生物样本方法开发策略
Waters CG Marketing
蔡会霞
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1
生物分析方法开发的挑战
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2
生物分析挑战抽丝剥茧
CFDA生物等效性核查重点：
进样时间轴（进样是否连续，是否挑选
数据）
常见问题：
进样不连续，挑选数据，手动积分
Why？
标曲低浓度RSD偏差过大，实测样本
QC出控
蛋白沉淀的背景干扰
Why？
No1.基质效应
Why？
前处理干扰去除不彻底
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通常不监测，但是
不监测≠不存在
3
生物分析挑战罪魁祸首-磷脂
常见误区
 监测磷脂，并未发现背景很高
R：亲脂性的磷脂在柱上富集，进
样几针或几十针背景逐渐升高或突
然流出，并无规律可循
 方法验证“通过了”
R: 方法验证通常采用混合血，实
 血中产生基质效应的最主要成分；
际分析中样本磷脂组成差异更大
 含有亲水基团容易离子化；
 同位素内标可消除基质效应
 含有亲脂基团容易在色谱柱上富集；
R：研究表明，氘代内标和原型受
 分子量不定难以监测；
基质效应干扰程度不同
 蛋白沉淀无法去除
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我们的目标
完全去除磷脂，让方法开发更简单
4
磷脂的监测方法1:监测单独的MRM离子通道
Utilizing a triple quadrupole mass spectrometer, we monitor
individual MRM transitions to quantify levels of specific lipids.
Typical lysophospholipid
184
O
H
H3C
H3C
H3C
+
O
P
N
OH
O
O
CH3
-
O
O
We monitor MRM transitions 496 > 184 (C16) and 524 > 184 (C18)
Typical Phosphatidylcholine
184
We monitor MRM transitions 704 > 184, 758 > 184, and 806 > 184 (C30-38)
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5
磷脂的监测方法2:监控所有磷脂*
Polar Head Group
Fragment
Hydrophobic Chains
184
Monitoring 184 > 184 shows all phosphatidylcholines in the sample
and is a good measure of overall cleanliness.
Monitoring 1 MRM transition rather than 5 is a more efficient use of
duty cycle.
*Little, J., Wempe, M. and Buchanan, C. Journal of Chromatography B, 833 (2006) 219-230.
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6
不同前处理方法对于磷脂的去除
MRM of m/z 184-184
184.4 > 184.4 (Lipid 184)
2.00e8
%
100
0
LLE with 5%
NH4OH in MTBE
0.20
0.40
0.60
0.80
2.29
2.21
2.88
2.60
2.72 2.78
2.10
1.90
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
2.20
2.40
2.80
184.4 > 184.4 (Lipid 184)
2.00e8
100
LLE with MTBE
2.27
%
0
2.60
2.56 2.62 2.682.80
1.90
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
2.20
2.40
2.60
2.80
184.4 > 184.4 (Lipid 184)
2.00e8
1.90
1.77
184.4 > 184.4 (Lipid 184)
2.00e8
PPT
1.381.42
1.63 1.75
1.51
1.32
%
100
0
0.20
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0.40
0.60
0.80
1.00
COMPANY CONFIDENTIAL
1.20
1.40
1.60
1.80
1.96
2.00
2.21
2.20
2.84
2.40
2.60
2.80
Time
7
磷脂的堆积会导致基质效应以及不可预测的结果
使用蛋白沉淀法，磷脂会堆积在色谱
柱中（一批50个样品）
右图显示蛋白沉淀后第一针进样和最
后一针进样的磷脂色谱图和分析物色
谱图。可以看到磷脂的堆积以及和目
标物的共流出，这会造成基质效应，
并影响定量准确性。
Application Note: Rapid, Reliable Metabolite Ratio Evaluation
for MIST Assessments in Drug Discovery and Preclinical
Studies, 720004453en
Danaceau et al. 2014 Bioanalysis 6(6) 761-771
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8
全扫描 (100~1000)方式下的MS谱图
直接注入标样与经不同净化方式所得鼠血清基质的混合物
(未经色谱分离)
心得安Propranolol
100
260
%
Scan ES+
6.00 e7
标样溶液
157
0
100
Scan ES+
6.00 e7
260
%
固相萃取 (<10%离子抑制)
130 166 203 239
0
100
Scan ES+
6.00 e7
143
%
液液萃取 (40-60%离子抑制)
260
138
298 303 327351
159 184
0
105
100
106
244
% 140 146
176 203
217
260
0
100
Scan ES+
6.00 e7
蛋白质沉淀 (80-90% 离子抑制)
163
200
518 546
319 325 350
300
373
400
566590
