Meetrapport LDH
NB: er horen eenheden bij alle berekeningen !!!
LDH1 De activiteitsmetingen van lactaat dehydrogenase
Wat zijn isoenzymen?
Iso-enzymen zijn eiwitten die dezelfde functie uitvoeren maar een andere aminozuur volgorde
hebben. Ze worden gecodeert door verschillende genen in het DNA en verschillen vaak in de
manier
waarop
ze gereguleerd
zijn, maar ook in de VMAX en KM.
Wat
is het
doel van
de LDH1 experimenten?
De invloed van pH en het effect van oxamaat op de enzymactiviteit van LDH uit runderhart
bepalen. Door de specifieke activiteit en het turnover getal onder de verschillende reactieonstandigheden te berekenen.
Hoe werkt een spectrofotometer?
Met een spectrofotometer meet je de absorptie van licht door moleculen. Er wordt licht door
het cuvet met de te meten oplossing gestuurd. De moleculen in de oplossing absorberen een
deel van het licht en het restant licht valt op de detector. De detector verteld vervolgens
hoeveel licht er op gevallen is en dus hoeveel geabsorbeerd is.
Voer de activiteitsmetingen uit
2. Geef de absorptieverandering per minuut voor de vier uitgevoerde activiteitsmetingen.
Reactie 1
0.0042*60= 0.252
Reactie 2
Reactie 3
0.0016*60= 0.096
0.0011*60= 0.066
Reactie 4
0.0002*60= 0.012
3. Bereken uit de absorptiedaling de initiële activiteit van LDH onder de experimentele
omstandigheden van de vier uitgevoerde activiteitsmetingen (in μmol.min-1.mg-1: de
specifieke activiteit).
Reactie 1
Reactie 2
Reactie 3
Reactie 4
40.0 μmol*min-1*mg-1
15.2 μmol*min-1*mg-1
10.5 μmol*min-1*mg-1
1.90 μmol*min-1*mg-1
TIP: Voer deze berekening stap voor stap uit (bij voorkeur op papier), en bepaal na elke
stap wat de eenheid is na je berekening.
4. Bereken het turnovergetal van LDH per subunit (in s-1)
Reactie 1
169.5 s-1
Reactie 2
Reactie 3
70.2 s-1
99.4 s-1
1
Reactie 4
21.2 s-1
5. Vergelijk de metingen van pyruvaat en pyruvaat + oxamaat bij pH 7.0. Is het mogelijk
om op basis van bovenstaande uitgerekende gegevens te bepalen of oxamaat remt
en zo ja of oxamaat een competitieve dan wel een niet-competitieve remmer is?
Oxamaat is een remmer, maar je kan niet bepalen of het een competitieve of nietcompetitieve remmer is.
6. Als dit niet mogelijk is, welke experimenten moet men dan uitvoeren om te kunnen
bepalen wat voor type remmer oxamaat is?
Een michaelis menten experiment met verschillende hoeveelheden substraat tegen
een vaste hoeveelheid van de remmer. Hieruit kan je dan afleiden of de verhouding
veel uitmaakt bij de remming door naar de vmax te kijken.
LDH2 Het bepalen van de bindingsconstante van NADH aan
LDH
Wat is het doel van de LDH2 experimenten?
De dissociatieconstante berekenen van NADH aan LDH door fluorescentie metingen.
Waarom meet je fluorescentie in een hoek van 90 graden t.o.v. het excitatielicht?
Om te zorgen dat er geen excitatielicht voor fluorescentie wordt aangezien is er een hoek van
90 graden zodat het excitatielicht niet direct op de detector valt.
NADH fluorescentie in buffer en ethanol, het effect van de binding aan LDH en het effect van
oxamaat
meting
medium
[NADH]
μM
[LDH]
μM
1
2
3
4
5
6
buffer
buffer
buffer
buffer
ethanol
ethanol
4
4
4
4
2.14
2.14
-
[oxamaat] fluorescentie
Netto
μM
FL
fluorescentie
100
-
2
41.25
68.87
73.95
78.55
26.99
77.84
27.62
32.7
37.3
50.85
1. Geef aan waarom de NADH fluorescentie in ethanol hoger is dan in water (zie
Theoriedeel Fluorescentie).
Ethanol zorgt voor een meer apolair milieu. Oftewel een lagere polariteit dan water.
Vul in de tabel de gecorrigeerde NADH fluorescentie bij oplopende lactaat dehydrogenase
concentraties, de geschatte maximale fluorescentie (Fluormax) en de berekende Kd in (zie
Excel-sheet BB, in twee cijfers achter de komma).
