на протеинот (најчесто хидрофобно) и странично организирани аминокиселини (коишто ја прават површината на протеинот-хидрофилна) и кои можат да бидат поларизирани (со негативен или позитивен набој). Набојот на протеините потекнува од pH-зависната јонизација на страничните карбоксилни и амино групи. Според тоа, вкупниот набој на еден протеин е одреден од бројот и видот на аминокиселините од кои е составен и pH средината на медиумот. За секој протеин постои единствена pH вредност на која тој не поседува електричен набој, која е наречена изоелекрична точка (pI). На оваа pH вредност не постои електрофоретска подвижност на протеините. Во медиум со pH поголема од неговата pI тој ќе има вкупен негативен полнеж и при електрофореза ќе се движи кон позитивната електрода (анода) и спротивно, во медиум со pH помала од неговата pI тој ќе има вкупен позитивен полнеж и ќе се движи кон негативната електрода (катода). Ова укажува на важноста од одржување на константна вредност на pH средината при електрофореза, особено кога протеините се сепарираат во нивната нативна состојба. Мешавината од протеини ја подложуваме на електрофореза во неденатурирачки услови во гел во кој е воспоставен стабилен pH градиент. Во зависност од полнежот и количината на наелектризираност на протеините тие ќе се движат кон соодветната електрода. Движејќи се низ гелот тие Слика 46. Електрофоретско раздвојување на протеини врз основа на електричниот полнеж минуваат низ средината со различни pH вредности и доаѓа до промена на 70 наелектризираните групи. Кога протеинот ќе се најде на местото во кое pH на гелот е еднакво на pl на протеинот тој застанува. На овој начин можат да се раздвојат протеини кои се разликуваат во pl и за 0,01. Дводимензионална гел електрофореза Се користи за раздвојување на смеса која содржи повеќе компоненти. Оваа постапка е комбинација на две еднодимензионални техники. Најчесто се комбинира раздвојување на компонентите од смесата врз основа на нивната изоелектрична точка и SDS-PAGE техника. (слика 47) Слика 47.Принцип на дводимензионална гел електрофореза.Раздвојување на компонентите од смесата врз основа на нивната изоелектрична точка и SDS-PAGE техника По раздвојување на компонентите од смесата врз основа на нивната изоелектрична точка, гелот со раздвоените протеини се пренесува на вертикално поставен SDS-полиакриламиден гел. Протеините се распоредени на врвот на полиакриламидниот гел врз основа на тоа до каде стигнале според нивната изоелектрична точка. Потоа се подложуваат на електрофореза во вертикална насока и како продукт се добива дводимензионален примерок. Во овој случај компонентите се раздвоени во хоризонтална насока на основа на нивната изоелектрична точка, а во вертикална насока според нивната маса. Гел електрофореза во пулсирачко поле – PFGE За раздвојување на ДНК молекули поголеми од 50 kb, а во пракса често и само над 20 kb, се користи модифицирана електрофореза на агарозен гел, наречена гел електрофореза во пулсирачко поле – PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis). (слика 48) Со помош на обичната електрофореза големите ДНК молекули не можат добро да се раздвојат и даваат широки дифузни зони. Кај PFGE молекулите што се анализираат мораат да ја променат својата конформација и ориентација при секоја промена на правецот на електричното поле. Постојат неколку модели за објаснување на раздвојувањето на големите ДНК молекули со PFGE, но точниот механизам не е познат. Резултатот од дејството на променливото електрично поле е дека поголемите молекули се движат побавно од малите молекули, а подвижноста зависи од времетраењето на импулсот и молекулската маса. Електричното поле се воспоставува помеѓу електродите кои се поставени околу гелот во правоаголна или шестоаголна 71 Слика 48.Принцип на електрофореза во пулсирачко електрично поле. Раздвојување на ДНК молекули поголеми од 50 kb конфигурација. Правецот на полето се менува периодично, со наизменично вклучување, односно исклучување на одреден пар електроди во одреден временски период (импулс). Времетраењето на импулсот варира во опсег од 1ѕ до 90s, во зависност на должината на молекулите кои се анализираат. Освен импулсот можат да се менуваат и други фактори и тоа: напонот, бројот на електроди, геометрискиот облик на гелот, температурата, концентрацијата на агароза во гелот, пуферот и времетраењето на електрофорезата. По завршената гел електрофореза, гелот се потопува во раствор на етидиум бромид, кој претставува флуоросцентна боја. Тој навлегува помеѓу ланците на ДНК молекулите и се поврзува со нив, па ако после тоа гелот се изложи на УВ зраци, поодделните зони на раздвоените молекули ќе флуоресцираат со портокалова светлина. Електрофореза на агарозен гел Агарозата е полисахарид, составен од D-галактоза и 3,6-анхидро-L- галактоза како градбени блокови, а како линеарен полимер може да се екстрахира од црвените алги. Големината на порите во агарозниот гел зависи од концентрацијата на агарозата во гелот. Подготовка на агароза носач: Се подготвува со растворање на агарозата (цврста бела прашкаста супстанца) во некој пуферски раствор (најчесто во три-ацетатен пуфер), со загревање. Таквиот топол раствор се излева во хоризонтални стаклени плочи-садови, со различни димензии, во Сликa 49.