459
500
600
701
780 805
700
800
900
m/z
1000
消除样品基质中的干扰物可大大减少对样品离子化的干扰。
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9
前处理技术的挑战
 我到底用哪种前处理方法最好？
 我不知道怎么做SPE 的方法开发？
 我没有SPE 操作经验？
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10
生物样本前处理方法决策树
样品是否
需要浓缩？
否
是
OStro 板
OASIS PRiME HLB
.通过式SPE
. 三步法
.无需方法开发
. 流速更快
.去除磷脂/蛋白
.去除磷脂/色素
Oasis PRiME MCX/
Oasis MAX/WAX/WCX
.2*4方法学
. 高选择性
.进一步提升灵敏度
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11
生物样本前处理方法决策树
第一步：Ostro 96孔板/升级版PPT法
将Ostro 放置到收集板上,加入 50-200µL 血
浆到孔内
用力加入3倍体积的 2% 甲酸乙腈溶液,
(不推荐使用甲醇),用排枪抽吸三次以混匀
利用正压或真空装置过滤样本,滤液分析
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12
Ostro 96孔板-回收率&除磷脂效果
残留磷脂水平
为各种分析物获得最佳回收率
(6 replicates in data set)
18000000
16000000
14000000
12000000
10000000
8000000
6000000
4000000
2000000
0
Ostro
Competitor 1
Competitor 2
PPT
400000
100
90
350000
% Recovery
80
300000
250000
200000
70
60
Ostro
50
LLE
40
SSLE
30
150000
20
10
100000
COMPANY CONFIDENTIAL
)
(b
id
n
az
m
Br
o
N
ifl
um
ic
ep
Ac
fe
ro
to
p
Ke
am
(a
(z
)
)
a)
2
69
T6
ni
lfo
su
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a)
(s
id
Ac
c
an
pr
ne
ty
lp
SSLE
Py
re
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LLE
N
-a
ce
Ostro
ro
ca
0
Pr
o
in
am
ol
id
ol
e
(b
(b
)
)
0
50000
13
不同前处理方法对于磷脂的去除
MRM of m/z 184-184
184.4 > 184.4 (Lipid 184)
2.00e8
%
100
0
LLE with 5%
NH4OH in MTBE
0.20
0.40
0.60
0.80
2.29
2.21
2.88
2.60
2.72 2.78
2.10
1.90
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
2.20
2.40
LLE with MTBE
%
2.27
2.56 2.62 2.682.80
1.90
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
1.40
1.60
1.80
2.00
2.20
2.40
2.60
2.80
184.4 > 184.4 (Lipid 184)
2.00e8
Ostro™
%
100
2.80
184.4 > 184.4 (Lipid 184)
2.00e8
100
0
2.60
1.90 1.96
1.77
0
0.40
0.60
0.80
1.00
1.20
0
PPT
0.20
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1.40
1.60
1.80
2.00
2.20
2.40
2.60
2.80
184.4 > 184.4 (Lipid 184)
2.00e8
1.381.42
1.63 1.75
1.51
1.32
%
100
0.20
0.40
0.60
0.80
1.00
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1.20
1.40
1.60
1.80
1.96
2.00
2.21
2.20
2.84
2.40
2.60
2.80
Time
14
磷脂堆积
gradient
end
100
1.99
%
PPT last
injection
2.13 2.28
end
organic hold
758.4 > 184.4 (Lipid 758)
3.19e6
0
0.25
100
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.75
758.4 > 184.4 (Lipid 758)
3.19e6
PPT 1st
injection
%
2.50
0
0.25
100
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.75
758.4 > 184.4 (Lipid 758)
3.19e6
Ostro last
injection
%
2.50
0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
%
2.75
758.4 > 184.4 (Lipid 758)
3.19e6
Ostro 1st
injection
100
2.50
0
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
1.50
1.75
2.00
2.25
2.50
2.75
Time
0.5 minute hold at high % organic does not fully elute PLs,
resulting in PL build-up and unpredictable elution in subsequent injections
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15
举例：药物及其代谢物研究
关键词：
 通过去除血浆中蛋白和磷脂，不会吸附样品中的待测物
 可检测到更多的代谢物，掌握全局
Ostro+XP=快速色谱分析，快速柱平衡，降低基质效应，提高方法稳定性
