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MICROSCOPÍA II
Univ. Gabrieli Saraí Marca Quenta
C.I. 9884824
Facultad de Ciencias Farmacéuticas y Bioquímicas, UMSA
Biología y Genética
Ing. Mónica Sequeiros
5 de abril de 2021
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Tabla de Contenido
Resumen ......................................................................................................................3
Objetivos .....................................................................................................................3
Hipótesis......................................................................................................................3
Desarrollo ....................................................................................................................3
Resultados ...................................................................................................................9
Conclusiones ............................................................................................................. 11
Anexos ...................................................................................................................... 11
Cuestionario .............................................................................................................. 13
Bibliografía ............................................................................................................... 17
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Resumen
En el presente informe se hablara de las recomendaciones y técnicas que se deben seguir para
obtener una correcta imagen en la observación del microscopio. Las primeras imágenes que se
obtengan serán de una pequeña gota de sangre, y a través de un video observamos las células
componentes de la sangre para poder identificarlas correctamente. Además, aprendimos sobre la
utilización de colorantes para mejorar el contraste de la imagen obtenida como el azul de
metileno y lugol.
Objetivos
Objetivo general
 Realizar correctamente el uso del microscopio óptico al momento de observar las
muestras.
Objetivos específicos
 Conocer el manejo del objetivo de inmersión.
 Observar la preparación de un frotis de sangre para observar con el objetivo de
inmersión.
 Observar a través de videos la tinción de muestras para su estudio.
Hipótesis
H1= El objetivo de inmersión tiene mayor aumento, pero menor campo de visión.
H0= El objetivo de inmersión tiene menor aumento, pero mayor campo de visión.
Desarrollo
Imagen del microscopio
Se debe tomar en consideración que la imagen de un microscopio óptico se encuentro
siempre "cabeza abajo" y si se mueve la preparación hacia un lado se observa que se desplaza en
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sentido opuesto, estas características se encuentran siempre presentes en un microscopio óptico y
debemos acostumbrarnos hasta encontrarlo normal.
La imagen invertida en el microscopio se da por:
Las lentes convexas, que permiten modificar el tamaño de las imágenes que las atraviesan
(esto ocurre al atravesar la lente la luz), invierten naturalmente su disposición, de tal manera que
la nueva imagen se forma invertida si la comparamos con la original.
Es una propiedad o característica física de las lentes. Y este fenómeno lo podemos
corregir colocando combinaciones de lentes, de tal manera que se vuelva a invertir la imagen.
Por ejemplo estas combinaciones de lentes se utilizan en el caso de los binoculares.
Enfoque
El enfoque de una preparación debe iniciarse siempre con el objetivo de menor aumento
ya que este quedan siempre más alejados de la platina; se debe subir la preparación con el
tornillo macrométrico hasta el tope siempre mirando por un lado del microscopio para evitar que
choque el objetivo con la preparación, después mirando a través del ocular se empieza a bajar
lentamente la platina hasta localizar el foco, es decir donde la preparación se observa
nítidamente.
La mayor parte de los microscopios actuales están pre focalizados, lo que indica que al
quedar en foco la lupa, los demás objetivos quedaran también enfocados, y solo se requiere de un
pequeño ajuste del tornillo micrométrico para ver nítidamente la imagen
Empleo del objetivo de inmersión en aceite (x100)
Se deben utilizar preparaciones tenidas completamente secas. Para esto se pone una
pequeña gota de aceite de inmersión sobre la porción que se va a examinar. Preferentemente se
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deben utilizar aceites sintéticos que no se secan, en vez de aceite de madera de cedro que se seca
rápidamente.
a. Bajar totalmente la platina.
b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la zona
que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y el de
40x. d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la gota de
aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la lente.
g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo de
inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo de
accidente es muy grande.
h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver a usar
el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea enfocar otro
campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el objetivo de
menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la preparación de la
platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición de observación.
j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica.
Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
Campo de observación: El campo de observación visto a través del objetivo del microscopio es
inversamente proporcional al aumento – por ejemplo, a mayor aumento menor campo de
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observación. Los objetivos parafocales y paracentrados facilitan el cambio entre aumentos (y
campos de observación) sin pérdida de foco o sin perder el objeto en altos aumentos.
Observación microscópica
Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrir a:
-Preparación húmeda. Se realiza colocando una gota de agua al espécimen utilizando un
cubreobjetos. Se observa directamente.
- Preparación fijada. Mediante calor o agentes químicos y después se tiñen mediante diferentes
técnicas. Estas preparaciones se observan sin cubreobjetos y habitualmente, con objetivos de
inmersión.
