TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 209-215
NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG BIỆT HÓA CỦA TẾ BÀO GỐC TRUNG
MÔ TỪ MÔ MỠ NGƯỜI THÀNH TẾ BÀO GIỐNG TẾ BÀO GAN IN VITRO
Nguyễn Thị Kim Nguyền*, Trương Hải Nhung, Mai Thị Trang,
Nguyễn Hải Nam, Phạm Văn Phúc
Trường Đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQG tp Hồ Chí Minh, *ntknguyen@hcmus.edu.vn
TÓM TẮT: Nghiên cứu của chúng tôi trình bày kết quả khảo sát khả năng biệt hóa của tế bào gốc trung
mô từ mô mỡ (adipose-derived stem cells-ADSCs) thành tế bào giống tế bào gan in vitro bằng môi trường
biệt hóa sử dụng hóa chất. Bằng các phương pháp kiểm tra kết quả sau biệt hóa chúng tôi đã chứng minh
được ADSCs có khả năng biệt hóa in vitro thành tế bào giống tế bào gan. Tế bào giống tế bào gan
(hepatocyte-like cells-HPCs) có sự thay đổi hình thái từ dạng đặc trưng của tế bào gốc trung mô sang dạng
đa giác với tỷ lệ giữa thể tích nhân tế bào và tế bào chất tăng lên, hình thái này tương tự với tế bào nhu mô
gan. Ngoài ra, HPCs biểu hiện cao các gen hướng gan như: α-fetoprotein, albumin, CK18, CK19 so với
ADSCs đối chứng. Đồng thời, kết quả nhuộm PAS (Periodic acid-Schiff stain) cho thấy HPCs có khả
năng dự trữ glycogen.
Từ khóa: Bệnh gan, biệt hóa tế bào, tế bào gan, tế bào gốc.
MỞ ĐẦU
Xơ gan là một trong những bệnh phổ biến
và là nguyên nhân dẫn đến tử vong cao trong số
các bệnh liên quan đến gan ở Việt Nam. Các
phương pháp điều trị hiện tại đối với căn bệnh
này là cấy ghép gan. Tuy nhiên, việc cấy ghép
gan tồn tại các nhược điểm như khan hiếm
nguồn cấy ghép, giá thành cao và khả năng gây
thải loại miễn dịch.
Tế bào gốc trung mô MSCs (mesenchymal
stem cell) được xem như một nguồn vật liệu tiềm
năng trong liệu pháp điều trị bệnh nhằm thay thế
các tế bào hoặc cơ quan mất chức năng của cơ
thể trong đó có tổn thương gan. Đến nay, MSCs
có thể được phân lập từ rất rất nhiều nguồn khác
nhau nhằm cung cấp nguồn vật liệu đa dạng và
dồi dào cho liệu pháp cấy ghép. Trong số đó, tế
bào gốc trung mô từ mô mỡ ADSCs (adiposederived stem cells) là một ứng cử viên tiềm năng
vì ngoài khả năng tự làm mới và tiềm năng biệt
hóa đa dòng như tế bào gốc trung mô, ADSCs
còn là một nguồn dồi dào cho liệu pháp cấy ghép
tự thân khắc phục các vấn đề về thải loại miễn
dịch trong cấy ghép dị cá thể [2].
Trong các báo cáo trước đó, hADSCs
(human adipose-derived stem cells) đã được
chứng minh có khả năng làm giảm xơ gan trong
mô hình chuột bị xơ gan bằng TAA bởi khả
năng biệt hóa thành tế bào gan nhằm thay thế
cho các tế bào gan bị hư hỏng hoặc cảm ứng các
tế bào nội sinh trong gan tăng sinh và thực hiện
chức năng [6]. Do đó, trong nghiên cứu này
chúng tôi tiến hành kiểm tra khả năng biệt hóa
in vitro của tế bào ADSCs thành các tế bào
giống tế bào gan để hướng tới các nghiên cứu
tiếp theo nhằm ứng dụng chúng trong điều trị
các bệnh thoái hóa tế bào gan.