Принцип на подготовка на агарозен гел. Агарозата се раствора со триацетатен пуфер така што се загрева, растворот потоа се излева во стаклен сад во кој е поставен чешел и се остава да се излади и да поминево цврста состојба. Чешелот ќе формира бунарчиња во гелот во кои потоа се внесува примерокот за анализа 72 кои се поставуваат чешли со цел да се формираат мали бунарчиња, каде подоцна ќе се внесат примероците за анализа. Гелот се одликува со добра цврстина, како последица од воспоставувањето на водородни врски во текот на неговото формирање. После добивањето на таквиот гел, тој се пренесува во сад наменет за електрофореза. Во тој сад се става соодветен пуфер, зависно од природата на примерокот. Во примерокот се додава индикатор за полесно следење на електрофоретското движење на молекулите низ гелот. Како индикатор најчесто се користат бромфенол сино и ксиленцијанол (има помала подвижност од бромфенол сино). Анализата на електрофореграмите вклучува детекција и квантификација на сепарираните протеински фракции по нивна визуелизација со употреба на соодветни техники за обојување. Најчесто користени техники на обојување се Coomassie blue во раствор за фиксација и редукција на среброто од неговите соли по фиксација на електрофореграмите. Лимитот на детекција со Coomassie blue техниката е 100-300ng протеин/лента, додека техниката на обојување со сребро е околу 100 пати посензитивна, со лимит на детекција од 1ng протеин. Одредувањето на големината на лентите (Mr на протеинот) е овозможено преку споредување со стандарди со позната големина кои секогаш се аплицираат паралелно со испитуваните примероци. Наједноставен начин за квантификација на испитуваниот протеин претставува визуелно споредување на интензитетот на лентата со интензитетот на стандардите, течени на истиот гел, кои се со позната концентрација. Поточен метод на квантификација претставува дензитометриско скенирање на обоените гелови. 73 Прашања: 1. Наброј го потребниот материјал и опрема за електрофореза! 2. Од што зависи брзината на патување на молекулата во гелот во текот на електрофорезата? 3. Кој е првиот метод на сепарација кај дводимензионалната електрофореза? 4. Која е разликата меѓу Полиакриламид гел електрофореза (PAGE) електрофореза во пулсирачко поле (PFGE)? и 5. Објасни ја SDS-PAGE! 74 Вежба бр.10 Изолација на нуклеински киселини Нуклеинските киселени се полимерни органски соединенија изградени од нуклеотиди. ДНК е двојна спирална молекула со дијаметар од 2nm. Извиткувањата се на секои 3,4nm или на секои 10 базни пара. При спирализирањето на хеликсот се формираат два вида на асиметрични жлебови: мал и голем. Големиот е кога веригите се најодалечени една од друга, а малиот е кога се најблиску. Завиеноста на ДНК е во правец од десно кон лево е конформација на ДНК која е најчеста и се вика В – ДНК. Покрај во оваа ДНК може да се сретне и во покомпактна форма или А – ДНК или доколку завиеноста е од лево кон десно обратно од В - формата се нарекува Z – форма. Хеликсот е составен од две комплементарни вериги изградени од Слика 50.Структура на ДНК дезоксирибоза и фосфорна група поврзани со фосфодиестерски врски. Веригите се антипаралелни, односно едната верига се простира во правец од 5` кон 3`, а другата од 3` кон 5`. Фосфатните групи ѝ даваат на молекулата голем негативен полнеж, што ја прави молекулата на ДНК поларна. Секој нуклеотид е изграден од пентозен шеќер - дезоксирибоза, кој со својот јаглероден атом на позиција 5` е поврзан со фосфорната група, а со јаглеродниот атом на позиција 1` е поврзан со азотна база. Четири азотни бази учествуваат во градбата на ДНК - аденин (А) и гуанин (G)- пурински бази, цитозин (C) и тиминот (Т)пиримидински бази. Два нуклеотида се поврзуваат на тој начин што фосфорната група од едниот нуклеотид се поврзува со хидроксилната група која се наоѓа на позиција 3` на пентозниот шеќер од другиот нуклеотид при што се формира динуклеотид и се ослободува вода. Врската помеѓу двата нуклеотида е од ковалентен карактер и, 75 бидејќи во неа учествуваат алкохолна група од 5` на шеќерот и фосфорната киселина, се нарекува фосфодиестерска врска. Количеството на пуринските и пиримидинските бази во молекулата на ДНК е идентично. Количеството на aденин е идентично со количеството на тимин, а количеството на цитозин со гуанин. ДНК е молекула, која во себе ги содржи сите информации за градбата и функцијата на секоја клетка. Со нејзината репликација се овозможува континуирано пренесување на информациите од една генерација на друга. Информациите за синтеза на протеини се кодирани во точно определени сегменти и се нарекуваат гени. За да стане информацијата функционална, односно да се синтетизира протеин, посредуваат рибонуклеинските киселини. Притоа, при процесот на транскрипција, информационата рибоуклеинска киселина (иРНК) се синтетизира на база на кодирачката секвенца од ДНК. Таа ја носи информацијата за точниот аминокиселински редослед на протеините. На база на иРНК, со посредство на транспортната РНК (тРНК) и рибозомалната РНК (рРНК), се синтетизираат протеините во рибозомите. Овој процес се нарекува транслација. Нуклеотидите на РНК се изградени од пентозен шеќер рибоза поврзан со фосфорна група и азотна база. Во градбата на РНК учествуваат четири азотни бази пурински аденин (А) и гуанин (Г) и пиримидински цитозин (Ц) и урацил (У). Покрај замената на дезоксирибозата со рибоза и присуството на урацил, наместо тимин, примарната структура на РНК е идентична со онаа на ДНК. Разликата во пентозниот шеќер, кој учествува во градбата на нуклеинските киселини, е само во позицијата 2` каде во дезоксирибозата C атом е поврзан со H, а во рибозата со OH група. ОH групата во молекулата на РНК ја прави истата хемиски понестабилна и овозможува поголема реактивност во ензимски посредуваните реакции. РНК, исто така, се сретнува во различни структурни конформации, па така може да биде едноверижна и двоверижна, линеарна Слика 51.Структура на РНК или циркуларна. Во споредба со ДНК, промените на просторните конформации кај РНК се многу почести и од нив најчесто зависи функцијата на самата молекула. Комплементарните места на едноверижната молекула можат по принципот на комплементарно базно поврзување (A со U, и C со G) да се врзат и притоа да формираат тридимензионална структура. 