Utilización del microscopio
1. Colocar una preparación.
2. Abrir el diafragma de la fuente de luz al máximo.
3. Abrir el diafragma del condensador al máximo y llevar el condensador al máximo de su
trayectoria.
4. Colocar el objetivo de menor aumento ej. 10x.
5. Prender la fuente de luz y ajustarla a una intensidad confortable.
6. Ajustar los binoculares a la distancia interpupilar y ajustar el foco de cada ocular si el
microscopio lo permite.
7. Enfocar la preparación.
8. Gradualmente cerrar el diafragma de la fuente de luz hasta ver una imagen poligonal.
9. Bajar el condensador hasta que los bordes del polígono se vean nítidos.
10. Ajustar el enfoque.
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11. Si la imagen poligonal no está en el centro, centrarla utilizando los tornillos del condensador.
12. Abrir el diafragma de la fuente de luz hasta que la poligonal apenas salga del campo, no
tocarlo más. No tocar más la altura del condensador.
13. Elegir el contraste óptimo ajustando el diafragma del condensador.
14. Verificar la iluminación quitando los oculares y mirando por el tubo hacia los objetivos
ajustar el diafragma a 2/3 abierto. (2/3 del campo iluminado).
15. Para cambiar el contraste regular el diafragma del condensador y para ajustar el brillo
modificar la intensidad de la fuente luminosa o colocar filtros. No cambiar la distancia del
condensador.
Al cambiar de objetivo solo modificar el diafragma de la fuente de luz y el diafragma del
condensador a la apertura del objetivo.
Tinción
Son técnicas que permiten observar especímenes en función de la capacidad de los mismos para
retener (o no) determinadas sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del
colorante.
Tipos de colorantes
Catiónicos. Son sustancias que tienen carga positiva. Penetran en el interior de las células y las
tiñen. Ejemplos: Azul de metileno, Cristal violeta, Safranina.
Aniónicos. Con carga negativa. No penetran en el interior celular, de modo que no tiñen las
células, sino el entorno. En este caso se habla de tinción negativa. Ejemplos: Eosina, Nigrosina.
Liposolubles. Se mezclan con los lípidos celulares y los tiñen. Ejemplo: Negro sudán.
Las tinciones pueden realizarse siguiente distintos métodos.
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Simples. Utilizan un solo colorante. Se basan en el hecho de que las células tienen una
composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma
diferente frente a un colorante. El colorante tiñe las células (Azul de metileno, Safranina) o no
(Nigrosina).
Diferenciada. Se basan en el hecho de que distintos tipos de células tienen distinta composición
química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a una tinción, lo que permite
clasificar los microorganismos en diferentes grupos, según su capacidad de tinción. Hay dos
tinciones de importancia taxonómica y medica: la tinción de Gram y la de ácido-alcohol
resistencia (de Ziehl-Neelsen). Estas tinciones utilizan más de un colorante.
Las GRAM POSITIVAS cuando realizar el procedimiento de tincion de gram, puede ver
que luego de añadir lugol, el colorante cristal violeta se mantiene en el interior de la bacteria. Las
GRAM NEGATIVAS al añadir lugol pierden la coloracion del cristal violeta y si le añades otro
colorante, por ejemplo la safranina, adoptaran ese color.
Tinción de las extensiones de sangre periférica:
El frotis, una vez seco, se fija y se tiñe mediante colorantes adecuados. Generalmente, en
los laboratorios hematológicos se emplean colorantes basados en la tinción de Romanowsky,
basado en una combinación de eosina y azul de metileno.
Con la tinción de los elementos formes de la sangre se pueden distinguir los siguientes
aspectos morfológicos de las células:
1.- La forma, dimensión y contorno de los hematíes (de color rosa pálido), leucocitos
(células nucleadas) y plaquetas (pequeños corpúsculos).
2.- El núcleo: de color púrpura
3.- El citoplasma: de color azulado o gris en los linfocitos y monocitos.
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4.- Granulaciones: mezcla de colores pardos (neutrófilos), anaranajadas (eosinófilos) y
azul oscuro (basófilos).
Técnica para observar la muestra de sangre
a. Con la lanceta estéril realizar una punción en un pulgar.
b. Depositar una gota de sangre en la parte central de un portaobjetos.
c. Colocar un portaobjetos como indica el dibujo y deslizarlo sobre toda la superficie del porta de
manera que se pueda obtener una fina película de sangre. La extensión que se realiza sobre un
portaobjetos de una muestra o cultivo se denomina frotis
d. Método Panóptico Rápido. Colocar el porta objeto con el frotis de sangre dentro la cubeta de
fijación que contiene Metanol por tres segundos, sacar sobre un papel toalla. Escurrir bien el
reactivo antes de introducirlo en el siguiente baño.
e. Introducir luego en el frasco de tinción que contiene Eosina por un periodo de cuatro
segundos. Escurrir bien el reactivo antes de introducirlo en el siguiente baño.
f. Finalmente introducir el porta objeto en azul de metileno por 2 segundos, dejar escurrir, g.