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16
举例：磷脂组学—Ostro+BEH Hilic
 Ostro下接2ml 收集板
 取100ul 血浆上样到Ostro板
 加入800ul 乙醇，并用枪混匀10X
 负压装置加压到-15Hg，收集洗脱液
 重复第三、第四步，合并流通液
 加入800ul 4.5:4.5:1 氯仿：甲醇：TEA混合溶液
 负压装置加压到-15Hg，收集洗脱液
 重复第六、第七步，合并洗脱液
 分别将流通液和洗脱液挥干，
用200ul
氯仿：甲醇 1：1复溶、进样
到BEH Hilic色谱柱分析
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17
生物样本前处理方法决策树
样品是否
需要浓缩？
否
是
OStro 板
OASIS PRiME HLB
.通过式SPE
. 三步法
.无需方法开发
. 流速更快
.去除磷脂/蛋白
.去除磷脂/色素
Oasis PRiME MCX/
Oasis MAX/WAX/WCX
.2*4方法学
. 高选择性
.进一步提升灵敏度
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18
Oasis PRiME……
PROCESS
ROBUSTNESS
improvements in…
MATRIX EFFECTS
EASE of USE
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19
Oasis PRiME HLB :更简单的方法流程
传统的流程
简化的
100% 甲醇
活化
不怕流干
100% 水
平衡
上样
上样
上样
5% 甲醇水
5% 甲醇水
清洗
100% 甲醇
90：10 乙腈/甲醇
洗脱
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20
更快的流速
 更快速不管是对于小柱还是96孔板，更不容于出现堵柱情况
Matrix
Device Format
Oasis PRiME HLB
Speed Increase
1:1 Diluted Plasma
1:1 Diluted Plasma
1:1 Diluted Urine
1:1 Diluted Urine
1:1 Diluted Milk
1:1 Diluted Milk
µElution Plate
1cc / 30mg Cartridge
30 mg Plate
10 mg Plate
3cc / 60 mg Cartridge
6cc / 200 mg Cartridge
2 - 3X Faster
4X Faster
6X Faster
2X Faster
1 - 2X Faster
2 - 3X Faster
Loading compared to Oasis HLB with 4 inch Hg, N=4
FASTER flows across multiple devices and sample matrices
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21
Oasis PRiME HLB 3步法流程示例:
测试物性质
Name
pKa
Log P
1B
叠氮胸苷 (AZT)
9.68
0.05
2B
7-羟基香豆素
7.8
1.6
Gradient in sunscreen, absorb UV
3A
非那西丁
2.2
1.6
Pain, fever reducer
4N
倍他米松
--
1.1
Anti-inflammatory and
immunosuppressive
5B
普罗替林
8.2
4.4
Antidepressant
6A
阿普唑仑
2.4
4.9
Panic and anxiety disorders
7B
阿米替林
9.7
4.8
Antidepressant
8A
萘普生
4.2
3.2
Pain, fever reducer
9B
普萘洛尔
9.5
2.5
Hypertension
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Comments
艾滋病毒/艾滋病的抗逆转录病毒药物
Drug Panel Mixture:
Highly variable hydrophobicities, wide pKa range
and Log Ps
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22
Oasis PRiME HLB 3步法流程示例: 色谱图
8
 叠氮胸苷 (AZT)
9
 倍他米松
 普罗替林
3
1
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2
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 7-羟基香豆素
 非那西丁
 阿普唑仑
 阿米替林
4
5
6
7
 萘普生
 普萘洛尔
23
Oasis PRiME HLB3步法流程示例:回收率和基质效应
Luckycat
1cc plasma 500-500
回收率
Luckycat
1cc ME
基质效应
120
100
80
60
40
20
0
-20
3-Step Protocol CONCLUSION
HIGH analyte recoveries (>80%) and
LOW (<15%) matrix effects
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24
Oasis PRiME HLB): 血浆中内源性类固醇
Oasis PRiME HLB µElution plate, N=4
流程
 150 μL 血浆 (10 ng/mL)
 300 μL 4:1 MeOH:ZnSO4 (89g/L) 蛋白沉淀
 3220 rcf离心10min
 上清液用900 μL 4% H3PO4
处理后的样品上样(2次)
2 x 200 μL of 25% MeOH清洗
2 x 25 μL 90:10 ACN:MeOH洗脱
Modified
Oasis PRiME Protocol
50 μL 25% MeOH 稀释
进样7.5 μL
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25
Oasis PRiME HLB 回收率和基质效应
80%血浆中内源性类固醇
60%
Matrix
Effects
Recovery
40%
20%
0%
-20%
Recovery
Matrix Effects
-40%
Cortisol
Adione
Mean
S.D.
