Clonación de DNA en diferentes sistemas celulares y Análisis de
Clones.
Por definición, la clonación es el procedimiento de obtener una población de varios
individuos genéticamente homogéneos a partir de uno solo mediante reproducción
asexuada. El concepto de clonación puede aplicarse, en la ciencia moderna, tanto
a nivel molecular como celular. En la actualidad, la clonación molecular es un
procedimiento de laboratorio consolidado que se utiliza amplia y rutinariamente
dentro de la biología molecular y la genética. Constituye una poderosa
herramienta que ha producido ya relevantes aplicaciones de diagnóstico y
terapéuticas en la moderna biomedicina, así como importantes usos industriales
por lo que a animales y plantas se refiere.
Tipos de Clonación:
CLONACIÓN MOLECULAR
Este tipo de clonación es uno de los métodos más conocido. Se basa
específicamente en extraer una parte del ADN y luego insertarlo en donde sea
conveniente (precisamente un plásmido o algo en donde sea posible la
clonación). A través de la clonación se pueden obtener múltiples copias de un ser
vivo, gracias a la acción de la DNA polimerasa. Podemos especificar el hecho de
que la clonación sirve para ampliar fragmentos cuyo contenido son los genes
(esenciales para el análisis del subsecuente).
Toda clonación debe seguir ciertos pasos para que ésta resulte efectiva:
Primero, esta la fragmentación, en donde se retira un pedazo de ADN
relativamente importante para poder contar con los genes necesarios para la
clonación. Este proceso puede realizarse a través de la digestión con enzimas de
restricción.
Luego, encontramos la ligación, que es el proceso por donde se une el pedazo de
ADN con un vector generalmente circular para que así se forme una secuencia
para ser incubado. Es importante contar con la enzima llamada ADN ligasa para
que ésta logre unirlos de buena manera.
Tercero, la transfección. Aquí una vez unido el vector con el gen de interés se
transfecta a una célula, es decir se incorpora en una célula para que ésta obtenga
la información necesaria para que se cumpla la clonación. Para finalizar,
encontramos la selección que es donde las células transfectadas se cultivan.
CLONACIÓN CELULAR
Se destaca este tipo de clonación debido a que de una sola célula se puede
formar una cierta población de esta misma. Este proceso destaca porque su uso
es a partir de aros o cilindros de clonación en donde a partir del procedimiento in
Vitro se cultivan los distintos tejidos. Se utiliza un agente mutagénico para
proporcionar la selección de las colonias y para que éstas sean expuestas a la
célula de la cual se desea clonar. Los aros o cilindros de clonación sirven para
recolectar las células clonadas para que crezcan en un mejor ambiente de
protección.
CLONACIÓN DE ORGANISMOS
Este tipo de clonación tiene una característica fundamental; es un tipo de
reproducción asexual en donde se reproduce o se forma una copia de un
organismo ya existente con la misma formación genética. Las amebas son un
ejemplo de esto, ya que solo existe un progenitor y la fecundación no existe.
Los hongos también se reproducen asexuadamente.
Hoy en día, encontramos la posibilidad de obtener un gemelo idéntico
naturalmente o artificialmente. La manera de hacer esto es alterando el desarrollo
embrionario o realizando una separación voluntaria de los blastómeros, debilitando
las uniones celulares.
De esta forma el clonaje de DNA recombinante nos abre la puerta a aplicaciones
como:
 El aislamiento de ADN.
 Amplificación de secuencias génicas.
 Estudio de regiones genómicas.
 La producción de proteínas.
 La creación de tipos celulares.
 Organismos con nuevas actividades.
Panorama General de la tecnología del DNA recombinante
La tecnología del clonaje de DNA constituye el núcleo central de la Ingeniería
Genética ya que se podrán aislar, disponer, producir y valorar modelos celulares
con idéntico contenido genético derivados de una célula progenitora.
OBJETIVOS DEL CLONAJE DE DNA
 Que el DNA extraño se mantenga en el sistema receptor, lo que implica
que conserva su integridad y no sea degradado por enzimas celulares.
 Es la expresión de la información que contiene el DNA. Para lo cual se
evalúa en la célula hospedadora, si se producen los productos amplificados
en el DNA extraño los cuales suelen ser valiosos y ser la causa de
comportamientos especiales de la célula receptora.
ETAPAS DE UN PROCESO DE CLONACIÓN
Tal proceso consta de 2 etapas, una de ellas es in vivo y la otra in vitro.
En el caso de la etapa in vivo:
Se caracteriza por la transferencia de la molécula de DNA exógeno acompañado
de un vector, hacia al interior de una célula que puede ser del mismo tipo que ella
de donde se extrajo o no.