76 Изолација на ДНК од различни биолошки материјали Постојат повеќе методи за изолација на нуклеински киселини. Изборот на методот зависи од типот, изворот, големината и количината на нуклеинската киселина, како и квалитетот кој што е потребен за понатамошна употреба. ДНК може да се изолира од полна крв, од различни видови на ткива, плунка, урина и др. Стандардна постапка за изолација на ДНК е фенол-хлороформ екстракција Основните чекори при изолирање на нуклеинските киселини се следниве: Слика 52. Постапка за изолација на ДНК со фенол-хлороформ екстракција Ослободување на ДНК од клетките односно од јадрената мембрана и мембраните на органелите кои содржат сопствена ДНК - - се подготвува суспензија од ткивото од кое сакаме да ја изолираме ДНК, се додава детергент најчесто SDS (sodium dodecyl sulfate) кој доведува до дезинтеграција на клетката со што се овозможува разградување на мембраните на клетката, се додаваат инхибитори на дезоксирибонуклеазите како што се висока температура или EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid), отстранувањето на протеините се врши со дигестија со протеиназа К која се врши на висока температура од околу 56 – 60 °С и се додаваат рибонуклеази со цел да се елиминираат РНК молекулите. 77 Екстракција на ДНК од останати клеточни комоненти - - дезинтегрираните клетки, обично, се третираат со смеса од фенол, хлороформ и изоамил алкохол, фенолот ги денатурира протеините што резултира со нивно одвојување од нуклеинските киселини, со што протеините се таложат на дното, додека ДНК останува растворена во горната фаза (алтернативно на фенолот, може да се користат соли со висока концентрација) и хлороформот, исто така, ги денатурира протеините и придонесува за одвојување на органската и водената фаза. Преципитација на ДНК во етанол или изопропанол - - Со додавање на етанол или изопропанол на температура од -20 °С доаѓа до денатурирање на протеините и се предизвикува таложење на нуклеинските киселини, При преципитацијата ДНК станува видлива како белузникава кончеста маса која може да се насобере со помош на пластично стапче или со центрифугирање. Најголем проблем при изолацијата на ДНК претставува неутрализацијата на ендогените ДН-ази кои се ослободуваат при разрушувањето на клеточните мембрани и предизвикуваат разложување на ДНК молекулите. Затоа секогаш е неопходно користење на соодветни инхибитори на овие ензими, висока температура или употреба на EDTA кој ги врзува двовалентните катјони неопходни за ензимската активност на ДН-азите. Новите техники на изолација на ДНК се базираат на цврсто-фазна екстракција (SPE -solid phase extraction). Методот се заснова на употреба на колони исполнети со силика (или некоја друга цврста фаза) која селективно ги врзува нуклеинските киселини (ДНК или РНК) во зависност од pH средината и концентрацијата на соли во пуферот. Овие колони, како и сите пуфери кои се потребни за изведување на постапката, доаѓаат во облик на комерцијални китови, а изолацијата на ДНК се изведува според инструкциите на производителот. Предноста на овие китови се состои од тоа што, за разлика од стандардната постапка, целиот процес на ДНК изолација се одвива многу полесно и побрзо. Мерење на концентрацијата и чистотата на нуклеинските киселини По екстракцијата на нуклеинските киселини вообичаено е да се провери нивната концентрација, чистота и интактност бидејќи е можно во изолатот да бидат присутни и други примеси (најчесто протеини) или да дојде до нивна деградација што директно влијае врз резултатите од последователните анализи. За оваа цел, најчесто се употребува комбинација од две методи: спектрофотометриско мерење и електрофореза на агарозен гел. Нуклеинските киселини и повеќето од најчестите контаминенти на готовите изолати апсорбираат во регионот од 230nm до 320nm. Ова овозможува со мерење на апсорбанцата во овој регион да се одреди концентрацијата на нуклеинските киселини и да се даде увид во нивото на контаминација на изолатот. Мерењето може да се изведе на конвенционален спектрофотометар или на посебни апарати кои се дизајнирани специјално за анализа на биомолекули како што се: BioPhotometer (Eppendorf) или NanoDrop (Thermo Scientific). Без разлика кој апарат ќе се користи, најзначајните бранови должини на кои треба да се обрне внимание се: 230nm: каде се наоѓаат максимумите на апсорпција на гванидин тиоцијанат (и други соли на гванидин) и фенол. Високи вредности на апсорпција на оваа бранова должина се индикативни за присуство на овие соединенија во примерокот. 78 260nm: прстените на пурините и пиримидините во нуклеиските киселини апсорбираат на 260nm и оваа вредност може да се искористи за пресметување на нивната концентрација. 280nm: благодарејќи на силната апсорпција на тирозинските и триптофанските резидуи на оваа бранова должина, апсорбанцата на 280nm се користи како индикатор за контаминација со протеини. 320nm: вредноста на апсорбанцата на оваа бранова должина претставува општа мерка за турбидитетот (опалесценцијата) на примерокот. Спектрофотометриски метод - Постои линеарна зависност помеѓу концентрацијата на ДНК и апсорбанцата на УВ, Пиримидинските и пуринските бази имаат абсорпционен максимум на 260nm бранова должина, Протеините имаат абсорпционен максимум на 280nm, Соодносот од абсорпцијата на 260nm и 280nm е индикатор за чистота на ДНК (доколку односот 260nm/280nm е поголем од 1,8 за ДНК односно од 2 за РНК се работи за релативно чист примерок). Колку е тој однос помал толку примесот на протеини е поголем во примерокот. Главен проблем со спектрофотометриското одредување на концентрацијата на нуклеинските киселини е тоа што одредени контаминенти, исто така, можат да апсорбираат на 260nm, што би довело до добивање на резултати кои се поголеми од вистинските. Исто така, овој метод не може да направи разлика помеѓу ДНК и РНК, односно не може да открие контаминираност на ДНК со РНК и обратно. Поради тоа паралелно со спектрофотометриското одредување се изведува и електрофореза на агарозен гел. Покрај тоа, на гелот може да се воочи и степенот на деградација на нуклеинските киселини. Електрофореза на агарозен гел Електрофореза на агарозен гел е корисна, едноставна и доста брза метода, која не бара скапи хемикалии. Со неа можат да се раздвојат многу јасни фрагменти кои се поголеми и од 100bp. Електрофорезата на нуклеински киселини е метод за одредување на квалитетот на екстрахираната нуклеинска киселина или начин да се одреди големината на фрагментот од нуклеинската киселина после полимераза верижна реакција. Покрај тоа што овој е аналитички метод, електрофорезата може да биде и препаративен метод. Со овој метод може да се издвои одреден фрагмент од нуклеинската киселина така што ќе се исече делот од гелот каде се наоѓа фрагментот од интерес, а потоа со понатамошна пурификација може да се добие чист фрагмент од нуклеинската киселина кој понатаму може соодветно да се анализира, односно секвенционира. Раздвојување на фрагментите од ДНК молекулата со електрофореза е под дејство на електрично поле низ кое фрагментите од ДНК молекулата се движат кон позитивната електрода – анода. Агарозниот гел се подготвува на стандардниот начин на изработка на електрофоретски гел. Агарозата се раствора со три-ацетатен пуфер. Во овој раствор се додава етидиум бромид (кој служи како индикатор при детекцијата на фрагментите). Растворот се загрева и се излева во стаклен сад во кој е поставен чешел и се остава да желатинизира. Вака подготвениот гел потоа се пренесува во сад за електрофореза. 