PRIMERII OMOLOGI TRANSPOZONULUI ACTIVATOR ÎN
STUDIEREA POLIMORFISMUL MOLECULAR AL
GENOMURILOR VEGETALE
Paşa Lilia
Institutul de Genetică şi Fiziologie a Plantelor al AŞM
Introducere
Elementele transpozabile (ET) reprezintă elemente genetice, care se pot deplasa
dintr-un site al unui cromozom, în un alt site al aceluiaşi cromozom sau a unuia diferit şi,
prin urmare, sînt capabile să modifice constituţia genetică a organismului [1]. În funcţie de
mecanismul transpoziţiei, ET se clasifică în două clase retrotranspozoni şi transpozoni.
Din clasa I fac parte elementele transpozabile ARN numite şi retrotranspozoni sau
retroelemente, care prezintă un mecanism de transpoziţie „copie-inserează” mediat de
ARN [2]. Elementele clasei II sau transpozonii, utilizează un intermediar ADN,
transpoziţia lor asigurîndu-se printr-un proces de tipul „taie-inserează”. Transpozonii
constituie clasa majoritară de ET identificate în genomul plantelor, dar majoritatea
transpozonilor sînt transcripţional inactivi şi imobili [3, 4].
Fiind prezentate în genom într-un număr diferit de copii şi avînd o localizare
aleatorie, ET prezintă interes practic prin perspectiva utilizării lor în studiul
polimorfismului molecular al speciilor. Astfel au fost propuse procedee în baza tehnicii
PCR (polymerase chain reaction – reacţia polimerazei în lanţ) cu utilizarea primerilor
ET, atît a retrotranspozonilor, cum ar fi IRAP (Inter Retrotransposon Amplified
Polymorphism), REMAP (Retrotransposon Microsatellite Amplified Polymorphism),
RBIP (Retrotransposon-Based Insertion Polymorphisms), S-SAP (Sequence-Specific
Amplification Polymorphism) [5, 6], cît şi a transpozonilor, de exemplu, polimorfismul
speciilor şi hibrizilor interspecifici ai g. Helianthus utilizînd primerii ET MuDR [7].
Scopul prezentei lucrări a fost evaluarea primerilor PCR omologi ET Activator (Ac)
al porumbului, în calitate de marcheri în evidenţierea polimorfismului molecular al
speciilor de plante angiosperme, distanţate filogenetic, în genomul cărora au fost
identificate succesiuni „Ac-like”.
Materiale şi metode
Obiectul de cercetare l-au constituit genomurile a cinci specii de plante angiosperme
– Asparagus officinalis L. (sparanghel), Allium cepa L. (ceapă), Magnolia sp. (magnolia),
Buxus sempervirens L. (cimişir), Anethum graveolens L.(mărar).
ADN-ul genomic a fost izolat utilizînd metoda CTAB modificată [8].
În PCR au fost utilizaţi primerii oligonucleotidici specifici, creaţi în Laboratorul
Genetică moleculară al IGFP al AŞM, în baza secvenţei nucleotidice complete a Ac (4565
p. b.) din genomul de Zea mays L., prezentate în baza de date GeneBank [9].
Modelul structurii transpozonului Activator al Zea mays a fost executat utilizînd softul Vector NTI Delux 40, secvenţa nucleotidică completă şi descrierea structurii Ac (4565
p. b.) [9].
Reacţia s-a efectuat în soluţia tampon: 66 mM tris-HCl (pH-8,4), 16 mM (NH4)2SO4,
2,5 mM MgCl2, 0,1% Tween 20, 7 % glicerol, 100 μg · ml-1 BSA (Bovin Serum
Albumin), cîte 0,2 mM de fiecare dNTP, 1,25 U Taq DNA polymeraza (Fermantas), 5 pM
primer şi 5-10 ng ADN.
Pentru amplificarea fragmentelor polimorfe utilizînd cîte un singur primer reacţia s-a
desfăşurat în condiţiile: denaturarea 95 0C – 1 min., alinierea 40 0C – 2 min., extensia 72
0
C – 1 min., 8 cicluri, apoi denaturarea 95 0C – 0,5 min., alinierea 65 0C – 1 min., extensia
72 0C – 1 min., 35 cicluri.