Mientras que en el análisis in vitro:
Una vez que se supone el clonaje, se realiza una nueva etapa de extracción, bien
del DNA amplificado o producto expresado, a partir del sistema celular
hospedador.
Lo cual conlleva un proceso de purificación, análisis y valoración del producto de
amplificación.
Así, está experimentación se desarrolla alrededor de unos elementos principales
que pueden ser considerados como “protagonistas” del proceso, y que son:
 El DNA recombinante, que resulta de la unión in vitro del DNA pasajero y
del DNA vector. Esta molécula es el objeto central de las etapas de trabajo
in vitro, previas y posteriores a la etapa de clonaje. Es preparado e
introducido en el interior celular y, luego, tras su aislamiento de cultivo, será
purificado y analizado.
 La célula hospedadora que recibirá al DNA recombinante para su
mantenimiento, amplificación y expresión. Ofrece todos sus sistemas
genéticos y bioquímicos, y actúa como un laboratorio especializado donde
se puede llevar a cabo la realización del proceso previamente diseñado.
Además, destacan dos etapas particulares dentro de la experimentación general
del clonaje.
 La transformación celular: proceso en el que un DNA manipulado in vitro es
transferido al interior de las células hospedadoras, atravesando la
estructura de su envoltura sin afectarla sustancialmente.
 El análisis de clones transformados: que permite distinguir, entre las células
que resultan del intento de transformación, aquellas que no hayan aceptado
DNA exógeno, aquellas que hayan incorporado sólo al DNA vector,
aquellas que captaron molécula de DNA recombinante y, finalmente,
aquella colonia que incorporó una secuencia particular del pasajero.
DNA Pasajero
Se utiliza como soporte de una información para síntesis de un producto proteico.
Se le conoce como DNA pasajero, DNA extraño o Foráneo, también inserto
recordando su ubicación en el interior de un recombinante.
El DNA se extrae de su fuente biológica natural, una vez purificado y, en su caso,
caracterizado y manipulado, se une al DNA vector para formar el DNA
recombinante y ser clonado. Tras su clonaje y amplificación puede recuperarse del
cultivo y separarse del vector para su estudio y análisis.
Tipos de DNA pasajero:
Puede ser un único fragmento o una población mixta de piezas diferentes
de DNA.
Puede ser un DNA bicatenario, un DNA de hebra simple o un RNA.
Puede ser un DNA natural, extraído de una fuente biológica cualquiera, o
bien una molécula sintética, obtenida artificialmente; también puede ser un
cDNA sintetizado a partir de un mRNA.
DNA Vector
Es el principal responsable del éxito del experimento al depender de él tanto la
supervivencia del recombinante en el cultivo transformado como la expresión del
pasajero en sus células.
Se trata de una molécula encargada de recibir (unirse) al DNA pasajero y
acompañarle en su trasferencia al interior de la celular.
El DNA vector transporta distintos tipos de marcadores fenotípicos para la
selección de células así como diversas señales para la expresión del pasajero; l
vector se le pide todo lo necesario para lograr el objetivo marcado.
Los vectores son por ello construcciones complejas, moléculas quiméricas
formadas a partir de la unión de regiones de muy diferentes procedencias,
naturales o sintéticas, y colocadas en un orden y sentido específicos.
TIPOS DE DNA VECTOR
Un vector puede ser específico para un determinado tipo de célula o bien activo en
diferentes tipos celulares. Así existen vectores para el clonaje de:





Especies bacterianas.
Diversas levaduras.
Plantas.
Distintos tipos de células o en embriones animales.
Vectores mixtos, empleados en más de un tipo celular.
Aunque la molécula de DNA vector suele estar compuesta por piezas de muy
distinta procedencia, es posible clasificar estos vectores en función de la fuente
principal como:
a)
b)
c)
d)
Derivados de plásmidos.
Derivados de bacteriófagos o de virus eucariotas.
Vectores mixtos como los fagómiodos.
Vectores integrativos, cuya función es integrar el recombinante en el
cromosoma de la célula receptora.
Finalmente, deben distinguirse dos tipos de vectores según su capacidad de
actuación sobre el pasajero que transportan:
Vectores de clonaje: cuya única misión es mantener establemente al
recombinante en el interior de la célula hospedadora.
Vectores de expresión: que aportan las señales necesarias para la
transcripción y/o la traducción de la secuencia del inserto.
Condiciones de un Vector
Para que una molécula de DNA pueda actuar como vector en un experimento de
clonación, debe cumplir con unos requisitos mínimos:
1) Debe tener un origen de replicación (región ori) que sea activo en la célula
hospedadora.
2) El vector debe tener regiones que faciliten un buen reparto entre células
hijas.
3) Debe presentar uno o varios sitios de restricción.
