מבוא תוחלת חיים מווסתת הן על ידי גנים והן על ידי הסביבה .למסקנה זו הגיעו חוקרים שערכו מחקר בזבובי פירות -דרוזופילה (Drosophila melanogaster).הם מצאו שמוטציה בגן בודד ,בזבובים הטרוזיגוטים למוטציה ,הביאה להכפלת תוחלת החיים שלהם בלי לפגוע בפוריות או בתפקודים פיזיים של הזבובים; גן זה כונה "I'm not dead yet",או בקיצורIndy. קבוצת מחקר מארה"ב העמידה ניסוי שמטרתו לבחון את ההשפעה שיש למוטציות בגן Indyעל תוחלת החיים של הזבובים .נבחרו שתי קבוצות זבובים :האחת כללה את זבובי זן הבר ושימשה כקבוצת בקרה ,והקבוצה השנייה כללה זבובים נושאי מוטציה בגן Indy.החוקרים עקבו אחר הישרדות הזבובים לאורך זמן .תוצאות הניסוי מוצגות באיור . 1 איור -1אחוז ההישרדות של זבובי זן הבר וזבובים מוטנטיים ל -Indyלאורך זמן 1.מהו אחוז הזבובים ששרדו ביום ה 50-בקבוצת הבקרה ובקבוצת הזבובים המוטנטיים ל?-Indy בחרו תשובה אחת: א .אחוז הזבובים ששרדו בקבוצת הבקרה ביום ה 50-הוא כ 40%-ואילו בקבוצת המוטנטים שרדו כ. 85%- ב .אחוז הזבובים ששרדו בקבוצת הבקרה ביום ה 50-הוא כ 85%-ואילו בקבוצת המוטנטים שרדו כ.40%- ג .ההבדל באחוז הזבובים ששרדו ביום ה 50-בין שתי הקבוצות הוא זניח ,כלומר שיעור ההישרדות בשתי הקבוצות היה דומה. ד .אחוז הזבובים ששרדו ביום ה 50-בקבוצת הבקרה גדול פי שניים מאחוז הזבובים ששרדו בקבוצת המוטנטים. משוב לבחירה בתשובה זו התשובה היא :א .אחוז הזבובים ששרדו בקבוצת הבקרה ביום ה 50-הוא כ 40%-ואילו בקבוצת המוטנטים שרדו כ. 85%- .2החוקרים ביצעו את הניסוי בתנאים מבוקרים וקבועים של טמפרטורה ,לחות ומזון .מה החשיבות של שמירה על תנאים קבועים ? השמירה על תנאים קבועים מבטיחה שהניסוי בודק רק את השפעת המשתנה הבלתי תלוי (הגורם הנבדק) ובכך מקנה למסקנות תוקף ומהימנות ,תחת ההנחה שהביקורות ובדיקת המשתנים תקינות. החוקרים מיפו את המוטציה בגן Indyומצאו שהיא מצויה באינטרון .האינטרון אמנם משועתק ,אך הוא מוסר ממולקולת ה -RNAשליח הראשונית ) (pre-mRNAבתהליך השחבור ,ולכן איננו מצוי ב -RNAשליח הבוגר (mRNA),איננו מתורגם ואיננו מקודד לחלבון ! מאחר שהמוטציה בגן Indyממוקמת באינטרון ,הניחו החוקרים שרצף החלבון Indyהמקּודד על ידי הגן התקין זהה לרצף החלבון Indyהמקּודד על ידי הגן המוטנטי .החוקרים בודדו את ה -mRNAהמקֹודד ל- Indy,קבעו את רצף הנוקלאוטידים של ה -mRNA,ובעזרתו חזו את רצף החלבון Indy.ומצאו שמדובר בחלבון באורך 572חומצות אמיניות . .3החוקרים חזו שהחלבון Indyבאורך 572חומצות אמיניות .מה לדעתך יהיה אורכו של הרצף הנוקלאוטידים המקֹודד ) (CDSלחלבון? בחרו תשובה אחת: א 1623 .נוקלאוטידים ב . 1716נוקלאוטידים ג . 572נוקלאוטידים ד . 