Introducción.
Que es cromatografía
Método de análisis que permite la separación de gases o líquidos de una mezcla
por adsorción selectiva
En la Cromatografía Líquida, tradicionalmente se suele designar la técnica según el soporte de la fase
estacionaria, existiendo la Cromatografía en Columna, Cromatografía en Capa Fina, Cromatografía en
Papel...
Usualmente, la fase estacionaria suele ser polar y la fase móvil apolar, por lo que cuando ocurre los
contrario, se le denomina Cromatografía de Fase Reversa.
En esta práctica se tratará, principalmente la cromatografía líquida y, dentro de esta, la de Adsorción
soportada en capa fina y en columna.
Porque el termino de exclusión diapositia 3
el término de “Cromatografía de exclusión por tamaño”. También se denomina “cromatografía de
permeabilidad sobre gel” (GPC) o de permeación en gel. Su principal aplicación es la separación de
las moléculas en función de su tamaño con la finalidad de estudiar el peso molecular y distribución
de los polímeros.
Inicio de la cromatografía diapositiva 3
El inicio de esta técnica se estableció a partir de la preparación de microesferas de geles de
compuestos orgánicos y biológicos solubles en agua, los cuales se aplicaron a la separación de
polímeros disueltos en disolventes orgánicos utilizando un relleno de poliestireno. En
consecuencia, la técnica se denominó permeabilidad en gel (GPC).
Características de la columna de exclusión diapositiva 5
Las columnas pueden ser de vidrio borosilicato o de material plástico transparente
No se utilizan columnas metálicas para evitar fenómenos de catálisis, que pueden provocar
degradaciones del gel o de la muestra.
•
Moléculas permeables: moléculas pequeñas que entran el interior del relleno poroso,
pasan lentamente y quedan retenidas en el poro.
•
Moléculas fraccionables: moléculas intermedias que entran de manera parcial en el
relleno poroso.
•
Moléculas excluidas: moléculas de medida superior al poro del relleno que no entran en el
relleno y pasan rápidamente por él.
Otros Parámetros de la fase estacionaria diapositiva 7
A mayor viscosidad, menos reproducibles son los resultados.
‐ El aumento de la temperatura favorece la resolución de la muestra, ya que la difusión se produce
con mayor facilidad.
‐ Los valores bajos de fuerza iónica favorecen las interacciones iónicas solutofase estacionaria,
mientras los valores altos favorecen las interacciones hidrofóbicas.
‐ El pH influye en la ionización de los solutos y grupos activos de la fase estacionaria. ‐ Al aumentar
el flujo del eluyente se produce una disminución de la eficacia de la columna.
Fundamento de la Cromatografía de Intercambio Iónico
Primero: las sustancias a separar se unen al intercambiador utilizando condiciones que originan
una unión fuerte y estable
Segundo: se eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente fuerza iónica,
compitiendo los componentes del buffer con el material por los sitios de unión.
Equipo de cromatografía intercambiador iónico
Elución
Las moléculas captadas por el intercambiador son eluídas debido a cambios en la composición
del buffer. consiste en aumentar progresivamente la concentración de un contraión, de modo de
desplazar el equilibrio de unión de la macromolécula hacia la forma libre. El contraión es
normalmente una sal, disuelta en eluyente (NaCl, KCl, etc).
Equilibrio: El primer paso es el equilibrio de la fase estacionaria con las condiciones iniciales
deseadas. Cuando el equilibrio se ha logrado, toda la fase estacionaria se encuentra asociada a
iones complementarios (que pueden ser cloro o sodio). Por ejemplo, un intercambiador
catiónico sulfonado asociado a Na+ producto de la disociación de NaOH.
Regeneración
Por último, se remueven las partículas que aún están asociadas al intercambiador. Los iones que
se adhieren a los sitios activos de la resina son de muy diferente tipo y pueden ser removidos
total o parcialmente durante el proceso de regeneración. Una vez agotadas las resinas, se
pueden regenerar a su forma inicial para reanudar la operación de intercambio.