lOMoARcPSD|4091009
BIC10306 - Samenvatting Practical Biological Chemistry
Practical Biological Chemistry (Wageningen University & Research)
StuDocu is not sponsored or endorsed by any college or university
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
BIC10306
Biochemie
BLOK 1 eiwitfunctie op moleculair niveau
1.1
Opfrisser Michaelis-Menten kinetiek
Michealis-menten kinetiek is een van de meest bekende en gebruikte modellen voor enzym kinetiek.
Het model beschrijft de enzymatische reactie van een enzym (E), een substraat (S) en het product (P).
De binding van het enzym aan het substraat is een reversible reactie waarbij het enzym-substraat
complex ES wordt gevormd.
Het michaelis-menten model beschrijft deze enzymatische reactie middels een formule die de
snelheid v, de verandering van product in de tijd, relateert aan de concentratie van het substraat
V0 is de initiële snelheid, de snelheid meteen na het begin van de reactie, en S de concentratie
substraat. Vmax is de maximale snelheid die het systeem kan bereiken onder maximale substraat
concentraties, deze is o.a. afhankelijk van de hoeveelheid enzym. De michaelis-menten constante K M
is de concentratie substraat waarbij de helft van de maximale snelheid wordt bereikt. K m is
omgekeerd evenredig met de affiniteit van het substraat voor het enzym. Een lage K m = hoge
affiniteit, een hoge Km = lage affiniteit, hij is onafhankelijk van de hoeveelheid enzym.
Vmax en Km kunnen experimenteel bepaald worden door de initiële reactie snelheid bij verschillende
substraat concentratie (en constante enzymconcentratie) te meten. De initiële snelheid wordt
gemeten aan het beging van de reactie, hier is de hoeveelheid substraat nog niet limiterend.
Het belang van kinetische parameters.
Indien je een enzym wilt bestuderen doormiddel van het product (substraat) dat gevormd wordt is
het belangrijk dat er een lineair verband bestaat tussen de hoeveelheid enzym en de hoeveelheid
meetbaar product (of substraat). Immers als er twee keer zoveel enzym is, moet er ook twee keer
zoveel enzym activiteit gemeten worden. Dit is niet zo triviaal als je misschien denkt. Immers als er
weinig substraat aanwezig is zal er competitie voor substraat optreden en kunnen niet alle enzymen
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
een substraat molecuul binden. Verhoog je in zo'n geval de hoeveelheid enzym dan zul je nauwelijks
meer product vormen. Je moet dus onder verzadigende substraat concentratie meten (oftewel er
moet voldoende substraat zijn). Het toevoegen van een overmaat substraat is daarnaast ook risicovol
omdat substraat inhibitie ook kan voorkomen. Daarom is het beter om de eigenschappen van het
enzym goed te kennen en te weten welke reactie omstandigheden goed zijn V max en Km spelen daar
een belangrijke rol bij.
Meten onder pseudo Vmax condities
In de meeste experimenten probeert men V max, maar deze kan nooit worden bereikt je zou een
oneindige substraat concentratie nodig hebben, maar hij kan wel benaderd worden. Als men onder
pseudo VMAX condities wil meten dan kiest men een substraatconcentratie die 10 maal de KM is. Bij
deze substraatconcentratie wordt 91% van de theoretisch haalbare enzymactiviteit gemeten.
Het is in de praktijk niet mogelijk om de Vmax te meten. Bij hoge substraat concentraties bestaat
daarnaast ook het gevaar van substraat remming.
LDH
Het enzym lactaat dehydrogenase LDH
LDH is betrokken bij de vorming van lactaat (melkzuur), verzuring van spieren bij grote inspanningen.
Als er voldoende zuurstof aanwezig is (aerobe condities) wordt pyruvaat omgezet in acetyl-CoA, dat
in de citroenzuurcyclus volledig wordt omgezet in CO2. Maar bij zware inspanning wordt er te weinig
zuurstof naar de spieren getransporteerd en wordt het eindproduct van de glycolyse, pyruvaat,
omgezet in lactaat. LDH is dan het laatste enzym in een serie, die de omzetting van glucose
(glycogeen) in lactaat katalyseert (figuur 2.1A). Meer specifiek, wordt de reactie van pyruvaat in
lactaat gecatalyseerd. In gist en bacterieën wordt vanuit pyruvaat ethanol geproduceerd in plaats van
lactaat.
De afbraak van suikers is belangrijk voor energie productie. Onder aerobe condities worden per
glucose molecuul 2 moleculen ATP gevormd in de glycolyse en daarna in de citroenzuur cyclus en voo
ral tijdens de oxidatievefosforyleringsreacties nog eens 28 moleculen ATP.
Het in de spoer gevormde lactaat diffundeert naar het bloed waar het na opname door de lever weer
kan worden omgezet in pyruvaat eveneens via LDH en vervolgens via de reacties van de
gluconeogenese in glucose of glycogeen. In andere weefsels, zoals hartspier, wordt lactaat ook
opgenomen uit het bloed en eveneens via LDH weer omgezet in pyruvaat dat daarna onder aerobe
omstandigheden via de citroenzuurcyclus en ademhalingsketen wordt geoxideerd. Hierbij worden er
per lactaat molecuul ongeveer 14 moleculen ATP gevormd (een stuk efficiënter dus)
De reactievergelijking van de door LDH gekatalyseerde reacties is:
LDH vormen
Er zijn twee LDH genen en vijf verschillende LDH vormen in het menselijk lichaam
Mensen hebben twee LDH genen, die coderen voor een H(earth)- en een M(uscle)-type LDHsubeenheid. De aminozuurvolgorde is 75% gelijk, het zijn iso-enzymen. Iso-enzymen zijn eiwitten die
dezelfde functie uitvoeren maar een andere aminozuur volgorde hebben. Ze worden gecodeerd door
verschillende genen in het DNA en verschillen vaak in de manier waarop ze gereguleerd zijn, maar
ook in de Vmax en Km. Werkzaam LDH bestaat uit vier sub eenheden (tetrameer) die elk een
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
katalytische plaats hebben. Met twee verschillende sub eenheden (iso-enzymen) zijn dus vijf
combinaties mogelijk die allen worden aangetroffen. De expressie van de twee LDH genen is
weefselspecifiek. Het H-type enzym heeft een hoge affiniteit voor de substraten (optimaal bij lage
substraat concentraties) maar wordt bij wat hogere pyruvaat concentraties geremd. Deze
eigenschappen zorgen ervoor dat in hartspier (met overwegend H-type enzym, H4) bij een hoge
pyruvaat productie, pyruvaat niet omgezet wordt in lactaat. Bij het M type is het juist anders om. De
hart spier kan hierdoor niet verzuren en ophouden met werken, de skeletspier kan wel tijdelijk een
grote inspanning leveren maar verzuurt dan wel.
LDH1 Enzymactiviteit; reactiesnelheden en turnovergetal.
Enzymcatalyse zorgt ervoor dat de reacties, die ook zonder enzym plaats kunnen vinden maar dan
veel trager verlopen, sneller verlopen. Het meten van reactiesnelheden onder verschillende condities
wordt enzymkinetiek genoemd.
De activiteit van een enzym wordt meestal uitgedrukt als de hoeveelheid substraat dat per
tijdeenheid wordt omgezet, bijvoorbeeld in µmol min-1. Vaker wordt gesproken over de specifieke
activiteit, dit is de activiteit per milligram eiwit in het enzym preparaat . (µmol min-1 mg -1). De
specifieke activiteit geeft dus ook informatie over de zuiverheid van het eiwitpreparaat waarin het
enzym zit.
Het turnovergetal (kcat) geeft aan hoeveel moleculen substraat maximaal per tijdseenheid kunnen
worden omgezet per katalytische subunit. Het turnover getal van een enzym wordt berekend door
de maximale reactiesnelheid (Vmax) te delen door de hoeveelheid enzym [E T]. Het turnover getal
wordt weergeven in tijdseenheid-1
Spectrofotometerie
Met een spectrofotometer meet men de absorptie van licht door moleculen. Deze absorptie is recht
evenredig met de concentratie van moleculen en wordt beschreven door de wet van Lambert-beer.
Indien twee keer zoveel moleculen aanwezig zijn en de weglengte van het licht gelijk is, zal er ook
twee keer zoveel licht geabsorbeerd worden.
