Uploaded by Mhateo Sanchez Albarracin

Determinación de b-caroteno en Mango de Azucar

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Determinación de ​β​-caroteno en mago de azúcar (​mangifera indica​) por medio de las
técnicas de UV-Vis y UHPLC
Carlos Edwin Gonzalez, Matheo Sanchez Albarracin, Daniel Felipe Leal Herrera
Universidad Nacional de Colombia, Facultad de ciencias, Departamento de Química
Abstract
In the article the results of the determination of β-carotene in a mango sample (mangifera indica) are
presented, through the development of a UV-Vis and UHPLC method. The analysis carried out were carried
out by means of the external standard quantification method and by the UV-Vis carotenoid quantification
protocol. Obtaining as a result an average concentration of 17.6 mg / 100g of fresh pulp for the UV-vis
method and a concentration of 5.7 mg / 100g of fresh pulp for UHPLC; with limits of quantification (LOQ) of
28.1 mg / L and 1.6 mg / L respectively.
keywords:​ β-carotene, UV-Vis, UHPLC.
Resumen
En el artículo se presentan los resultados de la determinación de β
​ ​-caroteno en una muestra de mango
(​mangifera indica)​ , mediante el desarrollo de un método UV-Vis y UHPLC. Los análisis realizados se
llevaron a cabo por medio del método de cuantificación de patrón externo y por protocolo de cuantificación de
carotenoides por UV-Vis. Obteniendo como resultado una concentración promedio 17,6 mg/100g de pulpa
fresca para el método de UV-vis y una concentración de 5,7 mg/100g de pulpa fresca para UHPLC; con
límites de cuantificación (LOQ) de 28,1 mg/L y de 1,6 mg/L respectivamente.
Palabras clave : ​ β-carotene, UV-Vis, UHPLC.
1. Introducción
La coloración en la mayoría de objetos que vemos
diariamente se asocian a compuestos químicos que
confieren dicha propiedad. Los colores observados
en los alimentos se deben a la presencia de
pigmentos naturales, los cuales son compuestos
químicos que se caracterizan por poseer uno o
varios cromóforos en su estructura, los cuales
absorben a una longitud de onda específica y
emiten a una longitud de onda en la región del
espectro visible. Los pigmentos naturales son
extraídos en su mayoría de plantas.
Las
tonalidades como amarillas, naranjas y rojas son
debidas a la presencia de carotenoides, pigmentos
orgánicos que pertenecen a la familia de los
terpenos, lo cual implica que están formados por
unidades de isopreno y su síntesis se presenta a
partir de isopentenil pirofosfato (Figura 1) (Sing.
O , 1997).
Los carotenoides pueden dividirse en dos grandes
grupos: los carotenos y las xantofilas. Los
carotenos se caracterizan por ser hidrocarburos,
mientras que las xantofilas son derivados
oxigenados de carotenoides que se presentan como
alcholores, aldehídos, ácidos, ésteres, epoxisidos
que resultan ser solubles en sustancias polares
como el metanol, entre estos se tiene como
Figura 1​: Esquema de síntesis de carotenos y xantofilas
como ​provitamina A para la formación de retinol,
molécula de importancia para la protección y
conservación del tejido ocular (Sing.O , 1997).
Por la razón anterior, se ha determinado el
contenido de β-caroteno presente en mango de
azúcar (mangifera indica), fruto tropical de
consumo común en Colombia.
Figura 2:​ β-caroteno y derivados oxigenados (xantofilas).
ejemplo la transformación de β-caroteno a
β-criptoxantina y finalmente a zeaxantina siendo
estos dos últimos xantofilas (Figura 2).
La importancia de estos compuestos en el ámbito
de la salud, es la variedad de propiedades que estos
compuesto pueden aportar al organismo tales como
ser antioxidantes, provitamina A, inhibidores de
cáncer y efectos tales como prevención de
enfermedades cardiovasculares, así como de la
degeneración macular además de decrecimiento de
la formación de cataratas.