79 Слика 53. Електрофореза на агарозен гел. Метод за одредување на квалитетот на екстрахираната нуклеинска киселина или одредување на големината на фрагментот од нуклеинската киселина За време на електрофорезата доаѓа до движење на ДНК молекулата кон анодата, а етидиум бромидот се движи кон катодата со што се овозможува вметнување на етидиум бромидот помеѓу базите во ДНК молекулата. Визуелизацијата на фрагментите од ДНК на агарозниот гел се прави со помош УВ светлина. Под УВ светлина ДНК фрагментите со вметнатиот етидиум бромид помеѓу базите се осветлува и може лесно да се детектираат нивните позиции. Изолација на РНК За разлика од изолацијата на ДНК молекулата при изолација на РНК молекулата можат да настанат одредени потешкотии кои произлегуваат од следниве карактеристики: - РНК е нестабилна молекула и лесно подложна на деградација поради присуството на хидроксилна група на 2’ позиција во рибозата; Ендогените рибонуклеази се термостабилни ензими со што се отежнува нивната инактивација; Контаминираност на примерокот со егзогени рибонуклеази кои можат да потекнуваат од кожата или косата на експериментаторот, од нечисти лабораториски садови или поради бактериска контаминација од воздухот. Постапката на изолација на РНК - Ослободување на РНК од клетките преку разорување на клетките и ткивата во присуство на детергенти при што се врши и ефективна депротеинизација; Со додавање на монофазен раствор на ISOGEN (хомогена смеса од фенол и гванидин тиоцијанат) се овозможува дестабилизирање на водородните врски и хидрофобните интеракции како и инактивација на рибонуклеазите; 80 - - Раздвојување на растворената РНК од ДНК и протеините со фенол-хлороформ екстракција при што се раздвојуваат три слоја во органската фаза, најдолу паѓаат протеините и липидите, над неа е слој - интерфаза во кој се наоѓа ДНК и во најгорниот слој водената фаза во која се наоѓа РНК; Преципитација на РНК се овозможува со додавање на изопропанол; Издвоената РНК се раствора во вода или во соодветн пуфер ТЕ и се чува на 70 степени до понатамошна употреба; Бидејќи лесно може да се контаминира, за време на изолацијата на РНК треба да се користат ракавици, површината за работа да е чиста, стерилен прибор, водата која се користи претходно треба да е третирана со диетилпирокарбонат кој е силен инактиватор на рибонуклеази. Слика 54.Постапка за истовремена изолација на РНК, ДНК и протеини од еден примерок 81 Прашања: 1. Ако содржината на G-C парот во специфична ДНК молекула е 56%, во колкав процент се застапени секоја од базите (А,Т,G,C) во оваа молекула? 2. Ако на тимин отпаѓа 15% од вкупниот број на бази во една ДНК молекула колкав е процентот на цитозин во истата молекула? 3. Ако еден ланец на специфична ДНК молекула содржи 20% аденин, а неговиот комплементарен ланец содржи 10% цитозин и 5% гванин, пресметај ја застапеноста на секоја од базите во таа молекула! 4. Кои се основните чекори кај фенол-хлороформ екстракцијата на ДНК? 5. Објасни ја постапката за изолација на РНК! 82 Вежба бр.11 Екстракција на протеини Повеќето клетки содржат илјадници различни протеини. Прочистувањето на еден вид може да претставува предизик, особено ако тој протеин е присутен во клетката во мали концентрации. Еден протеин може да се прочисти од мешавина на протеини бидејќи протеините се разликуваат значително во голем број на физички и хемиски својства. Овие својства се резултат на нивната аминокиселинска секвенца. Аминокиселински резидуи можат да бидат позитивно или негативно наелектризирани, неутрални и поларни или неутрални и хидрофобни. Покрај тоа, полипептидот може да биде свиткан во дефинирана секундарна структура (α-хеликси, β-плочи) и терциерна структура со уникатна големината, облик и дистрибуција на резидуите на неговата површина. Два протеина можат да бидат мошне слични во една особина, како што е вкупниот елекричен полнеж, а многу различни во друга особина, како молекуларна големина или облик. Преку искористување на разликите во својства помеѓу протеинот од интерес и другите протеини во смесата може да биде дизајнирана рационална серија на чекори на фракционирање кои, кога би се употребувале последователно, би довеле до целосно прочистување на тој протеин. Овие својства опфаќаат: - димензии, густина, растворливост, изоелектрична точка, дистрибуција на полнеж, хидрофобност афинитет кон антитело и сл. За таа цел се користат т.