%RSD
Mean
S.D.
皮质醇
72.7%
3.1%
4.2%
-19.0%
3.1%
雄烯二酮
72.5%
1.9%
2.7%
-6.9%
2.2%
17-羟孕酮
71.5%
1.9%
2.6%
-4.5%
1.3%
Mean
-10.1%
平均基质效应10%
17-OHP
较低的标准偏差(3.1% or less)证明 Oasis PRiME HLB的提取和净化效果
的一致性
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26
Oasis PRiME HLB vs. PPT
磷脂去除
血浆中内源性类固醇
100
%
Oasis PRiME HLB
PPT 流程:
150 μL 血浆 (10 ng/mL)
加入300 μL 4:1 MeOH:ZnSO4
3220 rcf 离心10min
0
2.00
100
4.00
6.00
8.00
磷脂峰面积
2.52
2.81
PPT
22152370
PRiME HLB
690579
%
PPT
Oasis PRiME HLB 表现优异:
去除97%磷脂 vs. PPT
0
Time
2.00
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4.00
6.00
COMPANY CONFIDENTIAL
8.00
27
生物样本前处理方法决策树
样品是否
需要浓
缩？
否
是
OStro 板
OASIS PRiME HLB
.通过式SPE
. 三步法
.无需方法开发
. 流速更快
.去除磷脂/蛋白
.去除磷脂/色素
Oasis PRiME MCX/
Oasis MAX/WAX/WCX
.2*4方法学
. 高选择性
. 提高回收率与灵敏度
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28
Oasis® 2x4 方法
对于碱:
pKa 2-10
使用Oasis® MCX
对于酸
对于强碱
对于强酸
pKa 2-8
pKa >10
pKa <1.0
®
使用 Oasis® WAX 使用 Oasis® WCX 使用 Oasis MAX
提取流程 1
样品制备
样品制备
上样
上样
清洗:
2% 甲酸
清洗:
5% 氨水
洗脱 1:
中性化合物100% 甲醇
洗脱1:
酸性化合物 100% 甲醇
洗脱2:
含5% 氨水 的甲醇
碱
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提取流程 2
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强酸
碱性化合物
洗脱 2:
含2% 甲酸的甲醇
强碱
酸
29
碱性化合物离子化:离子交换机理的关键
碱
(质子接受体)
B
(未离子化)
50%
0%
100%
+
BH
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+ OH
(离子化)
@ pKb*
Low pH
High pH
pKa = pH at which 50% of the analyte molecules in
solution are charged (ionized) and 50% are un-ionized
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-
50%
100%
0%
* pKa of conjugate acid
30
酸性化合物离子化:离子交换机理的关键
酸(质子供给体)
HA
(未离子化)
50%
100%
0%
+
H
+
A
(离子化)
@ pKa
Low pH
High pH
-
50%
0%
100%
pKa = pH at which 50% of the analyte molecules in
solution are charged (ionized) and 50% are un-ionized
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31
举例：离子交换模式对灵敏度的提升
 基质：人血浆
 目标物：罂粟碱类，苯二氮卓类，兴奋剂类，抗癫痫类，合成卡西酮等65种药
物
 对比方案
– Oasis PRiME HLB
o
Eluate 90/10 ACN/MeOH
o
Eluate 80/20 ACN/MeOH
o
Eluate 50/50 ACN/MeOH
– Oasis PRiME MCX
o
3-Step Protocol
o
4-Step Protocol
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32
仪器条件
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33
Oasis PRiME HLB 的结果讨论
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34
Oasis PRiME MCX 结果讨论
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35
磷脂去除效果综合评估
 Oasis PRiME MCX 对碱性药物的萃取与传统的MCX相当，磷脂去除效率
则可高达98%。
 Oasis PRiME HLB 通用流程的磷脂去除效果优秀，但对极性及可电离
碱性化合物的回收率结果一般。
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36
生物样本前处理方法决策树
样品是否
需要浓
缩？
否
是
OStro 板
OASIS PRiME HLB
.通过式SPE
. 三步法
.无需方法开发
. 流速更快
.去除磷脂/蛋白
.去除磷脂/色素
Oasis PRiME MCX/
Oasis MAX/WAX/WCX