A la fecha se han logrado diferenciar cerca de 600
carotenoides diferentes, sin embargo esto
compuestos han sido encontrados únicamente en
tejidos vegetales y algunos tipos de bacterias,
razón por la cual estos compuestos son
introducidos al organismo mediante dieta, con lo
que una identificación del contenido de estos
compuestos en frutas y vegetales es de importancia
para la determinación de qué alimentos incorporar
en la ingesta diaria de alimentos para obtener los
beneficios dados por estas moléculas (Sing.O ,
1997).
Entre los carotenoides más comunes, se encuentra
el β-caroteno, derivado directo del licopeno el cual
es uno de los carotenoides de mayor actividad
2. Materiales y métodos
Celdas de cuarzo ​(1x2cm?)
2.1 Metodología
- Extracción de ​β-caroteno
La extracción del beta-caroteno fue realizada a
partir dos gramos de pulpa fresca de mango
(​mangifera indica​). En tubo falcon se adiciona a la
pulpa
4
mL
de
solución extractante
(Acetona:Metanol 2:1, v/v, 0,5% hidroxibutilanisol
(BHA)) así como 2 mL de hexano, dicha mezcla
fue homogeneizada en ultra-turrax MICCRA RT
(21000 rpm x 2 min), luego de homogeneizar, cada
muestra fue sometida a ultrasonido a baja
temperatura por un periodo de 10 min.
Posteriormente se centrifugó a 7.068 gravedades
por 10 minutos en centrífuga Thermo Scientific
Sorvall LYNX 4000 centrifugue, el sobrenadante
resultante (fase orgánica) fue retirado y se
adiciona a esta 2mL de solución 1M de NaCl; se
homogeneizó en vortex a máxima velocidad por 2
minutos, se esperó a separación de fases y se
extrajo el sobrenadante (fase orgánica). A la
solución acuosa junto con el sólido inicial, se le
realizó una segunda extracción nuevamente con 4
mL de solución extractante y 2 mL de hexano,
homogeneizada por unos segundo en vortex y
sometidas a ultrasonido por 10 minutos,
posteriormente se adiciona 3 mL de solución 1M
de NaCl, se centrifugó nuevamente por un periodo
de 10 minutos. El sobrenadante obtenido fue
separado y colocado con la fase orgánica producto
del primer proceso de extracción. El extracto
obtenido fue luego llevado a sequedad con
atmósfera de gas nitrógeno; el sólido obtenido fue
almacenado en congelador a -20°C. Para el análisis
posterior el sólido fue redisuelto en la solución
extractante llevando a un volumen final de 2 mL
en balón aforado; la muestra fue filtrada con
jeringa y filtro titan3 PVDF 0.45μm, se separó
1mL para cada método analítico y fue
almacenando en congelador.
- Cromatografía por UHPLC
Para la cuantificación de β-caroteno por
cromatografía, se empleó un cromatógrafo UHPLC
Thermo Scientific Dionex Ultimate 3000, equipado
con los módulos: Automuestreador, bomba de tres
canales, módulo de columna con horno, y detector
de arreglo de diodos (DAD), empleando una
columna Acquity UPLC BEH Shield RP18
(2,1x150 mm, tamaño de partícula 1,7μm), la
temperatura del horno para la corrida
cromatográfica fue de 20°C durante todo el
análisis; para la fase móvil se empleó tres mezclas
como eluyente (Eluyente ​A: acetato de
etilo/trietanolamina (100:0,25, v/v), eluyente ​B:
acetonitrilo/trietanolamina
(100:0.25,v/v)
y
eluyente C​:acetonitrilo/agua/trietanolamina, v/v/v).
Para el proceso de elución, se mantuvo constante la
composición de solvente C con un 5% durante
toda la corrida cromatográfica. El programa de
elución fue: 0-1 min , isocrático 95% B, 1-13 min,
gradiente 65% B, 13 - 15 min isocrático 65%B,
15-17 min gradiente 95% B, 17 - 27 isocrático
95%B. El flujo empleado fue de 250 uL/min.
Curva de calibración para UHPLC
Para la curva de calibración mediante estándar
externo, se utilizó una solución stock de 1040
mg/L (​Solución A​) empleando patrón de
β-caroteno de LKT Labs, para el análisis por
UHPLC. Para ello se pesaron 0,0104 g del patrón
de ​β​-caroteno y se lleva a un volumen de 10,0 mL
en un balón aforado, llevando a volumen con la
solución extractante.