Llevar a la cubeta y realizar un ligero lavado con la piseta.
h. Dejar que el alcohol se evapore de la preparación.
i. Una vez que se encuentre completamente seco, observe con el objetivo 4X, identifique el área
de estudio, luego proceda a colocar unas gotas de aceite de inmersión, posterior lleve el objetivo
100X para lograr una buena visualización.
j. Observar al microscopio, analizar y registrar en su hoja de campo. La técnica Wright o
Panóptico Rápido, permite hacer una óptima visualización de eritrocitos (célula animal).
Resultados
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Como no pudimos observar sangre, como material utilizamos una pequeña gota de
yogurt. Practicamos la preparación de la muestra en el portaobjetos e hicimos el frotis con el
cubreobjetos. Posteriormente mandamos fotos a través del jamboard.
Finalmente observamos y distinguimos las diferentes células de la sangre
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Conclusiones
Los microscopios poseen una importancia enorme en la investigación científica, gracias a
ellos hemos descubierto miles de cosas que no se pueden ver a simple vista. Así por ejemplo, se
observó a través de las imágenes de anteriores años, las muestras de sangre y sus respectivas
células. Por eso es importante realizar un correcto uso del microscopio para trabajar con mayor
eficacia.
Anexos
Figura 1-. Disposición del líquido y las placas para una muestra
Fuente: www.academia.edu
Figura 2-. Frotis
Fuente: GUIA DE LABORATORIO "BIOLOGÍA Y GENÉTICA"
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Figuras 3-. Colorantes
Fuente: https://jamboard.google.com/d/1opmqRZMMzTGHDj08TM8tXtK0iqfInyBVp0Mzo3NxehI/viewer?f=0
Figuras 4 y 5-. Sangre en el microscopio
Fuente: https://image.slidesharecdn.com
https://naturzientziak.files.wordpress.com/2012/04/microscopio.jpg
Figura 6-. Células de la sangre
Fuente: https://mmegias.webs.uvigo.es/a-imagenes-grandes/imagenes/sangre-todo.jpg
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Cuestionario
CUESTIONARIO 1- APLICACIÓN ÓPTICA EN BIOLOGÍA
1. A que se llama longitud de onda de la luz
R. Es la distancia entre las dos crestas o valles sucesivos de la onda de luz
2. Describa el espectro solar
R. En el espacio, el espectro solar se parece más a la radiación de un cuerpo negro y
cubre diferentes longitudes de onda.
3. Que es el índice de refracción absoluto
R. El índice de refracción absoluto se define como la relación entre la velocidad de la luz
en el vacío y en el medio dado.
4. Que es el índice de refracción relativo
R. Cuando la luz pasa de un medio (que no sea el vacío o el aire) a otro medio
5. Anote los índices de refracción relativo
a) AIRE: 1.000294
b) AGUA: 1.333
c) ACEITE: 1,51
d) ACEITE DE CEDRON: 1.516
e) VIDRIO: 1.50
6. Que se entiende por reflexión total
R. Es el fenómeno que se produce cuando un rayo de luz atraviesa un medio de índice de
refracción n2 menor que el índice de refracción n1 en el que éste se encuentra, se refracta
de tal modo que no es capaz de atravesar la superficie entre ambos medios reflejándose
completamente.
7. Que se entiende por polarización de la luz
R. La polarización, en Física, se define como un fenómeno causado por la naturaleza
ondulatoria de la radiación electromagnética. La luz del sol viaja a través del vacío para
llegar a la Tierra, que es un ejemplo de onda electromagnética. Estas ondas se denominan
ondas electromagnéticas porque se forman cuando un campo eléctrico interactúa con un
campo magnético.
CUESTIONARIO 2-EL MICROSCOPIO COMPUESTO
1. Haga un resumen del perfeccionamiento del microscopio compuesto
R. Los microscopios de luz datan de al menos 1595, cuando Zacharias Jansen (15801638) de Holanda inventó un microscopio de luz compuesto, uno que usaba dos lentes,
con el segundo lente magnificando aún más la imagen producida por el primero. Sus
microscopios eran tubos colapsados que se usaban como un telescopio al revés y
producían aumentos de hasta nueve veces (9x).