1719נוקלאוטידים משוב לבחירה בתשובה זו התשובה היא :ד .כל חומצה אמינית מקּודדת על ידי קודון באורך 3נוקלאוטידים ,וה -CDSמכיל גם את קודון עצירת התרגום .על כן חישוב אורך ה -CDSהוא אורך החלבון כפול 3לקבלת מספר הנוקלאוטידים המקודדים לחומצה אמינית ועוד קודון סיום שלושה נוקלאוטידים ,כלומר :(3X572)+3=1719. בעקבות המוטציה בגן ל -Indy,תוחלת החיים בזבובים התארכה וההזדקנות שלהם עוכבה .הדבר עורר אצל החוקרים מספר שאלות :מה תפקידו של החלבון ? Indyהאם ניתן למצוא במאגרי המידע חלבונים בעלי רצף דומה( הומולוגים )שמקורם באדם או באורגניזמים אחרים? האם חלבונים הדומים ברצפם ל -Indyשמקורם באורגניזמים אחרים גם קשורים בתוחלת החיים? האם וכיצד ניתן יהיה לנצל את המידע לגבי Indyלשם פיתוח תרופות ויישומים התורמים להארכת תוחלת החיים באדם ? תיאור המשימה )(protein BLAST השלב הראשון בדרך לספק תשובות לשאלות שהתעוררו אצל החוקרים הוא לחפש במאגרי המידע רצפים בעלי דמיון לרצף החלבון Indy.הכלי הביואינפורמטי( BLASTקיצור של Basic Local Alignment Search Tool),הוא כלי לחיפוש ) (Search Toolבאמצעות העֳמָ דָ ת רצפים (Sequence Alignment). מדובר למעשה במספר מנועי חיפוש שמאפשרים לחפש במאגרי מידע של רצפים ,את רשומות הרצפים הדומים לרצף הנתון בידי החוקרים ,הנקרא גם רצף שאילתה .אנו נשתמש במנוע חיפוש המשווה רצף שאילתה של חלבון ,במקרה זה Indy,לרשומות של רצפים במאגרים של רצפי חומצות אמיניות ,ומציג את רשומות הרצפים הדומות לו ביותר .הכלי נקרא protein BLAST,או בקיצור BLASTp. שלבי המשימה .1 .2 ניעזר במנוע החיפוש BLASTpלשם חיפוש רצפים הדומים לרצף החלבון Indyשמקורו בזבובים. נלמד על רצפים מאדם הדומים ל -Indyמזבובים. חיפוש רשומות של רצפי חלבונים בעלי דמיון לרצף Indyבעזרת הכלי BLASTp ראשית נכנס לממשק של כלֵי החיפוש ,BLASTעל ידי לחיצה על הקישור הבא: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi. בממשק המתקבל (מסך )1ניתן למצוא מספר כלים להשוואת רצפים ,כגון ) nucleotide BLAST (BLASTnהמאפשר השוואת רצף שאילתה של נוקלאוטידים למאגרים של רצפי נוקלאוטידים proteinBLAST (BLASTp) ,המאפשר השוואת רצף שאילתה של חומצות אמינו למאגרים של רצפי חלבונים ,וקיימות אפשרויות חיפוש נוספות שלא נתמקד בהן. מסך :1ממשק כלֵי החיפושBLAST כיוון שברשותנו רצף החלבון Indyמזבובים ואנו מעוניינים לחפש רצפים דומים לו במאגרים של רצפי חומצות אמינו ,נשתמש בכלי protein BLAST.נלחץ על הקישור ,ולפנינו יפתח מסך הכלי( BLASTpמסך ). 2 מסך :2ממשק הכליprotein BLAST נדביק לתוך חלון החיפוש ,בחלקו העליון של המסך ,את רצף חומצות האמינו של Indy בפורמט FASTA.