- Espectrofotometría UV-Vis
Para la cuantificación por espectrofotometría
UV-Vis se empleó el espectrofotómetro Thermo
Scientific Evolution 600 UV-Vis de doble canal,
empleando cubetas de cuarzo. La medición se
realizó por barrido en un rango de longitudes de
onda (λ) de 380 nm a 500 nm.
Curva de calibración para UV-Vis
Para la curva de calibración mediante estándar
externo, se usó una solución stock de 1210 mg/L
(​Solución B​) empleando patrón de ​β​-caroteno de
Sigma (Tipo I, ≥ 93% (UV), C9750-5G) para el
análisis por UHPLC. Para ello se pesaron 0,0121 g
del patrón de ​β​-caroteno y se lleva a un volumen
de 10,0 mL en un balón aforado, llevando a
volumen con la solución extractante.
3. Resultados
Tabla 1. ​Peso de la pulpa de mango en base húmeda para las cuatro
muestras
Muestra
Peso ( ± 0,001g)
M1
2,037
M2
2,061
M3
2,099
M4
2,041
Figura 3. ​Comparación del extracto obtenido (derecho) con el
blanco de procedimiento(izquierda)
3. 1 Resultados obtenidos por el metodo de
UHPLC
Tabla 2. ​Datos obtenidos de las áreas para las soluciones patrones
de ​β​-caroteno.
Concentración (mg/L)
Área (mAU*min)
5,2
0,7215
10,4
1,2373
20,8
2,6048
41,6
5,0526
52,0
6,1598
83,2
8,9331
104,0
11,509
Gráfica 3 . ​Fracción de cromatograma obtenido experimentalmente
para la muestra M1. (Zona de interés t = 13,8 min ).
Gráfica 4 . Comparación cromatogramas de la muestra de mango
(A) y del patrón de ​β​-caroteno degradado (B)
Tabla 3. Datos obtenidos de las áreas de las cuatro muestras de
mango y determinación de la concentración en el extracto.
(Muestras analizadas 8 días después de la extracción).
Gráfica 1. ​Cromatogramas solapados de los puntos de calibración
por patrón externo para la cuantificación de ​β​-caroteno
Muestra
Gráfica 2.​Curva de calibración por patrón externo para la
cuantificación de ​β​-caroteno por UHPLC. (ta: 1,882, tb: 39.783,
tcorr*:39.783, tcrítico:2.447 (p<95%)).
Tabla 2.​ Valores de absorbancia de once blancos para la
determinación de límite de detección (LOD) y límite de
cuantificación (LOQ)
Blanco 1
Abs
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
0,022 0,05 0,02 0,02 0,02 0,06 0,01 0,05 0,03 0,00 0,02
Tiempo de
retención
(min)
Área
Concentración
(mg/L)
Concentración
de ​β​-caroteno
en mg en 100 g
de pulpa en
base húmeda de
mango
Blanco
13,811
0,0656
----
---
M1
13,810
2,1909
17,6
5,8
M2
13,813
4,1986
36,2
11,7
M3
13,809
1,5537
11,7
3,7
M4
13,811
0,7916
4,6
1,5
Gráfica 6. ​Espectros de UV-Vis para las patrónes de la curva de
calibración por estándar externo
Gráfica 5. ​Espectro UV-Vis, obtenido para el ​β​-caroteno y para los
productos de degradación en las muestra (1) vs el patrón de
β​-caroteno degradado( 2 y 3 ).
3.2 Resultados obtenidos por el método de
UV-VIS
Gráfica 7 . Curva de calibración por patrón externo (rojo) y adición
de estándar (Azul) para la cuantificación de ​β​-caroteno por UV-vis a
452 nm. (ta: 2,503, tb: 30,313, tcorr*:30,313, tcrítico:2.447
(p<95%)).
Tabla 5 ​Datos obtenidos de las absorbancias de las soluciones
patrón para la curva de calibración
Concentración (mg/L)
Absorbancia (452 nm)
12,1
0,006
24,2
0,130
36,3
0,260
48,5
0,409
60,5
0,528
72,6
0,643
84,7
0,770
108,9
0,940
Gráfica 8.​ Espectros UV-Vis (380 a 500 nm) de cada muestra de
mango.