.2*4方法学
. 高选择性
.进一步提升灵敏度
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37
生物样本中多肽类药物的前处理方法
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38
选择合适的前处理技术
 查阅了200 篇关于蛋白定量的文献2
 最常见的样品预处理技术
– 反相SPE (RP SPE) 和蛋白沉淀法(PPT) 非常普遍
– 液液萃取法LLE) 使用的很少
 我们的实验经验
– 2 个肽添加到人血浆中，浓度是100 ng/mL
– RP SPE, PPT, LLE
– 标准: 高的回收率(>80%)
低的基质效应(<15%)
2
Van den Broek, I., Sparidans, R., Schellens, J., and Beijnen, J. J. Chromatogr. B, 2008, 872, 1-22.
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39
结果
% 回收率
% 基质效应
50
40
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
30
20
10
0
-10
-20
*
-40
Reversedphase SPE
PPT
LLE
Bivalirudin
*
-30
-50
Reversedphase SPE
PPT
LLE
Desmopressin
< 1% recovery for LLE
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40
混合模式的吸附剂
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Oasis 2 x 4 方法流程
Bases:
pKa 2-10
Oasis MCX
Strong
Acids:
Strong
Bases:
pKa <1.0
pKa >10
Oasis WAX
Oasis WCX
Protocol 1
Protocol 2
Load Pretreated Sample
Load Pretreated Sample
Wash 1:
Wash 1:
2% Formic acid
5% NH4OH
Wash 2 or Elute 1:
Wash 2 or Elute 1:
100% MeOH
100% MeOH
Acids:
pKa 2-8
Oasis MAX
2 Elution steps:
Elute 1 = reversed-phase
Elute 2:
5% NH4OH in 60:40 ACN:MeOH
Bases
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Strong Acids
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2% HCOOH in 60:40
ACN:MeOH
Strong Bases
Elute 2 = ion exchange
Acids
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利用小分子化合物流程，得出的结果
% SPE 回收率，人血浆
Desmopressin
Bivalirudin
100
100
90
90
80
80
70
60
Elute 2
Elute 1
50
40
70
60
Elute 2
Elute 1
50
40
30
20
30
20
10
0
10
0
Oasis® Oasis® Oasis® Oasis®
MCX WAX MAX WCX
Oasis® Oasis® Oasis® Oasis®
MCX WAX MAX WCX
 回收率不足以满足灵敏度的需求
 回收率备份成了反相和离子交换两部分
 需要进一步优化
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43
利用小分子化合物流程，得出的结果
% SPE 回收率，人血浆
Desmopressin
Bivalirudin
100
100
90
90
80
80
70
60
Elute 2
Elute 1
50
40
70
60
Elute 2
Elute 1
50
40
30
20
30
20
10
0
10
0
Oasis® Oasis® Oasis® Oasis®
MCX WAX MAX WCX
Oasis® Oasis® Oasis® Oasis®
MCX WAX MAX WCX
 Oasis® MAX and Oasis® WCX 展现了最大希望
 1 个流程对于两个吸附剂
 最终洗脱液要与流动相兼容
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Oasis 2 x 4 流程到多肽流程
Acids:
Strong Bases:
pKa 2-8
pKa >10
Oasis MAX
Oasis WCX
Strong Bases:
pKa >10
Oasis WCX
Original
Load Pretreated Sample
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pKa 2-8
Oasis MAX
Optimized
Load: dilute plasma with
4% H3PO4
Wash 1:
Wash 1:
5% NH4OH
5% NH4OH
Wash 2 or Elute 1:
Wash 2:
100% MeOH
20% ACN
Elute 2: 5% NH4OH in 60:40
ACN:MeOH
Elution:
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Acids:
1% TFA in 75/25 ACN/H2O
45
Oasis® PST SPE Protocol for Peptides
Strong Bases:
Acids:
Oasis WCX
Oasis MAX
pKa 2-8
pKa >10
PST Protocol
Load: dilute plasma with
4% H3PO4
让WCX 及多肽带电
Wash 1:
5% NH4OH
Wash 2:
洗脱干扰物质
20% ACN
酸加入确保溶解度，
降低有机溶剂确保肽
不要沉淀
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Elution:
1% TFA in 75/25 ACN/H2O
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稀释后上反相分析
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实例分析：
MW
pI
# of
Residues
Octreotide
1019
9.3
8
40.8
Angiotensin II
1046
7.35
8
38.3
Desmopressin
1069
8.6
9
16.8
Vasopressin
1084
9.1
9
7.6
Goserelin
1270
7.3
10
31.7
Angiotensin I
1296
7.51
10
56.2
Somatostatin
1638
10.4
14
52.6
Neurotensin
1673
8.93
13
44.4
Bivalirudin
2180
3.87
20
46.2
BNP
3464
12
32
15.9
Teriparatide
4118
9.1
34
90.4
Enfuvirtide
4492
4.06
36
155.9
Peptide
HPLC
Index*
*更大的数字= 更疏水
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利用多肽流程后的结果
% SPE Recovery
120
100
80
Oasis MAX
60
Oasis WCX
40
20
0
不同的肽的结果比较良好:通用流程可以覆盖75%的肽
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进一步优化BNP, Enfuvirtide and Somatostatin保证WCX 及肽处于带电
% SPE Recovery
120
100
状态 使用pH 6 缓冲盐
碱性环境不稳定: 改变预处理
在wash 1 步骤，代替
方法及 wash 步骤变为
用碱代替酸，来打0.1%TFA
5% NH4OH
破结合力
80
Screening Protocol
Modified Protocol
60
40
20
0
这三种的肽的方法经过优化后，回收率结果都很好
所有的基质效应小于15%
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Oasis® µElution萃取板技术：
解决了肽提取过程中的难题
Oasis® µElution plate technology
 无需挥干即有浓缩富集作用，最多可以富集15倍
– 肽定量分析通常需要对样品浓缩才能满足LOQ的要求
 避免了N2挥干过程中肽的丢失
– 有些肽热不稳定
– 肽非常容易发生非特异性吸附
 速度: 96个样品在30min内即可完成
每个样品的处理时间<20 s
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μElution Plate Design
2 mg of Oasis®
Sorbent
All these features enable a 25µL elution volume
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Why Oasis µElution Format?
Sample Enrichment: Up to a 15X Concentration
0.5 ng/mL
risperidone
100
MCX µElution plate
411.2 > 191.2
2.17e6
%
15X concentration
0
0.10
100
0.20
0.30
0.40
0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
1.10
1.20
1.30
1.40
411.2 > 191.2
2.17e6
MCX 10 mg plate
%
No concentration
0
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0.10
0.20
0.30
0.40
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0.50
0.60
0.70
0.80
0.90
1.00
1.10
1.20
1.30
1.40
Time
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正压96-孔固相萃取装置上进行SPE实验(高通量生
化分析)
 正压模式
 孔与孔之间流速一致
 高粘度样品回收率重现性好
 提高工作效率
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负压96-孔固相萃取装置上进行SPE实验
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Questions
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