н. хроматографски техники (одделување на компоненти од различни смеси). Хроматографијата претставува техника за раздвојување на компоненти од смеса со помош на две фази од кои едната е мобилна, а другата е стационарна фаза. Јоноизменувачка хроматографија Критериум за раздвојување на молекули од смеса кај јоноизменувачката хроматографија е разликата во наелектризираноста на молекулите (слика 55). Овој вид хроматографија најчесто се изведува во колона, по приготвувањето на смесата од носач која ја претставува стационарната фаза (најчесто од целулоза, декстран или агароза) таа се додава во колоната. Најзначајната компонента за изведување на јоноизменувачката хроматографија е јоноизменувачката функционална група која е ковалентно врзана за носачот на стационарната фаза и која носи електричен полнеж. Понатаму, оваа јоноизменувачка функционална група електростатски и реверзибилно е поврзана со мали, спротивно наелектризирани јони (на пример: Na+ , Cl- и сл.). Потоа се додава примерокот кој може да претставува груб клеточен екстракт кој содржи голем број на различни протеини со различен електричен полнеж. Молекулите, кои не се наелектризирани или оние кои носат ист полнеж како јоноизменувачката функционална група нема да се врзат во колоната, туку ќе излезат од неа. Наспроти тоа, молекулите кои носат полнеж, кој е спротивен со полнежот на јоноизменувачката функционална група, ќе ги истиснат електростатски поврзаните мали јони (без оглед на нивната големина) и ќе се задржат на колоната. На крај се измиваат, односно отстрануваат супстанциите кои се врзале за носачот во колоната преку додавање на раствор во кој константно се зголемува јонската концентрација. Целта на оваа јонска 83 концентрација е да се искористат негативните јони во растворот да ги заменат протеините од јонските врзувачки места на носачот, при што протеините ќе се одделуваат еден по еден во зависност од нивниот полнеж. При зголемувањето на јонската концентрација на пуферот за измивање примероците на раствор кои минуваат низ колоните се собираат со помош на фракционен собирач. Во оваа техника, исто така, може да се користи и негативно наелектризиран носач при што би се сепарирале позитивно наелектризирани групи на протеини. Слика 55. Јонизменувачка компоненти од смеса врз наелектризираност хроматографија. Раздвојување на основа на разликите на нивната Гел филтрациска хроматографија Гел хроматографијата уште се нарекува и молекулско прочистување, ексклузиона хроматографија или гел филтрација. Со примената на оваа хроматографска техника молекулите можат да се раздвојуваат врз основа на нивната големина и нивниот облик. Матриксот, односно стационарната фаза која ја исполнува колоната, е хидрофилен и формира порозни сфери при бубрење. Како матрикс најчесто се користат: декстран, агароза и полиакриламид. На врвот на колоната се нанесува примерокот. Мобилната фаза тече континуирано низ колоната и со себе ги носи молекулите од примерокот. Мобилната фаза го зазема просторот и внатре во порозните сфери и надвор од нив. Оние молекули, чиј дијаметар е поголем од дијаметарот на сферите, се движат исклучиво низ интерстициелниот простор, минуваат пократок пат и први ќе се елуираат. Молекулите, пак, со дијаметар помал од пречникот на сферите влегуваат во внатрешноста на матриксот, минуваат значително подолг пат и побавно се елуираат (слика 56). 84 Слика 56.Принцип на гел филтрација. Раздвојување на молекулите од смеса врз основа на нивната големина и облик Афинитетна хроматографија Афинитетната хроматографија се базира на високоспецифични интеракции помеѓу комплементарни молекули (имобилизиран лиганд и протеинот од интерес). Со оваа техника, всушност, раздвојувањето и пречистувањето на молекулите се врши врз основа на нивниот специфичен афинитет, а не врз основа на разликата во нивните физичко - хемиски особини. Слика 57. Принцип на афинитетна хроматографија. Хроматографија која се базира на високоспецифични интеракции помеѓу комплементарни молекули (имобилизиран лиганд и протеин од интерес) 85 Специфичниот афинитет подразбира високо специфична биолошка интеракција, на пример: - интеракција помеѓу ензим и супстрат или аналог на супстратот, - ензим и инхибитор, - ензим и кофактор, - хормон и рецептор и - антиген и антитело. Афинитетната хроматографија најчесто користи колони коишто се исполнети со инертен матрикс (полиакриламид, агароза, целулоза, декстран или посебни комбинации на овие супстанции), за кој ковалентно е врзан селективен лиганд. За матриксот ќе се врзат само оние молекули од примерокот кои имаат специфичен афинитет за лигандот. Врските кои се воспоставуваат помеѓу лигандот и препозната молекула се слаби реверзибилни интеракции. После ова следува фазата на елуирање на молекулите од интерес. 86 Прашања: 1. Каков метод е хроматогрфијата, кои се двете основни фази кај овој метод? 2. Врз основа на кои особини можат да се раздвојат компонентите од смесата? 3. Врз основа на што се раздвојуваат молекулите кај јоноизменувачката хроматографија? Објасни го начинот на раздвојување! 4. На кој начин молекулите можат да се раздвојат врз основа на нивната големина и нивниот облик? Објасни! 5. Објасни ја афинитетната хроматографија кај раздвојувањето компоненти од смеса! 87 Вежба бр.12 Блотирачки (blotting) техники Блотирачките техниките претставуваат пренос на ДНК или РНК фрагменти или протеини од гел, после извршена електрофореза, на нитроцелулозна хартија или најлонска мембрана по пат на впивање. По завршената електрофореза, гелот се пренесува на соодветна мембрана за која се поврзува, така што макромолекулите од гелот се пренесуваат на мембраната, па така врзани за мембраната можат специфично да се детектираат со помош на други обележани молекули. За обележување се користат радиоактивни изотопи, флуоросцентни молекули или ензимски компоненти. Техника Southern blot Northern blot Western blot Анализирана макромолекула ДНК РНК Протеини Гел Проба агароза/акриламид Агароза полиакриламид обележана ДНК обележана ДНК Антитело Southern blot техниката e eден од најупотребуваните методи за детекција на фрагменти на ДНК. Оваа техника служи за анализа на гени, идентификација на специфични секвенци, анализа на мутации, карактеризација на генотипови. Со оваа техника може да се детектираат разни генетски или хромозомски мутации, вклучувајќи делеции, инверзии или транслокации. Southern blot техниката се одвива во следниве фази: - Сепарирање на ДНК фрагментите, Хибридизација на сепарираните протеини со специфична проба Постапката започнува со дигестија на ДНК со рестрикциони ензими. Во зависност од тоа кој фрагмент од ДНК сакаме да го добиеме ќе се употреби соодветниот ензим, или комбинација од рестрикциони ензими. Фрагментираната ДНК се сепарира со електрофореза и се денатурира за да се добијат едноверижни молекули. Следната етапа е