נשים לב ,כי לו היה בידינו רצף של חלבון ידוע שיש לו קוד זיהוי (Accession )numberבמאגר הנתונים ,ניתן להזין קוד זה ,ולא את כל פירוט הרצף ,לחלון החיפוש. בחלונית לבחירת מאגר הנתונים ) (Databaseאליו יושווה רצף השאילתה ,נבחר במאגרNon- redundant protein sequence (nr),שכן זהו מאגר איכותי ולא חוזרני של רצפי חלבונים .בחלונית לבחירת האורגניזם ) (Organismשהוא מקור הרצפים הדומים שאנו מחפשים נרשום Homo sapiens, כיוון שאנו מעוניינים לחפש רצפים מאדם הדומים ל -Indyמזבובים (מסך . )3 מסך :3הזנת רצף השאילתה ,ובחירת מאגר המידע והאורגניזם מקור הרשומות לחיפוש. נבצע את החיפוש על ידי לחיצה על לחצן BLASTונמתין לדף התוצאות . ניתוח דף התוצאות תוצאות החיפוש שביצענו כוללות את רשומות הרצפים שמקורם באדם ) (Homo sapiensממאגר החלבונים nr,אשר דומים לרצף החלבון Indy,ששימש כרצף השאילתה . דף התוצאות מוצג לפנינו והוא כולל מספר חלקים. החלק הראשון כולל פרטי מידע על החיפוש ,כלומר נתונים טכניים כגון :שם רצף השאילתה ,מאיזה סוג הוא ,מה אורכו ,באיזה מאגר מידע בוצע החיפוש ועוד (מסך . )4 מסך :4דף תוצאות החיפוש -חלק :1פרטי מידע על רצף השאילתה והחיפוש החלק השני של דף התוצאות מכיל סיכום גרפי ) (Graphic Summaryתיאור גרפי של התוצאות שהתקבלו (מסך .)5תחילה מוצג סרגל קנה מידה לאורך רצף השאילתה (Query seq),והוא משתנה בהתאם לאורך רצף השאילתה ,המוצג מספרית מעל הסרגל .תחתיו מוצגים מוטיבים חלבוניים שמורים ,כגון מוטיבים המאפיינים משפחות של חלבונים ) (Superfamiliesאו מוטיבים החשובים למבנה או תפקוד החלבון (multi-domains),והם מוצגים בהתאם לאורך ומיקום יחסית לרצף השאילתה . החלק העיקרי של הסיכום הגרפי מציג שוב קו המייצג את אורך רצף השאילתה .תחתיו מוצגים קוים בצבעים שונים ואורך שונה ,כאשר כל קו מייצג רשומת רצף אחרת שנמצאה דומה לרצף השאילתה. הרשומות מוצגות בסדר יורד על פי מידת הדמיון לרצף השאילתה :תחילה מוצגים הרצפים הדומים ביותר ולאחר מכן הרצפים הדומים פחות .צבע הקו מעיד על מידת הדמיון בין רצף התוצאה לרצף השאילתה ,מידת הדמיון המחושבת ומיוצגת בציון Score.על פי מפתח צבע נקבע שציון מעל 200 מקנה צבע אדום (מעיד על מידת דמיון גבוהה) ,ציון 80-200מקנה צבע ורוד (מעיד על מידת דמיון גבוהה) וכך הלאה עד שציון הנמוך מ 40-מקנה צבע שחור (מעיד על מידת דמיון נמוכה מאוד). הניקוד מביא בחשבון שני גורמים עיקריים :עד כמה רצף התוצאה דומה לרצף השאילתה ,ועד כמה ארוך החלק הדומה בין הרצפים המושווים .לכן יתכנו מצבים בהם רצף תוצאה המציג דמיון לא גבוה לרצף השאילתה ,אך על פני אורך ניכר ,יקבל ניקוד גבוה יחסית ,ואילו רצף תוצאה בעל דמיון גבוה לרצף השאילתה ,אך על פני אורך קצר ,יקבל ציון נמוך יותר .