Philippe SOUCAILLE
2016
4GB
GENETIQUE BACTERIENNE
UF : Génie Génétique et Génétique Bactérienne
Chapitre 2 : Les MUTATIONS
soucaill@insa-toulouse.fr
1
INTRODUCTION
Au cours de la division bactérienne, il apparait spontanément des mutants pour lesquelles il
est incapable de synthétiser un ou des métabolites. Source principale des mutations : la
réplication.
Certaines mutations peuvent conduire à l’incapacité d’effectuer la synthèse d’un métabolite
essentiel. La survie de ces mutants dépendra de la présence de ce métabolite dans le milieu. De
tels mutants sont dits auxotrophes (ex His- = autotrophe à Histidine) par opposition à la souche
parentale dite prototrophes (ex His+ = prototrophe à Histidine).
Les mutations spontanées peuvent affecter toutes les fonctions cellulaires, comme par exemple
la respiration, la fermentation des sucres, la synthèse de la paroi. Dans tous les cas, la survie de
tels mutants dépendra des conditions d’environnement, autrement dit de la pression de
sélection que subira la souche.
Fréquence de mutation = 10-8 par génération et par cellule. Cette fréquence peut être fortement
augmentée par l’exposition de la souche à un agent mutagène, physique ou chimique. On parlera
alors de mutations induites par opposition aux mutations spontanées.
I.
LES MUTATIONS SPONTANEES
A) Mutations liées à des erreurs de réplication
1) Transitions/Transversions
Watson et Crick : proposent leur modèle de la double hélice grâce en particulier à leur
connaissance de la chimie des bases qui peuvent exister sous différentes formes
tautomèriques. Ils notèrent que l’insertion d’un mauvais tautomère dans l’ADN pouvait sans
doute mener à un mauvais appariement des bases et à l’apparition d’une mutation au cours de la
réplication. Donc les formes tautotmériques des bases pouvaient être à l’origine de certaines
mutations.
La forme amino de la cytosine
(forme majoritaire) est capable de
s’apparier avec la forme imino de
l’adénosine (forme minoritaire).
La forme amino de l’Adénosine
(forme majoritaire) est capable de
s’apparier avec la forme imino de la
cytosine (forme minoritaire).
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La forme céto de la Thymine (forme
majoritaire) est capable de s’apparier avec
la forme enol de la guanine (forme
minoritaire).
La forme céto de la Guanine (forme
majoritaire) est capable de s’apparier avec
la forme enol de la Thyimine (forme
minoritaire).
L’ADN polymérase corrige très efficacement ces erreurs grâce à sa fonction 3’  5’
exonucléasique. Cependant, tous les évènements de tautomérisation n’ont pas le même effet
sur la géométrie de la double hélice qui est le principal déterminant de la correction d’erreur par
la polymérase. Si on supprime cette activité de la polymérase, on diminue son efficacité.
L’incorporation d’un tautomère rare (faible) d’une purine (imino-adénine ou énol-guanine) à la
place d’une purine (G ou A) provoquera un appariement illégitime, A-C ou GT, mais la
déformation de la double hélice sera faible car les paires formées seront toujours de type purinepyrimidine. De même pour la substitution d’une pyrimidine par la forme tautomère rare d’une
autre pyrimidine (imino-cytosine ou énol- thymine).
Ce type d’erreur a donc des chances de passer le crible de la polymérase et au cours de la
réplication suivante, l’appariement normal étant respecté par un retour de la base à sa forme
tautomère la plus courante, une des quatre molécules filles d’ADN portera une mutation de type
GC -> AT ou AT -> GC. Ces mutations sont appelées des transitions. La forme minoritaire de la
thymine peut faire 3 liaisons et va donc se lier à une guanine.
Par contre, on peut rencontrer un autre type de mutations dans lequel une purine est remplacée
par une pyrimidine ou inversement : G ->C ou T ->G par exemple. On parle alors de transversion.
Ce type de mutation va résulter en une déformation importante de l’hélice d’ADN et ne peut pas
ne pas être détectée par la polymérase lors de la réplication. Il est donc peu vraisemblable que
de telles mutations résultent d’erreurs de réplication. On n’a pas en fait d’explication claire du
mécanisme d’apparition de telles mutations.