Produsele de amplificare au fost divizate în gelul de agaroză de 2%, cu bromură de
etidiu, prin electroforeză (5-8 V/cm) în soluţia tampon de migrare tris-borat-EDTA (pH
8,3), vizualizate în razele UV (302 nm) şi fotografiate (DigimaxS600/KenoxSamsung).
Pentru calcularea dimensiunilor amplimerilor, s-a utilizat marcherul de referinţă "100
bp Ladder DNA marker" (Axygen biosciences), soft-urile Paint Shop Pro 7 şi Excel (curba
exponenţială y = a*e^bx).
Rezultate şi discuţii
Termenul „Ac-like transposon” este utilizat pentru ET din clasa II cu caracteristici
asemănătoare elementului Ac descoperit de Barbara McClintock la porumb.
Anterior au fost publicate rezultatele privind identificarea în genomurile Asparagus
officinalis L., Allium cepa L., Buxus sempervirens L. Magnolia sp. şi Anethum graveolens
L. a secvenţelor nucleotidice omoloage ET Ac [10].
În cercetările prezente, printr-o serie de testări "single primer PCR" (reacţia
polimerazei în lanţ cu un singur primer), s-a investigat posibilitatea evidenţieri
polimorfismului molecular al genomurilor Asparagus officinalis L., Allium cepa L.,
Magnolia sp., Buxus sempervirens L., Anethum graveolens L. utilizînd primerii omologi
ET Ac al porumbului. Au fost testaţi opt primeri oligonucleotidici specifici, patru – E16,
D3, E17, E18– de la exremitatea 5' a Ac şi patru – E19, E20, E21, E22 – de la extremitatea
3' a Ac. Primerii E16, E19 şi E20 au orientarea 5' → 3', iar D3, E17, E18, E21, E22 3' →
5' (figura 1).
Figura 1. Modelul structurii transpozonului Activator (4565 p. b.) al Zea mays cu
indicarea poziţiei primerilor utilizaţi în studiu. TIR – repetiţii terminale inversate (terminal inverted
repeats), ORFa – cadru deschis citirii (open reading frame)
În rezultatul reacţiilor, desfăşurate în condiţiile descrise mai sus, şi analizei
electroforetice a produselor acestora, au fost obţinute spectre de ADN, care diferă în
dependenţă de primerul şi genomul analizat.
Astfel, în probele cu ADN-ul genomic al speciilor analizate şi primerul E20, au fost
amplificate de la 5 (Allium cepa L.) pînă la 8 (Anethum graveolens L.) fragmente
specifice, cu dimensiunile cuprinse între 230 -1060 p. b. (figura 1, benzile 1-5).
În variantele cu primerului E21 au fost sintetizate de la 6 (Asparagus officinalis L.,
Allium cepa L., Anethum graveolens L.) pînă la 9 (Buxus sp.) fragmente polimorfe, cu
dimensiunile de 200 – 2000 p. b. (figura 1, benzile 6-10).
Figura 1. Electroforegrama produselor PCR amplificate cu utilizarea primerului E20 (1-5) şi E21
(6-10): Asparagus officinalis L (1, 6)., Allium cepa L. (2, 7), Buxus sempervirens L., (3, 8),
Magnolia sp. (4, 9), Anethum graveolens L. (5, 10), M –marcherul
În cazul primerului E18, cu excepţia genomului Allium cepa L., au fost amplificaţi 4
(Magnolia sp.) – 7 (Asparagus officinalis L.) amplimeri specifici cu dimensiunile de la
300 p. b. pînă la 1520 p. b. (figura 2, benzile 1-5 ).
Utilizînd primerul E19, în dependenţă de genom, au fost amplificaţi de la 6 (Buxus
sp.) pîna la 8 (Allium cepa L.) amplimeri specifici, mărimea cărora variază de la 320 pînă
la 2340 p. b. (figura 2, benzile 6-10 ).
Figura 2. Electroforegrama produselor PCR amplificate cu utilizarea primerului E18 (1-5) şi E19
(6-10): Asparagus officinalis L (1, 6)., Allium cepa L. (2, 7), Buxus sempervirens L., (3, 8),
Magnolia sp. (4, 9), Anethum graveolens L. (5, 10), M – marcherul
În cazul primerilor E16 şi E17, pe lîngă genomurile analizate, în studiu a fost inclus
şi genomul de porumb.