трансфер на сепарираните ДНК фрагменти на мембрана која може да биде од нитроцелулозна или најлонска природа. За да се изведе трансферот од гелот на мембраната, гелот со сепарираните фрагменти се поставува на потопен сунѓер или, пак, хартија во пуфер, над гелот се поставува мембраната, а над мембраната сува хартија. Со ова се формираат услови за капиларно движење на пуферот во правец од гелот кон мембраната, а со тоа се овозможува трансфер на ДНК фрагментите на мембраната. Откога ќе заврши трансферот, на мембраната се нанесува претходно обележана проба која може да биде обележана со радиоактивен изотоп (најчесто 32P) или, пак, со нерадиоактивен обележувач (биотин, дигоксигенин), при што се создаваат услови за хибридизација. При ова, пробата специфично ќе се поврзе за комплементарните ДНК фрагменти, а остатокот ќе се измие од мембраната. Хибридизацискиот комплекс се визуализира со поставување на мембраната на радиографски филм. Анализата се базира на присуството на хибридизацискиот комплекс и големината на детектираниот бенд. 88 Слика 58.Принцип на Southern blot. Метод за детекција на ДНК фрагменти кој се заснова на сепарирање на ДНК фрагментите и нивна хибридизација со обележана проба Northern blot техниката служи за детекција на РНК молекули во испитуваниот примерок. Оваа техника функционира на сличен начин како и Southern blot-от. Изолираната РНК со помош на гел електрофореза се сепарира. Молекулите се движат низ гелот во зависност од нивната големина. Сепарираните РНК молекули потоа се тансферираат на мембрана на истиот принцип како и кај Southern blot-от. Мебраната се хибридизира со специфична проба која комплементарно се поврзува за РНК. Визуелизацијата се спроведува со авторадиографски филм или со рекција на хемилуминисценција (доколку се користи хемиски обележана проба). Во двата случаја се формира темна лента на рендгентскиот филм. Со анализа на сигналот може квантитативно да се определи кој ген колку е експресиран во даден примерок. Големината на бендот на радиографскиот филм зависи од хибридизацискиот сигнал, кој, пак, зависи од бројот на молекули кои се хибридизирале. Оваа техника може да се користи за проучување на генската експресија на ниво на информациона РНК, за детекција на големината на транскриптот од информационата РНК, проучување на деградацијата на РНК, проучување на различни сплајсинг варијанти на РНК и др. Недостаток кај оваа техника во однос на Southern blot, е тоа што РНК молекулата е понестабилна поради присуството на рибонуклеазите, кои можат да го деградираат примерокот. Тоа негативно може да влијае на квалитетот на податоците. 89 Western blot е техника со која молекулите на протеините специфично се детектираат со помош на специфични антитела. Оваа техника ги опфаќа следните фази: - пренос на протеините на мембрана; - блокирање на слободните врзувачки места на мембраните; - инкубација со примарно антитело кое е специфично за целниот протеин; - инкубација со секундарно антитело обележано со ензим и - детекција. Слика 59.Принцип на Western blot техниката. Техника за детекција на молекулите на протеините со помош на специфични антитела Сепарираните протеински фракции од гелот се пренесуваат на постабилен медиум (мембрана) за имобилизација, при што се добива идентична слика на раздвоените молекули, каква што е на гелот. Протеинскиот блотинг може да се изведе како капиларен или електрофоретски блотинг. Капиларниот блотинг се врши на следниот начин: Неколку листови филтерна хартија се натопуваат со трансфер пуфер и се поврзуваат со резервоарите со пуфер. На филтерната хартија се става исечок од полиакриламидниот гел, а над него нитроцелулозна мембрана. Над мембраната повторно се ставаат неколку листови филтерна хартија и сунѓер. Капиларниот блотинг се одвива 24-28 часа. При електорфоретскиот блотинг протеините се пренесуваат од гелот на мембраната по пат на електрофореза во рок од 30 минути до неколку часа. Гелот и мембраната се поставуваат во вертикален систем потопен во трансферен пуфер. Под дејство на електрично поле сепарираните протеини излегуваат од гелот и навлегуваат во мембраната. Ефикасноста на пренесување на протеините на мембраната се проверува со обојување на мембраната со боја Ponceau S, која не влијае на подоцнежниот процес на имунодетекција. Блокирање на слободните врзувачки места на мембраните се врши со цел да се спречат неспецифичните интеракции со антителата. За блокирање, обично, се користи BSA (bovine serum albumin - албумин од говедски серум) или немасно млеко во прав, со додаток на многу мали количини нејонски детергент, како што е Tween 20. 90 Детекцијата претставува постапка на изложување на мембраните на антитела кои специфично ги препознаваат протеините и откривање на врзаните антитела со помош на детекторски систем. Детекцијата најчесто е процес во два степена, иако денес постојат и едностепени детекциони методи. Во двостепената детекција се користат две различни антитела: примано и секундарно. Примарните антитела ги препознаваат молекулите на протеинот од интерес и се врзуваат директно за нив. После врзувањето на примарните антитела мембраната се плакне со пуфер за да се отстранат неврзаните антитела, а потоа мембраната се изложува на секундарните антитела, кои ги препознаваат специфичните делови од примарните антитела. За едностепена детекција се користи антитело кое го препознава протеинот и истовремено е ,,обележано’’ и врз основа на тоа се детектира протеинот од интерес. 91 Прашања: 1. Како се нарекува трансферот на протеини на мембрани како што се нитроцелулоза или PDVF? 2. Што анализираме со Southern blot техниката? 3. Што користиме за детекција на фрагментите од ДНК кај Southern blot техниката? 4. Кои се основните фази на Western blot техниката? 5. На кој начин се детектираат протеините сепарирани со Western blot техниката? 