המיקום של רצף התוצאה ביחס לרצף השאילתה מעיד על האזור ברצף השאילתה שבו מצוי הדמיון לרצף התוצאה . מסך :5דף תוצאות החיפוש -חלק :2סיכום גרפי .4מן הסיכום הגרפי ניתן ללמוד כי: בחרו תשובה אחת: א .מרבית רצפי התוצאה בעלי מידת דמיון נמוכה מאוד לרצף השאילתה. ב .מרבית רצפי התוצאה בעלי מידת דמיון גבוהה מאוד לרצף השאילתה. ג .הדמיון בין מרבית רצפי התוצאה לרצף השאילתה מתחיל רק כעבור כ 25-חומצות אמינו לערך ברצף השאילתה. ד .תשובות ב ו-ג נכונות . התשובה הנכונה היא :ד .כפי שניתן לראות מהסיכום הגרפי (מסך ,)6הצבע האדום של מרבית רצפי התוצאה מעיד על מידת דמיון גבוהה מאוד (ציון מעל )200בין רצף השאילתה לרצפי התוצאה .על סמך מיקום רצפי התוצאה ביחס לרצף השאילתה ניתן לראות שקיים דמיון לאורך רובו של רצף השאילתה ,אך לא בתחילת הרצף (בקצהו השמאלי) . מסך :6מידת הדמיון ואזור הדמיון בין רצף השאילתה לרצפי התוצאה ממאגר הנתונים החלק השלישי של דף התוצאות הוא למעשה תיאור ) (Descriptionsהתוצאות באמצעות טבלה (מסך .)7בטבלה מוצגים עבור כל רשומה ,שם ותיאור הרשומה (Description),ציון הדמיון לרצף השאילתה (Total score),איזה חלק מרצף התוצאה נמצא דומה לרצף השאילתה (Query coverage), אחוז העמדות בהן יש זהות בחומצה האמינית בין רצף התוצאה ורצף השאילתה (Ident),ולבסוף קוד הזיהוי ) (Accessionשל הרשומה .גם בחלק זה ,הרצפים מסודרים לפי רמת הדמיון שלהם לרצף השאילתה (הרצף הדומה ביותר לרצף השאילתה יופיע ראשון ברשימה) . מסך :7דף תוצאת החיפוש -חלק :3תיאור רצפי התוצאה מתיאור התוצאות ,ובחינה של רצף התוצאה שקוד הזיהוי שלו BAB71262,ניתן ללמוד כי: בחרו תשובה אחת: א .אחוז העמדות בהן יש זהות בחומצה האמינית בין רצף התוצאה ורצף השאילתה הוא .94% ב . 35%מרצף התוצאה נמצא דומה לרצף השאילתה. ג .אחוז העמדות בהן יש זהות בחומצה האמינית בין רצף התוצאה ורצף השאילתה הוא . 35% ד . 360עמדות ברצף התוצאה דומות לרצף השאילתה. התשובה הנכונה היא :ג .אחוז העמדות בהן יש זהות בחומצה האמינית בין רצף התוצאה ורצף השאילתה הוא ,35%וזאת ניתן ללמוד מעמודה Ident. בחלק הרביעי של דף התוצאות מוצגות העמדות הרצפים ) (Alignmentsבין רצף השאילתה לכל אחד מהרצפים הדומים לו (מסך .)8תחילה מוצגים נתונים לגבי רצף התוצאה ,כגון שם הרצף, מקורו ,קוד הזיהוי שלו ,ואורכו .בסוף מוצגת העמדת הרצפים עצמה כאשר בשורה העליונה בכלהעמדת רצפים מופיע רצף השאילתה (Query),בשורה התחתונה מופיע רצף התוצאה (Sbjct), וביניהם סימונים המעידים על הזהות (במסגרת ירוקה במסך ,)8הדמיון (במסגרת סגולה במסך )8 והשוני (במסגרת ורודה באיור) בין חומצות האמינו בכל עמדה בשני הרצפים .