(nb : à l’exception peut-être de mutations G*A où A a la configuration syn et G la configuration
trans, le couple formant une paire moins aberrante que les autres transversions.)
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2) Mutations de phase (glissement de cadre de lecture)
Un autre type d’erreur qui peut se produire spontanément au cours de la réplication est un
glissement sur l’un des deux brins, qui provoquera une délétion ou une insertion de
quelques bases, généralement une ou deux. Il faut toujours qu’il y ait des répétions de bases
pour qu’il y ait glissement du brin.


Si le glissement se produit sur le brin matrice, il se produira une délétion.
S’il se produit sur le brin néo-synthétisé, on obtiendra une insertion.
L’analyse de telles mutations est facilitée par le fait que si elles se produisent dans la séquence
d’un gène codant pour une protéine, elles provoquent généralement un changement du cadre de
lecture des codons. Dans son travail fondamental sur les mutants du phage T4 en 1961, Benzer
avait montré qu’il existait des positions beaucoup plus susceptibles d’être mutées spontanément
que d’autres dans l’ADN du phage. Il les avait appelées les points chauds de mutagénèse.
De même, Jeffrey Miller a entrepris une étude du même type sur le gène lacI et identifié un point
chaud particulièrement important. L’analyse de la séquence du gène a permis de déterminer que
la zone correspondant au point chaud de mutagénèse est constituée d’une séquence de quatre
bases répétée trois fois.
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3) Délétions
Ce mécanisme est très courant chez E.coli. La délétion spontanée de segments d’ADN importants
(de plusieurs dizaines ou centaines de paires de bases) est aussi un évènement fréquent.
L’analyse de telles délétions dans le gène lacI a montré qu’elles se situent le plus fréquemment
entre deux séquences répétées directes (homologues) dont une seule subsiste après la
délétion.
LacI
Il va donc y avoir une recombinaison homologue entre les 2 régions (qui se fera grâce à la
protéine RecA). Il s’agit donc d’un mécanisme qui est Rec-A dépendant. On obtiendra donc un
nouveau gène et un autre gène circulaire (correspondant au fragment LacI éliminé, qui sera
ensuite détruite dans la bactérie).
4) Insertions/ duplications
De la même manière que pour le cas précédent, on peut supposer que des insertions de grande
taille soient provoquées par un glissement de la polymérase entre deux séquences répétées
sur le brin néoformé. Il en résulterait alors une duplication de la séquence comprise entre les
deux séquences répétées. On obtient de nouveau l’’ADN WT mais aussi un fragment circulaire.
WT
Glissement
Mutant
RecA
WT
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B) Lésions spontanées
Définition : Il s’agit de lésions qui apparaissent spontanément, sur l’ADN au repos, mais qui
seront « stabilisées » lors du prochain cycle de réplication. On peut rencontrer 2 phénomènes :
La dépurination et la désamination.
1) Mécanisme : Dépurination
La rupture du lien glycosidique entre le désoxyribose et une base purique (A ou G) est un
évènement spontané assez fréquent (10.000/cellule/génération chez les cellules animales). Il en
résulte un site apurinique qui, s’il n’est pas réparé, va entrainer une mutation lors du cycle de
réplication suivant.
2) Mécanisme : Désamination
Un autre accident spontané fréquent est la désamination oxydative qui va toucher les
cytosines, qui donne un uracile. Ce n’est aps une base que l’on retrouve normalement dans un
ADN.
Une enzyme spécialisée, l’Uracile-ADN glycosylase (chez E. coli : le gène qui code pour cette
enzyme est umg) reconnait ces uraciles dans l’ADN et les excise (ne coupe pas la chaine
glycosydique mais libère l’Uracyle), puis l’ADN est réparé.