Antony van Leeuwenhoek (1632-1723) inventó un microscopio simple (de una lente)
alrededor de 1670 que aumentaba hasta 200x y alcanzaba el doble de resolución que los
mejores microscopios compuestos de su época, principalmente porque fabricó mejores
lentes. Mientras que otros fabricaban lentes mediante métodos tales como aplastar vidrio
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fundido entre trozos de madera, Leeuwenhoek los hacía esmerilando y puliendo
cuidadosamente el vidrio sólido. Así, se convirtió en el primero en ver células
individuales, incluidas bacterias, protozoos, células musculares y espermatozoides.
El inglés Robert Hooke (1635-1703) perfeccionó aún más el microscopio compuesto,
agregando características tales como un escenario para sostener la muestra, un iluminador
y controles de enfoque grueso y fino. Hasta 1800, los microscopios compuestos
diseñados por Hooke y otros estaban limitados a aumentos de 30x a 50x, y sus imágenes
exhibían bordes borrosos (aberración esférica) y distorsiones parecidas a un arco iris
(aberración cromática). La mejora más significativa en la óptica del microscopio se logró
en el siglo XIX, cuando los socios comerciales Carl Zeiss (1816-1888) y Ernst Abbe
(1840-1905) agregaron el condensador de la subplaca y desarrollaron lentes superiores
que redujeron en gran medida la aberración cromática y esférica, al tiempo que permitían
resolución enormemente mejorada y mayor aumento.
Que es y que objeto tiene el Charriot
R. Marco que sostiene el portaobjetos para poder moverse (generalmente con dos
perillas) que funciona para ubicar la parte deseada del preparado bajo la lente.
Cuál es el motivo de que el tubo tenga siempre una longitud de 160mm
R. Para la estandarización este valor fue fijado en 160 mm por la Royal Microscopical
Society en el siglo XIX.
Que es el sistema de Cardán del espejo
R. Los soportes de cardán tienen ejes de rotación (cabeceo y guiñada) que se cruzan en el
centro del plano de la superficie de la óptica para que la longitud del haz no cambie
durante el ajuste. Los verdaderos soportes de cardán siempre tienen ejes de rotación que
son verdaderos (paralelos y ortogonales) a la superficie de montaje. Esta configuración
elimina la diafonía entre los ajustes.
A que se llama Abertura Numérica
R. Medida de la eficiencia del objetivo de un microscopio; es el producto del seno de la
mitad del ángulo de abertura, multiplicado por el índice de refracción más bajo de
cualquier medio, entre el objetivo y la muestra
Cuanto es el aumento total de un Microscopio con objetivo 10x y ocular 15x
R. 150x
Donde se forma la imagen final en el microscopio
R. En el ocular.
Que aplicación en el microscopio tiene la reflexión total
R. En general, la iluminación de reflexión interna total tiene beneficios potenciales en
cualquier aplicación que requiera imágenes de estructuras diminutas o moléculas
individuales en muestras que tengan un gran número de fluoróforos ubicados fuera del
plano óptico de interés, como moléculas en solución en movimiento browniano, vesículas
sometidas a endocitosis o exocitosis o tráfico de una sola proteína en las células. Tales
muestras típicamente exhiben un aumento dramático en la relación señal / ruido debido a
la restricción del grosor de la región de excitación.
CUESTIONARIO 3-MANEJO DEL MICROSCOPIO
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1. Que es el poder de penetración en el microscopio
R. Es la capacidad que tiene un microscopio de poder realizar una observación
simultánea de dos o más planos de la muestra.
2. Que es el poder de definición
R. Es la capacidad que tiene el microscopio de brindar una imagen nítida y definida del
objeto.
3. Que es el poder de resolución
R. Es la capacidad de las lentes de distinguir con nitidez dos puntos situados muy
próximos entre sí.
4. Qué características tiene la imagen formada en el microscopio compuesto
R. La imagen que forma el microscopio compuesto es virtual, invertida y muy
amplificada.
5. ¿Al cambiar un objetivo de menor por otro de mayor aumento, el área que se
observa es mayor o menor?
R. Mayor aumento, menor campo visual.
CUESTIONARIO 4-OTROS TIPOS DE MICROSCOPIOS
1. Cuál es la ventaja de que el estéreo microscópico tenga dos objetivos y dos oculares
R. Utiliza dos trayectorias ópticas independientes con dos objetivos y dos oculares para
proporcionar ángulos de visión ligeramente diferentes a los ojos izquierdo y derecho. De
esta forma permite una visualización tridimensional de la muestra.