Tabla 6 ​: Concentración de betacaroteno determinada por curva de
calibración de estándar externo mediante UV-Vis. (Muestras
analizadas 10 días después de extracción.)
Muestra
Absorbancia
(452 nm)
Concentración
de Extracto
(mg/mL)
Concentración de
β​-caroteno​ en mg en
100 g de pulpa en base
húmeda de mango
M1
0,192
28,9
18,9
M2
0,222
31,9
20,6
M3
0,124
22,0
14,0
M4
0,160
25,6
16,8
Según se reporta en protocolo 1 y 2 de la
Determinación y medida de carotenoides por
espectrofotometría UV/Vis ​del ​Current Protocols
in Food Analytical Chemistry (2001)​, la
absorbancia a una misma longitud de onda se
puede dar por más de un tipo de carotenoide, por lo
cual la consideración de que la absorbancia a 452
nm es única del ​β​-caroteno no sería correcta.
Debido a esto, siguiendo el protocolo enunciado,
se “estima” la cantidad de betacaroteno en cada
muestra, empleando la tabla 8 y ecuación 1.
Para confirmar los valores obtenidos empleando la
curva, se realiza la segunda derivada tanto de la
curva de calibración como de las muestras.
Gráfica 11: ​Comparación de segunda derivada de muestra
M1 (Negro) y segunda derivada de patrones de 24,2 mg/L
(Azul) y 36,5 mg/L (Amarillo).
Gráfica 9​: Segunda derivada del espectro UV-Vis de cada patrón
empleado en la curva de calibración.
Gráfica 12: Curva de calibración UV-Vis empleando
segunda derivada.
Gráfica 10​: Segunda derivada del espectro UV-Vis de cada muestra
de mango empleado en la curva de calibración para.
Donde A es la absorbancia de la muestra, V​1 es el
factor de dilución de la muestra, A1% es la
absorbancia de una solución del carotenoide al 1%
y C 1% la concentración de una solución al 1%.
Tabla 8 ​: Concentración de betacaroteno estimada mediante
ecuación (1) con A1% :2592 UA y C 1% : 10011 mg/L .( Muestras
analizadas 10 días después de extracción).
Muestra
Absorbancia
(452 nm)
Concentración
de Extracto
(mg/L)
Concentración de
β​-caroteno​ en mg en
100 g de pulpa en base
húmeda de mango
Gráfica 13​: Segunda derivada de muestras en zona de interés
(440 a 460 nm).
M1
0,192
4,9
0,5
M2
0,222
5,7
0,6
Tabla 7​: ​Concentración de betacaroteno determinada por curva de
M3
0,124
3,2
0,3
M4
0,160
4,1
0,4
calibración de segunda derivada. (Muestras analizadas 10 días
después de extracción.)
Muestra
2da.
Derivada
(​x10​ )
Concentración
de Extracto
(mg/L)
(x10​2​)
100 g de pulpa en base
húmeda de mango
M1
-8,47
2,2
21,2
M2
-0,108
3,0
28,8
M3
-5,87
1,8
16,9
M4
-7,96
2,3
22,9
-4​
Concentración de
β​-caroteno​ en mg en
Tabla 8​: Datos de λ​max y coeficiente de extinción para una selección
de carotenoides.
[Carotenoide] (mg/L) =
AxV1
A1%
*C
1%
(1)
4. Análisis de Resultados
Para el proceso de extracción, se tuvo en cuenta
que el analito a analizar es de carácter apolar y que
es fotosensible y termolábil, razón por la cual sufre
reacciones de isomerización por exposición a luz y
temperatura, además de que es un compuesto que
se oxida con facilidad al contacto con el aire, por
ello fue pertinente trabajar de manera rápida
evitando lo mayor posible la exposición de
muestras y patrones a la luz así como de
incrementos de temperatura en las cuales se
pudieran controlar dichos factores. Aun así durante
el proceso de extracción como en los procesos de
medición no se pudo controlar completamente
dichas propiedades, lo cual se puede ver reflejado
en los cambios de concentración de las muestras.