Cas particulier :
Dans le cas contraire, un A sera inséré en face du U, et on aura donc transition d’une paire G-C
vers une paire A-T. Ces désaminations ne sont pas détectées par l’Uracile-ADN glycosylase si
elles touchent non pas la cytosine mais la 5-Méthyl cytosine. Cette base modifiée est obtenue
par méthylation spécifique de certaines cytosines au sein des séquences d’ADN, aussi bien chez
les procaryotes que chez les eucaryotes. Ces méthylations jouent un rôle important soit dans le
phénomène de restriction (bactéries et régulation de la réplication) soit dans le contrôle de
l’expression des gènes (eucaryotes). La désamination oxydative des 5-Me cytosines génère des
thymines. Comme il ne s’agit pas d’une base anormale dans l’ADN, elle n’est pas enlevée par
l’Uracyle-ADN glycosylase, et a donc une forte probabilité de se traduire par une mutation à la
réplication suivante. Là encore, l’équipe de Jeffrey Miller a montré que la fréquence d’apparition
spontanée des transitions G-C vers A-T dans le gène lacI est fortement corrélée à la présence des
cytosines méthylées dans sa séquence. On a donc des « hotspots » de mutation spontanées au
niveau des cytosines méthylées. On voit en passant, une justification de l’usage des T dans l’ADN
et non des U, car la désamination oxydative des cytosines entrainerait dans le cas contraire une
instabilité du code inacceptable.
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II.
LES MUTATIONS INDUITES
Un grand nombre d’agents physiques ou chimiques peuvent modifier la structure chimique de
l’ADN et provoquer l’apparition de mutations. On parle alors d’agents mutagènes.
A) Spécificité mutationnelle
Si l’on regarde la distribution des mutations provoquées par différents agents mutagènes, on
observe que chacun d’eux présente une spécificité qui le caractérise. Cette spécificité se traduit
par la préférence à la fois de certains types de mutations (Exemple : transition GC  AT) et
de certains sites au sein du génome.
Ce phénomène a été mis en évidence par Jeffrey Miller et en a fait une analyse détaillée dans les
années 80, grâce au système lacI: il a mesuré la fréquence d’apparition d’un codon stop UAG
dans la séquence du gène sous l’effet de différents mutagènes. La séquence du gène étant
connue, il a aussi pu identifier la nature de chacune de ces mutations. On voit que chacun des
mutagènes étudiés présente un spectre de spécificité caractéristique.
Ce spectre de spécificité a deux composants: d’une part une préférence pour un type donné de
substitution, qui traduit l’existence de plusieurs mécanismes de mutagénèse, d’autre part,
l’existence au sein d’une classe de « points chauds » de mutations, qui traduit l’influence de la
séquence environnante sur la fréquence de mutation.
B) Les analogues de bases
Certains composés chimiques ont des structures suffisamment proches des bases normales
pour qu’ils puissent être incorporés accidentellement à leur place dans l’ADN. Ce sont les
analogues de bases. Incorporé dans l’ADN au cours de la réplication, ils s’apparieront avec une
base normale. Au cours du cycle suivant, ils provoquent l’incorporation d’une base incorrecte.
Dans une base normale, les analogues de base possèdent une forme tautotmériques
normalement en petite quantité et en cas de mutation ils vont passer en grande quantité.
1) Cas du 5-Bromouracyle (5’BU)
Le 5-Bromo Uracile est un analogue de la thymine qui porte un brome en 5 à la place du
Méthyle. Il est donc capable d’être incorporé en face d’un A lors de la réplication de l’ADN.
La forme céto a des propriétés d’appariement identiques à celle de la thymine, mais le 5-Bu
existe fréquemment sous sa forme énol (du fait de la modification de la répartition électronique
dûe au brome, forme beaucoup moins rare). Sous cette forme, le 5-Bu a les mêmes propriétés
d’appariement qu’une cytosine.
Son incorporation dans l’ADN provoquera donc fréquemment une transition A-T vers G-C.
Inversement, s’il est incorporé sous forme énol, il peut, au cours du cycle suivant s’apparier sous
sa forme céto avec une Adénine et provoquer une transition G-C vers A-T.
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2) Cas du 2-AminoPurine (2-AP)
Un autre mutagène analogue de base très utilisé est la 2-aminopurine. Analogue de l’Adénine,
elle peut s’apparier « de manière normale » avec la thymine, mais aussi de façon illégitime avec
la cytosine. La 2-AP provoquera donc aussi préférentiellement des transitions AT  GC.