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tế bào hADSCs sử dụng trong nghiên cứu
này được cung cấp bởi phòng thí nghiệm Tế bào
gốc, Trường đại học Khoa học tự nhiên.
Nuôi cấy tăng sinh hADSCs
Tế bào hADSCs sau khi được thu nhận và
xác định đặc điểm của tế bào gốc trung mô sẽ
được nuôi cấy thứ cấp trong môi trường MSC
Cult Kit (Công ty GeneWorld, Việt Nam). Khi
đạt mật độ 80-90% diện tích bề mặt bình nuôi
cấy, tế bào được xử lý với trypsin/EDTA 0,25%
(Công ty GeneWorld, Việt Nam) và được cấy
chuyền sang bình nuôi cấy mới.
Biệt hóa định hướng gan in vitro
Quy trình biệt hóa: tế bào hADSCs được
nuôi cấy tăng sinh đến P3. Khi tế bào đạt mật
độ 80% bề mặt bình nuôi cấy tiến hành cấy
chuyền qua đĩa 12 giếng được phủ với
fibronectin 5 µg/ml để biệt hóa. Khi tế bào P4
đạt mật độ 80-90% bề mặt nuôi cấy, tiến hành
209
Nguyen Thi Kim Nguyen et al.
biệt hóa với hai môi trường biệt hóa. Tế bào
được biệt hóa qua hai giai đoạn:
Giai đoạn 1: tế bào hADSC P4 được nuôi
cấy 7 ngày trong môi trường cảm ứng với thành
phần là môi trường nuôi cấy được bổ sung với
HGF 20 ng/ml, bFGF 10 ng/ml và nicotiamide
4,9 mM.
Giai đoạn 2: sau 7 ngày tiến hành thay bằng
môi trường biệt hóa với thành phần gồm môi
trường nuôi cấy bổ sung với OMS 20 ng/ml,
dexamethasone 1 µmol/l và ITS 10 ng/ml trong
3 tuần.
Kiểm tra đặc điểm của HPCs sau biệt hóa
Trong quá trình biệt hóa tế bào sử dụng
kính hiển vi quan sát hình thái và ghi nhận sự
thay đổi hình thái mỗi ngày.
Để so sánh mức độ biểu hiện gen định
hướng của tế bào sau biệt hóa với tế bào đối
chứng (tế bào hADSCs không biệt hóa và tế bào
ung thư gan người HepG2), phản ứng RT-PCR
(SuperScript® III One-Step RT-PCR System
with Platinum®Taq, InvitrogenTM) được sử
dụng cùng với các cặp mồi chuyên biệt cho các
gen đặc trưng cho tế bào gan (bảng 1).
Bảng 1. Các cặp mồi được sử dụng trong nghiên cứu (Sigma)
Tên gen
CK18
CK19
Albumin
Anpha
fetoprotrein
Fibronectin
Mồi xuôi
Mồi ngược
Mồi xuôi
Mồi ngược
Mồi xuôi
Mồi ngược
Mồi xuôi
Mồi ngược
Mồi xuôi
Mồi ngược
Trình tự
GAGATCGAGGCTCTCAAGGA
CAAGCTGGCCTTCAGATTTC
ATGGCCGAGCAGAACCGGAA
CCATGAGCCGCTGGTACTCC
TGCTTGAATGTGCTGATGACAG
AAGGCAAGTCAGCAGGCATCTC
TGCAGCCAAAGTGAAGAGGGAA
CATAGCGAGCAGCCCAAAGAAG
TGAAGAGGGGCACATGCTGA
GTGGGAGTTGGGCTGACTCG
Kết quả điện di sản phẩm PCR được phân
tích bằng phần mềm ImageJ (National Institutes
of Health) nhằm so sánh mức độ biểu hiện các
gen định hướng gan của các dòng tế bào.
