Instituto Tecnológico y de Estudios Superiores de Monterrey
Campus Puebla
Probabilidad y estadística
Profesor: Julio César Ramírez San Juan
Proyecto final
Resistencia bacteriana de​ Escherichia coli ​y​ Pseudomonas
aeruginosa ​en extractos naturales y antibióticos.
Andrea Rivera Ahumada A01324157
Carlos Joaquín Pérez Guzmán A00819997
Emilio García Pinedo A01730387
6 de mayo de 2019
Enero-Mayo 2019
Introducción
Según la ​Organización Mundial de la Salud​, “Al tomar antibióticos que no necesitamos
estamos acelerando la aparición de resistencia a ellos” (s.f.) En otras palabras, esto significa
que la efectividad de los medicamentos cada vez es menor en menos tiempo. Gracias a la
capacidad mutagénica de los microorganismos, estos tienen a generar enfermedades con
sintomatología prolongada por mayor tiempo, eleva los índices de mortalidad y los costos
aumentan. (Instituto de Salud Pública, s.f.).
Los remedios caseros se han utilizado para combatir signos y síntomas de enfermedades. Este
tipo de conocimiento ha sido transmitido de generación en generación y han logrado sustituir
a los fármacos y/o antibióticos en algunos casos. Sin embargo, existen diferentes posturas en
las cuales se discute si los remedios caseros son efectivos o no. En un estudio realizado por
Felicity Bishop, profesora asociada de Psicología de la Salud en la Universidad de
Southampton, demostró que los remedios tienen el efecto placebo, es decir, aunque carezcan
de acción curativa, producen un efecto terapéutico si el paciente los usa convencido de que es
un medicamento eficaz (Brown, 2018).
En internet, existe un gran número de páginas web de carácter no científico recomiendan
plantas y forma de preparación distinta. Un ejemplo de estas es la página de Psicología y
mente. Un punto a favor es a pesar de que tiene referencias bibliográficas, el autor no es
especialista en el tema. Por ello, este trabajo se centra en probar la efectividad de los
remedios propuestos por la web. Las plantas propuestas son: ​Mentha piperita ​(menta),
Zingiber officinale (jengibre), ​Mentha spicata (hierbabuena), ​Thymus vulgaris (tomillo),
Allium sativum (ajo) y ​Chamaemelum nobile (manzanilla). Estas plantas fueron escogidas
debido a que estas tienen propiedades que ayudan a contrarrestar síntomas y signos que
ocasionan las bacterias que se mencionan a continuación.
Para probar la sensibilidad o el grado de resistencia de ​Escherichia coli 25922 y
Pseudomonas aeruginosa 77853 en este trabajo fue necesario usar la técnica in vitro de
antibiograma. En la medida de lo posible, estas intentarán reproducir condiciones fisiológicas
del humano así como también favorecer el crecimiento bacteriano. Este tipo de técnica se
utiliza en cuatro situaciones particulares. La primera es cuando difícilmente se puede prever
la sensibilidad de un microorganismo ante un agente antimicrobiano. La segunda es necesaria
para aquellos microorganismos con gran capacidad mutagénica, ya que estos se necesitan
mantener en constante observación para posteriormente informar la comunidad médica sobre
aquellas enfermedades que hayan desarrollado una resistencia. La siguiente situación está
vinculada con enfermedades que pueden poner en riesgo la vida del paciente y se necesite un
tratamiento específico, un ejemplo es la meningitis. La último situación es para aquellas
enfermedades que muestren resistencia a los antibióticos que normalmente se usa para su
tratamiento (Negroni, 2009).
El concepto básico de antibiograma es la difusión de las partículas del agente microbiano,
generando así una zona radial de inhibición de crecimiento bacteriano. En este se coloca
sensidiscos, también llamados discos de difusión, en un medio inoculado con
microorganismos. El tamaño del halo de inhibición dependerá más de la tasa de difusión que
de la sensibilidad del antibiótico (​Sumbali & Mehrotra, 2009 ​).
Para explicarlo de forma gráfica, se debe suponer que el antibiótico aplicado en el disco es un
punto negro sólido, el cual, se irá degradando de color de forma radial conforme al moviendo
a lo largo del medio como se representa en la figura 1.
Figura 1. Representación de la difusión del antibiótico a lo largo del tiempo en un agar.
Ahora bien, la resistencia del microorganismo es un mecanismo de adaptación (​Sprenger,
2015). Por lo tanto, las cepas más adaptadas/resistentes podrán crecer más cerca de donde
originalmente se colocó el antibiótico. En la figura 2, se puede apreciar de forma más
detallada la explicación anterior.
Figura 2. Representación del crecimiento bacteriano según su resistencia.
Para los datos que se generarán en este proyecto usaremos conceptos de probabilidad y
estadística para describirlos y analizarlos. Para la descripción se usarán datos como la media
y la desviación estándar, con el fin de saber el comportamiento de los antibióticos con las
bacterias utilizadas.