2. Cuál es el fundamento del microscopio de contraste de fases
R. La microscopía de contraste de fase imparte contraste con el material biológico no
manchado mediante la transformación de las diferencias de fase de la luz causadas por
diferencias en el índice refractar entre los componentes celulares en diferencias en la
amplitud de la luz, es decir, las áreas claras y oscuras, que se pueden observar.
3. Explique la diferencia que hay en la formación de la imagen en el microscopio de
rastreo y el electrónico
R. La principal diferencia entre microscopio electrónico de barrido y microscopio
electrónico de transmisión es que el microscopio electrónico de barrido crea una imagen
al detectar electrones reflejados o desprendidos, mientras que el microscopio electrónico
de transmisión utiliza electrones transmitidos (electrones que pasan a través de la
muestra) para crear una imagen.
4. Cuanto es el aumento máximo en el microscopio electrónico
R. La ampliación de un microscopio electrónico puede ser de hasta 10.000.000x, con una
resolución de 50 picometros (0,05 nanómetros).
5. Haga un resumen de las principales analogías y diferencias que existen entre la
microscopia que acaba de estudiar
El microscopio óptico utiliza luz visible, mientras que el electrónico emplea
electrones, que tienen longitudes de onda más cortas que permiten un mayor
aumento.
La lente del microscopio óptico es de vidrio. En cambio del microscopio
electrónico es electromagnética.
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El tamaño de los microscopios electrónicos es mucho más grandes que los
ópticos.
Las imágenes del microscopio electrónico no tienen color, mientras que las del
óptico si son a color.
Los microscopios ópticos son los microscopios más simples y antiguos que
existen en comparación con el modelo de electrones más nuevo.
Los modelos ópticos son más baratos y fáciles de mantener que el microscopio
electrónico.
Los microscopios ópticos tienen un poder de aumento máximo de 1,000, en
comparación con el mejor poder de resolución del microscopio electrónico que
puede alcanzar 1,000,000 de veces.
En general, los microscopios electrónicos ofrecen una imagen más detallada en
comparación con los microscopios ópticos.
CUESTIONARIO 5-MICROTÉCNICA
1. Qué objetivo tiene la deshidratación de una pieza y como se la realiza
R. La deshidratación resulta imprescindible para evitar que el agua de la muestra
contamine el microscopio y afecte el vacío requerido para su funcionamiento. Hay dos
métodos generales para deshidratar tejidos. El más común es el reemplazamiento gradual
de agua con un solvente orgánico por transferencia del tejido a través de soluciones de
concentraciones crecientes (etanol, acetona)-referido como una serie de deshidratación
graduada. Un método menos común en microscopía de campo claro es una
deshidratación rápida utilizando un reactivo orgánico (metil celosolve, dimetoxipropano,
trietil fosfato). Durante la deshidratación rápida, el agua del tejido es reemplazada
rápidamente, sin el daño por tensión superficial que puede ir asociado con los alcoholes o
la acetona.
2. Por qué es necesario reducir las piezas a laminas delgadas para su observación
R. La muestra tiene que ser muy delgado para permitir que la luz pase a través de fuerza
y sin distorsión y para permitir una hoja de cubierta para sentarse de manera uniforme
sobre la muestra.
3. Cite ejemplos de fijadores oxidantes y reductores
R. a) Oxidantes: el tetraóxido de osmio (ácido ósmico), el bicromato de potasio, ácido
crómico, bicloruro de mercurio o “sublimado corrosivo”, ácido pícrico, ácido acético.
b) Reductores: el formaldehído, el glutaraldehído, el alcohol etílico, el alcohol metílico.
4. Que es el poder mordiente de un fijador
R. Algunos fijadores, además de fijar, modifican químicamente a ciertas estructuras
celulares para que posteriormente puedan unirse a ellas los colorantes. Este este tipo de
modificación química se le denomina efecto mordiente.
5. Como explica el fenómeno de retención de colorantes en una preparación
R. La utilización de los colorantes en los procesos de identificación en microbiología se
fundamenta en las propiedades fisicoquímicas de estas sustancias. En el campo de la
física, la óptica explica cómo todos los objetos son observables dependiendo de las
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longitudes de onda que se absorben y se transmiten dentro del denominado “espectro
visible”. Dichas transiciones se deben, a su vez, a los compuestos químicos y a los
movimientos electrónicos dentro de los átomos. Así mismo, cuando interacciona un
colorante con una célula o un tejido, ocurren reacciones que dependen de grupos
químicos funcionales denominados cromóforos y auxocromos.
6. Qué características tiene la preparación que hizo en su practica
R. En esta preparación se muestran los glóbulos blancos, glóbulos rojos y plaquetas
coloreadas por Wright o Panóptico Rápido.
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