Kiểm tra chức năng dự trữ glycogen
Để kiểm tra chức năng dự trữ glycogen của
tế bào giống tế bào gan sau biệt hóa, tế bào
hADSCs đối chứng, HepG2 và HPCs được cố
định và nhuộm PAS ở bệnh viện Chợ Rẫy,
thành phố Hồ Chí Minh.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
Nuôi cấy thứ cấp tế bào hADSCs
Kết quả nhuộm Giemsa quan sát hình thái
cho thấy, tế bào hADSCs không có sự thay đổi
hình thái sau nhiều thế hệ từ P3, P4, P5 và P6
(hình 1).
Kết quả biệt hóa thành tế bào giống tế bào
gan
210
Kích thước sản
phẩm (bp)
357
328
162
217
274
Từ giai đoạn biệt hóa ngày 5, tế bào đã có
sự thay đổi hình thái, cụ thể là chuyển từ dạng
đặc trưng trung mô sang dạng tế với hình dạng
đa giác đặc trưng với tế bào gan (hình 2). Bên
cạnh đó, một số tế bào trong nghiên cứu này ở
giai đoạn trưởng thành cũng xuất hiện 2 nhân
tương tự nghiên cứu của Lotfi (2012) [3] và
Schwartz (2002) [7]. Hình thái đa nhân của tế
bào cảm ứng giai đoạn trưởng thành được kiểm
tra thông qua phương pháp nhuộm H & E và
Hoechst. Sự thay đổi hình dạng của tế bào cảm
ứng theo thời gian (tế bào có hình thái giống tế
bào gan) là một trong những tiêu chí ban đầu
đánh giá quá trình biệt hóa của hADSCs thành
tế bào giống tế bào gan.
Dựa vào kết quả (hình 3a) chúng tôi nhận
thấy sản phẩm RT-PCR gen CK19 xuất hiện ở
giếng 2 và 3 với kích thước như dự đoán (357
bp), trong khi đó không có sản phẩm xuất hiện
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 209-215
ở giếng số 1. Kết quả của (hình 3b) chứng tỏ tế
bào biệt hóa thành tế bào giống tế bào gan đang
ở giai đoạn sớm vì CK19 là gen đặc trưng của tế
bào mật, các tế bào tiền thân của gan, tế bào ung
thư gan [11].
Kết quả ở hình 3 cho thấy, gen α-fetoprotein
xuất hiện ở giếng số 1, 2, 3 với một vạch có
kích thước như dự đoán. So sánh cường độ sáng
của sản phẩm RT-PCR gen α-fetoprotein bằng
phần mềm ImageJ, chúng tôi nhận thấy, cường
độ sáng của α-fetoprotein ở giếng số 2, 3 gấp 8
lần so với giếng số một (hADSCs). Cùng với
kết quả kiểm tra sự biểu hiện của gen CK19, sự
biểu hiện của gen α-fetoprotein ở nhóm biệt hóa
góp phần khẳng định các tế bào biệt hóa thành
tế bào giống tế bào gan đang trải qua giai đoạn
sớm trong quá trình trưởng thành của tế bào
gan.
Hình 1. Hình thái tế bào hADSCs ở thế hệ thứ 3 (a), thứ 4 (b), thứ 5 (c) và thứ 6 (d)
Hình 2. Hình thái tế bào hADSCs sau khi biệt hóa ngày 0 (a), ngày thứ 5 (b),
ngày thứ 15 (c), ngày thứ 21 (d)
211
Nguyen Thi Kim Nguyen et al.
a
b
Hình 3. a. Kết quả điện di kết quả RT-PCR sau 5 ngày biệt hóa: giếng 1. Đối chứng (ADSC chưa
biệt hóa); giếng 2. ADSC biệt hóa sau 5 ngày; giếng 3. Chứng dương (tế bào ung thư gan HepG2);
b. Kết quả phân tích độ sáng của các gen chuyên biệt giữa các lô thí nghiệm bằng phần mềm
ImageJ: 1. ADSCs đối chứng; 2. ADSC biệt hóa ngày 5; 3. HepG2.
a
b
Hình 4. a. Kết quả RT-PCR gen albumin và CK18: 1. ADSCs đối chứng; 2. ADSC biệt hóa ngày
21; 3. HepG2; b. Kết quả phân tích độ sáng của các gen chuyên biệt giữa các lô thí nghiệm bằng
phần mềm ImageJ: 1. ADSCs đối chứng; 2. ADSC biệt hóa ngày 21; 3. HepG2.