4) Si el sistema de transferencia no es muy eficiente se requiere de un
marcador fenotípico de selección para anular a las células que no contienen
el pasajero.
5) El rendimiento del sistema de trasferencia es inversamente proporcional al
tamaño de la molécula. Por lo que es muy ventajoso que el vector tenga un
tamaño pequeño; eso favorece la entrada del recombinante a la célula.
Además de esas condiciones, algunos vectores ofrecen otras muchas ventajas,
por ejemplo:
 Marcadores de selección alternativos que permiten el uso de distintas vías
e, incluso, la detección de recombinantes.
 Señales diversas de expresión que dirijan y controlen la lectura del inserto
por parte de la maquinaria transcripcional celular; es necesario tener en
cuenta la compatibilidad entre señales y maquinaria a fin de que la
expresión se dé adecuadamente.
 Sitios múltiples de clonaje o polylinkers, secuencias casi siempre sintéticas
en las que se ha agrupado un número alto de dianas de restricción, que
aumentan su versatilidad para unirse a pasajeros con diferentes extremos.
El DNA Recombinante
Es la molécula que resulta de la unión del DNA vector y el DNA pasajero. Su
amplificación, análisis y expresión pasa por su transferencia al interior de una
célula hospedadora, es decir, su clonaje.
La síntesis del DNA recombinante, se basa en la unión in vitro del DNA vector y el
DNA pasajero mediante la acción de la DNA-ligasa.
La Célula hospedadora
Ha de recibir al DNA recombinante y colaborar a su replicación. Se utiliza como un
laboratorio sofisticado capaz de realizar procesos enzimáticos muy diferentes,
para lo que ofrece todo su equipamiento molecular. Los experimentos pioneros
utilizaron a E. coli como célula hospedadora.
Hoy puede decirse que cualquier tipo celular puede ser usado como hospedador.
Ejemplos de células hospedadoras:





Bacterias de tipo Gram-positivas como Gram-negativas.
Las levaduras, especialmente Saccharomyces cerevisae.
Plantas superiores empleadas para trabajos de transgénesis.
Líneas celulares de tejidos animales capaces de crecimiento in vitro.
Embriones animales, que son fuente de obtención de individuos
transgénicos de gran interés en la Biología.
Características de un hospedador
La célula receptora de un DNA recombinante ha de aceptarlo sin afectar su
integridad y debe permitir que se mantenga estable en sus descendientes. Sus
sistemas celulares deben ser capaces de llevar a cabo la replicación y expresión
del recombinante a través de su interacción con las señales activas presentes en
él.
En una estirpe bacteriana hospedadora se debe considerar:
•
•
•
Que carezca de un sistema de restricción activo, es decir que sea rEn el caso de E.coli se usan estirpes tipo Ecok deficientes en restricción,
para que no degraden la molécula de DNA.
Por lo tanto se emplean estirpes con genotipo hsdRque pueden
modificar pero no romper los sitios Ecok.
Además de estas características generales que se requieren en un sistema
hospedador, existen otras muchas preferidas para muchos casos particulares. En
función del objetivo del experimento, del vector específico utilizado, de las etapas
concretas que vayan a seguirse en el proceso.
Transferencia de DNA a la célula hospedadora
La transferencia de una molécula de DNA al interior de una célula, proceso
conocido genéricamente como transformación (en bacterias) o transfección (en
eucariotas), se consigue por diferentes procedimientos. La molécula de DNA entra
a la célula por un mecanismo no siempre bien conocido, sin que el tratamiento
utilizado altere excesivamente la integridad de su cubierta celular.
Hoy son varios los métodos disponibles para lograr la transferencia; se basan en
principios diferentes y su efectividad varía mucho con el tipo celular al que se
aplica.
Principales técnica de transferencia de DNA:
 Transformación por choque térmico:
Consiste en la captura de DNA por células previamente tratadas con metales (Ca,
Rb, Co, etc.), con el fin de alterar su envuelta (células competentes), la elevación
de la temperatura en el cultivo permite el paso de la molécula de DNA; la célula
recibe el nombre de Célula trasformada o Transformante. Una variante que utiliza
sales de litio y polietilenglicol (PEG) permite la transformación de células de
levadura con eficacia.
 Infección por fagos o virus:
Es un método natural enormemente eficaz, la estrategia implica colocar el DNA
recombinante en el interior de una partícula viral infectiva, para que el sistema
natural lleve a cabo su transferencia a la célula infectada.
 Electroporación:
Se basa en la utilización de descargas eléctricas para alterar la estructura de la
envuelta celular y permitir el paso del DNA exógeno, es un método que puede ser
aplicado a muy distintos tipos de células, bacterianas y eucariotas.
 La transfección con DNA precipitado con fosfato calcico:
Es la forma clásica para lograr la captura de un DNA por células eucariontes en
cultivo.