El coeficiente de correlación es una medida de regresión que pretende cuantificar el grado de
variación conjunta entre dos variables, si se representan en un diagrama de dispersión los
valores que toman dos variables, el coeficiente de correlación señala lo bien o mal que el
conjunto de puntos representados se aproxima a una recta. También se calculará la
probabilidad de que al tomar un antibiótico al azar, este tenga un efecto positivo para
erradicar el crecimiento bacteriano.
Materiales y métodos
Como primer paso fue necesario elaborar extracciones líquido-líquido de los remedios
escogidos. Posteriormente se tomaron y cortaron dientes de ajo. Luego se cortaron las flores
de la manzanilla, mientras que el jengibre se cortó en rodajas. Se tomaron únicamente las
hojas del tomillo, hierbabuena y menta. Después se colocaron en agua previamente calentada
con una temperatura entre 90-100ºC durante 15 minutos para obtener los extractos. Para el
proceso de esterilización se utilizó una membrana de 0.22 ul. Por otro lado, también se
prepararon soluciones de estreptomicina, kanamicina, gentamicina y ampicilina con
concentraciones de 100 ug/mL, 50 ug/mL, 80 ug/mL y 100 ug/mL respectivamente.
El siguiente paso fue elaborar medio agar nutritivo con una concentración de 23 g/L. Se dejó
esterilizando 15 minutos a 121ºC y 15 psia. Se vertió el medio en placas petri en zona de
esterilidad y se dejó enfriar por unos cuantos minutos.
Posteriormente, se tomaron 200 ul de dos soluciones con caldo nutritivo; una sembrada con
E. coli y la otra con ​P. aeruginosa​. Después se colocó el volumen pipeteado en placas petri y
rápidamente fueron sembradas mediante el método de siembra masiva. En total, se cultivaron
cuatro placas con inóculo de ​E. coli y​ el mismo número de placas con ​P. aeruginosa.​
Segundos después se colocaron discos de difusión estériles. En ellos se les añadió 15 ul del
agente antimicrobiano. Para finalizar, se dejaron incubando las placas a 37ºC durante 24
horas. Al finalizar el periodo de incubación, se midió el diámetro del halo de inhibición.
Figura 3. Extractos preparados​
​Figura 4. Colocación de discos
Figura 5. Medición de halos de inhibición
Resultados y discusión
Resultados de los extractos naturales
Figura 6. Medición por triplicado de 6 extractos naturales en ​E. coli​.
Figura 7. Medición por triplicado de 6 extractos naturales en ​P. aeruginosa​.
Con los resultados obtenidos, se puede observar que las dos bacterias utilizadas en el
experimento son resistentes a los extractos naturales, ya que no se formó un halo de
inhibición en los tres ensayos. Ahora bien, los extractos se realizaron como una persona
normalmente lo haría en su hogar. Sin embargo, en la literatura se encontró que en todos las
extracciones se realizaron con etanol o metanol cercano al 100% y no con agua (Azuero,
2016; Castillo, 2017; ,Guevara 2012). Esto se debe que el etanol y el metanol son compuestos
no polares, en consecuencia puede arrastrar compuestos no polares e incluso los compuestos
polares que se encuentran dentro de las plantas (Azuero, 2016). En cambio, el agua
únicamente arrastra compuestos altamente polares (Pasto & Johnson, 2003). Por lo tanto, se
puede concluir que los compuestos con efecto antimicrobiano son no polares y únicamente
serán arrastrados por de la misma especie.
Resultados de los antibióticos
Figura 8. Medición por cuadruplicado de 4 antibióticos en ​E. coli​.
Figura 9. Medición por cuadruplicado de 4 antibióticos en ​P. aeruginosa.​
Gráfica 1. Promedio del diámetro del halo de inhibición en ​E. coli.​
Antibióticos Estreptomicina
Desviación
2.88
Gentamicina
Kanamicina
Ampicilina
1.65
2.03
1.86
Tabla 1. Desviación estándar del halo de inhibición en ​E. coli​.
Gráfica 2. Promedio del diámetro del halo de inhibición en ​P. aeruginosa.​
Antibióticos Estreptomicina
Desviación
1.04
Gentamicina
Kanamicina
Ampicilina
1.10
2.18
1.16
Tabla 2. Desviación estándar del halo de inhibición en ​P. aeruginosa.​
Escherichia coli
Antibiótico
Resistente (mm)
Intermedio (mm)
Sensible (mm)
Estreptomicina
<=11
12-14
>=15
Gentamicina
<=12
13-14
>=15
Kanamicina
<=13
14-17
>=18
Ampicilina
<=13
14-16
>=17
Tabla 3. Susceptibilidad antibiótica de ​E. coli ​(Cockerill et al., 2013).
Escherichia coli
Antibiótico
Resistente (mm)
Intermedio (mm)
Sensible (mm)
Estreptomicina
24.82
Gentamicina
13.885
Kanamicina
25.465
Ampicilina
23.3
Tabla 4. Susceptibilidad antibiótica de las mediciones promediadas del halo de inhibición para 4 antibióticos en ​E. coli.​
Pseudomonas aeruginosa
Antibiótico
Resistente (mm)
Intermedio (mm)
Sensible (mm)
Estreptomicina
14
15-20
>21
Gentamicina
12
13-14
>15
Kanamicina
13>=
14-16
=>17
Ampicilina
<13
14-17
>17
Tabla 5. Susceptibilidad antibiótica de ​P. aeruginosa (​ Reynolds, 2019).