So sánh với các kết quả nghiên cứu sự biểu
hiện các gen albumin, CK18 của Schwartz et al.
(2002) [7]; Seo et al. (2005) [8]; Banas et al.
(2007) [1] kết quả mà chúng tôi đạt được cũng
tương tự như các kết quả đã công bố trong các
nghiên cứu của các tác giả trên (hình 4).
212
Ngoài ra, chúng tôi còn phân tích thêm sự biểu
hiện của Bcl-2, là gen mã hóa cho protein kháng
apoptosis ở tế bào ung thư gan [9], bên cạnh chức
năng kháng sự tự chết của tế bào (apoptosis), Bcl-2
còn có chức năng kháng stress oxy hóa và biểu hiện
mạnh ở tế bào ung thư hay khi gan bị tổn thương.
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 209-215
a
b
Hình 5. (a) Kết quả RT-PCR gen Bcl2 và Gapdh: (1) ADSCs đối chứng; (2) ADSC biệt hóa ngày
21; (3) HepG2; (b) Kết quả phân tích độ sáng của các gen chuyên biệt giữa các lô thí nghiệm bằng
phần mềm ImageJ: (1) ADSCs đối chứng; (2) ADSC ngày biệt hóa 21; (3) HepG2
Hình 6. Kết quả nhuộm PAS: tế bào hADSCs P4 (a), tế bào HepG2 (b), tế bào HPC (c)
Kết quả RT-PCR gen Bcl-2 (hình 5a) ở
nhóm đối chứng và nhóm biệt hóa có vạch mờ
như nhau, còn ở lô HepG2 vạch sáng và rõ hơn
có kích thước đúng như dự đoán (101 bp). Kết
quả điện so sánh cường độ sáng của gen sử
dụng phần mềm ImageJ (hình 5b) cho thấy,
cường độ sáng của gen Bcl-2 ở nhóm HepG2
gấp đôi cường độ sáng ở nhóm đối chứng (tế
bào hADSCs không biệt hóa) và lô biệt hóa. Kết
quả này cho thấy quá trình cảm ứng biệt hóa
hADSCs thành tế bào giống tế bào gan bằng
môi trường chứa nhân tố cảm ứng
dexamethasone và ITS không làm cho hADSC
biểu hiện gen ung thư.
Kết quả nhuộm PAS cho thấy, tế bào HPC
có tế bào chất bắt màu hồng với thuốc nhuộm so
với đối chứng hADSCs. Tuy nhiên, cường độ
màu vẫn còn thấp hơn nhiều so với HepG2, kết
quả này chứng tỏ HPC có khả năng dự trữ
glycogen tương tự như tế bào gan (hình 6).
Trong giai đoạn 1 của quá trình biệt hóa,
chúng tôi sử dụng các nhân tố biệt hóa như
HGF, FGF và nicotinamide. Ở giai đoạn 2,
dexamethasone và ITS được dùng tiếp tục trong
việc cảm ứng biệt hóa và trưởng thành các tế
bào hADSCs thành tế bào giống tế bào gan.
Theo nhiều báo cáo, dexamethasone là một
hormone glucocorticoid tổng hợp, tác động lên
các thụ thể trong tế bào chất, xúc tiến sự tổng
hợp glucose và glycogen ở gan, ức chế sự phát
triển của nguyên bào sợi và các tế bào ung thư
gan. Trong nuôi cấy in vitro, dexamethasone
thường được bổ sung vào môi trường nuôi để
làm tăng khả năng sống sót và chức năng của tế
213
Nguyen Thi Kim Nguyen et al.
bào gan. Thêm vào đó, ITS thúc đẩy sự tăng
sinh và trưởng thành cũng như duy trì sự sống
và chức năng của tế bào gan. Các nhân tố biệt
hóa như HGF, FGF, nicotinamide được sử dụng
nhiều trong các nghiên cứu biệt hóa tế bào gan
từ tế bào gốc trung mô ở giai đoạn định hướng.