LDH2 de dissociatieconstante van NADH en LDH; fluorescentie
De dissociatieconstante van NADH en LDH
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
De dissociatie constante (kd) is een evenwichtsconstante die de sterke van interactie/binding tussen
twee componenten beschrijft, bijvoorbeeld tussen een enzym en zijn substraat. Er bestaat altijd een
evenwicht tussen het enzym-substraat complex (ES), het vrije enzym (E) en vrij substraat (S):
Dit is een dynamisch evenwicht; elk afzonderlijk substraat molecuul is nu weer gebonden aan het
enzym, dan weer vrij. De dissociatieconstante:
Fluorescentie
Fluorescentie is een kwantummechanisch proces waarbij moleculen licht (fotonen) van een bepaalde
golflengte absorberen, en vervolgens licht van een hogere golflengte (=lagere energie) uitzenden.
Moleculen waarbij fluorescentie optreedt: geconjugeerde onverzadigde bingingen (zoals NADH) en
metalen. Het opgenomen foton is het exciterende foton terwijl het uitgezonden foton het
geemiteerde foton is.
Met een fluorimeter kun je kun je het excitatie- en emissielicht van elkaar scheiden; hierdoor is het
mogelijk om alleen het fluorescentielicht waar te nemen. Fluorescentie is niet recht evenredig met
de concentratie ven een bepaalde stof, is ook sterk afhankelijk van de lichtintensiteit en gevoeligheid
van de licht detector in de fluorimeter
Bepaling van de dissociatie constante tussen LDH en NADH middels fluorescentie
Wanneer NADH aan een enzym bindt, gaat het over van een waterig milieu naar een omgeving met
een andere polariteit. Hierdoor verandert de quantumefficientie van de NADH fluorescentie, dat wil
zeggen, dat meer (of minder) van het geabsorbeerde licht in de vorm van fluorescentie wordt uit
gezonden. Wat het effect is van de polariteit van de omgeving op de fluorescentie van NADH ga je
meten door en vergelijk te maken tussen de fluorescentie in een waterig milieu (buffer) en een meer
apolair milieu (ethanol)
LDH3 de standaard vrije energie verandering
Vrije energie en leven
Vanuit de chemie (thermodynamica) is bekend aan welke voorwaarden een reactie moet voldoen wil
deze spontaan kunnen verlopen. Dit wordt aangegeven door het concept vrije energie. Elke systeem
bij een constante druk streeft naar een zo laag mogelijke vrije energie. De vrije energie (G, Gibbs
energie) is opgebouwd uit twee termen: de enthalpie (H, warmte inhoud van de moleculen) en de
entropie (S, energie verspreiding) G=H-TS
Als er sprake is van een reactie bij constante temperatuur en druk wordt de vrije energie verandering
ΔG = ΔH – TΔS. Een reactie kan spontaan verlopen als de vrije energie daalt. Dit betekent dat de vrije
energie van de producten minder moet zijn dan van de substraten. De ΔG van de reactie moet
negatief zijn. Dankzij enzymen die vrije energie leverende reacties (ΔG < 0) kunnen koppelen aan vrij
energie vereisende reacties (ΔG > 0) is biosynthese mogelijk. Met recht kan gesproken worden dat
enzymen de schakel zijn tussen de dode stof en de levende cel.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
De redoxreactie van pyruvaat en NADH
Het enzym katalyseert de reactie naar de evenwichtssituatie. In evenwicht is het vrije energieverschil
tussen substraten en producten nul
Deze reactie is opgebouwd uit twee redox halfreacties: pyruvaat wordt gereduceerd tot lactaat en
NADH wordt geoxideerd tot NAD+.
Er geldt ΔG = - nFΔE. Hierbij is n het aantal elektronen die bij de redox reactie betrokken zijn en F is
de Faraday constante. De reactie geldt ook voor de standaard vrije energie (ΔG 0) en standaard redox
potentiaal.
De verandering van vrije energie is ΔG is daarnaast afhankelijk van de standaard vrije energie
verandering ΔG0 en de concentraties van reactanten volgens onderstaande formule. Hierbij is R de
gasconstante en T de temperatuur in graden Kelvin.
Dit is de wet van nernst.
LDH4 werkingsmechanisme van LDH
Het werkingsmechanisme VAN LDH is karakteristiek voor nagenoeg alle NAD(P)(H)- afhankelijke
dehydrogenase. NADH bindt eerst aan het enzym gevolgd door pyruvaat. Na de hydride (H -)
overdracht vanaf NAHD naar pyruvaat en protonering van de ketongroep, verlaat lactaat als eerste
het enzym, gevolgd door NAD+. Dit type reactie wordt een geordende sequentieel mechanisme
genoemd. In het onderstaande schema zijn de acht intermediaire vormen van het enzym weergeven:
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Hoe is het schema van de katalytische cyclus bepaald?
De katalytische cyclus bestaat uit acht stappen of deelreacties. Behalve door kennis van de
driedimensionale structuur, zijn de verschillende deel reacties en hun snelheidsconstantes bepaald
met klassieke steady state en snelle pre steady state kinetiek. Bij steady state kinetiek meet men de
langzaamste stap(pen) van de katalytische cyclus. Bij pre-steady state kijkt men naar eigenschappen
van het enzym tijdens het eerste rondje van de katalytische cyclus.
Blok 2 biochemische analyses
PPO
Polyphenol oxidase
We bekijken de activiteit en remming van polyphenol oxidase. Het is een koper bevattende enzym is
betrokken bij de bruinkleuring van groenten en fruit. Door het oxideren van mono en di phenolen tot
quinonen ontstaan zeer reactieve verbindingen die polymeriseren tot rood-bruin gekleurde
melanines. De reactie bestaat uit drie reversibele deel reacties, waarbij PPO slechts bij de eerste
twee betrokken is.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Verschillende remmers
- Citroenzuur
o Verlaging pH
o Binding koper (chelation)
- L-cystine
o Reactie met quinonen
- Vitamine C
o Reductie van quinen naar diphenolen
 Nadat vitamine C is verbruikt nunnen de quinonen alsnog polymeriseren
- Sulfiet
o Covalente additie reactie met quinonen
o Reageert ook met melanines  bleken
- Kojic acid
o Reductie van quinonen tot diphenolen
o Coordinatie met koperatomen in active site PPO (competitive inhibitor)
Urinezuur meting
Urine en medische aandoeningen gerelateerd aan verhoogde urinezuurvorming
Urinezuur is het product van de purine nucleotide afbraakroute in mensen. Te hoge urinezuur
concentraties leiden tot problemen omdat mensen het enzym uricase, dat het slecht oplosbare
urinezuur omzet in het beter oplosbare allantoine, missen. De reactie waarbij urinezuur wordt
omgezet in allantoine is hier onder weergeven.
Jicht en nierstenen
Jicht en nierstenen zijn bijvoorbeeld ook ziekten die veroorzaakt worden door te hoge
urinezuurconcentraties.In vroegere tijden werd jicht geassocieerd met overdadig eten en drinken.
Deze personen dronken veel wijn uit loden bekers en kregen een loodvergiftiging. Hierdoor werkten
onder meer de nieren niet goed meer en werd urinezuur niet efficiënt uitgescheiden. Het gevolg was
een hoge concentratie urinezuur. Door een hoge urinezuurconcentratie ontstaan
natriumuraatkristallen en deze kristallen veroorzaken uiteindelijk de pijn in de gewrichten.
Nierstenen hebben een vergelijkbare oorzaak. ook hier is er te veel urinezuur en ontstaan er
natriumuraatkristallen, in dit geval in de nieren. Allopurinol wordt vaker voorgeschreven tegen jicht
of nierstenen. Dit medicijn wordt gebruikt om de urinezuurproductie te beperken via de remming
van xanthine oxidase. Dit enzym katalyseert de laatste stap in het purine katabolisme, de omzetting
van xanthine in urinezuur. Daarnaast worden ontstekingsremmers gebruikt om de pijnlijke gevolgen
van de natriumuraatkristallen in de gewrichten te verminderen.
