홍역 및 유행성이하선염 바이러스에 대한 중화항체 평가법 개발 및 개선 Development of neutralizing assay for detection of measles and mumps virus neutralizing antibodies 2016년 2월 질병관리본부 국립보건연구원 연구최종보고서 [제 2 세부과제 ] 과제번호 보안등급 연구개발 단계 연구단명 연구과제명 연구책임자 2015-NG47002-00 □ 보안과제 ■ 일반과제 연구결과공개 ■ 가 □ 부 ※ 보안과제 및 연구결과 비공개에 해당하는 경우 사유를 간략히 기재 ■ 기초 □ 응용 □ 개발 ※ 응용 및 개발단계 해당, 공지된 기술 및 지식재산권 존재여부 확인 □ 유 □ 무 신종 및 재출현 호흡기바이러스 대응 연구단 국 문: 홍역 및 유행성이하선염 바이러스에 대한 중화항체 평가법 개발 및 개선 영 문: Development of neutralizing assay for detection of measles and mumps virus neutralizing antibodies 과학기술인 성 명 강혜지 10989718w 등록번호 소 속 호흡기바이러스과 연구기간 직급(직위) 2015.02～ 2015.12 보건연구사 ( 11개월 ) 감염병관리기술 총 연구비 150,000 천원 예산과목 개 발 연 구 (4800-4845-300) 연구비 해당년도 배정 연구비 1차년도 계 심의 완료 활용실적 연구비 사용비율 150,000 천원 121,507천원 81.00% 150,000 천원 121,507천원 81.00% ☑ 생명윤리 ☑ 생물안전 세부사업 성과지표 연구성과 사용 연구비 □ 동물실험윤리 측정산식(해당지표) 실적치 - - - - 감염병백신 개발지수 - - SCI(E)논문지수 - - 감염병제어기술 개발지수 병원체 연구인프라 활용지수 위와 같이 연구최종보고서를 제출합니다. 2016 년 2 월 26 일 연구책임자 질병관리본부장 귀하 강 혜 지 서명(인) 연구결과 요약서 [ 제 2세부과제 ] 연구단명 연구과제명 신종 및 재출현 호흡기바이러스 대응 연구단 국 문: 홍역 및 유행성이하선염 바이러스에 대한 중화항체 평가법 개발 및 개선 영 문: Development of neutralizing assay for detection of measles and mumps virus neutralizing antibodies 성 명 강혜지 과학기술인 등록번호 10989718 소 속 호흡기바이러스과 직급(직위) 보건연구사 연구책임자 총 연구기간 총 연구비 2015.02 ～ 2015.12 (11 개월) 150,000 천원 예산과목 감염병관리기술개발연구 (4800-4845-300) ○ 연구목표 홍역 및 유행성이하선염 바이러스에 대한 혈청 중화항체 측정을 위한 면역 발색 기반의 중화항체 측정법을 확립하고 재현성과 유용성 확립을 위한 혈청 중화항체 측정법의 표준화 ○ 연구내용 및 범위 면역발색 기반의 FRNT 측정법의 확립 및 기반구축 - 항체기반의 면역발색(Immunocolorimetric assay, ICA) FRNT 측정법의 확립 - 확립된 FRNT 측정법의 PRNT 측정법과의 비교 및 유용성 검증 - International 또는 In house standard를 통한 측정법의 표준화 재조합 바이러스를 이용한 PRMN 측정법을 위한 기반 구축 - Reverse genetics 기술을 이용한 재조합 eGFP 발현 홍역 바이러스 plasmid 정보분석 - 재조합 바이러스 rescue를 위한 transfection 조건 확립 ○ 기대효과 및 활용방안 - 백신효능 평가를 위한 표준 SOP 제시 가능 - VPD 관련 예방(접종)정책수립 및 전략 개발을 위한 기초자료 제공 내부연구과제 연구결과 요약서 [ 제2세부과제 ] 수행연도 인건비 연구장비· 재료비 연구 활동비 연구과제 추진비 연구 관리비 (단위: 천원) 합계 2 3,7 0 4 8 9 ,95 7 6,6 8 8 1 ,15 8 0 121,507 1 년차 ( 2015) 2 3,7 0 4 8 9 ,95 7 6,6 8 8 1 ,15 8 0 121,507 연 구 비 계 내 역 1 년차 ( 2015) 연 세부사업 성과지표 감염병제어기술 개발지수 병원체 연구인프라 활용지수 SCI(E)논문지수 측정산식(해당지표) 실적치 - - - - - - 구 성 과 실 적 - SOP 1건(홍역 FRNT 관련) 최종 - SCI 논문 1편(홍역 FRNT등 중화항체검사법 비교 관련 논문) 기대성과 - 간행물 게재 1건(주간 건강과 질병-최근 바이러스 중화항체 측정법 개발 현황) 색인어 (5개) (국문, 영문) 국문: 홍역, 유행성이하선염, 중화항체, 항체, 백신 영문: measles, mumps, neutralizing antibody, antibody, vaccine 제(2)세부 과제명: 홍역 및 유행성이하선염 바이러스에 대한 중화항체 평가법 개발 및 개선 제1장 연구의 목적 및 필요성 제1절. 중화항체 측정법의 개발의 필요성과 중요성 1. 국내 홍역 유행의 발생 현황과 MMR 백신 접종률 가. 홍역(measles)은 전염력이 강한 급성 바이러스성 감염성 질환으로 국 내에서 1965년 홍역 백신을 도입한 이후 국가적인 백신 정책이 도입 및 실시되어 그 발생 빈도가 감소하였으나 1989-1990년 및 1993년에 유행 발생하였고, 특히 2000-2001년에 전국적으로 많은 홍역 환자가 보고되는 대유행이 있었다1,2. 나. 2000-2001년의 홍역 대유행의 원인을 홍역 감수성 연령대의 홍역에 대한 면역도 저하로 판단되어 감수성 연령에 일제 백신(Measle과 Rubella 2가 백신)을 접종하여 전국적인 홍역에 대한 면역도를 상승시 켰고 이후에도 MMR (Measles, Mumps, Rubella) 3가 백신의 2회 접 종 국가사업을 통해 MMR에 대한 백신 접종률을 95%이상으로 높게 유지하고 있다 (그림 1)3-5. 그림 1. 연도별 국내 홍역 발생 및 백신접종 현황 다. 