El cromatograma obtenido para el patrón de
β​-caroteno ​se observa en la gráfica 1. la cual
resulta ser un solapamiento de todos los
cromatogramas de las soluciones patrón de la
curva de calibración , la cual permite caracterizar
un tiempo de retención de 13,80 min para dicho
analito, además de que el pico resulta ser simétrico.
En la gráfica 2. ​se evidencia la curva de calibración
para UHPLC en la cual se trabajó en un rango
lineal de (5,20 - 104,0 mg/L) obteniendo un
coeficiente de correlación (R​2​) =0,9968 definiendo
así que existe una tendencia lineal entre la
concentración y el área.
Para el análisis de las muestras de mango en
UHPLC, se tuvo en cuenta el tiempo de retención,
la cantidad de picos presentes en el análisis
cromatográfico y el área. Dicho esto, en el
cromatograma de la muestra M1 (ver gráfica 3)​. ​Se
logran evidenciar 3 picos importantes; el pico
cromatográfico de color rojo se asocia al analito de
interés puesto que el tiempo de retención (13,830
min) coincide con el tiempo de retención del
patrón de ​β​-caroteno, mientras que los otros picos
se presentan en tiempos de 14,077 y 14,583
minutos respectivamente. Dichos picos se pueden
asociar a algún compuesto de degradación de
β​-caroteno debido a la isomerización o a la
oxidación de mismo, a pesar de que no se tiene
certeza de la identidad de estos compuesto, se
observa que absorben a una longitud diferente que
la del ​β​-caroteno, como se observa en la gráfica 5.
El pico 2 absorbe a una longitud de 445 nm
mientras el pico 3 a una longitud de onda de 443
nm esto se debe a que el cromóforo de cada
compuesto es diferente. Cada uno de estos
compuestos, fue generado en el proceso de análisis
de la muestra, ya que la concentración que
presentan es muy baja, y como se observa en la
gráfica 4, corresponden con las señales obtenidas
del patrón degradado, también podemos rectificar
la correspondencia de señales en la gráfica 5,
donde observamos cómo cada una de las señales
presenta un espectro de UV-Vis muy similar y con
máximos de absorbancia similares.
Observando tanto la tabla 3 como la tabla 6, se
tiene que aunque se trata de la misma muestra,
cada réplica está indicando cambios de
concentración significativos, por lo que se puede
considerar que el proceso de extracción y
almacenamiento no fue homogéneo, debido a la
diferencia de respuestas tanto en UHPLC como en
UV-Vis. Teniendo en ambos casos que la muestra
de mayor concentración es la muestra M2 con 11,7
mg/100 g pulpa y 20,6 mg/100g de pulpa en base
húmeda por UHPLC y UV-Vis respectivamente,
presentando una desviación estándar de 4,382 mg,
lo que indica que el método a pesar de ser muy
selectivo para el ​β​-caroteno, presenta una precisión
muy baja.
Ahora bien, se debe considerar que los valores
obtenidos pueden no corresponder a la totalidad
del β-caroteno presente en la muestra de mango
debido a la degradación que pudo generarse
durante
la
misma
extracción
(errores
experimentales) como en el almacenamiento
(medición de muestra a 8 y 10 días luego de la
extracción, UHPLC y UV-Vis respectivamente).
Este fenómeno se puede evidenciar al comparar los
cromatogramas de la muestra con los presentados
por patrones con degradación en la gráfica 4.
Como se evidencia, aún con la muestra almacenada
en las condiciones óptimas de -20°C y en ausencia
de luz, según dicho cromatograma, el β-caroteno
no posee la misma concentración inicial, por tanto
con la manipulación de este ítem de ensayo y
posterior almacenamiento para medición por
UV-Vis se pudo generar mayor descomposición.
Para la verificación de que la respuesta dada por
UHPLC fueran cuantificables según la curva de
calibración empleada se determina los límites de
detección y de cuantificación empleando los
valores de la tabla 2. con las siguientes ecuaciones.
LOD = Y b + 3Sb
LOQ = Y b + 10Sb
LOD = 3Sb/m
LOQ = 10Sb/m
(2)
(3)
(4)
(5)
Donde:
Yb : Promedio de los blancos (0,0308)
Sb : Desviación de los blancos (0,0173)
m: Pendiente de curva de calibración.