92 Вежба бр.13 Полимераза верижна реакција (Polymerase chain reaction (PCR)) Полимераза верижна реакција е една од најзначајните и најчесто употребуваните техники во молекуларната биологија бидејќи овозможува брза и едноставна in vitro амплификација (умножување) на ДНК секвенци (фрагменти) од интерес. Bо рок од само неколку часа, од само еден ДНК молекул можат да се добијат милијарда идентични копии на фрагментот од интерес означени како ампликони. Добиените ампликони понатаму можат да се визуелизираат со стандардни електрофоретски техники (агарозна или полиакриламидна електрофореза) или, пак, да бидат вклучени во понатамошни анализи, како што се рестрикција со ендонуклеази, секвенционирање итн. За изведба на PCR потребно е: - - - Матрична ДНК – двоверижна ДНК молекула што го содржи сегментот кој треба да се амплифицира; 2 почетни примерока (прајмери) – две кратки олигонуклеотидни секвенци (15-30 нуклеотиди) комплеметарни со по еден ланец на ДНК, поточно со краевите од сегменетот од интерес; Taq полимераза – термостабилна ДНК полимераза (оригинално изолирана од Thermus aquaticus) која што го катализира создавањето на фосфодиестерските врски; Смеса од сите 4 деоксирибонуклеозидни трифосфати “dNTP” (dATP, dGTP, dCTP, dTTP); Пуфер за реакција: Tris, KCL, Mg2+ јони, желатин. Присуството на Mg2+ јони е неопходно за активноста на Taq полимеразата, Tris – базниот пуфер ја регулира pH во релативно широк спектар на температурни промени. KCL ја зголемува активноста на ДНК – полимеразите со што се зголемува приносот. Полимераза верижната реакција претставува in vitro ензимска реакција која се одвива во серија на инкубациски чекори на различни температури во точно определени временски интервали. Еден PCR циклус се состои од три инкубациски чекори: Денатурација на двоверижните ДНК молекули на температура од 95°С. На оваа температура доаѓа до раскинување на водородните врски помеѓу комплементарните бази во двојниот хеликс при што се добиваат едноверижни нишки. Овој чекор се одвива за време од 30-60 секунди. Анилирање на прајмерите на температура од 50 до 65°С за време од 30 секунди. Прајмерите претставуваат едноверижни олигонуклеотиди (составени од околу 20 нуклеотиди) кои комплементарно се врзуваат (хибридизираат) на двата краја на фрагментот од интерес. Едниот, таканаречен преден прајмер е комплементарен со 5’ крајот на едната ДНК верига, додека другиот, реверзен прајмер, е комплементарен со 3’ крајот на другата верига од регионот кој треба да се амплифицира. Од местото каде ќе се анилираат прајмерите, ќе започне синтезата на комплементарната верига. Екстензија на прајмерите на температура од 72°С. Екстензијата на прајмерите ја врши термостабилната Taq полимераза (оригинално изолирана од термофилната бактерија Thermus aquaticus) со додавање на слободни деоксирибонуклеоидни трифосфати (dATP, dGTP, dCTP иdTTP) во продолжение на прајмерите во насока од 93 5’→3'. На тој начин доѓа до синтеза на нова верига комплементарна на веригата за која се врзани прајмерите. Слика 60. Принцип на полимераза верижна реакција.Техника за амплификација (умножување) на ДНК секвенци (фрагменти) од интерес Со комплетирање на трите етапи, завршува еден циклус при што се удвојува количество на саканиот ДНК сегмент. Продуктите од PCR амплификацијата се акумулираат експоненцијално во тек на 25-30 циклуси, така што ДНК која се синтетизира во еден циклус самата претставува матрица за синтеза на нова ДНК во наредниот циклус. Така, со само 30 повторувања на реакцијата на количеството на ДНК се зголемува над милион пати. На крајот од реакцијата, теоретскиот принос изнесува 230, што претставува 109 идентични копии на фрагментот од интерес. По триесетиот циклус амплификацијата навлегува во неекспоненцијална (плато) фаза, што се должи на намалената количина на слободни деоксирибонуклеоидни трифосфати, прајмерите и редуцираната активност на ензимот. 94 Самата PCR реакција се изведува во специјални апарати означени како PCR-машини „thermocycler” (термосајклери). Слика 61. Експоненцијална и плато фаза при изведување на полимераза верижната реакција Во основа тие претставуваат прецизни суви инкубатори со можност за програмирана промена на инкубациската температура во текот на релативно краток временски период. PCR- машините се програмираат со соодветен профил на динамика и температурни вредности на загревање и ладење на термалниот блок. Двоверижните амплификциски продукти – ампликони со еднаква должина на двете комплементарни вериги, дефинирани со парот прајмери, се појавуваат во текот на третиот циклус и се акумулираат експоненцијално во текот на амплификацијата. Бројот на првично синтетизираните продукти, кои имаат недефинирани краеви и кои се непосакуван нуспродукт, се надминува со ДНК копиите кои имаат дефинирани краеви. Слика 62.Thermocycler – PCR машина. 95 Видови на полимераза верижна реакција Квантитативна PCR (qPCR) позната е и како Real time PCR - Метод кој овозможува истовремена амплификација и квантификација на целните фрагменти. Кај оваа техника акумулирањето на PCR продуктите, а со тоа и текот на амплификацијата на матичната ДНК се следи во реално време. Слика 63.Квантитативна PCR (qPCR). а) анализа со SYBR-зелена флуорессцентна боја; б) Анализа со TagMan нуклеаза Еден од начините за квантификација е во реакциската смеса да се додаде флуоресцентна боја SYBR Green, која флуоресцира кога е вметната во двоверижната ДНК молекула. Притоа, флуоресценцијата е правопропорционална со бројот на PCRпродуктите кои се создаваат во текот на амплификацијата. Многу поспецифичен, но и поскап начин на квантифицирање е со употреба на двојно обележан, краток олигонуклеотид кој е комплементарен со дел од амплимерот, означен како TaqMan проба. На 5’ крајот од оваа проба е врзан флуоресцентен молекул флуорофор (Fluorophore), додека на спротивниот 3' крај е врзан молекул таканаречен избледувач (Quencher) кој има способност да ја потиснува флуоресценцијата кога е во непосредна близина на флуорохромот. Од тие причини самата проба не флуоресцира, било да е слободна во растворот или анилирана со комплементарниот ДНК регион. Амплификацијата се врши со специфична Taq полимераза која поседува 5’→3' егзонуклеазна активност. При ензимската екстензија на прајмерот во текот на амплификацијата, оваа полимераза ја одвојува и деградира TaqMan сондата со што флуорохромот се раздвојува од молекулата избледувач со што флуоресценцијата се зголемува пропорционално со акумулираните специфични PCR продукти. Поради брзината и прецизноста, оваа техника е извонредно корисна во молекуларната дијагностика, каде што се потребни брзи резултати. 