이후 국가적인 백신 정책을 통해 홍역 발생 감소가 지속되어 2006년 홍역 퇴치 선언, 이후 산발적으로 홍역 유행이 발생하였지만 2010년 을 기준으로 국내 토착화된 홍역은 전혀 발생하지 않았다4,6. 라. 2014년 3월 홍역 퇴치국가로 인증을 받았음에도 불구하고, 2010년 인 천, 2013년 경남 및 경기 북부를 중심으로 홍역 유행이 발생하였으며, 특히 2014년에는 전국적으로 홍역 유행 발생이 지속되고 있으며, 유 전자 분석결과 국내에서 발생하지 않은 새로운 유전형의 홍역에 의한 발생임이 밝혀졌다 (그림 2, 3, 표1). 그림 2. 해외유입 홍역 감염사례의 증가 (2008-2014.7) 그림 3. 2013-2014년 국내 홍역 유행 현황 표 1. 연도별 홍역 해외유입 사례 (2015년 10월 기준) 연도 해외유입건 해외여행국 유전형 2008 1 Thailand - 2009 2 Libya, Vietnam H1, B3 2010 1 Australia H1 2011 3 Philippines, Thailand D9 2012 2 Thailand, Malaysia - 2013 4 2014 20 2015.10 3 Indonesia, Philippines, Malaysia Philippines, China, Vietnam, Singapore Turkey/Greece/Bulgaria, China, Indonesia D9, B3 B3, D8, H1 D8 2. 성인 홍역 유행의 발생 및 발생 원인에 대한 가설 가. 2014년 기준 국내에서 총 442명의 홍역 환자가 발생하였고 6세 미만 영유아뿐만 아니라 초,중,고등학교 연령 및 MMR 백신을 2회 접종하 였다고 추정되는 성인 연령에서도 150명 이상의 집단 발병이 발생하 였다 (그림 4). 그림 4. 2014년 국내 발생 홍역의 실험실적 확진 연령별 분포 나. 높은 백신 접종률에도 불구하고 최근 국내의 영유아 및 성인 연령에서 의 홍역 유행 발생 원인에 대한 가설은 1)백신의 저온 유지망의 유지 의 문제, 백신 투여시의 너무 이른 시기 등 여러 가지 문제로 발생하 는 2)primary vaccine failure, waning immunity가 가속화 되면서 발 생하는 3)secondary vaccine failure, 4)면역도 저하, 5) 바이러스 변 이로 인한 면역회피 등으로 제시되고 있으며 이에 대한 조사의 필요성 이 강조되는 실정이다7-11. 3. 유행성이하선염 발생의 증가 가. 유행성이하선염 바이러스에 의한 감염증 발생은 1996년 약독화 생백 신이 개발된 이후 지속적으로 감소되어오다가 1980년대 중반 이후 중 국, 스위스, 미국, 캐나다 및 국내에서 집단 감염이 보고되었으며, 최 근에는 백신 접종자 층에서 까지 산발적인 유행이 보고되고 있다12,13. 나. 국내에서는 1974년부터 유행성이하선염 생 바이러스 백신 접종이 실 시되었고, 1997년부터 2가 MMR 백신 정책이 도입된 이후로 유행성이 하선염 환자수가 10만 명당 5명 이하로 현저히 감소하였으나, 2007년 4557건 으로부터 꾸준히 증가하여 2012년 7420건, 2013년 17,024 건, 2014년 25,734건으로 폭발적으로 환자수가 증가하고 있기 때문에 그 원인을 규명하고 해결을 위한 국가 차원의 연구가 시급하다. 다. 특이점은 홍역 퇴치 사업으로 유행성이하선염이 포함된 3가 MMR 백 신을 국가 차원에서 2회 접종을 시행하고 있고, 95% 이상의 높은 백 신 접종률에서도 환자들이 계속적으로 증가하는 것이 문제이다. 최근 5년의 발생을 기준으로 유행성이하선염은 대부분 19세 미만에서 발생 하며, 그중 13-18세가 유행성이하선염의 호발 연령대임이 확인 되었 다. 또한 연도별 호발연령대가 움직이지 않고 같은 연령대에서 나타나 는 것을 통해 특정 년도의 백신의 효능이 좋지 않았던 게 아니라 백신 을 접종하고 일정 연령이 되면 어떤 문제가 되는 원인(Waning immunity)에 의해 유행성이하선염이 발생하게 된다는 가설을 설정하 고 항체가 측정 및 중화항체의 측정을 통해 원인규명이 필요한 실정이 다. 4. 홍역 및 유행성이하선염 유행의 발생원인 규명을 위한 중화항체 측정의 중요성 가. 최근 유행하고 있는 홍역 및 유행성이하선염의 발생원인 규명을 위해 백신 접종력을 비롯한 다양한 변수(variable) 조사를 통한 역학 연구와 병행해서 항체가 및 중화항체가를 측정하여 primary vaccine failure, secondary vaccine failure, 면역도 저하 등의 가설을 검증하고 백신 의 효능 평가 및 백신 정책의 수립에 근거 자료로 제시할 수 있다. 나. 홍역 항체를 측정하는 검사에는 혈구응집억제 시험법 등 여러 가지 방 법이 있으나, 최근에는 검사 방법이 쉽고 시간이 많이 걸리지 않는 효소면역측정법(ELISA)을 통해 홍역 항체를 측정한다. 홍역 ELISA 의 경우 Whole virus 구조에 대한 항체의 존재를 검출하는 방법으로써 항체가가 높아도 실제 홍역에 대한 방어능력과는 관계없을 가능성이 있다 14,15 . 다. 홍역 바이러스의 중화항체 측정법의 Gold standard 는 plaque 형성 능력을 이용한, Plaque reduction neutralization test (PRNT) 법으로 홍역바이러스에 대한 중화항체의 존재유무 및 그 양을 검출할 수 있는 방법으로 사용되고 있고, 홍역 ELISA 보다 민감도도 높다고 알려져 있다16,17. 또한 영유아에서의 경태반 홍역 IgG 항체의 감소 추세를 조 사 할 때, 백신 접종 후 항체전환율(seropositive conversion)을 측정 할 때에도 중화항체 측정법으로 검사하는 것이 좋으며, ELISA 항체 검사 결과는 주의하여 해석하는 것이 필요하다고 여겨지고 있다18,19. 라. 