לעיתים בהשוואת הרצפים הכלי מכניס רווחים באחד הרצפים ,שמעידים על חוסר בחומצה אמינית בעמדה נתונה ברצף מסוים אל מול הרצף אליו הוא מושווה (במסגרת כתומה במסך .)8בתחילת ובסוף כל שורה מצוין מספר העמדה בכל רצף . מסך :8דף תוצאת החיפוש -חלק :4העמדות הרצפים כדי ללמוד יותר על העמדת הרצפים ,נוכל להיעזר בטבלה הבאה : נתונים כלליים על כל העמדת רצפים ניתן למצוא בין הנתונים על רצף התוצאה לבין העמדת הרצפים עצמה (מסך .)8כך ניתן ללמוד על הציון (Score),כפי שתיארנו קודם ,על העמדות בהן קיימות חומצות אמיניות זהות ) (Identitiesבשני הרצפים ,העמדות בהן קיימות חומצות אמיניות זהות או דומות בתכונותיהן (Positives),בשני הרצפים ,והעמדות בהן באחד הרצפים חסרה חומצה אמינית (או יותר) ולכן הכלי הביואינפורמטי הוסיף רווח ) (Gapכדי שבהמשך השוואת הרצפים נוכל לראות את הדמיון ביניהם . מתוך כל הרשומות המופיעות בדף התוצאות ,נבחר להמשיך לעבוד עם החלבון בעל קוד הזיהוי :AAF73251.בכדי למצוא את העמדת הרצפים שלרשומה זו עם רצף השאילתה ,ניתן ללחוץ על Ctrlו -F,ובחלון Findלהזין AAF73251ואז ללחוץ על Enterמספר פעמים עד שמגיעים להעמדת הרצפים (מסך . )9 מסך :9העמדת רצף הרשומה שקוד הזיהוי שלה הוא AAF73251ורצף השאילתהIndy .6כיצד תסבירו את הממצא שבהעמדת הרצפים ,רצף השאילתה מתחיל בעמדה 26ואילו רצף התוצאה מתחיל בעמדה ? 18 .7הסתכלו בעמדות 85-65של רצף השאילתה ובעמדות 530-510של רצף השאילתה וקבעו מהו המשפט הנכון: בחרו תשובה אחת: א .ברצף חלבון התוצאה נמצאו יותר חומצות אמינו זהות לעמדות 85-65ברצף שאילתה מאשר לעמדות 530-510ברצף השאילתה. ב .ברצף חלבון התוצאה נמצאו פחות חומצות אמינו זהות לעמדות 85-65בשאילתה מאשר לעמדות 530-510ברצף השאילתה. ג .ברצף חלבון התוצאה נמצאו מספר שווה של חומצות אמינו זהות לעמדות 85-65ולעמדות 530-510ברצף השאילתה. ד .ברצף חלבון התוצאה לא נמצאו כלל חומצות אמינו זהות לעמדות 85-65בשאילתה או לעמדות 530-510ברצף השאילתה. משמו של רצף התוצאה הנ"ל ,ניתן ללמוד כי החלבון הוא נשא המשחלף מטבוליטים שהם תוצרי מעגל קרבס .יוני נתרן נכנסים לתא בהתאם למפל הריכוזים שלהם ,בעוד הנשא מעביר אל תוך התא גם תוצרי ביניים של מעגל קרבס כגון :ציטרט ,סוקצינט ועוד .מעגל קרבס הוא השלב השני בתהליך הנשימה התאית האירובית .הוא מתקיים בחלל המיטוכונדריה . .8מה חשיבותו של תהליך הנשימה התאית? בחרו תשובה אחת: א .בתהליך הנשימה התאית נוצרת אנרגיה זמינה -חמצן ,ההכרחי לפעילות האדם. ב .בתהליך הנשימה התאית נוצרת אנרגיה זמינה -סוכר ,ההכרחי לפעילות האדם. ג .בתהליך הנשימה התאית נוצרת אנרגיה זמינה -חום. ד .