Taléns-Visconti et al. (2006) [10] đã tiến hành
biệt hóa BMSCs và hADSCs thành tế bào giống
tế bào gan qua 2 giai đoạn: giai đoạn 1 cảm ứng
biệt hóa bằng HGF, FGF; giai đoạn 2 cảm ứng
biệt hóa và trưởng thành bằng dexamethasone,
ITS và OSM. Sau 21 ngày cảm ứng biệt hóa,
các tế bào biệt hóa cũng có hình thái và chức
năng giống tế bào gan [10]. Tương tự, Banas et
al. (2007) [1] sử dụng môi trường cảm ứng gồm
nhiều nhân tố cảm ứng (trong đó cũng có
dexamethasone và ITS) để cảm ứng biệt hóa
hADSCs thành tế bào giống tế bào gan. So sánh
với các nghiên cứu trên, nghiên cứu của chúng
tôi biến đổi qui trình của Taléns-Visconti (2006)
[10], chỉ sử dụng 2 nhân tố cảm ứng là
dexamethasone và ITS trong giai đoạn 2 để cảm
ứng hADSCs thành tế bào giống tế bào gan, và
kết quả cũng rất khả thi, đó là các tế bào này có
khả năng thay đổi hình thái, biểu hiện gen, và
có một số chức năng giống tế bào gan (bảng 2).
Tuy nhiên, về hiệu quả biệt hóa thì có thể
không giống nhau giữa các nghiên cứu do
nhiều yếu tố về kỹ thuật, điều kiện phòng
thí nghiệm.
Bảng 2: Bảng tổng kết sự biểu hiện gen của tế bào ADSC sau cảm ứng biệt hóa thành tế bào giống
tế bào gan
Giai đoạn trước
Gen
Biệt hóa ngày thứ 5
Biệt hóa ngày thứ 21
biêt hóa
α-fetoprotein
+
CK18
+
CK19
+
Albumin
+
Bcl-2
+
GADPH
+
+
+
KẾT LUẬN
Trong nghiên cứu này, vì tế bào biệt hóa in
vitro chưa được chứng minh hoàn toàn về cấu
trúc và chức năng của một tế bào gan thực thụ
nên chúng tôi gọi đây là tế bào giống tế bào
gan. Tuy nhiên, với những kết quả về hình thái,
về biểu hiện gen và về khả năng tích trữ
glycogen, đã phần nào có thể chứng minh tế bào
gốc đa năng thu từ mô mỡ hoàn toàn có khả
năng chuyển biệt hóa thành tế bào giống tế bào
gan và mở ra tiềm năng to lớn trong điều trị các
bệnh về thoái hoá ở gan.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Banas A., Teratani T., Yamamoto Y.,
Tokuhara M., Takeshita F., Quinn G.,
Okochi H., Ochiya T., 2007. Adipose tissueserived mesenchymal stem cells as a source
of human hepatocytes. Hepatology, 46: 219228.
2. Kim S. J., Park K. C., Lee J. U., Kim K. J.,
214
Kim D. G., 2011. Therapeutic potential of
adipose tissue-derived stem cells for liver
failure according to the transplantation
routes. J. Korean Surg. Soc., 81(3): 176186.
3. Lotfi A. S., Khoshdel A., Soleimani M.,
Daliri M., Adibi B., 2011. High yield
generation of hepatocyte like cells from
adipose derived stem cells. Scientific
Research and Essays, 7(10): 1141-1147.
4. Peng L., Zhu H., Zheng Y., Xie C., Chong
Y., Gao Z., 2011. Mesenchymal stem cells
differentiate into hepatocyte-like cells under
different induction systems in hepatitis B
patients with liver failure. Afr. J.
Biotechnol., 10(5): 840-847.