[NADH]
(μM)
LDH
(ml)
[LDH]
(μM)
NADH
Fluor
cor
Kd
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
4
0
0.01
0.03
0.06
0.10
0.15
0.21
0.28
0.36
0.45
0.55
0.66
0.78
0
0.71
2.14
4.27
7.12
10.68
14.95
19.94
25.63
32.04
39.16
46.99
55.54
41.25
53.22
73.95
96.44
114.39
126.13
133.4
138.01
141.06
143.17
144.69
145.81
146.67
2.266297
2.238412
2.249495
2.247867
2.247262
2.2472
2.246456
2.246327
2.246245
2.244919
2.24706
2.246231
2.266297
Maximale fluorescentie:
110
2. Toon de grafiek van fluorescentie tegen de LDH concentratie.
3
Fluorescence (AE)
Fluorescentie waarden, [NADH] = 4 µM
160
140
120
100
80
60
40
20
0
0
10
20
30
Toegevoegde [LDH] (µM)
4
40
50
60
3. Wat is de relatie tussen de fluorescentie en de concentratie LDH-NADH-complex?
Hoe hoger de concentratie van het LDH-NADH complex, hoe hoger de fluorescentie
is. Die is een rechtevenredig verband.
4. Beschrijf hoe je uit de toename van de NADH-fluorescentie kunt berekenen wat de
concentraties zijn van het LDH-NADH complex en van vrij LDH en NADH.
De totale concentratie NADH (4µM) is gelijk aan de concentratie LDH-NADH
complex bij de maximale gecorrigeerde fluorescentie.
De fractie NADH die een complex heeft gevormd, krijg je door: Fgecorrigeerd/Fmax
Dit vermenigvuldigd met de totale concentratie NADH geeft de complex
concentratie.
[NADH-LDH] = (Fg/Fmax)/[NADH]toegevoegd
De concentratie vrije LDH en NADH bereken je door de startconcentraties te
nemen en hier de complexconcentraties van af te trekken.
[LDH]vrij = [LDH]toegevoegd – [NADH-LDH]
[NADH]vrij = [NADH]toegevoegd – [NADH-LDH]
5. Geef de berekende Kd met bijbehorende eenheid.
Kd = 2.2 µM
5
LDH3 Het bepalen van de standaard vrije energieverandering van
de
reductie van pyruvaat tot lactaat door NADH
Een uitgebreidere beschrijving/uitleg van deze berekeningen vind je op
BlackBoard. Open de pagina (LDH3: Het bepalen van de standaard vrije energie
verandering van de reductie van pyruvaat tot lactaat door NADH) op je PC!
1. Geef aan wat de standaard vrije energie voor (bio)chemische reacties betekent en
verklaar waarom de vrije energie pH afhankelijk is voor de omzetting van pyruvaat
in lactaat (zie ook Powerpoints 5 + 6, Biochemie deel MIB-10306).
De standaard vrije energie (ΔG0): elk systeem streeft bij een constante druk naar een zo
laag mogelijke vrije energie. De vrije energie is opgebouwd uit twee termen:
- Enthalpie (H, warmte inhoud van de moleculen)
- Entropie (S, energie verspreiding)
G = H – TS
Om pyruvaat om te zetten in lactaat is H+ nodig. De pH staat in verband met hoeveel [H+] er
aanwezig is. H+ is één van de reactanten, dus als de pH veranderd, veranderd de [H+] en dus
de evenwichtsconstante K. De K heeft vervolgens weer invloed op de vrije energie.
2. Geef de absorptiewaarden voor de reacties 1, 3 en 4 vóór het begin van de reactie.
Reactie 1
Reactie 3
Reactie 4
0.586
0.675
0.0
3. Geef de
absorptiewaarden voor de reacties 1, 3, en 4 aan het eind van de reactie, na het
bereiken van evenwicht.
Reactie 1
Reactie 3
Reactie 4
0.0424
0.1
0.0985
4. Bereken uit de beginabsorptie van NADH en de absorptieveranderingen na
toevoegen van LDH de concentraties NADH, pyruvaat, lactaat en NAD + in evenwicht
bij pH 7 en pH 8.5 (experimenten 1, 3 en 4). Gebruik hierbij de wet van Lambert-Beer
en ook de door de assistent bepaalde beginconcentratie pyruvaat.
[Pyruvaat]
[Lactaat]
6
[NADH]
[NAD+]
Reactie 1
0.0137
0.08627
0.00673
0.08627
Reactie 3
0.0889
0.09111
0.01587
0.09111
Reactie 4
0.01563
9.984
0.01563
0.08437
5. Bereken met behulp van de Excel sheet (BB) de standaard vrije energie en de
evenwichtsconstante van de reacties bij pH 7.0 en 8.5.
Reactie 1
Reactie 3
Reactie 4
ΔG0 (kcal.mol-1)
Keq
-2.56
8.07E+01
-3.04
1.86E+02
-6.75
1.09E+05
Klopt de theorie dat een reactie alleen zal plaatsvinden als de vrije energie negatief is?
(Zie ook de door de practicumleiding berekende bepaalde ΔG-waarden vlak na het begin
van de reactie (grijze vakjes in de Excel file voor berekening ΔG). Wat is je verklaring ?