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C) Appariements illégitimes spécifiques
Certains agents mutagènes ne sont pas incorporés dans l’ADN mais altèrent une base en une
forme qui provoque un mauvais appariement.
1) Agents alkylants
C’est le cas des agents alkylants comme :


l’Ethyl-méthane sulfonate (EMS) : transfère un groupement étyl
la Nitrosoguanidine (NG) : transfère un groupement méthyl.
Ces réactifs vont surtout alkyler l’oxygène en position 6 de la guanine, bloquant ainsi une des
possibilités de liaisons hydrogène et provoquant son appariement avec la thymine. Ils vont
donc provoquer essentiellement des transitions du type GC  AT.
2) Hydroxylamine
L’hydroxylamine va oxyder surtout l’amine en position 4 des cytosines, pour former la N-4
hydroxycytosine, qui s’appariera avec l’Adénine. On aura donc essentiellement des
transitions GC AT.
De même, les ions bisulfites ou l’acide nitreux, qui désaminent la cytosine en uracile
provoqueront aussi des transitions GC  AT. L’acide nitreux désamine aussi l’Adénine en
Hypoxantine qui s’appariera à la cytosine.
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3) Agents intercalants
Certaines molécules planes peuvent s’intercaler entre les bases de l’ADN, provoquant une
déformation de la double hélice. Il s’agit de la Proflavine, l’Acridine orange et les ICR. Ils
provoquent alors la délétion ou l’insertion d’une paire de bases lors d’évènements de
réparation ou de recombinaison que nous détaillerons plus loin. Ils peuvent aussi stabiliser une
boucle d’ADN simple brin et favoriser les mécanismes de mutation par changement de phase tels
que nous les avons vus plus haut.
D) By-pass de la réplication : le système SOS
Certains agents mutagènes très puissants altèrent les bases de telle façon qu’elles ne peuvent
plus s’apparier. Lors de la réplication, la polymérase se trouve donc bloquée et la cellule est dans
une situation critique. Cette situation induit l’expression d’un groupe de gènes particuliers, les
gènes SOS, qui vont permettre de contourner le point de blocage de la réplication, mais au prix
de mutations. L’action de ces agents mutagènes parmi lesquels on trouve la plupart des
carcinogènes, dépend donc de la mise en route du système SOS. On ne sait pas comment le
système SOS agit au niveau de la réplication. On suppose qu’il intervient en diminuant la fidélité
de la réplication, de façon à permettre au complexe de réplication de passer par-dessus la lésion.
1) Les ultra-violets
Les ultraviolets provoquent l’apparition de photoproduits sur l’ADN, les plus fréquents étant
des dimères de pyrimidines, soit T-T, soit C-T. Ces dimères covalents ne peuvent plus
s’apparier avec les autres bases. L’intervention du système SOS va provoquer le plus souvent
une transition, mais on peut aussi avoir des délétions, des changements de phase ou des
transversions.
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2) L’aflatoxine B1
L’aflatoxine B1 est un puissant agent mutagène et plus particulièrement un carcinogène,
multipliant la fréquence de mutation par plus de 106.
En se substituant sur la position N7 de la guanine, elle va provoquer l’apparition de sites
apuriniques. Le système SOS incorpore préférentiellement un A en face d’un site apurinique. On
aura donc des transitions GC  AT.
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III. LES MECANISMES de la REPARATION
Face à ces agressions naturelles ou induites par les mutagènes que subit l’ADN cellulaire, les
cellules ont développé des systèmes enzymatiques qui permettent sa réparation.
A) La réversion directe l’EPR
Nous avons vu que les lésions dues aux UV sont de 2 types. Celle résultant en :

la Formation de cyclobutane-pyrimidine peut être réparée directement grâce à une
enzyme de photoréactivation (EPR) qui, sous l’effet de la lumière blanche (l’enzyme
ne peut pas agir dans l’obscurité), coupe les liaisons entre les deux cycles et régénère
les bases de départ. Ce système ne peut opérer dans l’obscurité. Les dimères formés en
6-4 ne peuvent être réparés par cette enzyme. Certains organismes possèdent une
deuxième enzyme qui permet la réparation des dimères 6-4 (mais pas coli).