Medische urinezuur testen
Vanwege de veelheid aan medische afwijkingen die gekenmerkt worden door verhoogde
urinezuurconcentraties worden er veel urinezuurtesten uitgevoerd. Er is echter wel een medische
discussie over de limieten van een urinezuurtest. De concentratie van urinezuur in het bloed varieert
sterk van dag tot dag en gedurende het jaar. Verhogende factoren zijn een eiwitrijk dieet met vooral
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
veel orgaanvlees, sardines, ansjovis en alcohol. Daarnaast wordt de urinezuurconcentratie verhoogd
door vasten en extreem sporten. Boven 0.42 mM urinezuur in het bloedserum spreekt men van
hyperuricemia. Als de urinezuurconcentratie hoger wordt dan 0.48 mM in het bloedserum dan slaat
natriumuraat neer in de weefsels. In de urine worden bij mannen waarden tussen de 1 en 4 mM
uraat (de gedeprotoneerde vorm van urinezuur, pKa = 5.8) gevonden. De waarden bij vrouwen zijn
iets lager.
Vragen uit het meet rapport
6. waarom voeg je ammoniumfosfaat, methanol en acetylaceton toe aan je
urinezuurbepalingsmengsel.
Deze reactantien zijn nodig voor vervolgreacties van allantoine naar DDL. Ammoniumfosfaat
oplossing heeft meerdere fincties: De pH 7.0 en NH 4+ (rest PO43-)
10. Wat is de fysiologische functie van katalase?
In het lichaam detoxificering van peroxides in peroxisomen. Echter peroxides (reactive oxygen
species ROS) kunnen ook een signaleringen rol in de cel vervullen in dat geval katalase dus ook
Immunopreipitatie (IP)
IP: eiwit complexen
Eiwitten vormen in de cel vaak complexen met andere eiwitten. Eiwitten met een quaternaire
structuur zijn heel stabiel. Deze complexen zijn opgebouwd uit subeenheden, die altijd met elkaar
een complex vormen.
In andere gevallen zijn de complexen veel minder stabiel, en bestaan ze slechts tijdelijk in de cel. B.V.
bij signaal overdracht, bij signaaloverdracht wordt een receptor op het celmembraan geactiveerd
door een externe prikker. Dit zet een cascase van vervolgreacties in werking: de G α-subeenheid
dissocieert van Gβ- en Ggamma-subeenheden en vormt tijdelijk een complex met, bijvoorbeeld,
adenylaatcyclase. Hierdoor wordt adenylaatcyclase geactiveerd en zet ATP om in cAMP. cAMP is een
second messenger, die onder andere de transcriptie reguleerd. De interacties van de Gα-subeenheid
met de Gβ- en Gγ-subeenheden en met adenylaatcyclase zijn tijdelijk, en afhankelijk van de binding
van GTP of GDP aan de Gα-subeenheid. Bovendien bestaan er in de cel meerdere Gα-subeenheden,
die elk een verschillende vervolgreactie stimuleren, doordat ze tijdelijke interactie aangaan met
verschillende downstream effectoren. Een voorbeeld van de signaal transductie van G-eiwitten na
binding van een neurotransmitter is hieronder weergegeven (deze signaal transductie route is geen
tentamenstof)
Immunoprecipitatie (IP)
Immunoprecipitatie (IP): het karakteriseren van eiwitten in een eiwitcomplex
Een fusie-eiwit bestaat uit het eiwit X waarvan je de eigenschappen wilt bestuderen, met aan de Cterminus of N-terminus een tweede, goed gekarakterideerd eiwit gekoppeld. In dit geval Green
Fluorescent Protein (GFP). De koppeling eiwit X en GFP gebeurt met behulp van genclonering: de
genen voor eiwit X en GFP worden gecloneerd in het zelfde leesframe, en zonder een stopcodon
ertussen. Als dit fusie-gen wordt teruggeplaatst in het organisme waaruit het gen voor eiwit x
oorspronkelijk afkomstig is, vind transcriptie van het fusie gen plaats. Er ontstaat dan een fusie eiwit.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Een IP
Doel
- Identificeren van componenten van eiwitcomplexen die betrokken zijn bij cellulaire
processen
Kwaliteit antilichaampreparaat
- Voor een succesvolle immunoparticipatie is een kwalitief goed antilichaampreparaat nodig
- Dit betekent dat het percentage IgG moleculen met een hoge bindingscapaciteit voor het
antigeen hoog moet zijn (minimaal 1%, liever meer dan 10%)
- Vaak is een zuivering van antilichamen nodig (slechts een bepaald percentage van de
polyclonale antilichamen bindt aan specifieke antigeen)
De immunoglobuline structuur
- Het antilichaam (molecuul) bestaat uit 2 zware en lichte ketens die verbonden zijn door
disulfide bruggen
- De Fab domeinen bevatten de antigeen bindingsplaatsn
- Het Fc domein wordt gevormd door de zware ketend en is via flexible linkers verbonden met
de Fab domeinen
Hoe voer je een immunoprecipitatie uit? De stappen
- Stap 1
o Incubatie met beads
 (plant)weefsel met T-GFP fusie eiwit malen
 Anti-GFP-beads toevoegen aan cel extract
 Ieder anti-GFP bindt 2 GFPs
- Stap 2
o Wassen en isolatie eiwitcomplexen
- Stap 3
o Eiwitten scheiden
 Eiwitcomplex denatureren en op gel laden
 Eiwitbandjes scheiden door elektroforese, kleuren en uitsnijden
Gel-elektroforese
Bij elektroforese worden moleculen onder invloed van een elektrische veld gescheiden op basis van
verschil in ladingen en grootte
SDS-PAGE (SDS-poly-acrylamide gel electroforese) scheidt eiwitten op basis van hun grootte. De
negatieve lading van de eiwitten komt door een SDS (een negatief geladen molecuul dat aan de
eiwitten bindt), door deze lading migreren de eiwitten in de polyacrylamide gel. De grotere
moleculen migreren trager dan kleinere moleculen
DNA-electroforese gaat uit van de negative lading van DNA. Grotere DNA moleculen migreeren
trager in de agarose matrix dan kleinere moleculen. Scheiding vind dus vooral plaats op basis van
grootte.
- Stap 4
o Voorbehandeling eiwitbandjes (voor trypsine digestie)
 Incubatie uitgesneden eiwitband met dihiothreitol om de cystines (disulfide
bruggen) van het eiwit te reduceren
 Incubatie met iodoacetamide om de gereduceerde cysteines te blokkeren
door carboxymethylering
 Wegvangen overmaat lodoacetamide met vrij cysteine
- Stap 6
o Identificatie van eiwitcomplex
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009

De massa van een polypeptide keten kan bepaald worden met de MALDITOF techniek
-
Stap 7
o Database search analyse onbekende eiwitten
 Massa’s van peptiden worden ingelezen in MASCOT
 Post-translationele modificaties (PTMs) kunnen worden opgegeven, zijn
afhankelijk van het organisme
 Via statistische analyse wordt bepaald met welke polypetideketen(s) de
aangeboden massa’s zoveel mogelijk overeen komen
 Het resultaat is een tabel waarin de eiwitten met de hoogste scores
bovenaan staan (coverage, fysiologische functie)
IP: antilichamen & immunologische methoden
IP: antilichamen
Voor een goed antilichaampreparaat heeft zowel een hoge bindingscapaciteit als een hoge
bindingsaffiniteit voor GFP. De bindingscapaciteit is het percentage bindingsplaatsen op de
antilichaam moleculen die ook daadwerkelijk GFP binden, het beschrijft de zuiverheid van het
preparaat. Een goed antilichaam heeft een bindingscapaciteit van minimaal 1% maar liever meer dan
20%. De bindingsaffiniteit is een maat voor de sterkte van de binding, hij wordt uitgedrukt in de K d
(dissociatie constante) en is een concentratie. Hoe hoger de affiniteit hoe lager de K d. de
bindingsaffiniteit is ondermeer belangrijk om het verlies van eiwitten tijdens de wasstappen in een
immunoprecipitatie experiment beperkt te houden.
Structuur van antilichamen
Antilichamen maken deel uit van de specifieke afweer van gewervelde dieren. Ze worden gemaakt in
B-cellen, die de antilichamen onder andere uitscheiden in het bloed. Antilichaam wordt gemaakt in
een reactie op de aanwezigheid van een lichaamsvreemde stof, het antigeen (meestal eiwitten). Het
antilichaam herkent een groep of een cluster van aminozuurzijketens van het antigeen. De
bindingsplaats wordt epitoop genoemd.