Pseudomonas aeruginosa
Antibiótico
Resistente (mm)
Intermedio (mm)
Estreptomicina
Gentamicina
28.035
9.31
Kanamicina
Ampicilina
Sensible (mm)
16
9.505
Tabla 6. Susceptibilidad antibiótica de las mediciones promediadas del halo de inhibición para 4 antibióticos en ​P.
aeruginosa​.
De acuerdo a los resultados obtenidos en los cuatro antibióticos utilizados, se puede observar
que a diferencia de los extractos naturales, si existe susceptibilidad a los medicamentos por
parte de las bacterias. En un antibiograma, existen parámetros que determinan si una bacteria
susceptible a los antibióticos. Los valores en las tablas 3 y 5, se muestran los parámetros, es
decir, los rangos de diámetro de los halos de inhibición para determinar si la bacteria es
resistente o sensible, obtenidos de diferentes estudios. Por otro lado, las tablas 4 y 6 indican
los valores promediados de las mediciones.
Ahora bien, en el artículo de Cantón et al., se puede encontrar que realizó ensayos con
diferentes concentraciones y determinó el diámetro del halo de inhibición de cepas de ​E. coli
sensibles, intermedias y resistentes. Al calcular la correlación ambas variables se concluyó
que la relación entre ellas es inexistentes, es decir, el diámetro no es dependiente de la
concentración o viceversa.
Coeficiente de correlación
El siguiente apartado se muestran los gráficos y el resultado del coeficiente de correlación
para las concentraciones y el tamaño del halo de inhibición para considera a ​E. coli como
resistente, intermedio o sensible al antibiótico. En el primer gráfico se observan los valores de
la cantidad de antibiótico en los discos en µg, en los siguientes 3 se ven los valores del
diámetro para considerarse sensible, intermedio y resistente. Y por último el coeficiente de
correlación relacionando la concentración con cada uno de los diámetros de resistente,
intermedia y sensible.
Estos valores de los coeficientes de correlación son cercanos a cero lo que indica que entre la
concentración y el diámetro de inhibición es muy poca la relación que tienen. Se concluye
que la concentración no es determinante para erradicar la enfermedad sino el antibiótico
mismo y sus propiedades; por ejemplo, el espectro de acción o el mecanismo de acción.
Gráfica 3. Cantidad de antibiótico en cada disco.
Gráfica 4. Diámetro de inhibición de ​E. coli.​ Sensible.
Gráfica 5. Diámetro de inhibición de ​E. coli.​ Intermedio.
Gráfica 6. Diámetro de inhibición de ​E. coli.​ Resistente.
Gráfica 7. Coeficiente de correlación entre concentración y diámetro.
Probabilidad de consumir un antibiótico y que este sea efectivo
Es posible utilizar una distribución binomial como herramienta para lograr calcular el éxito
de probabilidad de la ingesta de un antibiótico al azar y que este muestre una actividad
antimicrobiana. De acuerdo con la tabla 4 se obtuvieron tres casos donde la ​E. coli se mostró
sensible y en solo un caso mostró resistencia intermedia. De igual modo, en la tabla 6 mostró
una resistencia a dos antibióticos, una resistencia intermedias y un sensibilidad a un
antibiótico. Se determinó únicamente como caso de éxito en aquellos escenarios donde la
bacteria se mostrará sensible al antimicrobiano. Por otro lado, cualquier otro escenario se
consideró como fracaso. Los resultados se muestran a continuación.
Ecuación de Distribución Binomial
P (y) = (nCy)p y q n−y
E. coli
Cálculo
Resultado
P. aeruginosa
P (y) = (4C3)0.75 3 0.25 4−3 P (y) = (4C1)0.25 1 0.75 4−1
P (y) = 0.4218
P (y) = 0.4218
Tabla 7. Resultados de cálculo de probabilidad con distribución binomial.
Como se muestra en los resultados, la probabilidad de consumir cualquiera de los antibióticos
utilizados y que se erradique una de estas bacterias, es la misma.
Conclusión
El uso masivo de los antibióticos durante los últimos años está ejerciendo presión al cambio a
las bacterias, provocando, resistencias a varios antibióticos. Resultando que tratamientos que
en un principio eran eficaces ahora resulten inofensivos para el patógeno. Es importante
mencionar que la resistencia a los antibióticos e algo inevitable, pero, con el uso indebido y
abusivo de estos provoca un aceleramiento a este proceso. Para prevenir y controlar la
propagación de resistencias a los antibióticos la población puede tomar antibióticos
únicamente cuando los prescriba un profesional, prevenir infecciones teniendo una higiene
suficiente. Claro está no es solo trabajo de la población en general, se puede apoyar esta
prevención con leyes, profesionales de salud y con el sector agrícola.
Por todo lo anterior, en este estudio se exhorta al lector a tomar medicamentos de forma
responsable para evitar el daño a la ecología del ambiente que rodea al individuo como señala
el Instituto de Salud Pública (s.f.).
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