Ja, de reacties verlopen doordat er gestreven wordt naar een zo laag mogelijke vrije
energie.
6. Probeer een verklaring te vinden wanneer de experimenteel bepaalde standaard
vrije energie niet in overeenstemming is met de literatuurwaarde. Denk hierbij aan de
zuiverheid van de gebruikte reagentia, de nauwkeurigheid waarmee de reagentia
kunnen worden toegevoegd in- relatie tot de eindconcentraties van de reactanten.
Geef ook aan welk van de drie experimenten (pH 7.0 en 8.5 gestart met pyruvaat en
NADH of het experiment bij pH 8.5 gestart met lactaat en NAD+) waarschijnlijk de
betrouwbaarste waarde op zal leveren.
7
Er kan bij het pipetteren fouten gemaakt zijn en meetfouten door de apparatuur.
Bij experiment 4 is de concentratie lactaat veel groter, waardoor kleine afwijkingen
minder grote gevolgen hebben voor de concentratie NADH.
LDH4 Werkingsmechanisme en structuur LDH
NB: alle aminozuren hebben ook een nummer !!!
Vraag 1
Is het katalytisch centrum direct vanuit de oplossing bereikbaar voor de substraten van
het enzym, als je kijkt naar het enzym-substraat complex (ldh-2) ?
Van NADH wel, want die zit aan de buitenkant van het eiwit. Oxomaat is niet te
bereiken.
Vraag 2
a. Beschrijf het effect van de binding van NADH en oxamaat op de conformatie van het
eiwit.
De conformatie verandert met als gevolg dat het substraat als het ware omarmt wordt
door het enzym.
b. Welk gedeelte van het eiwit verandert het meeste van conformatie (geef aminozuren
inclusief nummer) ?
ALA96 tot SER105
Vraag 3
Wat is de afstand tussen de C4 van NADH en de C1 van oxamaat? Zou deze afstand
klein genoeg zijn voor de overdracht van een hydride ? Verklaar je antwoord.
8
3.20 Å
Ja, want de electronenwolken van de twee carbonatomen overlapen. Die zijn namelijk
2.00 Å
Vraag 4
a. Via welke interacties binden moleculen aan eiwitten (enzymen)?
Via non-covalenten bindingen zoals:
• Electrostatic (or ionogenic) interactions
• Hydrogen bridges
• Vanderwaals interactions
• Hydrophobic interactions
b. Welke aminozuurresiduen in LDH zijn direct betrokken bij de binding van/hebben
direct interactie met oxamaat (pyruvaat)?
VAL31, ILE249, ASP166, HIS193, ARG106, ARG169
c. Tot welke categorie(n) zou je deze binding(en) rekenen?
Vanderwaals krachten, ionogene interacties en hydrofobe interacties
d. Welke binding zou de meeste vrije energie geven, en waarom (geef het aminozuur,
met nummer) ? Verklaar je antwoord.
HIS193, want die kan 2 waterstofbruggen aangaan.
Vraag 5
Welk aminozuurresidu in het katalytisch centrum is in staat een proton te leveren of op
te nemen bij neutrale pH ? Verklaar je antwoord.
9
Neutrale pH = 7.00, Histidine heeft een pKa van 9.09 en van 6.04. Deze liggen beiden
in de buurt van 7, dus kan het protonen opnemen en afstaan
Vraag 6 a
De pKa van het aminozuurresidu dat een proton zou kunnen leveren is mogelijk te laag
om bij een pH ≥ 7.5 voldoende geprotoneerd te zijn. Welk aminozuurresidu is in staat
de pKa van het proton leverende aminozuurresidu naar hogere waarden te verschuiven
? En waarom ?
ASP166, want negatief geladen, dus kan protonen aantrekken.
Vraag 6 b
Verklaar nu ook de lagere reactiesnelheid bij een pH van 8,5 (zie je LDH1 meting) ?
Door een hogere pH komt een deel van de protonen niet meer los door het kleine pKa
verschil. Dus de reactie gaat dan langzamer.
Vraag 7
Welke aminozuurresiduen zouden de overgangstoestand stabiliseren? Anders gezegd,
welke aminozuurresiduen induceren een polarisatie in de carbonylbinding van
pyruvaat/oxamaat ?
Positief geladen aminozuren: ARG106 en HIS193
Vraag 8
Zijn er in de structuur apolaire aminozuurresiduen te vinden in het bindingsoppervlak
van NADH? Deze micro-omgeving van NADH op het enzymoppervlak verklaart de
toename van de NADH fluorescentie door binding.
10
Nee, ze zijn polair
Vraag 9
Kun je een verklaring geven voor de afname van de NADH fluorescentie nadat oxamaat
is gebonden aan het NADH-LDH complex? Kijk ook eens naar je fluorescentie
metingen met NADH, LDH en oxamaat (LDH-2, tabel 1)
NADH gaat op NAD+ lijken, waardoor die fluorecentie verliest
11