Antilichamen zijn opgebouwd uit 4 eiwitketens, 2 zware ketens en 2 lichte
ketens, zie door S-bruggen gekoppeld zijn. Y-vormige structuur. Nterminale delen van de zware en lichte ketens hebben van alle
antilichamen een sterk overeenkomstige aminozuurvolgorde: ze worden
het constante deel van jet antilichaam genoemd. De aminozuursequentie
van de C-terminale delen van de lichte en zware ketens is variabel,
bepaald de specificiteit van antilichamen. Binding vindt plaats middels een
niet-covalente bindingen zoals iongene interacties en vanderwaaldinteracties. Door de
complementaire structuur zijn die laatste erg sterk. Covalente bindingen zijn niet flexibel genoeg
voor antilichaam-antigeen binding.
Immunologische methoden
Methoden waarbij we gebruik maken van de specificiteit van antilichamen noemen we
immunologische methoden. Deze methoden zijn belangrijke gereedschappen om eiwitten te
zuiveren, kwantitatief te bepalen ent te lokaliseren in de cel.
IP: IgG titratie experiment
Een antilichaampreparaat wordt vaak als volgt gemaakt; Men immuniseert een konijn met een
antigen en na een paar weken tapt men bloed af en wordt de IgG fractie gezuiverd.
Voordat he he antilichamen echter kunt gebruiken om je eiwitcomplexen te isoleren, moet je eerst
uitzoeken of de kwaliteit van je antilichamen wel goed genoeg is. Als je bindingscapaciteit hoog is
(meer dan 10% van de antilichaam moleculen in je preparaat heeft een hoge affiniteit voor het
antigeen), dan is je preparaat goed genoeg om een betrouwbare immunoprecipitatie uit te voeren.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Immunoprecipitatie & eiwitscheiding
Immunoprecipitatie
Vervolgens wordt een hoeveelheid IgG(anti-GFP)-agarose bolletjes (b.v. 25 μg) geïncubeerd met een
hoeveelheid celextract (bijvoorbeeld 5 mL) waarin een fusieeiwit (X-GFP) aanwezig is. Na een aantal
uren zwenken bij 4 °C worden de agarose bolletjes gesedimenteerd met behulp van centrifugatie. Er
wordt 3 keer gewassen met buffer om aspecifiek gebonden eiwitten te verwijderen. Vervolgens
wordt het eiwitcomplex losgekoppeld van de agarose-IgG bolletjes door het toevoegen van Sodium
Dodecyl Sulfaat (SDS). SDS ontvouwt eiwitten en verbreekt hiermee ook de niet-covalente bindingen
tussen de antigen-fusie-eiwitten en de antilichamen en tussen de verschillende eiwitten van het eiwit
complex. De agarose bolletjes worden weer gesedimenteerd en de eiwitten blijven in het
supernatant.
Eiwit scheiding en bewerking voor massa spectrometrie
Er is nu een oplossing met allerlei eiwitten er in. Ze worden nu behandeld met β-mercaptoethanol,
dit verbreekt de zwavel bruggen. Vervolgens worden de eiwitten m.b.v. SDS-PAGE op grootte
gescheiden, eiwitscheidingsmethode gebaseerd op de lading van het eiwit in een elektrisch veld. De
lading van een eiwit kan zowel positief als negatief zijn en is afhankelijk van de pH van de oplossing.
SDS wordt toegevoegd om er voor te zorgen dat de eiwit electroforese geen last heeft van de
intrinsieke lading van een eiwit. Ze worden negatiever. De bandjes die ontstaan worden uit de gel
geknipt en in reageerbuizen gedaan.
Een aantal bandjes bevatten eiwitten die cysteïne bevatten. Dit is erg reactief, en kan gemakkelijk
een covalente zwavelbrug vormen met cysteïnes van andere eiwitketens. Om dit te voorkomen
worden ze eerst gereduceerd, en vervolgens gemodificeerd met jodoacetaat (deze wordt weg
gevangen). Hierdoor wordt de vrije SH-groep van cysteïne geblokkeerd, en kan deze niet meer
reageren. Het mengsel wordt uiteindelijk behandeld met trypsine, is een protease die eiwitten splitst
na de aminozuren Lysine en Arginine, er ontstaan peptiden.
IP: Massa spectrometrie
Massa spectrometrie (MS): het karakteriseren van peptiden.
Met massa spectrometrie is het mogelijk om met zeer grote precisie en hoge gevoeligheid de
atomaire samenstelling van een molecuul te bepalen zonder vooraf kennis te hebben van de
identiteit van dit molecuul.
IP-stappen.
1. Antigen-fusie eiwitten uit een celextract binden aan de IgG-agarose bolletjes
2. De IgG-agarose bolletjes sedimenteren met behulp van centrifugatie
3. Wasbuffer toevoegen en de IgG-agarose bolletjes daarna sedimenteren met behulp van
centrifugatie, om zo aspecifiek gebondene eiwitten te verwijderen (3x)
4. Eiwitten loskoppelen van de IgG-agarose bolletjes
5. De IgG-agarose bolletjes sedimenteren met behulp van centrifugatie en het supernatant
verder gebruiken
6. De eiwitten scheiden met behulp van poluacrylamide-gel-electroforese
7. Individuele eiwitbandjes uitsnijden
8. Samples behandelen met o.a. DTT en iodoacetamide en uiteindelijk digesteren met trypisine.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Moleculaire biologie
Module 1.
Part 1. Tomato genome.
Genome complexity
Het nucleaire genoom van tomaten bestaat uit 900 miljoen
Bp, en is verdeeld over 12 chromosomen. Het is diploïde, dus
twee kopieën, allelen. Je ziet hier twaalf chromosomen, want
dit is een stap bij meiose, waar de twee chromosomen zo
dicht bij elkaar zijn dat het een lijkt. In de donkere delen van
de chromosomen zit meer DNA (meer compact) dan in de
lichte delen. Maar de lichte delen zijn meer toegankelijk voor
DNA binding eiwitten (het DNA is minder compact). De
donkere delen heten heterochromatine. Eukaryotische
chromosomen zijn verpakt in chromatin, dit bestaat uit DNA
en eiwitten. Chromatine bestaat uit nucleosomen. Ongeveer
150 bp DNA zijn ~1,8 keer om een bolletje gewikkeld,
genaamd de histone. De nucleosome is vervolgens omringd
door een H1 histone, die voor een hogere ordening van de nucleosomen zorgen.
Door deze dichte verpakking is veel DNA niet makkelijk te bereiken door regulatory proteins en RNA
polymerases. Daardoor zijn de genen in het heterochromatine grotendeels inactief.
De lichtere delen heten euchromatine, waar het DNA minder dicht verpakt is. De meeste actieve
genen liggen dus in het euchromatine. In een planten cel kan je het DNA vinden dan vertaald in
genen vinden in, de nucleus, mitochondria en de chloroplasten. Deze hebben ook hun eigen DNA. Ze
denken dat deze cellen een bacterie binnen zijn gegaan en daar zijn “gebleven”.
Agarose gel elektroforese
Om DNA te bestuderen, moet je het kunnen visualiseren dit kan doormiddel van Agarose gel
elektroforese. Kleine delen van het DNA zullen makkelijk door het de gel verplaatsen, grootte delen
een stuk minder, zo kun je DNA moleculen onderscheiden op grootte. Het DNA zal naar de puls kant
migreren van de elektroden, want DNA is negatief geladen, door de fosfaat groepen.
Een agarose gel heeft ook nadelen, zo kun je hele kleine deeltjes (<50 bp) niet onderscheiden en
grootte deeltjes (>20 Kp) niet onderscheiden. De hoeveelheid agarose bepaald de zeefgrootte. Het
bepaald ook de snelheid. Om de DNA in de gel te zien, de gel wordt geverfd met fluorescentie. Het
effect van UV licht op DNA, zorgt voor mutaties en zorgt voor breuken in het DNA.
Measuring DNA/RNA concentration.
DNA en RNA absorberen licht op 260 nm, terwijl eiwitten licht meestal absorberen bij 280 nm. Hoe
puur het DNA/RNA is, ligt aan de ratio 260/280 nm die gemeten is door de spectrofotometer.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Restriction enzymes
De ontdekking van restrictie-enzymen zorgde voor het
ontstaan van de moleculaire biologie en genetische
modificatie. Restrictie-enzymen komen van nature in
bacteriën voor om het genoom te beschermen tegen
indringend DNA. Het genoom van de bacterie wordt
beschermd door extra methyl-groepen aan het DNA,
waardoor de restrictie-enzymen het DNA niet meer
herkennen. Restrictie-enzymen knippen het DNA op
speciale plekken, de restriction sites. Door te knippen
met restrictie-enzymen ontstaan er sticky ends. Er
kunnen ook blunt end fragments ontstaan.