L’alkyltransférase : Il existe aussi une enzyme qui élimine directement certains
groupes alkyl sur le O6 de la guanine, ajoutés par l’EMS ou la NG. Dans le cas de
l’enzyme de coli (Ada), on a montré que l’enzyme transfère directement le groupe
méthyle de la O-6 Guanine (ou de la Me-O-4 thymine) sur une cystéine du site actif, ce
qui a pour effet d’inactiver l’enzyme. Si le niveau de méthylation des guanines est trop
important, le système de réparation peut donc être saturé.
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B) Les voies de l’excision
1) Mécanisme général d’excision (Nucleotide Excision Repair : NER)
Une autre façon de procéder à la
réparation consiste à exciser la partie
endommagée puis à la remplacer par la
séquence correcte, déterminée à partir
du brin intact.
Le mécanisme général d’excision fait
intervenir les produits de trois gènes :
uvrA, uvrB et uvrC. Ce mécanisme
reconnaît des déformations de l’ADN
mais aussi des dimères de T-T.
C’est le complexe de reconnaissance
UvrA2-UvrB qui reconnait toutes les
lésions qui déforment la double hélice
d’ADN.
UvrB (va reconnaitre les dimères de
UvrA) se fixe alors à l’ADN (et UvrA2
s’en
va)
guidant
ainsi
UvrC
(exonucléase) qui va couper l’ADN sur
le brin abimé, 8 bases en amont alors
que UvrB coupe 3-4 bases en aval de la
lésion. Il en résulte une petite zone
simple brin de 12 bases qui est comblée
par la DNA polymérase I et la ligase et
donc récrer un ADN double brin réparé.
UvrD est une hélicase qui va séparer les
2 brins d’ADN.
Ce système général d’excision est
capable de reconnaitre et de réparer de
nombreux types de lésion, y compris les
lésions UV. Il est responsable de 99%
des réparations des mutations
déformant l’ADN.
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Il existe également un autre système d’excision spécifique de la base qui n’est pas correcte : Le
système BER = Base Excision Repair
Certaines lésions ne causent pas de distorsion
notable dans double hélice et sont détectées +
réparées par systèmes spécifiques = enzymes
spécialisées
qui
enlèvent
la
base
endommagée.
Les ADN glycosylase peuvent couper la liaison
N-glycosidique entre la base et le sucre dans
l’ADN. Il existe de nombreuses ADNglycosylases, capables de reconnaitre chacune
un type de base modifiée (alkylée, oxydées,
cycle ouvert, photo-dimères… et certains types
de mésappariements) :
 Uracyl-ADN glycosylase reconnait les
produits de désamination des cytosines
 Hypoxanthine-ADN
glycosylase,
reconnait les produits de désamination des
adénines.
 MutY : capable d’éliminer les adénines
en face des guanines (paire A-G) mais aussi les
produits de l’oxydation de la guanine, la 8-oxoG,
qui peut s’apparier avec un C ou un A.
 MutM : excise la 8-oxoGuanine des
paires G-C pour permettre la resynthèse de la
bonne paire GC avant la prochaine réplication.
 Mut T : enzyme qui va hydrolyser le
dGTP en dGMP de manière à ce qu’il ne soit plus
incorporé par l’ADN.
Les endonucléases AP = apurinique, élimine tout
élément de sucre qui n’a pas de base. Répare les sites
apuriniques laissés après intervention de ADN-glycosylase
qui coupent spécifiquement l’ADN au niveau des sites
apuriniques ou abasiques, puis activité exonucléase pour
éliminer le nucléotide abimé. Ensuite l’ADN est réparé par
la DNA pol I + la ligase. Dans certains cas, une autre
enzyme intervient (phosphodiestérase ou glycosylase
lyase) en conjonction avec l’AP endonucléase.