בתהליך הנשימה התאית נוצרת אנרגיה זמינה- ATP. במחקר המשך ,נמצא באמצעות ניסויים כי החלבון INDYאמנם מעורב בשחלוף תוצרי ביניים של מעגל קרבס ,אך הוא ייחודי בכך שאיננו תלוי במפל ריכוז יוני נתרן .הוא מאפשר כניסה אל התא והוצאה מן התא של תוצרי ביניים של מעגל קרבס ,בהתאם לריכוזים שלהם ,ובכך מבקר את רמתם בתא .לתוצרי מעגל קרבס יש חשיבות גם בבקרה על תהליכים מטבוליים בתא . סיכום הפעילות החוקרים גילו כי מוטציה בחלבון INDYבזבובי הפירות -דרוזופילה -מאריכה את תוחלת החיים שלהם באופן ניכר .הארכת תוחלת החיים מתאפשרת רק אם הזבוב נושא המוטציה הוא הטרוזיגוט , והמוטציה גורמת לכך שפעילות החלבון המוטנטי מופחתת .החוקרים נעזרו בהכלאות ומוטנטים שונים בגן -Indyומצאו שהפחתה נוספת ברמתו או פעילותו של החלבון INDYלא מובילה להארכה בתוחלת החיים .מכאן הסיקו החוקרים שקיימת חשיבות לרמת הביטוי של החלבון ,כלומר ברמת ביטוי נמוכה או גבוהה מדי לא תהיה השפעה על תוחלת החיים של הזבוב. במחקר הביואינפורמטי באמצעות מנוע החיפוש BLASTpנמצאו חלבונים הדומים ברצף שלהם ל- INDYבאדם ,ואחד מהם שקוד הזיהוי שלו AAF73251,הוא חלבון המצוי בקרומי תאים של יונקים ומתפקד כנשא המשחלף תוצרים של מעגל קרבס .מעגל זה הוא שלב בתהליך הנשימה התאית האירובית שבו מתפרקות מולקולות אורגניות לאנאורגניות ,ויוצרות מטבוליטים משניים לאורך התהליך .עודף של מטבוליטים אלה יופנה לבניית מולקולות אחרות כמו הורמונים ,סטרואידים ושומן. בניסויים בזבובים נמצא שהחלבון INDYמתבטא בעיקר בגופי שומן ובמעי -מה שמרמז על תפקודו במטבוליזם של שומן ואנרגיה ובחילוף חומרים. אחת מהנחות החוקרים היא שקיים קשר ישיר בין ההזדקנות לבין המאזן הקלורי .נמצא במחקרים קודמים כי כאשר צריכת הקלוריות באדם מוגבלת במידה אז תוחלת החיים גדלה ,ואילו מצב של הגב לה חריפה על צריכת הקלוריות (במצב רעב) או צריכת קלוריות ללא הגבלה (עודף תזונה) מובילים להאצת תהליך ההזדקנות וקיצור תוחלת החיים .כלומר ,כמות הקלוריות צריכה להיות במידה שתבטיח קיום אופטימלי של כל מערכות הגוף .בהתאם לכך ,החוקרים מצאו שבזבובים בעלי מוטציה בגן לחלבון INDYגורמת לביטוי מופחת של החלבון התקין ,דבר שעשוי להפחית שחלוף מטבוליטים שניוניים תוצרי מעגל קרבס .אלו תנאים המדמים מצב בו צריכת הקלוריות מוגבלת ,דבר המוביל להארכת תוחלת החיים .החוקרים משערים שתרופות הגורמות להפחתה ברמת הביטוי או בפעילות של נשאים המשחלפים את תוצרי מעגל קרבס ,כגון INDY,עשויות לדמות מצב של הגבלת צריכת קלוריות ,ובכך להוביל להארכת תוחלת חיים באדם .תרופות שכאלו עשויות לסייע גם בטיפול במחלות מטבוליות כגון השמנה וסכרת .9חוקרים מעוניינים לבדוק את ההשפעה של רמת ביטוי הגן באדם על תוחלת החיים .כיצד תבדוק את רמת הביטוי ?