Electroforeza în gel de agaroză I. Principiul metodei Electroforeza în gel de agaroză este o metodă de electroforeză folosită în biochimie, biologie moleculară, genetică și chimie clinică pentru a separa o populație mixtă de macromolecule precum ADN sau proteine într-o matrice de agaroză, una dintre cele două componente principale ale agarului. Proteinele pot fi separate după sarcină și/sau dimensiune, iar ADN-ul și moleculele de ARN după lungime. Biomoleculele sunt separate prin aplicarea unui câmp electric, care determină migrarea moleculelor spre unul dintre poli „+” sau „-” în dependență de sarcina electrică a acestora. Mobilitatea electroforetică este influențată de mai mulți factori printre care: concentrația de agaroză, conformația moleculei de ADN (monocatenară, bicatenară sau supraspiralizat), masa moleculară, prezența compusului fluorescent în gel, tăria ionică a soluției tampon utilizată, voltajul aplicat. Fig. 1 Tehnica de separare a acizilor nucleici prin electroforeza orizontală Electroforeza AND în gel de agaroză este aplicată pentru determinarea purităţii, verificarea existenţei produşilor rezultaţi în urma PCR-ului și a lungimii acestora sau la analiza fragmentelor rezultate după restricția ADN (clivarea enzimatică). Benzile sunt vizualizate datorită utilizării compuşilor fluorescenţi intercalanți (bromura de etidiu sau SYBR Green) prin iradiere cu lumină UV. Pentru facilitarea estimărilor cantitative există colecţii de polimeri „marcheri de masă moleculară” utilizaţi pentru etalonarea separărilor. Soluţii tampon utilizate frecvent pentru electroforeza ADN în gel de agaroză 50X TAE (Tris –acetate- EDTA) soluţie tampon pentru electroforeză Per litru Concentraţia finală 1x 242g 40mM Baza Tris 57,1ml 20mM Acid acetic glacial 100ml 1mM 0,5M EDTA pH 8,0 Până la 1 l H2 O 10X TBE (Tris-borate-EDTA) soluţie tampon pentru electroforeză Per litru Concentraţia finală 1x Baza Tris Acid boric 0,5M EDTA pH 8,0 H2 O 108g 55g 40ml Pînă la 1 l 89mM 89mM 2mM II. Mersul lucrării 1. Asamblați camera electroforetică. 2. Pregătiți 60 ml de gel de agaroză cu concentrația de 0,7%. Pentru aceasta dizolvați 0,42 g de agaroză în 60ml soluție tampon TAE 1X prin încălzire timp de 1-2 min. în cuptorul cu microunde. N.B! Evitați fierberea gelului! După necesitate pregătiți soluție tampon TAE 1X (minim 1l) care va fi folosită, de asemenea, pentru a umple camera electroforetică. 3. Răciți gelul la temperatura de aprox. 50 °C, și adăugați 5 µl de bromură de etidiu 1mg/ml Atenție! Bromura de etidiu este un compus neurotoxic! Soluțiile se vor manevra folosind mănuși de nitril. 4. Plasați pieptănul la o distanța de 1-2 cm de electrodul încărcat negativ, după care turnați amestecul în camera pentru gel. 5. Îndepărtați atent pieptănul și distanțatoarele (dacă au fost utilizate). 6. Umpleți camera electroforetică cu soluție tampon TAE 1X astfel încât gelul să fie complet acoperit cu soluție. 7. Aplicați probele care conțin ADN și probele de referință. Pentru a facilita aplicarea probei preventiv pregătiți un amestec care conține 5 µl probă și 1 µl Loading Dye 6x (0,25% albastru de bromofenol, 40% zaharoza sau 30% glicerina dizolvate în apa bidistilată). 8. Conectați sursa de curent electric, 90V, lăsând probele să migreze timp de 40 min. 9. După expirarea timpului de migrare, îndepărtați soluția tampon și vizualizați gelul în transiluminatorul UV, λ = 254 nm (la întuneric). 10.Preluați imaginea și analizați rezultatul electroforezei ADN. 11.Formulați concluzii cu privire la calitatea și cantitatea ADN.