SOP: CD34+ Purification by CD34 MicroBead kit (Miltenyi Biotec, cat# 130-046-702)
1. Equipment, Materials, and Reagents
1. Equipment
1.1.
BSC
1.2.
Pipette aid and pipette boy
1.3.
Centrifuge
1.4.
Hematocytometer
1.5.
Flow cytometer
2. Materials
2.1.
Conical 15 and 50 mL centrifuge tubes (Eppendorf)
2.2.
0.22 μm pore size syringe filter (Thermo Scientific, cat. no. 155-0045)
2.3.
Magnetic column (LS column) (Mentinyi)
2.4.
30, 40 and 70 μm cell strainer (Nylon mesh) (BD falcon)
3. Reagents and cell
3.1.
Microbead CD34+ kit (Mentinyi)
3.2.
Fetal bovine serum (FBS, Merck Mittipore)
3.3.
DPBS (HyClone, USA)
3.4.
EDTA
3.5.
DMSO
3.6.
MACs buffer: Prepare solution containing phosphate-buffered saline (PBS), pH
7.2, 0.5% bovine serum albumin (BSA), and 2 mM EDTA
2. Methods
2.1. Isolation of PBMC fraction
2.1.1.Dilute sample with 1X DPBS (1:1)
Note: ตัวอย่างเลือดที่ได้มาเอาเข้าตู้เย็น 4˚C ในห้อง Clean Room จากนั้นเติมเลือดลงไปใน Conical
Tubes 50 mL แล้วเติม 1X DPBS (1:1) ในหลอดที่มีตัวอย่างเลือด
2.1.2.Over-layer diluted sample on 15 mL of Ficoll or Isoprep solution
Note: เติม Ficol 15 mL/tube ใน Conical Tubes 50 mL แล้วนำตัวอย่างเลือดที่ dilute แล้วเติมลงไป
ในหลอดที่บรรจุ Ficol โดยเอียงหลอดและค่อยๆเติม ค่อยๆปล่อยตัวอย่างเลือดบน Ficol หากปล่อยแรง
ไปตัวอย่างเลือดจะลงไปปนข้างล่าง Ficol ได้ เรียกวิธีนี้ว่า Over-layer
Note: ตัวอย่างเลือดที่ยังเหลืออยู่ในหลอด ล้างด้วย 1X DPBS 1 mL อีกรอบก่อนใส่ใน Microcentrifuge
Tubes 1.5 mL นำไป spin down แล้วดูดส่วน supernatant ทิ้ง พันหลอดด้วย parafilm นำหลอดที่มีตัว
อย่างเลือดนี้เก็บที่ตู้เย็น -80˚C ตัวอย่างเลือดที่เก็บถ้าจะนำมาใช้จริงก็ล้างอีก 1 หรือ 2 ก่อน
2.1.3.Centrifugation 400xg (no break), 30 min, RT (25˚C หรือ 19˚C ก็ได้) ***Discard
supernatant
Note: ACCEL(ขึ้น) = 6 DECEL (ลง) = 0
2.1.4.Take PBMC fraction and wash cell pellet with 1X DPBS, 300xg (with break), 10
min, RT (note1)
Note: ใช้ Transfer Pipets ดูดชั้น Plasma ทิ้งไป แล้วดูดชั้น PBMC ใส่ใน Conical Tubes 50 mL แล้ว
ล้าง PBMC ด้วย 1X DPBS (2:1) จากนั้นดูด supernatant ทิ้ง
Note: ACCEL(ขึ้น) = 9 DECEL (ลง) = 9
Note: ถ้าหมุนเหวี่ยงแล้ว PBMC มีสีเหลืองหมายความว่าดูด plasma เยอะ แต่ถ้า PBMC มีสีขาวขุ่นหมาย
ความว่าดูด ficol เยอะ ล้าง PBMC ต่อจนกว่าจะใส
2.1.5.Resuspend pellet with 1 mL of DPBS and count cells viability with trypan blue
2.2. Labelling CD34+ cells
2.2.1.Filter cells via 40 or 70 μm cell strainer and wash cells by MACs buffer (note 2)
Note: วาง cell stainer บน Conical Tubes 50 mL แล้วปิเปตตัวอย่างเลือดลงไปใน cell stainer จากนั้น
ล้างหลอดที่ใส่ตัวอย่างเลือดด้วย Macs buffer แล้วปิเปตลงไปใน cell stainer เติม MacsBuffer ลงไป
ในหลอดที่ใส่ตัวอย่างเลือดจนกว่าจะล้างหลอดหมด คือให้แน่ใจว่าในหลอดไม่มีตัวอย่างเลือดแล้ว
Note: 70 μm cell stainer ใช้สำหรับกรองตัวอย่างเลือดที่มีก้อนเลือด โดยใช้ 70 μm cell strainer แล้ว
ตามด้วย 40 μm cell strainer ส่วนใหญ่ 70 μm cell strainer จะใช้กับตัวอย่างเลือดของคนปกติ ส่วน 40