 Transformación por liposomas o lipofección:
Se emplean pequeñas vesículas preparadas a partir de lípidos catiónicos; el DNA
en disolución se acompleja espontáneamente con las vesículas, que a su vez se
asocian a células animales en cultivo, protoplastos de levaduras provocando la
fusión a la membrana plasmática y la transferencia del DNA al interior.
 Micoinyección:
Se emplea un equipo sofisticado de micromanipulación (microscopio, microjeringa,
microagujas), para seleccionar, fijar e inyectar a una célula o grupo de células una
pequeña cantidad de DNA.
Su eficacia es muy alta, pero solo es aplicable a un cierto número de células, por
lo que su utilidad está limitada al trabajo con ovocitos de anfibios o con embriones
de insectos o mamíferos.
 Bombardeo con microproyectiles (biolística):
Se basa en el uso de proyectiles esféricos hechos de un metal pesado a cuya
superficie se ha unido el DNA que se quiere transferir.
A partir de un cañón, estas partículas se lanzan a gran velocidad sobre las células
receptoras, el procedimiento es muy eficaz para células que tiene pared celular
fuerte; difícil de atravesar de otra manera.
Análisis de clones
Tras la etapa de transferencia de DNA, se procede a analizar el resultado de este
proceso a fin de aislar el clon o clones que se persiguen; para lo cual se hace uso
de análisis como:
 Selección de transformantes.
 Detección de Recombinantes.
 Identificación de clones (Screening de Bibliotecas)
 Selección de transformantes: Se hace uso de marcadores genéticos que
permiten una selección fenotípica de las células transformadas o
transformantes. Un ejemplo claro serían los genes que otorgan resistencia
a un antibiótico.
Para la selección de bacterias transformadas existen una amplia variedad
de antibióticos; para el trabajo en células eucariotas, se han desarrollado,
además, otros sistemas alternativos basados en el empleo de un agente
tóxico y de un gen de resistencia a ese agente.
Por otro lado, algunos procedimientos de transferencia de DNA, como la
microinyección o la infección con virus no requieren normalmente la ayuda
de un proceso de selección, bien por su alta eficacia, bien porque el
resultado de la transferencia lleva ya en sí mismo un sistema de detección
de transformantes.
 Detección de recombinantes: La identificación y selección de células
transformadas se consigue tras el empleo de un marcador incorporado al
vector; pero la síntesis del recombinante, catalizada por la DNA–ligasa dará
a la formación de:
a) Células transformadas por la molécula recombinante.
b) Células transformadas por el vector.
Ambos tipos de células serán seleccionables al contener en su interior el
gen marcador. Por lo que interesa distinguir entre ambos tipos de
transformantes y poder detectar entre ellos aquellos que han sido
transformados por el DNA recombinante.
Algunas estrategias empleadas para la selección de recombinantes son:
•
Inactivación de un marcador por la inserción del pasajero.
•
Aislar el DNA presente en diferentes clones y analizarlo por restricción para
identificar el recombinante buscado.
•
La solución definitiva sería la utilización de un segundo gen marcador que
codificase un producto tóxico para la célula y que tuviese en el interior de su
secuencia un sitio para la inserción del pasajero. Este sistema, conocido
como selección positiva, no está generalizado y sólo es ofrecido por
algunas parejas vector-hospedador.
 Identificación de clones (Screening de Bibliotecas): Cuando el DNA que se
pretende clonar es una mezcla de fragmentos que resulta que se liga a una
única especie de DNA vector, el recombinante que resulta es mixto. Entre la
población de células transformadas se distribuyen los distintos
recombinantes, y por lo tanto los distintos pasajeros, lo que se conoce
como un banco de secuencias, banco de genes, biblioteca o genoteca. La
construcción de una biblioteca es el primer paso para el aislamiento de una
secuencia pura; ya que con la identificación de un determinado clon de la
biblioteca se conduce al aislamiento del pasajero.
Principales estrategias para el análisis de bibliotecas:
 La identificación de la secuencia mediante hibridación del DNA célular.
 La selección del clon aprovechando que el pasajero codifica una actividad
seleccionable.
 La complementación de alguna mutación del hospedador por el gen
pasajero del recombinante.
 La identificación inmunológica del producto proteico codificado por el DNA
pasajero.
El análisis de una biblioteca permite identificar y aislar un clon concreto.
Éste es el verdadero significado del término clonar: aislar y disponer de un
clon que contiene un recombinante portador de una única secuencia
insertada.
Tras el aislamiento del DNA clonado, normalmente se abre la vía del
subclonaje. Con frecuencia, el tamaño del inserto conseguido es demasiado
grande para su manejo y estudio y se debe fragmentar en piezas menores
que, a su vez, serán clonadas en una segunda etapa de clonaje.