Een schematisch beeld van de posities van de restrictieenzymen op een stuk DNA heet een physical map.
Je moet zorgen dat je genoeg enzym toevoegt, op de goede temperatuur en lang genoeg incubeert,
anders krijg je een partial digest.
Part 2: Gene structure
Exercise 2.1
Het DNA heeft introns en exons, het cDNA (mRNA) heeft geen introns. Deze introns worden
verwijderd. Om te weten waar de introns en exons zitten, moet je het DNA en CDNA met elkaar
vergelijken. Er zijn altijd bepaalde splice sites waar mRNA wordt geknipt als de introns uit het RNA
worden gehaald.
Exercise 2.2
Om de transcriptie te laten beginnen is er een startsignaal nodig. Het startsignaal vindt plaats in de
regio genaamd de promoter. Een promotor is een DNA-element dat de expressie van genen regelt.
De promotor ligt nog voor het eerste exon, en wordt niet overgeschreven in RNA. Een RNApolymerase enzym complex bindt aan een bepaald deel van de promotor, de TATA-box. De promotor
bepaalt dus vanaf wanneer RNA wordt afgeschreven. Eukaryotische RNA polymerases hebben
transcriptie factoren (speciale eiwitten) nodig om aan het DNA te kunnen binden. Daarnaast zijn er
nog bepaalde regulatory-regions, genaamd enhancers, die ver weg kunnen liggen van de promotor.
Door de 3D-structuur van DNA kunnen de enhancers ruimtelijk gezien toch bij het transcriptioncomplex liggen.
Een van de bewerkingsstappen van het nieuw overgeschreven mRNA is polyadenylation.
RNApolymerase
synthetiseert RNA ver nadat het gen al is afgelopen. Daardoor kan het RNA tot wel
honderden nucleotiden langer zijn dan het ‘volwassen’ mRNA. Deze RNA staart wordt erafgeknipt
door het polyadenylationcomplex en in plaats daarvan een poly-A-tail eraan gezet. Het
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
polyadenylationcomplex bindt altijd aan een specifieke plaats: de polyadenylationsite.
Een van de bewerkingsstappen van het nieuw overgeschreven mRNA is polyadenylation.
RNApolymerase synthetiseert RNA ver nadat het gen al is afgelopen. Daardoor kan het RNA tot wel
honderden nucleotiden langer zijn dan het ‘volwassen’ mRNA. Deze RNA staart wordt erafgeknipt
door het polyadenylationcomplex en in plaats daarvan een poly-A-tail eraan gezet. Het
polyadenylationcomplex bindt altijd aan een specifieke plaats: de polyadenylationsite.
Exercise 2.3
Niet het hele mRNA wordt vertaald in het cytoplasma, maar alleen het ORF (open reading frame).
mRNA word door ribosomen omgezet in eiwitten. De ribosomen lezen het mRNA en koppelt de
aminozuren aan elkaar. Drie basen zijn een amniozuur, een codon. Start codon is AUG (methionine).
Stopcodon is UAA, UGA, UAG, deze behoort niet tot het ORF, het kan ook niet omgezet worden het is
niets. In een dubbel strengs DNA zijn er 6 reading frames.
Ook doordat DNA dubbel strengs is kan het worden vertaald van de bovenste en de onderste streng.
De streng waar het RNA polymerase aan hecht wordt de template streng genoemd. RNA kan alleen
in de 5’-3’ richting worden aangemaakt.
De regio voor het startcodon wordt niet vertaald in aminozuren. Dit is het 5’UnTranslatedRegion.
Hetzelfde voor het stopcodon maar deze wordt dan 3’UTR genoemd.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Part 3. Gene detection
PCR
PCR is een methode om een
specifiek deel van het DNA te
vermenigvuldigen, van een
complex mengsel. Als je met
PCR werkt zit er een
voorwaarde aan: dat je het
uiteinde weet van het DNA dat
je gaat vermenigvuldigen.
Want op deze sequensen kunnen dan primers (20 -30 bp) worden
gemaakt. Om een PCR te laten werken heb je 2 primers nodig. Een
forward (die past op de template) en reversprimer.
5’is een fosfaat kant, en 3’ is een hydroxyl groep.
Bij PRC wordt er gebruik gemaakt van de hittebestendige DNA-polymerase Taq-polymerase.
Het proces van DNA-amplificatie gaat in een paar herhalende stappen:
1. Primers toevoegen
2. Verhitting tot 95°C, om de strengen uit elkaar te halen
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
3. Afkoelen tot 55°-65°C, voor de aanhechting van de primers
4. Verhitting to 72°, voor DNA synthese.
Stap 4 wordt af en toe vaker herhaald omdat het synthetiseren van DNA tijd kost, en je wilt geen
halve stukken DNA. De specificiteit van de PCR-reactie hangt af van de lengte van de primers en
annealingteperatuur. De is de temperatuur waarbij de primers specifiek/optimaal hechten aan de
template DNA-strang. Deze temperatuur is afhankelijk van de primer, en de samenstelling van de
PCR-buffer.
Het is belangrijk om je te realiseren dat de sequenties van de primers ook in het uiteindelijke PCR
product terecht komen. Hier kun je gebruik van maken door bijvoorbeeld restrictie sites aan het
einde van je primer te zetten.
Southern blotting
Southern blotting is een techniek om een specifiek DNA fragment te detecteren in een complexe mix,
op basis van baseparing tussen complementary enkel strengs DNA moleculen.
Southern blot wordt gebruikt voor:
- Te kijken of een DNA fragment aanwezig is in een
bepaald genoom
- Te kijk en of een gen geisoleerd van organisme x
ook aanwezig in het genoom van organisme Y
- Bepalen hoeveel homologe genen aanwezig zijn
in het genoom van een organisme. Als je B.V. er
achter wil komen of een gen deel is van een
genen familie.
Om te kunnen southern blotten moet je eerst een filtraat
maken van je DNA fragmenten.
Het is hiervoor belangrijk dat het DNA enkel strengs is
omdat je het wil gebruiken voor hybridsation.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Nadat het DNA is opgezogen in het membraan-filter, wordt het DNA definitief gebonden aan het
filter door de membraan te bakken of te behandelen met UV licht.
Daarna kun je de blot incuberen met de single stranded labeled DNA probe. De probe zal nu willen
hybridiseren met zijn complementaire streng op de blot. Hoe stringent deze binding is hangt af van
de temperatuur en van de zoutconcentratie van de buffer.
- Hoe hoger de temperatuur, hoe specifieker de hybridisatie, omdat de bindingssterkte tussen
de probe en het DNA sterker moet zijn bij een hoge temperatuur
- Hoe lager de zoutconcentratie, hoe specifieker de hybridisatie, omdat de sterkte van de
waterstofbruggen lager wordt (alleen als de goede base is gebonden, zal deze verbinding niet
verbreken)
Als je weet dat je probe 100% complementary is aan het DNA op de blot, kun je een hoge stringency
gebruiken. Als dit niet het geval is, moet je een lagere stringency gebruiken. Een te lage stringency
zorgt voor een aspecifiek hybridisatie.
Als je veel hybridisatie bandjes ziek, betekent het dat de probe op veel plaatsen van het DNA kon
hechten. De probe vertegenwoordigd dan een repetitief DNA-fragment.
Je kan zo’n blot ook uitvoeren met RNA. Dit heet een Northern blot, kan gebruikt worden om te
kijken waar een gen wordt afgeschreven daarmee kun je bepalen hoe actief een gen is. Er bestaat
ook een manier om eiwitten op een blot te zetten. Dit heet een western Blot. Hier worden labeled
antibodies gebruikt.
Een variant van southern blotting is FISH: fluorescent in Situ hybridisation, waar een fluorescerende
DNA probe gebruikt wordt om chromosomen onder de miscroscoop te hybridiseren.
BLAST
Er zijn veel databases waarin sequences data (DNA, cDNA en protein) wordt verzameld. Naast
informatie over het genoom, zijn er ook databases waar genexpressie en eiwitstructuur en –
interacties opgeslagen zijn.
Wij gebruiken BLAST, nasic local alignment search tool, dat hier gebruikt wordt om te kijken hoeveel
homologs (related genes) van RbcS1 er in de tomaat (en in andere sequenced plant genomes) zitten.