(2) Límite de detección en señal, (3) límite de
cuantificación en señal, (4) límite de detección por
concentración y (5) límite de cuantificación por
concentración.
Obteniendo como resultado que el método de
estándar externo empleado posee un LOD de
0,5mg/L y LOQ de 1,6 mg/L
Con estos límites, se determinó que tres de las
cuatro muestras de mango se encuentra por encima
del límite de cuantificación siendo la muestra M4,
la única muestra que se encuentra por debajo del
límite de cuantificación.
Para el análisis del analito mediante la técnica de
UV-Vis se realizó una nueva curva de calibración
con otro patrón β-caroteno (solución B)
mencionado en la metodología. A partir de los
espectros obtenidos de este (Ver gráfica 6), se
logran evidenciar tres longitudes de onda, a las
cuales se obtienen los valores más altos de
absorbancia dichas longitudes de onda son 431 ,
452 y 475 nm, ello se debe a todo el sistema
conjugado que presenta la molécula. Para la
cuantificación del analito, se tuvo en cuenta
únicamente la absorción a una longitud de onda de
452 nm, puesto que a esta lambda se obtienen el
máximo de absorbancia y el pico se mantiene de
manera uniforme a medida que disminuye la
concentración lo cual permite realizar el análisis
del β-caroteno en el mango.
Para este caso de la muestra de mango, no se puede
hablar de una longitud de onda máxima para el
β-caroteno, ya que la muestra contiene otros
carotenoides presentes en la pulpa que poseen el
mismo cromóforo, de tal manera que en el espectro
de la muestra de mango no se observa únicamente
el analito de interés, sino posiblementes
compuestos asociados a la isomerización del
β-caroteno de su configuración usual trans a cis así
como otro tipo de carotenoides.
Los carotenoides se destruyen a altas temperaturas,
así como por efecto de la luz solar, ácidos, y por la
presencia de oxígeno. Las altas temperaturas
generan isomerizaciones de la estructura que
genera cambios en cromóforo principal; por otro
lado tanto la luz como los ácidos pueden generar la
ruptura de la molécula por reacciones fotoquímicas
y químicas respectivamente, en el caso de la
presencia de oxígeno promueve la oxidación de los
dobles enlaces a epóxidos, hidroxidos y peroxidos.
Una evidencia de ello se observa en la
decoloración de estos debido a la pérdida del
sistema resonante ( Caitlin S. Boon. et al (2010)).
Se realizó una curva de calibración mediante
patrón externo y a su vez se llevaron a cabo dos
puntos por adición de estándar para analizar efecto
matriz en la muestra de mango. En la gráfica 7. se
evidencian dichos puntos; como es de observar,
para el patrón externo se logró obtener una
coeficiente de correlación fue de (R​2​) =0,9934.
Así mismo, se realizó una curva de calibración a
partir de la segunda derivada de la absorbancia en
función de la concentración. En la gráfica 12. se
observan también una tendencia lineal cuyo
coeficiente correlación fue de (R​2​) =0,9794.
Por otro lado, se obtiene que a bajas
concentraciones se presentan efecto matriz, dado
que el valor de la absorbancia a una concentración
de 24,2 mg/L es un dato sobreestimado , respecto
al determinado por patrón externo, mientras que al
altas concentraciones, no se presenta dicho efecto.
Ello se debe a que a bajas concentraciones la
presencia de interferentes afecta la medida, ya que
la tensión superficial o viscosidad entre la muestra
y el estándar de calibración es diferente.
Las concentraciones obtenidas se encuentran en la
tabla 6. obteniendo un promedio de 17,57 mg de
betacaroteno en 100 g de pulpa en base húmeda
por interpolación directa en la gráfica 7. Mientras
que para el método de la segunda derivada se
obtuvo una concentración promedio de 22,4 mg/L.
A diferencia de los datos obtenidos por UHPLC,
los valores de las 4 muestras no estuvieron una
desviación elevada (2,870 mg), así mismo es
importante recalcar que los resultados obtenidos
por el método de UV-Vis fueron mayores que por
cromatografía, esto se puede debe a que la técnica
no es selectiva y las absorbancias obtenidas es el
resultado de la mezcla de carotenoides presentes en
el mango.