ENZIMAS DE RESTRICCION
El análisis provienen del griego “analio” que significa “desatar”, todo
procedimiento de análisis implica separar las “ártes” de un todo hasta llegar a
conocer sus principales o elementos. Es decir romper, fragmentar.
Fragmentación de ácidos nucleicos. Especificidad y objetivos
En general las moléculas de ácidos nucleicos son grandes, lo que las hace
sumamente
frágiles, con el
simple pipeteo de una disolución de DNA
cromosómico resulta suficiente para romper sus largas cadenas, lo que es
resultado de las fuerzas de cizalla, además de la rotura física, las moléculas de
ácidos nucleicos son sensibles a condiciones químicas y actividades enzimáticas
degradativas , sin embargo , la fragmentación de las moléculas de ácido nucleico,
aunque temida e indeseable en los procesos de aislamiento, resulta conveniente e
incluso esencial en las vías analíticas, la gran diferencia entre los distintos
métodos de rotura de estas moléculas la marca la especificidad en el proceso ,
una rotura inespecífica producirá una mezcla muy heterogénea de fragmentos,
cada uno con distinto tamaño y extremos diferentes , frente a esto una rotura de
una molécula por sitios específicos lleva una mezcla de composición más
homogénea y definida, aunque puede resultar un gran número de fragmentos
definidos por especificidad , aunque puede resultar un gran números de
fragmentos , todos ellos aparecen en fragmentos equimolares , de un tamaño
definido pero con extremos definidos por la especificidad de la reacción, lo que
hace posible su análisis y , a partir de él, la localización de los sitios específicos,
de rotura dentro de un esquema que represente al material original, lo que se
denomina mapa físico.
Eliminación de contaminantes. Los motivos por los cuales se puede perseguir
en un determinado momento la degradación de un DNA o de un RNA Son muy
diferentes, ya que los contaminantes de una DNA son otras macromoléculas,
resulta más rápido y más cómodo, eliminar estos componentes mediante
degradación química o enzimática.
La Producción
De Fragmentos Inespecíficos: la degradación busca la
conversión de las grandes moléculas en fragmentos de menor tamaño mediante
rotura aleatoria por sitios inespecíficos
Para facilitar su manejo: debido al tamaño de los ácidos nucleicos, causa de
mucha incomodidad su manejo, debido a la enorme densidad y viscosidad que
aporta a sus disoluciones, cuando no es importante mantener su integridad,
resulta conveniente fragmentar y conseguir una disolución más manejable.
Para estudiar la cinética de su renaturalización. la velocidad de
que se
renaturalizan las hebras de una molécula de DNA desnaturalizada es en
función de su concentración molar, esto es la base de un método analítico que
permite calcular el número de copias de cierta secuencia en un genoma , solo
este comportamiento se descubre en hebras de longitud pequeña o media ,
debido al gran tamaño de las moléculas de DNA tienen dificultades de
esterificación graves cuando intentan renaturalizar, de aquí su interés de la
renaturalización
Para clonar: las técnicas de clonaje presentan ciertas limitaciones en cuanto al
tamaño del fragmento al que se aplican , si es demasiado grande el fragmento,
el rendimiento y la eficacia de algunas etapas decaen notablemente , es
preferible trabajar con moléculas más cortas que proceden de la rotura , aunque
sea inespecífico de la molécula a la original.
La producción de fragmentos específicos:
la rotura por sitios específicos
permite trabajar con fragmentos homogéneos y poder acceder a su análisis.
 El análisis del tamaño de fragmentos y de las moléculas que dieron lugar
a las técnicas electroforéticas.
 La construcción de mapas físicos, la ubicación de los fragmentos en el
esquema de la molécula original da lugar a un mapa de esa última.
 La determinación de la secuencia de la molécula: de una molécula nucleica,
lo que es lo mismo, su caracterización definida a nivel primario.
5.2 Métodos de rotura de ácidos nucleicos
Los métodos de rotura de los ácidos nucleicos están basados en los métodos
físicos, químicos y enzimáticos.
a) Métodos físicos : las fuerzas de cizalla que se originan cuando se obliga a la
disolución que contiene a la molécula nucleica a pasar a través de una sección
mucho menor, para ello se utilizan prensas, algunas fuerzas análogas producidas
con una batidora o agitador de aspas que consiguen una rotura semejante.
Se produce una mezcla heterogénea de fragmentos, el tamaño depende de las
fuerzas provocadas, a la vez están en función de la presión aplicada, la reducción
de la sección, velocidad de las aspas y el tiempo de agitación.