BLAST is een programma dat DNA of eiwit sequenties kan alignen. Hiervoor gebruikt BLAST rrn
algoritme dat werkt in Twee stappen: eerst worden kleine stukjes van de sequence vergeleken met
sequenties in de database. Als er een match is wordt die sequence verder vergeleken met de input
sequence.
BLASTn is voor nucleotidesequenties, BLASTp is voor aminozuursequenties (protein)
Om aan te geven hoe overeenkomstig twee sequenties zijn, gebruikt BLAST twee scores: de Bit score
en de E-value.
Bit score vertelt hoe homoloog twee sequenties aan elkaar zijn: de maximale score is twee keer de
lengte die je in hebt gevoerd. Er wordt ook rekening gehouden met de impact die de verandering
hebben, zoals voor de vouwing van een eiwit. De bit score is niet afhankelijk van het aantal
sequences in de database.
E-value gaat over hoe uniek de input sequence is; he langer de E-value, hoe kleiner de kans is dat een
match ‘per ongeluk’ bij de resultaten staat. Het is dan ook logisch dat kleine input sequences een
hogere E value hebben, omdat de kans groter is dat die sequence toevallig gevonden wordt in de
database
De uit komst van een BLAST onderzoek bestaat uit drie onderdelen:
1. The graphical representation
2. A tabel
3. the individual alignments
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
CSI case
Voor een DNA fingerprint wil je een fingerprintsequentie die veel voorkomt, uniek is voor elk individu
en in elk individu voorkomt. Het beste kun je dan een microsatellite gebruiken, omdat dat een korte
sequentie is die veel voorkomt, en erg polymorphic is tussen individuen.
Daarnaast is een kleine sequentie ook nodig, omdat DNA op een crime scene uit elkaar valt. Grote
sequenties zijn dan niet te gebruiken.
Microsattelites komen op veel plaatsen in het genoom voor, en hebben een grote variatie in het
repeat-nummer op een bepaalde locus. Ze liggen wel altijd op een vaste plek in het genoom.
“in other words, different persons will all have a certain microsatellite (for example a GAGAGAGA
repeat) at a certain location (such as in a conserved gene), but the number of GA-repeats will vary
between different persons”
Module 2.
PART 1: transcription
De 5’-CAP beschermt de 5’ kant van het mRNA en helpt bij het transport naar het cytoplasma en het
binden aan ribosomen. En stabilisatie.
DNA en RNA hebben verschillende nucleotiden, DNA heeft deoxyribonucleotiden en RNA heeft
ribonucleotiden. (-OH groep)
RNA processing steps:
- RNA polymerase binding aan de promoter
- Transcriptie
- 5’-CAP toevoeging
- Afkippen van de primary transcript aan de 3’-end
- Poly-A staart wordt toegevoegd
- Introns verwijderen (splicing)
- Transport naar het cytoplasma
- Binding aan ribosomen
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
- Translatie
Splicing
Het verwijderen van de introns heet splicing, je houdt alleen exons over. Splicing is een heel
gereguleerd proces, want de introns moet precies worden verwijderd en de exons moeten goed aan
elkaar worden gemaakt voor een bruikbaar mRNA. Splicing wordt gedaan door een enzymcomplex
genaamd de spliceosome, hij herkent conserved nucleotides in de sequentie van de intron. Deze
conserved nucleotides zitten in elke intron. Ze heten splice-sites. Er zijn GU 5’-end ene AG aan de 3’end; de GU-AG regel. Branch point is er nog een: een A ongeveer 15-45 nucleotideen upstream t.o.v.
de 3’-splice site. The spliceosome functions in the nucleus.
De spliceosome zorgt ervoor dat het intron goed wordt opgevouwen en de exonen goed aan elkaar
gekoppeld worden:
Een gen codeert altijd meer exonen dan intronen, omdat een intron altijd tussen twee exonen ligt.
Polyadenylation
Bijna al het mRNA heet een poly-A tail, 100-250 A’, aan de 3’ kant, beschermd tegen het afbreken
van het RNA en zorgt voor transport naar het cytoplasma. Polyadenylation wordt uitgevoerd door
een enzym complex, genaamd poluadenylation complex, het bindt aan een specifieke sequence in
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
het RNA, het polyadenylation-signal. Dit is vaak (AAUAA). mRNA synthese en spilcing komen in
dezelfde plaatsen in de kern, factories
Differences between Eukaryotes and Bacteria
Bacterieel DNA wordt georganiseerd door operons. Een operon is een cluster genen die gereguleerd
worden door een promotor. Die genen worden afgeschreven als een grote mRNA-Keten, en
vervolgens apart vertaald naar eiwitten.
Alternative splicing
De complexiteit van een organisme hoeft niets te zeggen over de complexiteit van het genoom. Een
van de factoren die de complexiteit van het genoom vergroot is alternative splicing. Door alternative
splicing kunnen er verschillende mRNA moleculen (en dus eiwitten) gemaakt worden van een gen,
door een verschillende combinatie van exonen:
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Alternative splicing is vaak cel- of weefselspecifiek.
Elke mRNA heeft een poly-A-tail nodig, dus er moeten ook meerdere polyadenylation signal in het
gen zitten.
Stellingen die waar zijn over alternative splicing:
- One gene can code for multiple different mRNA’s
- One gene can have mulitple poly-adenylation signals
- A gene can encode multiple translation start sites
- Alternative splicing occurs in de the nucleus
- One cell can contain different mRNA’s derived from the same gene
- Alternative splicing can be species specific
PART 2. RT-PCR
Elke cel heeft een eigen transcriptosome, dat wil zeggen: een eigen collectie mRNA’s die voorkomen
in de cel. Onderzoek naar welke genen hoeveel worden overgeschreven, kan helpen bij bijvoorbeeld
kankeronderzoek.
Voordat een PCR gedaan kan worden op mRNA, moet RNA weer omgezet worden in copy DNA, ofwel
cDNA. Hiervoor wordt reverse-transcriptase gebruit. Zoals elke DNA-polymerase, heeft reversetranscriptase een klein stukje double-stranded DNA nodig. Daarvoor wordt een primer aan het RNA
gehecht Meestal is deze primer een oligo-dT primer (~25T’s ) die hecht aan de poly-A-Tail.
Als de primer heeft gehecht, kan het DNA-polymerase beginnen. Na de PCR kan het product op een
agarosegel geladen worden. De hoeveelheid PCR-product dat daarop zichtbaar is, is proportioneel
met de hoeveelheid mRNA van de sample. Door een primer te kiezen die specifiek is voor een gen,
kun je dus bepalen hoeveel mRNA van dat gen er aanwezig was in een sample.
RNA isolation
Voordat je aan een PCR kan beginnen moet je eerst RNA isoleren van een bepaald organisme of
weefsel. Er zijn verschillende soorten RNA: mRNA, tRNA, snRNA (small nuclear RNA, katalytische
functie in de kern) en rRNA. Verreweg het grootste deel van al het RNA bestaat uit rRNA. De rRNA’s
worden gecodeerd door de rDNA genen. Deze rDNA genen zijn een gen familie, met honderden
familieleden die als tandem repeats in het genoom liggen. Dit zie je in het plaat je hieronder. Door de
vele rDNA genen, en hun sterke activiteit, is rRNA de meest aanwezige soort RNA in de cel
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Ribosomen zijn gebouwd uit eiwitten en RNA moleculen, de rRNA.
rRNA’s hebben, net als tRNA’s en snRNA’s, geen poly-A-tails. Alleen mRNA’s hebben poly-A-tails!
Als je alle RNA van een cel op een agarosegel zet, zal je maar 3 of 4 bandjes zien door rRNA, dat maar
in 4 groottes voorkomt: 28s, 18s, 8s en 5s rRNA
Om RT-PCR te doen vanuit geïsoleerd RNA, hoef je niet eerst de mRNA te isoleren, omdat de oligo-dT
primer voor het maken van cDNA alleen aan de poly-A-tail hecht. Daardoor amplificeer je alleen het
mRNA en kun je het mRNA (in de vorm van cDNA) op een goed detecteren.
Isolating only the mRNA’s
Om mRNA’s te isoleren moet je gebruik maken van het feit
dat alle eukaryotische mRNA’s een poly-A-staart hebben.