Utilizînd primerul E16, au fost amplificaţi de la 3 (Asparagus officinalis L., Anethum
graveolens L.) pînă la 6 (Zea mays) amplimeri specifici pentru fiecare din genomurile
analizate, cu dimensiunile de la 302 pînă la 1746 p. b. (figura 3, benzile 1-6 ).
Primerul E17 a asigurat amplificarea a 1- 5 fragmente polinucleotidice polimorfe, cu
dimensiunile de la 330 pînă la 1218 p. b. (figura 3, benzile 7-10 ).
Figura 3. Electroforegrama produselor PCR amplificate cu utilizarea primerului E16 (1-6) şi E17
(7-12): Asparagus officinalis L (1, 7)., Allium cepa L. (2, 8), Buxus sempervirens L., (3, 9),
Magnolia sp. (4, 10), Anethum graveolens L. (5, 11), Zea mays (6, 12), M – marcherul
Deasemenea şi primerii E22 şi D3 asigură amplificarea a 5-8 şi 2-5 fragmente
polimorfe, cu dimensiunile cuprinse, respectiv, între 295 - 2400 p. b. şi 230 - 1500 p. b.
(figura 4).
Figura 4. Electroforegrama produselor PCR amplificate cu utilizarea primerului E22 (1-5) şi D3
(6-10): Asparagus officinalis L (1, 6)., Allium cepa L. (2, 7), Buxus sempervirens L., (3, 8),
Magnolia sp. (4, 9), Anethum graveolens L. (5, 10), M – marcherul
În baza rezultatelor prezente, dar şi a celor anterioare, deducem posibilitatea utilizării
primerilor omologi elementului transpozabil Activator, în evidenţierea
polimorfismului atît a genomurilor situate la distanţe filogenetice considerabile, cît şi a
genomurilor înrudite, cum ar fi formele parentale şi hibrizii interspecifici de Helianthus
[7].
Concluzie
Primerii omologi elementului transpozabil Activator al Zea mays L. pot fi
consideraţi marcheri universali în evidenţierea polimorfismului molecular al
speciilor de plante angiosperme.
Bibliografie
1. http://www.thefreedictionary.com/transposon (vizitat 26.09.2012).
2. Grandbastien M-A., Audeon C., Bonnivard E. et all. Stress activation and genomic impact
of Tnt1 retrotransposons in Solanaceae. Cytogenet. Genome Res. 2005. Vol.110, p. 229–
241.
3. Craig N., Craigie R.,Gellert M. et all. Mobile DNA II. Washington , DC : Am. Soc.
Microbiol. Press. 2002, p. 16.
4. Ţenea G., Elementele transpozabile, silenţierea şi rolul lor în evoluţia genomului vegetal,
Bucureşti 2002. P. 123-124.
5. Kalendar R., Grob T., Regina M., et all. IRAP and REMAP: Two new retrotransposonbased DNA fingerprinting techniques. Theoretical and Applied Genetics 98.1999, p. 704711.
6. Grzebelus Dtransposon insertion polzmorphism as a new source of molecular markers.
Journal of Fruit and Ornamental Plant Research Vol. 14 (Suppl. 1), 2006.
7. Анисимова И.Н., Туманова Л. Г., Гаврилова В.А., Дягилева А. В., Паша Л. И.,
Митин В. А., Тимофеева Г.И. Нестабильность генома межвидовых гибридов
подсолнечника. В: Генетика, 2009, 8 (45), 1067-1077.
8. Shaghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen R.A., Allard R.W. 1984. Ribosomal
DNA spacer-length polymorphisms in barley. Mendelian inheritance, chromosomal
location, and population dynamics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 80148018.
9. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/22112?report=genbank&log$=nucltop&blast_ran
k=47&RID=7WT4P9FY014 (vizitat 4. 11. 2008).
10. Deaghileva A., Paşa L., Mitin V., Tumanova L. „Ac-like” transposonii în genomurile
plantelor superioare. Buletinul Academiei de Ştiinţe a Moldovei. Ştiinţele vieţii, 2009,
nr.2, p. 70-73.