Las ondas de presión producidas por los ultrasonidos, los sonificadores son los
equipos que se utilizan para este propósito, modula la frecuencia como la
intensidad de la onda, esto permite trabajar en condiciones más controladas y
conseguir resultados más reproducibles,
Los fragmentos producidos presentan tamaños que se aproximan más a una
distribución gaussiana, la mezcla es heterogénea, el tamaño depende de las
condiciones y el tiempo.
b) Métodos Químicos: hidrolisis
polinucleotidica.
de enlaces éster fosfórico de la cadena
Hidrolisis acida: catalizadores son los protones de un ácido fuerte (clorhídrico), la
reacción comienza con la rotura de los enlaces que unen los restos de azúcar y
bases nitrogenadas puricas, lo que provoca la despurinizacion de la molécula
quedando inestable, la continuación del tratamiento acido conduce a la rotura de
los enlaces fosfodiester de la cadena por los puntos que precisamente perdieron la
base nitrogenada
Resulta una mezcla hetereogenea de mono-di y oligonucleótidos, en una que
depende de la intensidad de la reacción
Hidrolisis básica: catalizada por iones OH de una base fuerte (NaOH), la
hidrolisis básica solo actúa sobre la cadena de RNA, este mecanismo requiere un
OH en 2´tan solo presente en la en la ribosa de las moléculas de RNA.
La rotura libera mono-di u oligonucleótidos, su concentración relativa es en función
de la severidad de la hidrolisis
Hidrolisis parcial o total, con poca concentración del catalizador H o OH, a una
temperatura inferior a la óptima, limitando el tiempo de incubación, se consigue
que la reacción de hidrolisis no se realice en su totalidad, solo se rompan al zar
algunos enlaces éster fosfórico.
Del resultado de una hidrolisis parcial es una mezcla heterogénea de fragmento
oligonucleótidos, el tamaño responde de distribución de Gauss donde el tamaño
medio es función de la severidad de la reacción
C) Métodos enzimáticos.- producen la rotura de enlaces fosfodiéster de la
cadena polinucleotídica mediante su hidrólisis y esta reacción esta catalizada
enzimáticamente, a través del control de las condiciones (unidades de enzima,
temperatura, etc.) con esto se puede conseguir una hidrólisis total o parcial. En
este método se utilizan dos tipos de enzimas:

-

-
Endonucleasas
inespecíficas
(RNasas,
DNasas),
rompen
aleatoriamente puentes fosfato de la cadena. No presentan ninguna
especificidad de sitio. Las DNasas solo hidrolizan enlaces que implican
a restos de desoxirribosa; dependientes del catión Mg2+, su acción
resulta inhibida en presencia de agentes quelantes de este tipo de
cationes. Las RNasas son específicas en cadenas de RNA; son enzimas
muy activas y difíciles de desnaturalizar de manera irreversible; se
convierten en un riesgo en el de estas dos macromoléculas.
Los productos de enzimas son oligonucleótidos inespecíficos o incluso
mononucleotidos (si se lleva a cabo en condiciones de digestión total)
Endonucleasas de restricción, rompen DNA por enlaces específicos, son
únicas en este tipo de acción y son herramientas insustituibles en el
análisis de DNA.
Los fragmentos que se consiguen son fragmentos específicos
(fragmentos de restricción), resultado de la rotura del DNA por sitios
específicos.
UNIÓN ENZIMÁTICA DE FRAGMENTOS DE DNA:
La tecnología del clonaje del DNA recombinante, se fundamenta en un proceso
claramente sintético (in vitro): la unión de fragmentos de DNA para formar
moléculas recombinantes mixtas o quimeras, mediante el empleo de una actividad
enzimática central.
Considerando así a los Fragmentos de DNA como piezas de un sistema
informativo, las que contiene la información para la síntesis de un producto
(regiones codificadoras) y las que actúan dirigiendo y modulando la interacción de
estas últimas con la maquinaria enzimática responsable del proceso (señales). La
biología molecular se abre a las técnicas de manipulación de la información
genética: esto consiste en lograr una combinación adecuada de señales y
regiones codificadoras que sea funcional en un contexto celular apropiado.
Este mundo de posibilidades sintéticas se basa en un proceso de unión o ligado
de fragmentos de DNA bicatenario, fundamentado a su vez de una actividad
enzimática central: la DNA ligasa. Esta unión de piezas de DNA de cadena doble
(dsDNA) presenta una fuerte exigencia, que los extremos de las moléculas a unir
presenten extremos o terminales compatibles.
Unión enzimática de fragmentos de DNA:
La unión o ligado covalente de moléculas de DNA se basa en una reacción
enzimática, la esterificación del OH, en el 3’ de una desoxirribosa terminal por un
resto fosfato unido a la posición 5’ de otra desoxirribosa también terminal. La
actividad que cataliza esta reacción, la DNA ligasa, requiere dos cofactores: iones
Mg2+ y ATP o NAD (in vivo su función es sellar muescas en las moléculas de
dsDNA).
Extremos cohesivos
In vitro la DNA ligasa une dos piezas de dsDNA con extremos mono catenarios
protuberantes y de secuencias complementarias (extremos cohesivos); de forma
espontánea pueden ambos extremos acoplarse y mantenerse transitoriamente
unidos por puentes de hidrogeno, dando así un intermediario con dos muescas, la
DNA ligasa toma esta molécula como sustrato y cataliza el sellado en ambas
muscas produciendo así la unión de las dos piezas. Existen dos requisitos para
esta unión:
 Las terminales presenten las posiciones 5´ fosforiladas y las 3´con grupos
OH libres
 las regiones mono catenarias que sobresalen en el extremo de cada
fragmento sean complementarias entre sí a lo largo de toda su longitud, es
decir que sean cohesivas.
Con el uso de enzimas de restricción se obtienen productos con ambos requisitos.
Se pueden obtener así dos piezas de DNA que resultan de la digestión con una
misma enzima de restricción van a tener extremos protuberantes y cohesivos
entre sí, es decir compatibles.
Extremos romos
La DNA ligasa es también capaz de unir fragmentos de DNA de doble hebra
fosforilados en 5´y con terminales romo. Dándose un mecanismo que no pasa por
la formación de un intermediario, este mecanismo implica los dos extremos de dos
piezas de DNA y la enzima, en este caso la enzima interpreta como sustrato el
dsDNA con dos muscas. Esta reacción es posible a concentraciones mayores de
DNA y de enzima que favorezcan la unión de los tres componentes.
Todo extremo romo es compatible con cualquier otro. Esto permite unir piezas por
vías que no utilicen endonucleasas específicas. Lo único exigido a parte de fosfato
5´es la presencia del extremo romo que pueden obtenerse por rellenado o recorte
de los fragmentos (exonucleasa). Una desventaja es la imposibilidad de dirigir la
orientación en la unión de las piezas.
DNA ligasa:
La actividad enzimática más utilizada para la unión de fragmentos de DNA in vitro
es la actividad de bacteriófago T4, la cual presenta las propiedades siguientes:
 En presencia de iones MG2+ y ATP cataliza el sellado de muescas en una
molécula bacteriana de DNA.
 Esta actividad cataliza la unión de fragmentos de DNA de doble hebra con
terminales monocatenarias complementarias y cohesivas.
 La DNA ligas de T4 es capaz de unir fragmentos de DNA de extremos
romos.
 La temperatura de reacción depende de la naturaleza del sustrato; si este
tiene terminales protuberantes cohesivos se suelen utilizar temperaturas
bajas (8-14°C), si las piezas a unir presentan extremos romos, la
temperatura de la reacción suele ser relativamente altas (20-25°C)
Aplicaciones:
 Unión de fragmentos de dsDNA con extremos
complementarios y cohesivos.
 Unión de moléculas de dsDNA con extremos romos
 Unión de linkers
protuberantes
Extremos de los fragmentos a unir:
Para que dos piezas de dsDNA puedan ser unidas por la DNA ligasa es necesario
que presenten una estructura adecuada en sus extremos, de manera que puedan
acoplarse convenientemente para formar el verdadero sustrato de la enzima. Un
primer requisito a cumplirse es que el OH en 5´se encuentre fosforilado y el OH en
3´este libre.
Las regiones terminales de ambas piezas deben permitir que los grupos
funcionales implicados en el enlace puedan alcanzar posiciones que permitan la
catálisis lo cual se consigue si los extremos de ambos fragmentos son o bien romo
o protuberantes y cohesivos.
a) Extremos protuberantes iguales obtenidos por digestión con una sola
enzima:
Ambos fragmentos a unir se han obtenido por digestión con la misma
enzima, obteniéndose terminales idénticos protuberantes y cohesivos.
La primera fase de la reacción de ligado consiste en la unión de ambas
piezas por las regiones protuberantes, la velocidad de la reacción global
depende de la estabilidad del intermediario no covalente, función a si vez
de la fuerza de los pares de bases implicados.
Un terminal protuberante rico en G y C aporta más estabilidad al
intermediario y por lo tanto soporta temperaturas mayores, lo que facilita la
actividad de la enzima (ej.: extremos originados por Eco R1 son AATT que
forma un intermediario débil en comparación con extremos originados con
Xmal que es CCGG que produce un intermediario muy estable.)
b) Terminales compatibles obtenidos por digestión con enzimas diferentes
Mediante digestión con enzimas que reconocen diferentes dianas, pero que
producen regiones protuberantes idénticas (ej.: BamH1 y BglII, produciendo
la secuencia en el terminal 5´GATC);
c) Extremos romos. Con estos la compatibilidad de las terminales es absoluta.
Este tipo de unión presenta ciertos inconvenientes:
 En la práctica la reacción es algo más compleja (requiere mayores
concentraciones de enzima y de sustrato y medios con agentes
excluyentes de agua como PEG)
 La orientación de la unión de las piezas es incompatible
 La unión de fragmentos es irreversible ya que nos e recupera
ninguna diana de restricción en los puntos de ligado
Modificación de extremos:
a) Modificación del estado de fosforilación de los extremos:
El enlace fosfodiester cuya formación cataliza la ligasa se formará a partir
de un resto de fosfato unido a un OH en 5´de una desoxirribosa y un grupo
OH libre en un 3´de la desoxirribosa contigua. Si las piezas a unir
representan un esquema de fosforilación distinto tendrá que ser corregido
haciendo uso de las actividades de fosfatasa o de quinasa.
b) Conversión de terminales protuberantes a terminales romo
Esta es una modificación que puede lograrse por dos caminos:
1.- recortando el extremo monocatenario protuberante mediante digestión
con una exonucleasa. Esta modificación es viable siempre, pero elimina la
secuencia monocatenaria e impide la recuperación de la diana de
restricción.
2.-Rellenando la región en mono hebra mediante incubación con una
polimerasa y los cuatro dNTPs. Solo es viable cuando el extremo
protuberante es 5´,y la polimerasa puede elongar el 3´, y en algunos casos
es posible que los sitios de restricción se recuperen.
c) Conversión de terminales romo en extremos protuberantes.
Consiste en la construcción de una región homopolimerica en los extremos
3´de un dsDNA lo que se conoce como una cola (tail), empleando para ello
la actividad de la transferasa terminal. El procedimiento supone la
realización de dos incubaciones en una de ellas, uno de los fragmentos a
unir se trata con la enzima en presencia de un solo dNTP, en la otra
incubación la segunda pieza se trata con la dNTT (dN trasferasa terminal )y
el dNTP de base complementaria a la primera.
d) Relleno parcial de terminales protuberantes en 5´
Se basa en el relleno de regiones con el 3´retraido mediante polimerasa
pero en presencia de tan solo ciertos dNTPs precursores; así puede
conseguirse rellenar parcialmente los terminales monocatenarios y
reducirlos a unas secuencias cohesivas más cortas pero compatibles.
Linkers y adapadores.
linkers
Cuando no resulta difícil construir los terminales adecuados en los fragmentos que
se quiere unir, puede acudirse al empleo de ciertos oligonucleótidos sintéticos
preparados para este fin, Los linker que son fragmentos sintéticos de ssDNA (DNA
de cadena sencilla) construidos con estructuras palindrómicas es decir con
complementariedad interna y que contienen en su interior secuencias de una
cierta diana de restricción.
Adaptadores:
Son piezas cortas de DNA bicatenario, con extremos protuberantes
correspondientes a dos diferentes secuencias de sitios de restricción. Pueden
construirse ligando dos linkers y cortarlos con las enzimas correspondientes o bien
sintetizarlos directamente. Su empleo permite unir covalentemente piezas de
dsDNA con terminales incompatibles. Su existencia hace posible pegar cualquier
pareja de dsDNA.
Consideraciones del proceso de ligado:
Los aspectos mas relevantes tienen que ver con el rendimiento del proceso de
ligado y con la orientación de la unión entre las dos piezas.
Factores que afectan el rendimiento:
En el caso más general en el medio de reacción existen cuatro regiones
terminales dos de cada fragmento que pueden ser compatibles de manera que la
ligasa puede catalizar la unión de cualquier pareja entre ellas esto lleva a la
formación de subproductos (moléculas circulares, moléculas dimericas, o
moléculas de orden superior como círculos dimericos oligomeros simples o mixtos)
que reduce el rendimiento.
Para reducir los subproductos se puede:
 Aumentar la concentración de los fragmentos, aumentando los choque
intermoleculares para reducir la frecuencia de uniones intramoleculares
 Preparación de cada uno de los fragmentos con sus dos extremos distintos
para impedir formar círculos intramoleculares
 Construcción de colas homopolimericas para impedir la circularización y la
polimerización de fragmentos.
 Desfosforilación de uno de los fragmentos mediante incubación con
fosfatasa impide la formación de círculos y dímeros
Orientación de unión de los fragmentos:
La solución más general a este problema es el clonaje direccional el cual es un
proceso basado en preparar los fragmentos a unir de manera que, entre las
cuatro regiones terminales presenten solo dos sea compatibles : se bloquea la
circularización de los fragmentos y se dirige la orientación de su unión.