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Schéma récapitulatif des actions des Mut :
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C) La réparation post-réplicative
1) La réparation des paires défectueuses (Mismatch repair)
Objectif : réparer une erreur qui vient de la réplication mais qui n’a pas été repéré par l’ADN
polymérase. Mais il faut différencier le brin matrice du brin synthétisé => immédiatement
après fourche de réplication, les deux brins issus de la réplication se distinguent par la
méthylation : brin matrice est méthylé (adénines au niveau des séquences GATC, cytosines sur
les séquences CCAGG/CCTGG). Le brin néosynthétisé est méthylé un peu plus tard (8
minutes) :
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2) La réparation par recombinaison
Lors de l’intervention du système SOS, on a « by-pass » de la lésion, avec création très fréquente
d’un mésappariement. Un autre mode de réparation consiste à utiliser un segment de l’ADN
parental de l’autre brin en cours de réplication, qui sera échangé avec le brin
néosynthétisé face à la lésion, par recombinaison. Le brin parental ayant ainsi subi une
délétion simple brin sera ensuite réparée par la DNA pol I et la ligase. Le brin portant la lésion
peut ainsi être réparé en respectant la complémentarité des bases.
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D) Conclusion : la stratégie de réparation et les gènes mutateurs
La protection de la fidélité du code de l’ADN se fait à différents niveaux :

dans les cellules, il y a des enzymes de détoxification qui vont inactiver certains
mutagènes, formant une première barrière.

intervention d’un système général d’excision lorsque les lésions provoquent une
distorsion notable de la double hélice. Pour les lésions plus discrètes, des systèmes
spécialisés sont mis en jeu (ADN glycosylases).

système de réparation post-réplicatif assure une intervention immédiatement après la
réplication.
Ces stratégies de réparation (basées sur la reconnaissance des lésions et de mésappariements)
sont si efficaces qu’ils permettent d’avoir un taux de mutation qui passe de 10-7 à 10-9 (très
faible).
Lorsqu’un gène codant pour l’une de ces protéines est défectueux, on a alors affaire à une souche
mutatrice, dans laquelle le taux de mutation est anormalement élevé (augmentation des
mutations d’un facteur 1000). Les gènes impliqués dans ce processus de reconnaissance des
mésappariements sont donc appelés les gènes mutateurs.
Exemples :







dam, codant pour la méthylation des adénines
Ung (Uracyl-ADN-glycosylase)
mutD (proofreading de la DNA pol III, sous-unité épsilon),
mutS et mutL (reconnaissent les paires G-T),
mutY (paires G-A),
mutU (hélicase de séparation des brins, est aussi appelée UvrD ou Hélicase II)
mutH (endonucléase).
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IV.
LE TEST d’AMES
Idée : essayer de voir si les molécules sont potentiellement cancérigènes. Si une molécule est
mutagène chez une bactérie, alors elle sera probablement cancérigène chez l’homme ou les
animaux. Il s’agit d’une alternative simple et peu coûteuse aux tests sur animaux lors de
l’introduction d’un nouveau produit sur le marché.
Ames a mis au point des souches de Salmonella thyphimurium portant une série de mutations
:


dans le système de réparation par excision,
et enfin dans la voie de synthèse de l’histidine = fabrication de souches auxotrophes à
l’histidine par mutation de transition, transversion et mutation de phase. Ainsi, la
capacité d’un agent chimique de provoquer la réversion de la mutation His dans l’une de
ces souches sera indicative du type de mutation qu’il provoque : substitution de bases ou
mutation de phase.
De plus, comme de nombreux produits
chimiques sont susceptibles d’être
métabolisés
dans
l’organisme,
particulièrement par le système de
détoxification hépatique, et que ce
peut être soit le produit lui-même qui
est cancérigène, soit l’un de ses
métabolites, Ames a imaginé de
complémenter le milieu de culture des
bactéries par un extrait centrifugé (S9)
de foies de rats préalablement
stimulés pour la détoxification par
injection d’arochlore (un PCB).
Les bactéries sont incubées avec le
produit à tester, avec de l’extrait
hépatique S9, puis elles sont étalées sur
un milieu sans histidine. Le pouvoir
mutagène du produit ou de ses dérivés
peut alors être évalué en mesurant la
fréquence de réversion de l’auxotrophie
His, autrement dit le nombre de colonies
qui poussent sur le milieu sans histidine.
Ce test a permis de mettre en évidence
le pouvoir mutagène de centaines de
substances chimiques.
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