Want alleen oligo-dt hecht hier aan. Hierdoor gaan de poly-Atails van het mRNA aan de matrix zitten en kun je de rest van
het RNA wegwassen. Daarna kun je het mRNA losmaken,
waarna je puur mRNA overhoudt.
qPCR
qPCR staat voor quatitative PCR, en dit wordt gebruikt om te
bepalen hoe sterk een gen wordt overgeschreven. Met
andere woorden: Hoeveel mRNA er in een bepaald weedsel
aanwezig is. Hierbij volg je de hoeveelheid double-stranded
DNA dat met PCR wordt gemaakt in real time.
Een vaak gebruikte methode hiervoor maakt gebruik van een
fluoreserende dye genaamd SYBR-green, als dit bint aan
double-stranded DNA bindt, gaat het fluoresceren. De
hoeveelheid fluorescentie is dus een maat voor de
hoeveelheid DNA in een oplossing. Bij deze methode gebruikt
men een speciaal apparaat waar de hoeveelheid
fluorescentie wordt gemeten na elke PCR cycle. Deze
resultaten komen in een grafiek waar de fluorescentie wordt
uitgezet tegen de hoeveelheid cycles.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
De rode lijn heet de threshold. Als de threshold wordt bereikt bij
minder cycles, betekent dat dat de expressie van het gen hoger is.
Stel dat het verschil tussen twee samples 5 cycles is, dan betekent
dat dat de expressie van een gen in het ene sample 2^5 = 32x zo
hoog is als van het andere sample.
Je moet wel rekening houden met het feit dat er verschillende
begin hoeveelheden van het cDNA kunnen zijn. Daarom moet je
een housekeeping gene als reference gene gebruiken, waarvan de
expressie altijd hetzelfde is in elke cel. De resultaten van je
referemce kun je dan gebruike om een betere vergelijking te
maken.
PART 3. Sequencing
Sequencing is een techniek om achter de nucleotide sequence is van een stukje DNA. Een van de
meest gebruikte technieken is Sanger dideoxy sequencing methode. De term dideoxy komt van een
speciaal gemodificeerde neucleotide, de dideoxynucleotide (ddNTP):
Normaal gesproken wordt de 5’-fosfaatgroep van de nieuwe
nucleotide aan de 3’-OH groep van de oude nucleotide gekoppeld.
Omdat de ddNTP geen 3’-OH groep heeft, zal er geen nieuwe
nucleotide meer gekoppeld kunnen worden, en houdt de DNA-keten
op met verlengen.
In een sequencing reactie wordt een lage concentratie
dideoxynucleotide (ddNTP) bij de normale nucleotides (DNTP’s)
toegevoegd. Er bestaat dan de kans dat er een ddNTP wordt
ingebouwd in plaats van een dNTP.
De ddNtps en dNTPs worden toegevoegd aan enkelstrengs DNA.
Nadat er een primer is toegeboegd en de DNA-polymerase aan de
gang gaat, ontstaan er allemaal producten met op verschillende plaats een ddNTP.
De ddNTPs en dNTPs worden toegevoegd aan enkelstrengs
DNA. Nadat er een primer is toegvoegd en de DNA-polymerase
aan de gang gaat, ontstaan er allemaal producten met op
verschillende plaatsen een ddNTP in gebouwd. De producten
met op verschillende plaatsen een ddNTP ingebouwd. De
producten hebben dus allemaal een verschillende lengte.
Deze reactie kun je doen met alle nucleotides, dus ddATP,
ddTTP, ddCTP en ddGTP. De producten van deze reactie kun je
op een erg gevoelige gel laden. Je krijgt dan het volgende
resultaat:
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Je kan het detectern van de verschillende fragmenten DNA ook automatiseren foor fluorescent
gelabelde ddNTP’s te gebruiken. Elke ssNTP heeft een andere kleur (bijv. ddTT rood, ddATP groen,
etc.). De DNA-fragmenten laat je door een column lopen, waarbij een laser de kleur kan bepalen. Je
krijgt dan een peak-diagram:
Ja leest van links naar rechts.
Je kan niet zomaar een mengsel van DNA sequensen, je moet eerst een bepaald stuk DNA isoleren
(bijvoorbeeld DNA)
BELANGRIJK:
Module 3.
Part 1. Western blot.
Hoeveel mRNA er in de cel is, zegt nog niets over hoeveel eiwit er in de cel is. De hoeveelheid eiwit in
de cel hangt af van de stabiliteit van het mRNA, de efficiëntie van de translatie, de stabiliteit van het
eiwit, en de hoeveelheid eiwit of mRNA dat naar andere cellen wordt verplaatst. Om uit te vinden
hoeveel van een specifiek eiwit in een weefsel zit, moet je het eiwit kunnen detecteren.
Bij Western Blot maak je gebruik van labeled antibodies die speciaal aan een eiwit kunnen hechten
waardoor je het eiwit kan detecteren.
Om Western blot uit te voeren, moet je eerst de eiwitten van een weefsel isoleren. Daarna scheidt je
de eiwitten op basis van jun grootte met poluarylamide gel electrophoresis (PAGE). Daarvoor moet je
de eiwitten eerst denatureren dit doe je doormiddel van het koken van de eiwitten, hierna voeg je
DTT toe (beta-mercaptoethanol) in een hoge concentratie want het breekt de secundaire en tertaire
structuren van de eiwitten, waarna je ze bindt aan SDS. SDS is een negatief geladen, zeepachtig
molecuul, dat ervoor zorgt dat eiwitten een langwerpige vorm en een even grote lading krijgen.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
De gel kun je uiteindelijk stainen, waardoor je de eiwitten kunt zien.
Om een specifiek eiwit te detecteren, moeten de eiwitten van de gel eerst naar een positief gelanden
membraan (de western blot) verplaatst worden. Dit gebeurt door de gel en het membraan op elkaar
te leggen, waarna een spanning aangebracht wordt en de eiwitten naar het membraan verplaatsen
ditt gebeurt ook door SDS (ze gaan naar de positieve kant).
Antibody detection
Antilichaam detectie gebeurt in twee stappen:
- Eerst wordt er een primaire antilichaam gebruikt, het bindt aan het eiwit waar we interesse
in hebben. Je krijt dit anti lichaam door dat je een, door een anti stof in b.v een konijn te
spuiten deze gaat dan antilichamen aan maken en deze haal je weer uit het bloed van het
konijn.
- Hierna wil je het secundaire antilichaam maken. Deze bind aan het primaire antilichaam
(eiwit specifiek). Hij wordt gelabeld met een fluorescente groep of een enzym, waardoor ze
gedetecteerd kunnen worden. Het enzym dat vaak gebruikt wordt is HRP, dat in
aanwezigheid van substraat een signaal afgeeft (kleur op het membraan). Door de grote
activiteit van dit enzym is een erg nauwkeurige detectie mogelijk.
Om te voorkomen dat de anti lichamen aspecifiek aan het positief geladen membraan binden
moeten de plekken waar geen eiwitten aan het membraan gebonden zijn geblokkerd worden, dit
gebeurt door middel van BSA.
PART 2: mutations
Mutaties zijn permanente veranderingen in de structuur van de DNA-sequentie. Deze veranderingen
kunnen positief en negatief zijn. Als een mutatie voorkomt in een coderend deel van het DNA, kan dit
leiden tot een verandering in de structuur van een eiwit. Een mutatie kan ook voorkomen in het
regulerende deel van DNA, waardoor de expressie van het bijbehorende gen aangepast kan worden.
Dit verstoort de balans van de cel.
Er zijn verschillende soorten mutaties:
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
-
SNP: Single Nucleotide Polymorphism. Een nucleotide is vervangen door een andere
nucleotide. Ook wel puntmutatie genoemd.
- Deletion: een deel van het DNA verdwijnt. De lengte van de deletie kan verschillen
- Insertion: een extra stuk DNA dat ingebouwd wordt. De lengte van de insertion kan
verschillen.
Om te kijken of een mutatie een effect heeft op het eiwit, moet je de alle Reading Frames van een
gen bekijken, tot je de langste sequentie (en dus de langste aminozuursequentie) vindt. Die moet je
dan vergelijken met de sequentie van het niet gemuteerde gen.
Een frameshift ten gevolge van een mutatie kan een enorme impact hebben op het eiwit. Ook kan
een mutatie zitten in de conserved splice sited van RNA, waardoor het intron in het mRNA kan blijven
zitten.
Module 4.