Con relación a los limites de deteccion y
cuantificacion se utilizaron las ecuaciones (4) y
(5). Donde Sb es la desviación del modelo
matemático implementado, para este caso la
regresión lineal y m es la pendiente del mismo,
obteniendo así valores de LOD (8,4 mg/L) y
LOQ( 28,1 mg/L), estos valores pueden ser errados
debido a que no se pudo realizar los cálculos con
las medidas de los blancos. Dicho esto, solo la
muestra M2 se encuentra por encima del límite de
cuantificación, por lo que, los valores obtenidos
por UV-Vis, no son confiables para determinar la
concentración de ​β​-caroteno en la muestra de
mango.
Considerando los posibles errores obtenidos en la
absorbancia de la muestra, mediante la segunda
derivada de los espectros se tiene que la
concentración promedio para las muestras es 22,4
mg/100g pulpa en base húmeda, como se evidencia
en la tabla 7, evidenciando que dicho método
incrementa la concentración aparente. Sin
embargo, nuevamente el método no discrimina
cada componente de la mezcla, por lo que no se
puede asegurar que dicha concentración sea la
concentración real de betacaroteno.
En consideración con lo anterior, empleando el
protocolo propuesto por el ​Current Protocols in
Food Analytical Chemistry, q​ ue discrimina los
carotenoides por su coeficiente de absorción molar,
se tiene que el promedio estimado de betacaroteno
en las muestra es de 0,4mg/100g de pulpa en base
húmeda, obteniendo una concentración mucho
menor a las anteriores halladas mediante este
método.
Lo cual puede indicar que la mayoría de la
absorbancia presentada a 452 nm es debida a otros
compuestos como lo pueden ser la ​β-criptoxantina
y/o la zeaxantina, posibles resultantes de la
oxidación del betacaroteno, además de pérdidas
por isomerización por efectos de la temperatura ya
que el tiempo de análisis de las muestras fue
prolongado (10 días para análisis por UV-Vis).
Debido a que la técnica de UV-Vis no es selectiva
para el analito en estudio, es preferibles la
determinación de este compuesto mediante la
técnica UHPLC ya que esta permite la separación
de cada compuesto y su respectivo análisis.
Considerando entonces los valores obtenidos por
cromatografías, se comparan con rangos reportados
en literatura. Según ​Wilberg V et. al, para mangos
comprados en la ciudad de Rio de Janeiro se tiene
un rango de concentración de 6.6 a 25.4 μg/g (0,66
mg/100 g de fruta y 2,54mg/100g de fruta)
obteniendo entonces que la concentración obtenida
está por fuera de dicho rango. Sin embargo, en el
mismo documento se reporta que el valor
promedio puede variar de país a país reportando
que en mangos provenientes de Tailandia, EEUU
y Malasia presentan concentraciones promedios de
β​-caroteno de 0.63μg/g, 131.2μg/g y 6.15 μg/g
(6.3E-2 mg/100g de fruta, 13.12 mg/100g de fruta
y 6.15E-1 mg/100g de fruta) respectivamente. Por
dicha razón no es posible comparar los resultados
obtenidos.
​5. Recomendaciones
● Realizar la extracción en un lugar donde la
entrada de luz sea escasa para evitar
procesos de isomerización del b-caroteno
● Llevar a cabo la cuantificación del analito
el mismo dia que se prepara la solución
patrón para la curva de calibración.
● Cubrir los extractos y el patrón con papel
aluminio en un congelador, para minimizar
la degradación de los carotenoides.
6. Conclusiones
Las medidas de ​β​-caroteno por cualquier método
debe realizarse lo más pronto posible para evitar
pérdidas por degradación. La concentración de
β​-caroteno determinada por 100g de pulpa en
base húmeda, para las muestras de mango
analizadas, fue de 5,678 mg ± 4,382 mg por
UHPLC, teniendo en cuenta que las muestras de
mango presentaron degradación del ​β​-caroteno
asociado a la exposición de la misma a la luz y al
aire.
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