유행성이하선염 바이러스의 항체를 측정하는 방법으로는 compliment fixation 과 HI test 방법이 있으나, HI 항체는 Parainfluenza virus 와 Cross-reactive 하기 때문에 민감도가 떨어진다20,21. 따라서 검사방법 이 쉽고 민감도가 높은 ELISA 법을 통해 항체가를 측정하지만, 홍역 과 마찬가지로 방어능력의 측정과는 관계가 없다고 알려져 있다22. 마. 홍역 및 유행성이하선염의 혈청 중화항체 측정은 항체 방어 면역을 측 정하는 가장 민감도가 높은 방법으로써, 중화항체 측정법의 개선과 개 발은 중요하다. 제2장 연구의 연구목표 및 달성도, 관련 분야에의 기여도 구분 연구 목표 내용(범위) 달성도(%) 기여도(%) - 항체기반의 면역발색 FRNT 측정법의 1차 년도 면역발색 기반의 FRNT 측정법의 확립 및 기반 구축 확립 - 확립된 FRNT 측정법의 PRNT 측정법과 의 비교 및 유용성 검증 - International 또는 In house standard 를 통한 측정법의 표준화 재조합바이러스 를 이용한 PRMN 측정법을 위한 기반 구축 80% 80% - Reverse genetics 기술을 이용한 재조 합 eGFP 발현 홍역 바이러스의 rescue - 확보된 재조합바이러스의 감염능 확인 제3장 국내․ 외 기술개발 현황 제1절. 홍역 및 유행성이하선염의 중화항체 측정법의 연구기술 개발현황 1. 중화항체 측정법의 Gold Standard PRNT 가. 홍역의 경우 지난 과거의 중화항체 측정은 신속하고 간단히 수행할 수 있는 HI assay로 시행해 왔으나23, 1981년 Albrecht et al 그룹에서영 유아에서 홍역 백신 실패 원인을 조사하기위해 PRNT법이 개발되었으 며, 낮은 중화항체도 측정할 수 있도록 민감도를 크게 개선하였다24. 나. PRNT는 홍역 중화혈청의 양을 측정하는 방법으로 희석되어진 혈청 샘 플이 바이러스의 plaque형성을 중화하는 능력을 vero 세포를 이용하 여 확인하는 방법이다(그림5)16. 그림. 5 홍역 International standard를 이용하여 표준화하는 PRNT법16 다. 유행하선염의 바이러스도 마찬가지로 PRNT 중화항체 측정법이 보호면 역을 측정하는 "gold standard" 로 여겨지고 있으며25-27, Mauldinet al 은 ELISA 방법으로 측정된 항체가 와 PRNT 법으로 측정된 중화항체 가의 상관성을 비교하여 PRNT를 통한 중화항체의 측정법이 유행성이 하선염 바이러스의 보호 면역능력을 측정하는데 있어서 유효하다고 평 가하였다(그림 6)28. 그림 6 홍역 ELISA 항체가 와 PRNT 중화항체가의 상관관계28 2. PRNT 측정법의 단점 가. 홍역과 유행성이하선염의 PRNT 측정법은 각각 바이러스에 대한 혈청 중화항체를 측정하기에 있어서 좋은 방법이지만 수행과정의 복잡, 많 은 양의 샘플 필요, 한 번에 수행할 수 있는 샘플의 개수가 제한적, 약 5~7일정도의 긴 시간이 필요 등등의 단점을 가지고 있어, 기존 PRNT 측정법의 개선 또는 새로운 방식의 중화항체 측정방법이 필요 한 실정이다 (표. 2). 표. 2 PRNT 측정법의 단점 단점의 요인 단점의 요인의 예 샘플의 희석, 중화반응, 바이러스 감염, Incubation, 1) 수행과정의 복잡성 2) 많은 양의 샘플 필요 plaque 염색, 고정화, plaque count, 결과 계산 등 많 은 수행과정이 필요함에 따라 수행자의 숙련도에 따라 결과에 영향을 끼침 24 또는 12 well cell plate를 사용하고 최소 50ul 이 상의 많은 양의 혈청 샘플이 필요함 수행과정의 복잡성으로 인한 일회 수행 시 측정할 수 3) 측정 샘플 개수의 제한 있는 샘플 개수가 제한적 (12~15 샘플/일회 수행 시) 결과 확인까지 5~7일의 시간이 필요하며, 수행 첫날, 4) 필요시간 및 노동력 plaque count 및 결과 분석에 각각 4~7시간 이상의 시간 및 노동력이 필요함 5) 경제적인 측면 많은 양의 세포 및 실험 초자가 소비되기 때문에 비경 제적임 3. 혈청 중화항체 측정법의 개발 동향 가. PRNT 측정법의 단점을 극복하고자 최근에는 다양한 방법으로의 중화 항체 측정법이 개발되어지고 있다. 재조합 형광 발현 바이러스를 이용 한 PRMN (fluorescence based plaque reduction microneutralization)29,30 immunocolourimetric assay (ICA) 기반의 FRNT (focus reduction neutralization test)법20,31-33 등 민감도와 수 행방법의 단순화를 통한 홍역과 유행성이하선염 바이러스의 중화항체 측정법이 개발되어지고 있다. 나. PRMN 측정법은 기존 PRNT 측정법을 바탕으로 간단한 수행과정과 높 은 민감도, 소요시간, 반복 실험에서의 균일한 실험결과 등을 개선한 방법으로 형광을 발현하는 재조합 바이러스를 이용한 중화항체 측정법 이다(그림 7, 8)20,29,30. 그림 7. 재조합 MVeGFP 바이러스를 이용한 PRMN 측정법29 그림 8. PRMN 측정법에 의한 중화항체가와 ELISA 항체가의 상관성 비교29 다. FRNT 측정법은 ICA 를 바탕으로 바이러스 유래 단백질의 단클론 항체 를 이용하여 바이러스에 감염된 세포를 HPR-Conjugate 된 2차 항체 를 이용하여 substrate로 발색시켜 중화항체가를 측정하는 방법으로, 홍역과 유행성이하선염 바이러스의 중화항체측정법에 적용되었다 (그 림 9, 10)20,31,32,34,35. 그림 9. 혈청 샘플을 이용한 유행성이하선염의 FRNT 측정법31 그림 10. FRNT 와 PRNT 측정법의 중화항체가 비교31 4. PRNT 와 FRNT, PRMN과의 비교 가. FRNT 와 PRMN 법은 중화항체 측정법의 “gold standard”인 PRNT를 기반으로 PRNT 측정법의 단점을 개선하고 PRNT 와의 비교평가를 통 해 민감도, 수행과정의 단순화 및 결과 측정의 객관화 확보를 통해 개 발되어 왔다 (표 3). 