Part 1. Cloning
Cloning is het vermeerderen (kopiëren) van een specifiek stuk DNA-fragment in bacteriën. Daarvoor
moet je het DNA-fragment in een plasmide plakken, zodat het plasmide zichzelf kan repliceren. Het
werken met GMO’s is sterk gereguleerd, omdat bij genetisch modificeren vaak gebruik wordt
gemaakt van plasmides met antibiotica-resistenie genen. Deze plasmides kunnen erg snel
verspreiden onder bacteriën, en dat kan leiden tot multiresistente bacteriën.
Een plasmide dat gebruikt wordt voor klonen heet een vector. Hieronder zie je het pUC18 plasmide:
-
-
ORI = origin of replication. Hierdoor kan het plasmide zelfstandig repliceren
Amp_R = antibiotica-resistentie gen (in dit geval tegen ampicilline)
Polylinker = een regio op het plasmide waar een collectie van bepaalde restrictie sites zitten.
Daar kan een nieuw DNA-fragment worden ingebouwd. Ook wel de multiple cloning site
genoemd
lacZ = ORF voor een gen dat β-galactosidase codeert. De polylinker zit in het lacZ gen.
Klonen gaat in 3 stappen:
1. Digestie en Ligatie: eerst wordt het plasmide geknipt met een of twee restrictie enzymen, op
de plaats waar het DNA in het plasmide geplakt wordt. Dezelfde enzymen worden gebruikt
om de insert (het DNA-fragment dat in het plasmide geplaatst moet worden) te knippen. Het
plasmide en de insert hebben nu dezelfde sticky ends en kunnen hybridiseren met elkaar.
Daarna worden de dodofiester bindingen tussen de nucleotiden van het plasmide en de
insert met DNA-ligae hersteld
2. Transformatie van competente E.coli cellen: Nadat je DNA-fragment in de plasmide zit, moet
je ze op laten nemen door competente bacteriën. Bacteriën maak je competent door ze,
bijvoorbeeld, te behandelen met CaCl2, dat de celwand aanpast zodat ze plasmiden op
kunnen nemen. Daarna geef je ze een heatshock om de opname van de plasmiden te
triggeren. Je kan ook een elektroshock gebruiken om de cellen competent tee maken. Na de
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
shock laat je bacteriën herstellen van de shock. Een bacterie neemt over het algemeen maar
een plasmide op, waarna dat plasmide wordt vermenigvuldigd.
3. Selection of transformants: doordat bacteriën die plasmiden hebben opgenomen resistent
zijn tegen antibiotica, kun je de getransformeerde bacteriën (transformants) makkelijk
isoleren. Ondanks dat een bacterie een plasmide heeft opgenomen, kan het goed zijn dat de
insert er niet inzit, als gevolg van terug-ligation van het plasmide of de onvolledige digestion
van de vector. Om er zeker van te zijn dat je een kolonie hebt met een plasmide waar een
isert in zit, gebruik je een tweede controle, de blauw-wittte screening:
in de plasmide zit het lacZ gen, wat codeert voor β-galactosidase. Dit zet X-gal om in een
blauwe stof, waardoor de kolonie blauw wordt.
De insert is echter geplaatst in het lacZ gen. Door de onderbreking van het lacZ gen wordt
deze geïnactiveerd, en kan er geen X-gal meer omgezet worden in de blauwe stof. De
kolonies met de insert worden dan wit.
Er zijn meerdere valkuilen in een cloning-experiment. Als er geen kolonies op je plaat zijn, dan ben je:
- Vergeten ligase toe te voegen  plasmiden worden lineair en kunnen niet onderhouden
worden door bacteriën
- Het verkeerde antibioticum gebruikt
- Lage efficiëntie van competente cellen: te weinig bacteriën hebben plasmiden opgenomen
- Het insert-fragment was niet digested: plasmiden worden lineair en kunnen niet
onderhouden worden door bacteriën
Je kan het insert DNA-fragment weer terugkrijgen door witte kolonies te isoleren, te laten groeiwn en
het plasmide te isoleren. Je knipt ze daarna met dezelfde restrictie-enzymen, en zet ze op een gel.
Als je de plasmiden niet knipt met de restrictie-enzymen, blijven ze circulair en wordt de snelheid
waarmee het DNA over de gel loopt aangetast door de 3D structuur.
De meeste plasmiden zullen supercoil vormen. Supercoiled plasmiden zijn compacter en zullen
daarom sneller over de gel lopen.
Een plasmide kan ook in de open-circular form zijn. Dit wordt vaak veroorzaakt door een inkeping
(nick)in een van de strengen. Een open-circular form loopt langzamer over de gel
Door inkepingen in beide strengen kan het plasmide soms lineair zijn. De lineaire vorm ligt qua
snelheid tussen de supercoil en open-circular form.
Part 2: applications
Genome libary
Een genoom DNA libary is een collectie van recombinante plasmiden, die allemaal een verschillend
stuk DNA in zich hebben.
“the aim of a genomic library is to have each part of the chromosome represented in a plasmid”
Voor het genoom van een mens betekent dit dat je, met een gemiddelde insert-lengte van 3kb,
minimaal 3 milhoen pUC18 koloniën/plasmiden moet hebben, om het gehele genoom te bedekken.
Omdat je niet kan reguleren welk fragment wordt gekloneerd, worden er vaak 10x zo veel koloniën,
zodat elk stuk DNA in ieder geval 1x wordt gerepresenteerd. Door een ander plasmide te gebruiken,
kun je grotere DNA-fragenten gebruiken, waardoor je minder koloniën/plasmiden hoeft te maken:
Het DNA kun je vervolgens amplificeren door de methode hieronder:
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
cDNA libary
Een genoom library wordt gemaakt om een collectie van al het DNA te maken. Een cDNA library
wordt gemaakt om een collectie van al het RNA te maken. Hiervoor wordt RNA eerst omgeschreven
naar DNA door reverse-transcriptase. Om te zorgen dat het RNA intact blijft, worden de
cDNAfragmenten gemethyleerd, zodat het cDNA niet in stukken wordt geknipt door restrictieenzymen. Daarna worden er linkers toegevoegd aan het nieuwe cDNA. Linkers zijn stukjes DNA met
speciale restriction-sites erin, die niet gemethyleerd zijn. Hierdoor blijven de cDNA strengen intact en
heb je toch goed geknipte stukken cDNA die in het plasmide gezet kunnen worden. Daarna volg je
dezelfde procedure als bij de genomic library.
GFP-fusion
Een veelgebruikte toepassing voor klonen is het fuseren van een fluorescerend eiwit en het eiwit
waar interesse naar is. Hiermee kun je de locatie van het eiwit binnen de cel volgen. Een van de
meest gebruikte eiwitten is het Green Fluorescent Protein, GFP. GFP kun je in de ORF van een gen
bouwen, waarna je het stuk DNA in een plasmide zet. Hierna wordt het DNA als een groot mRNA
afgeschreven en vertaald in een eiwit.
Reporter construct
Een reporter gen (ofwel reporter) is een gen dat onder de controle van een promotor ligt. Met een
reporter kun je bestuderen of, waar en wanneer een gen tot uiting komt. Een reporter is makkelijk te
visualiseren. Door de aanwezigheid en intensiteit en plaats van een reporter te bepalen, kun je
uitspraken doen over de activiteit van een promotor, en dus van een gen.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)
lOMoARcPSD|4091009
Expression vector
Een veelgebruikte toepassing van klonen is het maken van GMO’s die belangrijke eiwitten of
enzymen maken. Twee bekende voorbeelden hiervan zijn de productie van insuline en de productie
van chymosin (voor het maken van kaas).
Insuline is een peptide hormoon, dat zorgt voor de opname van glucose uit het bloed. Vroeger werd
insuline uit dieren gehaald, maar tegenwoordig wordt het gesynthetiseerd. Hiervoor wordt het
insuline gen uit de mens in een expressie vector gezet en in E. coli tot uiting laten komen.
Chymosin is een belangrijk enzym voor het maken van kaas. Eerst werd dit enzym uit de maag van
een kalf gehaald. Tegenwoordig wordt het chymosin gesynthetiseerd door gistcellen.
Om een eiwit te laten maken door een bacterie, moet je het ORF van het eiwit plaatsen op een
plasmide. Hiervoor wordt het lacZ gen vervangen. Het eiwit-coderende gen staat dan onder controle
van de lacZ-promotor.
Downloaded by Nio Bytes (nio.bytes@gmail.com)