PCR EN TIEMPO REAL
TÉCNICA
Emplea del mismo modo que la PCR convencional (punto final), un molde de ADN, un
par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADN
polimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con
un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para
medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita
medir la tasa de generación de uno o más productos específicos. Dicha medición, se
realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que también se le denomina
PCR en tiempo real (es decir, PCR inmediata, simultánea). }
Etapas De La Técnica
a)
b)
c)
d)
e)
f)
Extracción de ADN genómico
Cuantificación y dilución del ADN
Preparación de la mezcla de reacción
Preparación de la curva de calibración y controles
Colocación de la mezcla de reacción y el ADN en la placa para la PCR
Amplificación por la PCR del fragmento del ADN endógeno y del gen de
interés
g) Ajuste de la curva de calibración y obtención de datos.
FUNDAMENTO
Se realiza en un termociclador con capacidad de hacer incidir sobre cada muestra un
haz de luz de una longitud de onda determinada y de detectar la fluorescencia emitida
por el fluorocromo excitado.
REACTIVOS
PROCEDIMIENTO
TIPOS DE SONDAS
Sondas De Hibridización Específicas
Son sondas marcadas con dos tipos de fluoróforos, un donador y un aceptor. El
proceso también se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante
resonancia (FRET) entre las dos moléculas. Las más utilizadas son las sondas de
hidrólisis, conocidas comercialmente como Taqman®, las sondas conocidas como
molecular beacons, los scorpions y las sondas FRET.
a. Sondas De Hidrólisis
Son oligonucleótidos marcados con un fluoróforo donador en el extremo 5’ que emite
fluorescencia al ser excitado y un aceptor en el extremo 3’ que absorbe la
fluorescencia liberada por el donador. Para que esto ocurra, las moléculas donadora y
aceptora deben estar espacialmente próximas. Además, el espectro de emisión de la
primera se ha de solapar con el espectro de absorción de la segunda. Mientras la
sonda está intacta, la fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor
Sin embargo, durante la amplificación de ADN templado, la sonda se hibrida con su
cadena complementaria. Al desplazarse a lo largo de la cadena, en su acción de
síntesis, la ADN polimerasa de Thermus aquaticus, que tiene actividad 5’ exonucleasa,
hidroliza el extremo libre 5’ de la sonda, produciéndose la liberación del fluoróforo
donador. Como donador y aceptor están ahora espacialmente alejados, la
fluorescencia emitida por el primero es captada por el detector. Las sondas de
hidrólisis ofrecen precisión similar que la que ofrecen los ensayos seguidos con SYBR
Green I (Wilheim et al., 2003a), pero éstas además dan gran seguridad de alcanzar la
especificidad. Debido a esto, el uso de sondas de hidrólisis es un método recurrente
para la genotipificación. Dos sondas fluorogénicas, marcadas con dos marcadores
espectralmente diferentes, pueden ser utilizadas para discriminar entre alelos nativos
y mutantes. Si se detecta la amplificación de una muestra de ADN desconocido por la
identificación del fluoróforo del alelo nativo y no por la del alelo mutado, la muestra se
considera como homocigoto del tipo nativo y, de forma inversa, si se encuentra
fluorescencia del marcador de identificación del mutante, se clasifica como
homocigoto de la cepa mutante. Si se presentan marcajes de ambos fluoróforos, esta se
designa como heterocigota para los dos alelos
b. Molecular Beacons
Son sondas parecidas a las anteriores. Tienen una molécula donadora en el extremo 5’
y una aceptora en el extremo 3’ pero, además, presentan una estructura secundaria en
forma de asa, en la que reside la secuencia de unión específica con el ADN diana. Los
extremos permanecen plegados cuando la sonda no está hibridada, lo que conlleva a
que donador y aceptor estén muy cerca uno de otro. En esta conformación la
fluorescencia emitida por el donador es absorbida por el aceptor y no es captada por
el lector del equipo. Sin embargo, al hibridar con el ADN blanco la sonda se abre,
alejándose donador y aceptor, pudiéndose detectar la fluorescencia emitida por el
primero, el uso de los molecular beacons proporciona un nivel adicional de
especificidad, ya que es muy poco probable que falsos amplicones o primers-dímeros
posean secuencias blanco para ellos, la generación de fluorescencia es exclusiva de la
síntesis de los amplicones analizados.
c. Scorpions
Son moléculas bifuncionales que contienen un primer covalentemente unido a una
sonda Las moléculas también contienen un fluoróforo que puede interactuar con un
represor (quencher) para reducir la fluorescencia. Cuando las moléculas se usan en
una reacción de PCR, el fluoróforo y el represor se separan generando un incremento
en la luz emitida Las ventajas de los scorpions se basan en que la sonda está acoplada
físicamente al primer. Esto significa que la reacción que se lleva a cabo para generar
la señal es un cambio unimolecular. En contraste con las colisiones bimoleculares
requeridas por otras tecnologías tales como Taqman® o molecular beacons. Las
ventajas de un cambio unimolecular son significativas, pues la reacción es instantánea
y ocurre antes que cualquier reacción inespecífica o colateral como los
realineamientos de los amplicones o el plegamiento inadecuado del templado. Esto
conduce a señales más fuertes, a un diseño más confiable de la sonda, a tiempos de
reacción más cortos y a una mejor discriminación. Los scorpions son primers con una
estructura tallo-asa que contiene un fluoróforo y un represor. La estructura tallo asa
está separada del primer por un “bloqueador”, el cual es una estructura con
modificaciones químicas que previene que se copie la estructura tallo asa del primer.
Durante la reacción de PCR, los primers scorpions se extienden para formar los
productos del PCR. En la etapa de alineamiento del ciclo de PCR, las secuencias de la
sonda en la cola del primer se curvan para hibridar la secuencia blanco en el producto
del PCR , Como la cola del scorpion y el producto del PCR forman parte de la misma
hebra de ADN, la interacción es intermolecular. La secuencia blanco generalmente se
escoge para estar a 3 bases del extremo 3’ del primer scorpion.
d. Sondas FRET
El sistema se compone de dos sondas que se unen a secuencias adyacentes del ADN
blanco. Una de las sondas lleva un donador en el extremo 3’ y la otra un aceptor en el
extremo 5’. Cuando las sondas están hibridadas, los dos fluoróforos están próximos. Al
ser excitado, el donador transfiere su energía al aceptor que, a su vez, emite la
fluorescencia que detecta el lector del equipo.
En todos estos sistemas, el incremento de ADN en cada ciclo se corresponde con un
aumento de hibridación de las sondas, lo que conlleva un aumento en la misma
proporción de fluorescencia emitida. El empleo de sondas garantiza la especificidad
de la detección y permite identificar polimorfismos o mutaciones puntuales, pero su
costo es más elevado que el SYBR Green I y la optimización de las condiciones de la
reacción resulta más difícil.
e. Otras sondas
Hay más químicas de sondas disponibles, todas con ventajas y desventajas. Entre ellas
se cuentan;
los Hybeacons, los cuales requieren solo un fluoróforo y hace uso de las propiedades
de represión del ADN. Esto los hace fáciles de diseñar y sintetizar. (French et al.,
2002).
Las sondas Light up están compuestas de naranja de tiazol conjugada a péptidos de
ácidos nucleicos (PNA) y combina las excelentes propiedades de los PNA, que
permiten el uso de sondas más cortas con un extraordinario aumento en la
fluorescencia.
Las sondas Eclipse® son sondas lineales que tienen un marcador del surco menor
(MGB su sigla en inglés), un represor en el extremo 5’ y el fluoróforo en el extremo 3’
(Bustin et al, 2004a).
VENTAJAS
 La primera gran ventaja de la PCR a tiempo real es su rapidez, puesto que no se
necesita ningún proceso adicional de detección.
 utilizar sistemas cerrados, el riesgo de contaminación disminuye de forma muy
importante. Los sistemas a tiempo real permiten cuantificar la concentración
inicial de ácido nucleico presente en las muestras de manera mucho más
sencilla, más precisa y sobre todo en un rango mucho mayor (5-6 log) que en
los procedimientos convencionales (2-4 log), Asimismo, la determinación de
mutaciones puntuales que pueden estar relacionadas con resistencias a
medicamentos antimicrobianos o con factores de virulencia, es mucho más fácil.
 Los equipos para PCR a tiempo real tienen una capacidad muy elevada ya que
en el mismo instrumento se pueden llevar a cabo ensayos cualitativos,
cuantitativos, determinación de mutaciones, PCR múltiple, etc., mientras que
para los procedimientos convencionales se requieren múltiples equipos
 Alta sensibilidad y especificidad
DESVENTAJAS