표 3. PRNT와 FRNT, PRMN 측정법의 비교 Culture plate Require cell Number Incubation time PRNT FRNT PRMN 24well plate 96well plate 96well plate 1 X 105 cells/well 2 X 104 cells/well 1.5 X 104 cells/well 5~7 days 2~3 days 2 days Detection Neutral red or Method Crystal violet Read out Eye “Gold standard” but slow, Feature labor-intensive, lage volumes of test component Fluorescence HRP-substrate expressing recombinant virus Eye or Image Fluorescence analyzer Reproducibility, EIA reader large number of samples to be tested, automated image analyzers Fluoresence-based, improved test readout, rapid, reproducible, high sensitive 5. 국내 개발 동향 가. 국내 홍역 바이러스의 중화항체 측정법은 PRNT가 확립되어 사용되어 지고 있지만, 백신의 효능평가 및 홍역의 유행 발생의 원인규명을 위 한 중화항체가의 측정이 필요하며, 간단하고, 대규모 샘플을 측정 할 수 있는 중화항체 측정법 개발에 대한 연구가 필요한 실정이다. 나. 국내 유행성이하선염 환자발생의 지속적인 증가로 인한 그 원인 규명 을 위한 연구가 필요하며, 그에 기초가 될 수 있는 중화항체의 측정이 중요하다. 하지만 국내의 경우 유행성이하선염 바이러스의 중화항체측 정법 확립이 되어있지 않기 때문에 구가 꼭 필요하다. 측정법의 개발 및 확립에 대한 연 제4장 연구의 내용 및 결과 제1절. 홍역바이러스의 FRNT 측정법의 확립 1. 홍역 바이러스 특이 항체를 이용한 감염된 세포의 검출능 확인 가. 바이러스 특이 항체로 홍역 바이러스에 감염된 세포의 검출능을 살펴 보기 위하여 96well plate에 vero/hSLAM 세포를 배양 후 Measles A (Edmonston) 바이러스 원액으로부터 4배수로 희석하여 감염 시킨 후 overlay medium (1.5% Carboxmethylcellouse, CMC)를 넣은 후 2일, 3일, 4일 간 배양한다. PBS로 2회 세척 후 100% MeOH로 30분 동안 고정 후 1st Anti-measles Nucleoprotein antibody (Millipore Cat# MAB8901) 1:2000으로 2시간, 2nd Anti-mouse IgG HRP 1:2000으로 한 시간 동안 반응 시킨 후 Stable DAB로 30분 동안 발색시켜 결과를 비교하였다 (그림 11). 그림 11. 홍역바이러스 특이 항체를 이용한 바이러스 검출능 확인 나. Measles Nucleoprotein antibody를 통하여 바이러스에 감염된 세포를 확인 할 수 있었으며, 3일과 4일 배양조건에서 바이러스에 감염된 세 포를 검출 할 수 있었다. 하지만 4일 배양조건에서는 plaque 이 많이 diffuse 되어 있어 중화항체를 측정하는 FRNT에 적용하기에는 않다. 반면 3일 배양 조건에서는 plaque가 적당한 크기로 형성되어있어 plaque을 count 하기에 적당하며, FRNT 측정법에 적합한 조건을 확인 하였다 (그림 12). 그림 12. 바이러스 plaque 형성능 비교 2. Substrate solution의 비교 가. FRNT 측정법에 적합한 최적의 substrate를 적용하기 위하여, stable DAB (Thermo, Cat# 750118)과 TrueBlue peroxidase substrate (KPL, Cat# 50-78-02)를 비교 하기 위하여 vero/hSLAM 세포에 Measles A (Edmonston) 바이러스를 감염 시킨 후 3일 간 배양하고 PBS로 2회 세척 후 100% MeOH로 30분 동안 고정 후 1st Anti-measles Nucleoprotein antibody (Millipore Cat# MAB8901) 1:2000으로 2시간, 2nd Anti-mouse IgG HRP 1:2000으로 한 시간 동 안 반응 시킨 후 Stable DAB 또는 TrueBlue substrate로 30분 동안 발색시켜 결과를 비교하였다 (그림 13). 그림 13. Substrate에 따른 발색 비교 나. Substrate 의 비교 결과 TrueBlue를 사용했을 때 바이러스의 plaque 이 stable DAB을 사용했을 때 보다 더 명확하게 발색이 되는 것을 확 인 하여 FRNT 측정법에 적용하였다. 3. Measles virus dose 조건의 확립 가. 바이러스 중화항체를 측정하기 위해서는 중화 반응을 할 때에 적절한 Dose의 바이러스를 이용하여야 한다. 또한 세포에 감염되고 plaque를 형성할 때 diffuse 되지 않는 조건을 확립하여야 한다. 따라서 바이러 스의 적정 dose를 정하기 위하여 홍역 바이러스 orignal stock을 FFU (Focus Forming Unit) assay를 Titration 하였다. 그 결과 보유하고 있 는 Measles virus A (Edmonstone, P4)는 1.12 X 105 ffu/ml 로 계산 되었다. 나. 바이러스를 1200 ffu/ml로 93.33배 희석 한 후 바이러스 희석액 과 Medium을 1:1로 균질화 하여 최종 30 ffu/well 로 vero/hSLAM 세포에 감염 시킨 후 3일 동안 배양 한 후 plaque의 형성을 관찰 하였다. (그 림 14). 다. 반복 감염실험을 통하여 각 well 당 virus plaque이 평균 27.2 ± 3.4 ffu/ml로 균일하게 형성되는 것을 확인 하였고 FRNT 측정법에 적용 하 였다 (그림 14). 그림 14. FRNT 측정법 확립을 위한 바이러스 Dose 조건 확인 4. 홍역 3rd International standard 혈청을 이용한 FRNT 측정법의 확립 가. 홍역 3rd International standard 혈청을 이용하여 홍역 바이러스에 대 한 중화능을 확인 하였다. 3rd를 Assay block을 이용하여 4배수 단계 희석액을 준비하여, 1200 ffu/ml measles virus 희석액과 균질화 한 후, 37°C 에서 2시간 동안 중화반응 시킨 후 vero/hSLAM 세포에 감염 시켜 3일 동안 배양 후 중화능을 확인 하였다 (표 4, 그림 15). 표 4. Mealse 3rd International standard의 희석 희석 배수 rd 3 Medium 10 40 160 640 2560 10240 40960 163840 655360 40 100 100 100 100 100 100 100 100 360 300 300 300 300 300 300 300 300 그림 15. FRNT 측정법의 plate 디자인(최종희석배수) 나. Virus control 평균 26.06 ± 5.26 이었고, cut off value는 13.03 이 었다. ND50은 Karber 공식을 사용하여 구하였으며, 3번의 반복실험 모 두 ND50은 2560으로 계산되었다. UC값은 1.17, Lower limit는 23.43 mIU/ml 이었다 (그림 16, 표 5). 그림 16. 3rd Standard를 이용한 FRNT 측정법의 확립 표 5. ND50의 계산 5. 반복 실험을 통한 FRNT 측정법의 재현성 확인 가. 3rd를 이용하여 반복실험을 통한 결과의 재현성을 확인하였다. 총 3회 의 실험에 걸쳐 9개의 sample 3rd를 이용하였으며, 각 sample 당 3반 복으로 실험을 진행하였다. 결과 9번의 실험 결과 모두 ND50 2560으 로 재현성 있는 결과를 확인하였다. 그림 17. 3rd를 이용한 FRNT 측정법의 재현성 확인 6. 사람 혈청을 이용한 PRNT 와 FRNT 측정법의 비교 가. 중화항체 측정법의 "Gold standard" 인 PRNT 측정법과의 비교를 통 해 FRNT 측정법의 민감도 및 유용성을 확인하기 위하여, 2014년 면역 도 조사에 사용된 사람 혈청을 이용하여 결과를 비교하였다. 총 27개 의 혈청을 사용 하였으며 각각의 측정법에 따른 조건대로 실험을 진행 하였고, PRNT는 24 well plate (1 sample/plate), FRNT는 96 well plate (3 samples/plate)를 사용하여 진행하였다 (그림 18). 그림 18. PRNT 와 FRNT 결과 plate 비교 나. 같은 샘플을 이용하여 각각 PRNT 와 FRNT 측정법으로 중화항체를 확인하여 상관관계를 비교 하였다. R2=0.888으로 두 방법사이에서의 높은 일치도를 보여주었다. 또한 FRNT는 PRNT 측정법보다 낮은 희석 배율부터 수행 할 수 있기 때문에 더욱 높은 민감도를 보였다 (그림 19, 표 6). 그림 19. PRNT50 과 FRNT50의 상관관계 비교 표 6. PRNT 와 FRNT의 결과 비교 Samples 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 PRNT ND50 1625.50 4096.00 1024.00 4096.00 256.00 1024.00 2580.32 4096.00 1625.50 1625.50 1024.00 645.08 1024.00 256.00 256.00 1024.00 GMT(mIU/ml) 1889.88 4762.20 1190.55 4762.20 297.64 1190.55 3000.00 4762.20 1889.88 1889.88 1190.55 750.00 1190.55 297.64 297.64 1190.55 FRNT ND50 1612.70 2560.00 640.00 2560.00 160.00 1015.94 2560.00 2560.00 1612.70 1612.70 640.00 640.00 1015.94 253.98 253.98 1015.94 GMT(mIU/ml) 1889.88 3000.00 750.00 3000.00 187.50 1190.55 3000.00 3000.00 1889.88 1889.88 750.00 750.00 1190.55 297.64 297.64 1190.55 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 645.08 1625.50 4096.00 1625.50 406.37 1024.00 64.00 1024.00 161.27 1024.00 256.00 750.00 1889.88 4762.20 1889.88 472.47 1190.55 74.41 1190.55 187.50 1190.55 297.64 403.17 640.00 2560.00 1015.94 160.00 640.00 63.50 640.00 40.00 403.17 253.98 472.47 750.00 3000.00 1190.55 187.50 750.00 74.41 750.00 46.88 472.47 297.64 다. 두 측정법 사이의 결과는 상관성 있게 비슷한 결과를 보여주었다. 하 지만 필요조건에 따라 FRNT 측정법은 더욱 적은 소모품 및 세포를 필 요로 하고, 바이러스 감염 후 배양기간 역시 5일에서 2일로 줄어 더욱 빠르게 중화항체를 측정 할 수 있으며, 바이러스에 감염된 세포를 바이 러스 특이 항체를 이용하여 확인하기 때문에 민감도 또한 높고, 결과 분석 또한 이미지 분석 장치를 사용하여 자동화 할 수 있다. 표 7. PRNT 와 FRNT 측정법의 요구조건 (샘플 12개 진행 예시) 구분 PRNT FRNT 12개 4개 (24well plate) (96well plate) 2.88 X 107 cells/total 7.68 X 106 cells/total 1 X 105 cells/well 2 X 104 cells/well 배양기간 5 일 3 일 감염 확인 plaque assay 발색체 Neutral red TrueBlue peroxidase 결과 분석 Eye Eye or Image analyzer plate 필요 세포 수 FFU (Focus forming unit) assay 7. 홍역 바이러스 FRNT 측정법의 모식도 가. FRNT 측정법 확립을 위하여 홍역 바이러스 특이 항체를 선정하였고, 감염 조건에 대한 배양기간, 바이러스 농도를 확립 하였으며, 최적의 substrate를 사용하여 바이러스 감염으로 형성되는 plaque을 더욱 선 명하게 확인하였고, 최종적으로는 Anti-measles 3rd international standard 혈청을 사용하여 중화능 및 중화항체 측정법에 대한 반복성 과 재현성을 확인하여 측정법의 표준화를 진행 하였다 (그림 20). 그림 20. 홍역 바이러스 FRNT 측정법 모식도 제2절. 유행성이선염 바이러스의 FRNT 측정법의 확립 1. 유행성이하선염 바이러스 특이 항체의 감염된 세포의 검출능 확인 가. 바이러스 특이 항체로 홍역 바이러스에 감염된 세포의 검출능을 살펴보 기 위하여 96well plate에 vero 세포를 배양 후 Mumps (Jeryl Lynn) 바이러스 원액으로부터 4배수로 희석하여 감염 시킨 후 overlay medium (1.5% Carboxmethylcellouse, CMC)를 넣은 후 2일, 3일 간 배양한다. PBS로 2회 세척 후 100% MeOH로 30분 동안 고정 후 1st Anti-Mumps Nucleoprotein antibody (Abcam Cat# 20859) 1:2000으 로 2시간, 2nd Anti-mouse IgG HRP 1:2000으로 한 시간 동안 반응 시킨 후 Stable DAB로 30분 동안 발색시켜 결과를 비교하였다 (그림 21). 그림 21. 유행성이하선염 바이러스 특이 항체를 이용한 검출능의 확인 나. Mumps Nucleoprotein antibody를 통하여 바이러스에 감염된 세포를 확인 할 수 있었으며, 2일과 3일 배양조건에서 바이러스에 감염된 세 포를 검출 할 수 있었다. 하지만 3일 배양조건에서는 plaque 이 많이 diffuse 되어 있어 중화항체를 측정하는 FRNT에 적용하기에는 않다. 반면 2일 배양 조건에서는 plaque가 적당한 크기로 형성되어있어 plaque을 count 하기에 적당하며, FRNT 측정법에 적합한 조건을 확인 하였다 (그림 22). 그림 22. 바이러스 plaque 형성능 비교 2. Host cell line의 비교 가. 유행성이하선염 바이러스는 주로 Vero 세포와 Vero/hSLAM 세포에서 분리 및 배양을 진행한다. FRNT 측정법에 적합한 세포를 확인하기 위 하여 Vero세포와 Vero/hSLAM 세포에 유행성이하선염 바이러스를 감염 시켜 plaque의 형성능을 비교 하였다 (그림 23). 그림 23. Vero 와 Vero/hSLAM 세포 에서의 plaque 형성능 비교 나. Vero/hSLAM 세포에서 보다 안정적으로 세포가 고정되고, plaque의 형 성 및 발색이 잘 이루어진 것을 확인하였고, FRNT 측정법의 host cell line 으로 결정하였다. 3. Substrate solution의 비교 가. FRNT 측정법에 적합한 최적의 substrate를 적용하기 위하여, stable DAB (Thermo, Cat# 750118)과 TrueBlue peroxidase substrate (KPL, Cat# 50-78-02)를 비교 하기 위하여 vero/hSLAM 세포에 유 행성이하선염 바이러스를 감염 시킨 후 2일 간 배양하고 PBS로 2회 세척 후 100% MeOH로 30분 동안 고정 후 1st Anti-mumps Nucleoprotein antibody (Abcam Cat# 20859) 1:2000으로 2시간, 2nd Anti-mouse IgG HRP 1:2000으로 한 시간 동안 반응 시킨 후 Stable DAB 또는 TrueBlue substrate로 30분 동안 발색시켜 결과를 비교하였다 (그림 24). 그림 24. Substrate에 따른 발색 비교 나. Substrate 의 비교 결과 홍역 바이러스와 마찬가지로 유행성이하선염 바이러스도 TrueBlue를 사용했을 때 바이러스의 plaque이 stable DAB 을 사용했을 때 보다 더 명확하게 발색이 되는 것을 확인 하여 FRNT 측정법에 적용하였다. 4. Mumps virus dose 조건의 확립 가. 바이러스의 적정 dose를 정하기 위하여 유행성이하선염 바이러스 orignal stock을 FFU assay로 Titration 하였다. 그 결과 보유하고 있는 Mumps (Jeryl Lynn P3)바이러스는 7.87 X 104 ffu/ml 로 계산되었 다. 나. 바이러스를 1200 ffu/ml로 65.58배 희석 한 후 바이러스 희석액 과 Medium을 1:1로 균질화 하여 최종 30 ffu/well 로 vero/hSLAM 세포에 감염 시킨 후 2일 동안 배양 한 후 plaque의 형성을 관찰 하였다 (그림 25). 그림 25. FRNT 측정법 확립을 위한 바이러스 Dose 조건 확인 다. 반복 감염 실험을 통하여 각 well 당 virus plaque이 평균 19.04 ± 2.8 ffu/ml로 균일하게 형성되는 것을 확인 하였고 FRNT 측정법에 적 용 하였다. 5. 제작한 anti-Mumps mouse 혈청을 이용한 FRNT 측정법 확립 가. 유행성이하선염 바이러스는 홍역 바이러스와 달리 표준 혈청이 없기 때문에 내부 연구단 과제인 신종 및 재출현 호흡기바이러스 질환의 발 생원인 규명과 진단기술 개발 연구 과제의 제 1 세부 과제 “중화항체 분석에 의한 유행성이하선염 발생원인 조사 연구”에서 제작한 anti-Mumps mouse 혈청을 이용하여 중화능을 확인하였다. 나. 마우스 혈청은 IgG ELISA 항체가를 기준으로 희석하여 FRNT를 진행 하였고 희석액과 1200 ffu/ml mumps virus를 균질화 한 후, 37°C 에 서 2시간 동안 중화반응 시킨 후 vero/hSLAM 세포에 감염 시켜 2일 동안 배양 후 중화능을 확인 하였다 (표8, 그림 26). 표 8. Anti-Mumps mouse 혈청의 희석 IgG Titer Mouse 항혈청 1,000,000 100,000 10,000 1,000 titer dilution titer dilution titer dilution titer dilution factor factor factor factor 19.01X 10X 10X 10X 19,010,966 그림 26. Anti-mumps mouse 혈청을 이용한 FRNT 측정법의 확립 다. Virus control 평균 21.56 ± 3.05 이었고, cut off value는 10.78 이었 다. ND50은 Karber 공식을 사용하여 구하였으며, ND50은 160 으로 계산되었다. 희석배수를 환산하여 계산된 orignal 마우스 혈청의 ND50 는 30,416 이다. (표 5). 표 9. ND50의 계산 6. In house 혈청 및 ELISA positive를 활용한 중화항체 측정법의 확립 가. 유행성이하선염 바이러스의 중화항체는 항체가 대비 낮은 수준을 보여 주고 있어 중화항체를 측정할 때에 낮은 희석 배율에서 진행 하는 것 이 필요 하다. 뿐만 아니라 사람 혈청에 대한 FRNT 측정 확립을 위하 여 호흡기바이러스과에 혈청 검사 진단 의뢰된 검체 중 유행성이하선 바이러스의 IgG 항체가가 높은 혈청을 선별하여 pooling한 In house 샘플, 유행성이하선염 IgG ELISA의 positive로 쓰이는 Accrun40 과 Enzygnost ELISA의 postive IgG를 준비하여 FRNT 측정법을 통해 비 교 하였다 (그림 27). 그림 27. In house control을 이용한 FRNT 측정법 확립 나. ND50은 각각 Accurun 40: 90.51, ELISA IgG control: 57.02, In house control: 71.84 로 계산되었다. In house control을 사용하여 확 인한 결과 중화항체는 매우 낮은 수준에서 형성됨을 확인 하였다. 이 결과는 2011년 Margaret MC. et al 36 그룹에서 유행 발생 전후의 혈 청 분석연구에서 제시한 환자그룹의 중화항체가 Median titer 23.2, 환 자 아님 그룹의 Median titer 73.4 로 중화 항체가는 매우 낮은 수준에 서 형성되고 있음을 알수있다. 따라서 사람에게서 유행성이하선염 바이 러스 중화항체를 측정하기 위해서는 매우 낮은 희석배수 및 민감도 높 은 측정이 필요함을 확인 하였고, FRNT 측정법의 희석배수 조건을 확 립하였다 (표 10). 표 10. In house control의 ND50 계산 7. 유행성이하선염 바이러스 FRNT 측정법의 모식도 가. FRNT 측정법 확립을 위하여 유행성이하선염 바이러스 특이 항체를 선 정하였고, 감염 조건에 대한 배양기간, 바이러스 농도를 확립 하였으 며, 최적의 substrate를 사용하여 바이러스 감염으로 형성되는 plaque 을 더욱 선명하게 확인하였고, 최종적으로는 Anti-mumps 마우스 혈청 사용하여 중화능을 확인하여 FRNT 측정법을 확립하였다 (그림 28). 그림 28. 유행성이하선염 바이러스 FRNT 측정법 모식도 제3절. 재조합 바이러스를 이용한 PRMN 측정법을 위한 기반 구축 1. Back born 과 helper plasmid의 확인 가. 일본 NIID로부터 분양 받은 재조합 홍역 바이러스를 분석하기 위하여 제공받은 sequence를 토대로 plasmid map과 enzyme site를 분석하 였다. Plasmid의 사이즈는 19.712kb 이며, nucleoprotein 앞부분에 Green floure sence repoter를 포함하고 있다 (그림 29). 그림 29. 재조합 바이러스 back born plasmid 나. 분석한 plasmid 정보를 기반으로 Helper plasmid (P△C, N, L) 와 back born plasmid를 restriction enzyme digestion 해서 plasmid가 올바로 존재하는지 확인 하였다 (그림 30). 그림 30. Restriction enzyme digestion을 통한 plasmid의 확인 2. RG system을 이용한 재조합 eGFP 발현 홍역바이러스의 Rescue 가. Plasmid의 대량 확보를 위하여 pHHRz-MV323-EGFP는 큰 사이즈의 plasmid를 안정적으로 생산할 수 있는 XL-10 Gold Ultracompetent cell (Agilent, Cat# 200314)를 이용하여 확보 하였고, pCITE-IC-N, pCITE-IC-pdeltaC, pCITEko-9301B-L plasmid들은 Top10 competent cell (Invitrogen, Cat#C4040-10)을 이용하여 plasmid를 확보한 다음 전기영동으로 확인 하였다 (그림 31). 그림 31. 확보한 plasmid의 확인 나. 확보된 plasmid들을 T7 polymerase가 발현 하고 있는 BHK/T7-9 세 포에 FUGEN HD Transfection reagent (Promega를 이용하여 transfection 하고, 2일 후에 스크래핑 하여 미리 배양된 Vero/hSLAM 세포에 Overlay 시켜 GFP의 발현을 확인하였다 (그림 32). 그 후 계속 모니터링 하였지만 바이러스에 의한 CPE 현상을 확인 할 수 없었다. NIID에서 분양받은 재조합 바이러스 back born은 SSPE strain으로부터 제작되어 졌기 때문에 세밀한 rescue 조건이 필요 할 것으로 예상되어 진다. 그림 32. Transfection 된 BHK/T7-9 세포에서의 형광발현 다. 추후 연구과제를 통하여 신종 및 재출현 호흡기바이러스 대응 연구단 에 포함 된 학술용역과제 “홍역 및 유행성이하선염 재조합 바이러스 제작”에서 제작된 plasmid를 통하여 재조합 바이러스를 rescue 조건을 확립하고 확보된 바이러스로 PRMN 측정법 확립을 진행할 예정이다. 제5장 연구개발결과의 활용계획 ○ 본 연구과제를 통해 확립된 FRNT 중화항체 측정법을 기관 SOP 진단법으 로 등록 예정 ○ 본 연구과제를 통해 확립된 FRNT 중화항체 측정법에 관한 논문게제 추진 중 ○ 본 연구과제를 통해 확립된 중화항체 측정법을 이용해 홍역 또는 유행성이 하선염의 발생원인 규명 연구에 활용 제6장 연구의 주요 연구성과 당초목표 (전체) 1년차 (2015) 건수 건수 달성도(%) 1 1 1 100 지침,홍보물 등 발간물 1 1 1 100 계 2 2 2 100 성과지표명 건수 SCI 논문 산업 재산권 소계 비SCI 학술 국제 발표 국내 국내 국제 출원 등록 출원 등록 기술료 - 사업화 - 인력양성 - 연수지원 - 국제학술대회 초청강연 국내외 학술대회 수상 전문서적 등 저술활동 연구성과활용 (세미나,심포지움 등) 진단법/기술개발 치료기술개발 기존 진단/치료기술 개선 임상시험실시 생명연구자원 등록·기탁 과학자 교류 국제공동연구&사업 참여 정책제안&제도개선 DB구축&정보활용 제7장 기대성과 1. 기술적 측면 가. 홍역과 유행성이하선염 바이러스 외에 VDP 감염병 관련 대상으로의 중화항체 측정법 활용가능 - 민감도 높고, 수행과정이 간단한 중화항체 측정법의 개발 및 확립은 다 른 백신에 대한 평가 또는 감염 바이러스의 중화항체 조사에 유용하게 활용이 가능하다. 나. 확립된 중화항체 측정법으로 대규모의 중화항체가 측정 수행가능 - 홍역과 유행성이하선염의 유행 발생의 원인규명을 위한 중화항체가의 측정은 매우 중요한 근거제시를 위해 대규모의 중화항체가 측정이 가 능하다. 2. 정책적 측면 가. 백신의 효능평가 또는 백신 실패의 원인 파악 가능 - MMR 백신을 국가 차원에서 2회 접종을 시행하고 있고, 95% 이상의 높은 백신 접종률에도 불구하고 홍역과 유행성이하선염이 유행 발생이 지속 된다는 것은 백신의 효능 또는 백신 실패를 비롯한 여러 가지 원 인이 있다고 할수 있다. 따라서 민감도 높은 중화항체 측정법을 통한 혈청 중화 항체가를 측정하고 분석함으로써 백신의 효능 평가 및 백신 실패원인에 대한 판단을 가능하게 한다. 이는 국가 백신정책 계획 수립 반영 가능하다. 제8장 주요 연구 변경사항 가. 내부연구과제 연구비 변경 - 관련: 호흡기바이러스과-1524(2015.07.05.)호 나. 내부연구과제 참여연구원 - 관련: 호흡기바이러스과-2006(2015.09.02.)호 - 참여연구원의 퇴사와 신규연구원 채용, 업무분장 변경에 따른 참여연구원 변경 다. 내부연구과제 연구노트 기록자 변경 - 관련: 호흡기바이러스과-2115(2015.09.18.)호 - 참여연구원 변경 등의 사유로 연구노트 기록자 변경 과제번호 과제명 연구책임자 내용 2015-NG47002-00 홍역 및 유행성이하선염에 대한 중화항체 평가법 개발 및 개선 강혜지 연구노트 기록자 변경 제9장 연구비 집행 실적 내역 (단위: 천원) 총 연구비 집행내역(2015년) 비목 세 목 사용용도 총 계 인 건 비 인건비 잔액 121,507 28,493 35,000 21,887 13,113 3,200 1,817 1,383 38,200 23,704 14,496 0 0 0 96,300 89,957 6,343 0 0 0 4,000 0 4,000 0 0 0 10,000 6,688 3,312 0 0 0 1,000 728 272 500 430 70 111,800 97,803 13,997 연구관리비 0 0 0 소계 0 0 0 기타직보수(110-02): 보수, 시간외 수당 등 소계 연구기자재 및 시설비 재료비 및 전산처리비 시제품 제작비 국외여비 직 접 비 집행액 150,000 연금지급금(320-03): 사회보험 및 퇴직금 연구장비 ․재료비 예산액 수용비 및 수수료 연구활동비 기술정보활동비 연구개발서비스 활용비 등 국내여비 연구과제 추진비 연구환경유지비 소계 간 접 비 제10장 참여연구원 참여연구원 수 구분 성명 연구책임자 연구관급 연구사급 기능직 연구원 계 1 1 3 0 6 11 과학기술인 등록번호 소속 직급 전공 및 학위 전공 학위 책임자 강혜지 10989718 호흡기바 보건연구 감염면 이러스과 사 역학 박사 연구원 김성순 10120814 호흡기바 보건 바이러 이러스과 연구관 스학 연구원 김유진 10836361 연구원 양정선 연구원 역할 10 X 박사 연구관리 및 수행 5 ☓ 호흡기바 보건연구 미생물 이러스과 사 학 박사 연구지원 5 X 10171381 호흡기바 보건연구 수의학 이러스과 사 박사 연구지원 5 X 정향민 11269923 호흡기바 보건 보건학 이러스과 연구사 박사 수료 연구지원 5 ☓ 연구원 한영우 10147544 호흡기바 일반가급 바이러 스면역 이러스과 박사 연구수행 20 X 연구원 이한샘 10204715 호흡기바 일반가급 의과학 이러스과 박사 연구수행 5 X 연구원 허덕림 10921344 호흡기바 일반가급 면역학 이러스과 석사 연구수행 10 X 연구원 김수진 11170143 호흡기바 일반나급 생물학 이러스과 학사 연구수행 10 X 연구원 김아름 10178046 호흡기바 일반가급 생물학 이러스과 석사 연구수행 5 X 연구원 김주애 10824405 호흡기바 이러스과 일반가급 생물학 박사 연구수행 20 ○ 계 과제총괄 인건비 참여율 지급 여부 100% 제11장 참고문헌 1. 1995 annual report of communicable disease. 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