5. Piryaei A., Valojerdi M. R., Shahsavani M.,
Baharvand H., 2010. Differentiation of bone
marrow-derived mesenchymal stem cells
into hepatocyte-like cells on nanofibers and
their transplantation into a carbon
TẠP CHÍ SINH HỌC 2014, 36(1se): 209-215
tetrachloride induced liver fibrosis model.
Stem Cell Rev. Rep., 7: 103-118.
6. Puglisi M. A., Saulnier N., Piscaglia A. C.,
Tondi P., Agnes S., Gasbarrini A., 2011.
Adipose tissue-derived mesenchymal stem
cells and hepatic differentiation: old
concepts and future perspectives. Eur. Rev.
Med. Pharmacol. Sci., 15: 355-364.
7. Schwartz R. E., Reyes M., Koodie L., Jiang
Y., Blackstad M., Lund T., Lenvik T.,
Johnson S., Hu W. S., Verfaillie C. M.,
2002. Multipotent adult progenitor cells
from bone marrow differentiate into
functional hepatocyte-like cells. J. Clin.
Invest., 109: 1291-1302.
8. Seo M. J., Suh S. Y., Bae Y. C., Jung J. S.,
2005. Differentiation of human adipose
stromal cells into hepatic lineage in vitro
and in vivo. Biochem. Bioph. Res. Com.,
328: 258-264.
9. Takahashi M., Saito H., Miyashita T.,
Kosuga M., Sumisa F., Yamada M.,
Ebinuma H., Ishii H., 1999. Overexpression
of Bcl-2 protects human hepatoma cells
from Fas-antibody-mediated apoptosis. J.
Hepatol., 31(2): 315-322.
10. Taléns-Visconti R., Bonora A., Jover R.,
Mirabet V., Carbonell F., Castell J. V.,
Gómez-Lechón M. J., 2006. Hepatogenic
differentiation of human mesenchymal stem
cells from adipose tissue in comparison with
bone marrow mesenchymal stem cells.
World J. Gastroentero., 12(36): 5834-5845.
11. Yang X. R., Xu Y., Shi G. M., 2008.
Cytokeratin 10 and Cytokeratin 19:
Predictive Markers for Poor Prognosis in
Hepatocellular Carcinoma Patients after
Curative Resection. Clin. Cancer Res., 14:
3850-3859.
EXPERIMENTAL RESEARCH ON EVALUATING DIFFERENTIATION
ABILITY OF ADIPOSE- DERIVED MESENCHYMAL STEM CELLS INTO
HEPATOCYTE- LIKE CELLS IN VITRO
Nguyen Thi Kim Nguyen, Truong Hai Nhung,
Mai Thi Trang, Nguyen Hai Nam, Pham Van Phuc
University of Science, Viet Nam National University Ho Chi Minh city
SUMMARY
Mesenchymal stem cells (MSCs) have many properties that suggest considerable potential utility in
cellular therapy of many disorders. It was proved that MSCs have characteristics including extensive
proliferative potential and the ability to undergo multilineage differentiation. In previous publications, it was
demonstrated that hADSCs (human adipose-derived stem cells) could alleviate liver fibrosis in CCl4 induced liver fibrosis mouse model by differentiating into hepatocytes replacing damaged hepatocytes or inducing
proliferation of endogenous cells in liver for functioning. In this experiment, hADSCs isolated from
Vietnamese women’s adipose tissue were used to evaluate ability of differentiation into hepatocyte-like cells
in vitro. After differentiation, properties of hADSCs-derived hepatocyte-like cells were determined by
changes of morphology, hepatocyte-specific gene expression (α-fetoprotein, albumin, cytokeratin 18,
cytokeratin 19) and functionally tested by cytoplasmic accumulation of glycogen. The results showed that
hADSCs differentiated into hepatocyte-like cells in vitro successfully by changes of morphology, increase in
gene expression and ability of cytoplasmic glycogen accumulation. This study is the fundamental experiment
for further experiments on using transplantation of hADSCs as treatment methods of liver disorders.
Keywords: Cirrhosis, hepatocytes, hepatic differentiation, stem cells.
Ngày nhận bài: 15-7-2013
215