96 RT-PCR (Reverse Transcription PCR, Реверзибилна транскриптаза полимераза верижна реакција) - претставува PCR која како почетен материјал користи РНК и се употребува при анализирање на експресијата на гените. Притоа, реакцијата се одвива во две фази. Во првата фаза се врши реверзибилна транскрипција на инфомационата РНК во комлементарна ДНК со ензимот реверзна транскриптаза. Комплементарната ДНК (cDNA) се разликува од геномската по тоа што ги содржи само протеинкодирачките секвенци (нема интрони). Втората фаза претставува амплификација на комплементарната ДНК и може да се одвива со класична PCR или qPCR. Слика 64. RT-PCR Техника во која како почетен материјал се користи РНК, со која се овозможува анализа на експресијата на гените Предности на PCR - - - PCR методот е едноставен и специфичен метод, со кој може од целиот геном да се амплифицира само мал сегмент; За целата постапка е доволно да се има единечна молекула на ДНК која може да се најде во секоја интактна клетка. Поради ова, се употребува во генетски, форензички или палеонтолошки истражувања; Станува збор за брз метод со кој за само неколку часа можат да се добијат милиони копии на некој ДНК сегмент; Со помош на генетски специфични прајмери рутински можат да се дијагностицираaт генетски мутации. Притоа, мутациите можат да бидат и само во еден базен пар; Анализите можат да се прават на многу мали ДНК примероци кои можат да се добиени и со ласерска биопсија на само единечна клетка. Недостатоци на PCR - Постои можност за добивање на погрешни резултати поради контаминација на почетниот примерок, Погрешни резултати можат да се добијат доколку дојде до мешање на ДНК примероци од два различна извора. Ова се должи на големата сензитивност на реакцијата бидејќи и многу мали количини на туѓа ДНК може да интерферира во анализата. Затоа е неопходно секогаш при спроведување на методот да се користат позитивни и негативни методи 97 Прашања: 1. Кои се основните инкубациски чекори од кои се состои еден PCR циклус? Објасни ги! 2. Наброј го потребниот материјал и опрема за PCR! 3. Објасни ја квантитативната PCR! 4. Објасни ја RT-PCR. 5. Која е разликата меѓу квантитативна PCR и RT-PCR? 98 Користена литература: 1. Abadi, A., Alyass, A., Robiou du Pont, S., Bolker, B., Singh, P., Mohan, V., Diaz, R., Engert, JC., Yusuf, S., Gerstein, HC., Anand, SS., Meyre, D. (2017) Penetrance of Polygenic Obesity Susceptibility Loci across the Body Mass Index Distribution. Am J Hum Genet., 101(6), 925-938. 2. Baumgartner, A., Weier, JF., Weier H, UG. (2006) Chromosome-specific DNA repeat probes. J Histochem Cytochem., 54, 1363–1370. 3. Benn, P., Cuckle, H., Pergament, E. (2013) Non-invasive prenatal testing for aneuploidy: current status and future prospects. Ultrasound Obstet Gynecol., 42(1), 15-33. 4. Cheng, L., Zhang, S., Wang, L., MacLennan, GT., Davidson, DD. (2017) Fluorescence in situ hybridization in surgical pathology: principles and applications. J Pathol Clin Res. ,23; 3(2), 73-99. 5. Celik, HG., Celik, E., Yildirim, G., Cetinkaya, M. (2017) Do triple test results predict risk for neonatal hyperbilirubinemia? Pak J Med Sci., 33(4), 979–983. 6. Carreira, IM., Mascarenhas, A., Matoso, E., Couceiro, AB., Ramos, L., Dufke, A., Mazauric, M., Stressig, R., Kosyakova, N., Melo, JB., Liehr, T. (2007) Three unusual but cytogenetically similar cases with up to five different cell lines involving structural and numerical abnormalities of chromosome 18. J Histochem Cytochem., 255, 1123– 1128. 7. Daan, J., Crommelin, A., Robert, D., Sindelar Bernd, M. (2013) Pharmaceutical Biotechnology: Fundamentals and Applications. Springer. 8. Griffiths, AJF., Miller, JH., Suzuki, DT., et al. (2000) An Introduction to Genetic Analysis. 7th edition. New York: W. H. Freeman. 9. Jiskoot, W., Crommelin, D. (2000) Methods for Structural Analysis of Protein Pharmaceuticals. Springer. 10. Lodish, H., Berk, A., Zipursky, SL.,Matsudaira, P., Baltimore, D., Darnell, J. (2000) Molecular Cell Biology. 4th edition. New York: W. H. Freeman 11. Wilson, K., Walker, J. (2010) Principles and Techniques of Biochemistry and Molecular Biology. 7th edition. Cambridge University Press, New York. 12. Lvovs, D., Favorova, O.O., Favorov, A.V. (2012) A Polygenic Approach to the Study of Polygenic Diseases. Acta Naturae., 4(3), 59–71. 13. Meltzer, JC., Sanders, V., Grimm, PC., Chiasson, N., Hoeltke, HJ., Garrett, KL., Greenberg, AH., Nance, DM. (1998) Nonradioactive Northern blotting with biotinylated and digoxigenin-labeled RNA probes. Electrophoresis., 19(8-9), 1351-5. 14. Marks, DS., Hopf, TA., Sander, C. (2012) Protein structure prediction from sequence variation. Nature Biotechnology. 30,1072–1080. 15. Neuwald, AF., Liu, S., Lipman, DJ., Lawrence, CE. (1994) Extracting protein alignment models from the sequence database. Nucleic Acids Research., 25, 12091– 12095. 16. Shaposhnikov, S., Thomsen, PD., Collins, AR. (2011) Combining fluorescent in situ hybridization with the comet assay for targeted examination of DNA damage and repair. Methods Mol Biol., 682, 115-32. 17. Vorsanova, S., Yurov, YB., Iourov, Y. (2010) Human interphase chromosomes: a review of available molecular cytogenetic technologies. Mol Cytogenet. 3, 1. 18. Shopland, LS., Lynch, CR., Peterson, KA., Thornton, K., Keeper, N., van Hase, J., Stein, S., Vincent, S., Molloy, KR, Kreth, G., Cremer, C., Bult, CJ., O'Brien, TP. (2006) Folding and organization of a contiguous chromosome region according to the gene distribution pattern in primary genomic sequence. J Cell Biol. 174, 27–38. 99 ISBN: 978-608-244-514-4 100

combinepdf-28 (1)

Products

Support

combinepdf-28 (1)

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib