LABORATORIO DI
PREPARAZIONE ESTRATTIVA
E SINTETICA DEI FARMACI
Corso di Laurea in CTF
a.a. 2019-2020
OBIETTIVI del CORSO
 Proporre allo studente, sulla base di conoscenze basilari di
Chimica Organica e Inorganica, lo studio e le applicazioni delle
varie tecniche di sintesi organica (sintesi in soluzione, sintesi in
fase solida, Chimica Combinatoriale e sintesi mediante
applicazione delle Microonde), di separazione, purificazione e
caratterizzazione di composti di tipo peptidico ed eterociclico
ad interesse farmaceutico.
 Le lezioni sono integrate
da esercitazioni a posto singolo.
STRUMENTI DIDATTICI
— Computer, video proiezioni delle lezioni
— Le lezioni sono tenute mediante l’ausilio di video proiettore e il materiale
didattico sarà reperibile on-line sul sito www.docenti.unina.it e presso la
Biblioteca di Facoltà.
Libri di testo consigliati
V. Rogers, B. S. Furniss, A. J. Hannaford: Vogel Chimica Organica Pratica, CEA,
1988
V. Santagada e G. Caliendo: Peptidi e Peptidomimetici, Piccin, 2003
V. Santagada, G. Caliendo, E. Perissutti: Le microonde nella sintesi organica,
Piccin, 2008
Aggiornamenti ricavati dalla letteratura scientifica recente.
Commissione d’esame:
o
o
o
o
o
o
Prof. ssa Beatrice Severino
Prof. Vincenzo Santagada
Prof. Ferdinando Fiorino
Prof. Francesco Frecentese
Dott.ssa Elisa Magli
Dott.ssa Angela Corvino
Progettazione di una metodica sintetica
• Mezzi e sviluppo della ricerca bibliografica: banche dati
Istruzioni generali per il lavoro in laboratorio
P • La sicurezza nei laboratori di Chimica Organica
R  Apparecchiature e procedimenti di reazione
O • Giunti intercambiabili di vetro smerigliato
G • Sistemi con giunti intercambiabili di vetro smerigliato di uso
generale in chimica organica preparativa
R • Raffreddamento delle miscele di reazione
A • Riscaldamento delle miscele di reazione
M • Agitazione meccanica
• Apparecchiature per speciali tecniche di reazione
M (idrogenazione catalitica, reazioni sotto pressione, reazioni
A in atmosfera inerte)
Tecniche di isolamento e purificazione
• Filtrazione
• Ricristallizzazione
• Sublimazione
• Liofilizzazione
• Estrazione con solventi
• Essiccazione di liquidi e di soluzioni di composti organici in
solventi organici
• Distillazione
• Cromatografia
• Conservazione dei campioni
P
R
O
G
R
A
M Determinazione delle costanti fisiche
M Punto di fusione, punto di ebollizione, determinazione del peso
A molecolare, determinazione del potere ottico rotatorio,
determinazione della densità e dell'indice di rifrazione, metodi
spettroscopici.
Sintesi peptidica
Caratteristiche generali degli amminoacidi e dei
peptidi
P • Amminoacidi
• Purificazione ed isolamento degli amminoacidi
R Gruppi protettori nella sintesi peptidica
O • Protezione minima e/o globale
G • Scelta dei gruppi protettori
• Protezione dei gruppi: amminico, ammidico, idrazidico,
R guanidinico, imidazolico, indolico, carbossilico, ossidrilico,
A tiolico.
Metodi di attivazione e accoppiamento
M • Sintesi peptidica in soluzione: scelta dei gruppi protettori in a e
M in catena laterale.
• Resine scavenger e reagenti supportati
A • Metodi di accoppiamento: via carbodimmidi, via anidridi miste,
via esteri attivi, via azide, via alogenuri acilici, anidridi di
Leuchs, reagenti di accoppiamento e additivi ausiliari.
Sintesi peptidica in fase solida
• Approccio di Merrifield, approccio di Sheppard
• Resine batch per la sintesi via Fmoc• Resine batch per la sintesi via Boc
• Resine a flusso continuo
• Resine per la sintesi di peptidi ciclici
• Resine per la sintesi di frammenti peptidici protetti
P
R
O
G Ottimizzazione delle procedure nella SPPS
R Sequenze difficili
A Sintesi in fase solida convergente
M Peptidomimetici
Mappa di Ramachandran, Restrizioni conformazionali
M •• Strategie
per lo sviluppo di peptidomimetici: restrizioni locali e
A globali di conformazione, impiego di residui vincolati,
sostituzione del legame peptidico con isosteri del legame
ammidico.
Metodologie sintetiche avanzate
Green Chemistry
P • Principi della green chemistry
• Impiego di solventi alternativi: liquidi ionici, fluidi supercritici,
R solventi fluorurati.
O Click chemistry
G • Click reactions
Click chemistry in acqua
R •• Applicazioni
A Reazioni Domino e Reazioni multicomponente
M (MCR)
M Flow Chemistry
A
Chimica combinatoria
• Sintesi peptidica multipla: metodo tea-bag, metodo multipin,
tecnica mimotopica, sintesi spazialmente indirizzabile.
• Metodi di identificazione di composti attivi: analisi diretta,
metodo deconvolutivo, tagging.
• Sintesi mediante supporti solidi macroscopici
P
R
O
Applicazione delle microonde nella sintesi di
G composti biologicamente attivi
R • Caratteristiche e proprietà fisiche delle microonde
A • Apparecchiature per il riscaldamento a microonde
• Applicazione alla sintesi di peptidomimetici e derivati
M eterociclici
M • Reazioni di catalisi in trasferimento di fase
A
In aggiunta ai circa 60 peptidi già sul mercato, circa 140 sono in
sperimentazione clinica e 500 in fase avanzata di sperimentazione
preclinica. [Fosgerau and Hoffmann. Peptide therapeutics: current status and future
directions. Drug Discovery Today Volume 20, Number 1 January 2015 ]
Lau and Dunn, Therapeutic peptides: Historical perspectives, current development trends,
and future directions Bioorganic & Medicinal Chemistry 26 (2018) 2700–2707
Teduglutide
Linaclotide
Teduglutide è un peptide di 33 residui che differisce dal GLP-2 solo per un aa:
un’Ala è sostituita con una Gly. Questa sostituzione impedisce l’idrolisi da parte
della dipeptidil peptidasi e aumenta l’emivita da 7 minuti (GLP-2) a circa due ore.
L’attività biologica comprende la protezione della mucosa intestinale, l’aumento
della circolazione a livello intestinale, la riduzione della motilità gastro-intestinale
e della secrezione acida gastrica.
Peptide conjugates
Prodotti ottenuti senza
utilizzare gruppi
protettori
O
O
H2N HN
OH
O
Phe-Gly
NH O
O
Gly-Gly
O
HO
Phe-Phe
OH
H2N
H2N HN
O
H2N HN
HO
Gly-Phe
O
GP
NH
Phe
O
O
OH H2N
O
Gly
GP
Prodotti ottenuti
utilizzando adatti gruppi
protettori
O
H2N HN
OH
O
Phe-Gly
Pn
+
OH
N
H
peptide
coupling
Pn
OPc
H2N
N
H
Ala - Val
(A - V)
Val
Ala
H
N
H2N
peptide
coupling
(-H2O)
O
OPc
Ala - Val
(A - V)
Pn
Ph
O
Pn
OPc
selectively
remove Pn
O
- H2O
O
O
O
H
N
N
H
H
N
Ph
O
N
H
H
N
O
OPc
Repeat
O
OH
O
Phe (F)
Phe - Ala - Val
(F - A - V)
Steps sintetici necessari per la sintesi in
soluzione di un tripeptide
peptide
synthesis
FORMAZIONE DEL LEGAME PEPTIDICO
•La formazione dell’ammide da un’ammina e da un acido carbossilico è lenta.
•La reazione può essere accelerata se la funzione carbossilica viene attivata.
Es. Dicicloesilcarbodiimmide (DCC)
O
R
O
O
C6H11
O
NH
H
R
O
R
+
+
C6H11 N C N C6H11
H
(DCC)
¥¥
R'-NH2
C6H11
O
"activated acid"
O
R
R
O C
NH
HN
R'
+ C6H11
O
OH
+
OBn
H2N
O
Ala
cBz
Boc
peptide
coupling
O
R'
N
H
+
N
H
H
N
Ph
cBz
N
H
cBz
OH
O
Phe (F)
H
N
Ph
N
H
O
N
H
H
N
OBn
O
H2, Pd/C
OBn
C6H11
DCU
CF3CO2H
H2N
Ph
OBn
O
O
H2N
O
H
N
selectively
remove Nprotecting
group
O
O
N
H
O
Val
DCC
C6H11
Amide
DCC
N
H
O C
+N
N
R'
H
H
C6H11
C6H11
NH
Boc
cBz
NH
R
O C
N
C6H11 N C N C6H11
C6H11
O
N
H
H
N
O
Phe - Ala - Val
(F - A - V)
O
OH
Boc
Il polistirene è la base del supporto solido
Ph
styrene
initiator
+
polymerization
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
divinylbenzene
(crosslinker, ~1 %)
Il
Ph
Ph
supporto solido è un copolimero di stirene e divinilbenzene.
Quest’ultimo fornisce il cross-linking che rende il polimero più
rigido.
Funzionalizzazione del polistirene
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
H3COCH2Cl
ZnCl2
Ph
CH2Cl
Ph
Ph
Ph
Ph
Ph
Alcuni
anelli aromatici vengono funzionalizzati trattando il
supporto polimerico con clorometil-metiletere (ClCH2OCH3) e ZnCl2
(o SnCl4)
Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS)
O
H
N
_
O
CH2Cl
R
BOC
O
O
R
NH
BOC
La resina clorometilata è trattata con l’amminoacido C-terminale,
Boc-protetto. Si verifica una sostituzione nucleofila e
l’amminoacido Boc-protetto viene legato alla resina come estere.
Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS)
CF3CO2H
O
O
O
R
NH
BOC
O
NH2
R
 Il gruppo protettore Boc viene rimosso con HCl.
 Il coupling via DCC permette l’aggiunta del
secondo amminoacido.
 Rimozione del peptide dalla resina con HBr in TFA.
PROCEDURA DI MERRIFIELD
Merrifield
automatizzò il suo metodo in fase solida.
Nel 1962 sintetizzò un nonapeptide (la bradichinina) in
8 giorni con il 68% di resa.
Nel 1969 sintetizzò la ribonucleasi (124 amminoacidi).
369 reazioni; 11,391 steps
Ribonucleasi A- 124 amminoacidi, catalizza l’idrolisi dell’RNA
La sintesi in fase solida della RNase A:
•2.9 % resa totale
•Resa media dello step di coupling ~ 97%
His-119 A
LYS
GLN
SER
LYS
LYS
LEU
LYS
ASN
ILE
LYS
GLN
GLU
GLU
HIS
SER
SER
PRO
ALA
ASN
CYS
THR
TYR
ALA
GLY
THR
MET
SER
ARG
VAL
ASP
VAL
TYR
ASP
PRO
ASN
ASN
ALA ALA ALA LYS PHE
ASP SER SER THR SER
ASN TYR CYS ASN GLN
ASN LEU THR LYS ASP
ASN THR PHE VAL HIS
VAL GLN ALA VAL CYS
ALA CYS LYS ASN GLY
GLN SER TYR SER THR
CYS ARG GLU THR GLY
ASN CYS ALA TYR LYS
LYS HIS ILE ILE VAL
PRO TYR VAL PRO VAL
ASP ALA SER VAL
GLU
ALA
MET
ARG
GLU
SER
GLN
MET
SER
THR
ALA
HIS
ARG
ALA
MET
CYS
SER
GLN
THR
SER
SER
THR
CYS
PHE
His-12 A
His-12 B
His-119 B
pdb code: 1AFL
R. Bruce Merrifield, Rockefeller University, 1984 Nobel Prize in Chemistry:
“for his development of methodology for chemical synthesis on a solid matrix.”
Solid Phase Peptide Synthesis (SPPS)
FMOC
O
H2 N
DCC
O
O
FMOC
H
N
O
N
H
O
H2 N
O
N
H
O
Ph
DCC
FMOC
Ph
N
H
purify:
wash & filter
O
N
H
remove Nprotecting
group
OH
N
H
purify:
wash & filter
O
peptide
coupling
Val
FMOC
OH
N
H
H
N
O
purify:
wash & filter
O
N
H
O
O
O
Phe (F)
N
H
remove Nprotecting
group
HF
remove Nprotecting
group and cleave
from solid-support
purify by liquid
chromatograrphy
Ph
H
N
H2 N
or electrophoresis
O
O
N
H
OH
O
Fmoc