μm cell strainer จะใช้กับตัวอย่างเลือดของผู้ป่วย thalassemia (ตัวอย่างเลือดเจาะจากไขกระดูก)
2.2.2.Centrifuge at 300xg, 3 min ***Discard supernatant
2.2.3.Count cells again and separate cells 1*108 cells/tube, spin to pack cells and
remove solution
Note: แบ่งเซลล์ลงไปใน Microcentrifuge Tubes 5 mL
2.2.4.Resuspend cells with 300 μL of MACs buffer
2.2.5.Labelling CD34+ cells, in 5 mL centrifuge tube, incubate in refrigerator (2-8°C) for
30 min
300 μL of cell suspension
100 μL of FcR blocking
100 μL of CD34 microbead (mix well before use)
Note: FcR blocking และ CD34 microbead ควร mix ด้วย vortex ก่อน เมื่อเติมสารครบทุกอย่างแล้ว
นำหลอดมาพัน parafilm แล้ว vortex ให้เข้ากันอีกรอบก่อนนำไป spin down ให้สารตกลงมา แล้วนำไป
แช่ตู้เย็น 4˚C ในห้อง Clean Room นาน 30 นาที
2.2.6.Wash cells by adding 5 mL of MACs buffer for up to 108 cells and centrifuge at
300xg for 5 min, discard supernatant
Note: หลังจากที่หมุนเหวี่ยงแล้ว ส่วนของ supernatant จะมีสีเหลืองของ CD34 microbead ดูดส่วนของ
supernatant ทิ้ง ให้เหลือเฉพาะส่วนของตะกอนสีแดง
2.2.7.Resuspend cells in 500 μL of MACs buffer, then take 2*106 cells for flow
cytometry#1 (before purify CD34+) *** Count cells again (Pre-sorting)
2.3. Isolation of CD34+ cells
2.3.1.Preparing LS column by priming with 3 mL of MACs buffer
Note: ***หันจงอยของคอลัมน์ออกด้านนอก เอาคอลัมน์ไปติดกับ midiMACs
2.3.2.Filter sample via 30 μM nylon mesh (optional)
Note: วาง pre-seperation filter บนคอลัมน์เพื่อเป็นการกรองเซลล์เม็ดเลือดแดง หรือไขมันซึ่งเราไม่ต้อง
การไม่ให้ผ่านคอลัมน์ เพราะจะทำให้คอลัมน์ตัน
2.3.3.Load sample 500 μL and collect flow-through containing unlabeled cells
2.3.4.Wash with 3 mL of MACs buffer 3 times and collect unlabeled cells that pass
through and combine with the flow-through from step 2.3.3. flow cytometry #2
2.3.5.Remove column and place on 15 mL conical tube
2.3.6.Pipette 5 mL of MACs buffer to elute cells and immediately flush out the
magnetically labeled cells by firmly pushing the plunger into the column
Note: เติม 5 mL Macs buffer ลงไปในคอลัม์แล้วผลักให้ Macs buffer ไหลผ่านคอลัมน์อย่างรวดเร็วและ
แรงๆ เรียกว่าการ flush out
Notes
1. Wash cell pellet until clear supernatant
2. Degas buffer before use
Note: วิธีเตรียม MacsBuffer (ความเข้มข้น 0.5% ในปริมาตร 250 mL)
1. ชั่งผง BSA 1.25 g ใน Conical Tubes 50 mL
2. ละลายผง BSA โดยใช้ 1X DPBS 40 mL มันจะละลายยาก ต้องใช้ vortex ช่วยในการละลาย
3. เทสารละลาย BSA เข้าไปใน Syringe เพื่อทำการกรอง
4. ยังมีสารละลาย BSA เหลืออยู่ในหลอด ให้ทำการเติม 1X DPBS 20 mL ลงไปเพื่อทำการล้างหลอด
5. จากนั้นปิเปตสารละลาย BSA ที่เหลืออยู่ในหลอดเข้าไปใน Syringe เพื่อทำการกรอง
6. เติม 1X DPBS ลงไปในสารละลาย BSA ที่เตรียมจนได้ปริมาตร 250 mL
Note: มี stock EDTA ความเข้มข้น 0.5M (หรือ 500 mM) ต้องการ EDTA ความเข้มข้น 2 mM ในปริมาตร
250 mL -> 500 x V = 2 x 250 -> V = 1 mL
7. เติม 0.5M EDTA ปริมาตร 1 mL ลงไปใน MacsBuffer