tijeras químicas para cortar DNA

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Tijeras químicas para cortar DNA:
Introducción a las Enzimas de Restricción
La ingeniería genética es posible debido al uso de enzimas especiales que cortan el DNA. Estas
enzimas se llaman enzimas de restricción. Las enzimas de restricción son proteínas especiales
producidas por bacterias para prevenir o restringir la invasión de DNA extraño (como el de los virus).
Actúan como tijeras para el DNA, cortando en pedazos el DNA extraño, para que este último no pueda
funcionar. http://www-naweb.iaea.org/nafa/aph/resources/RE.swf
Las enzimas de restricción reconocen y cortan en lugares específicos, llamados sitios de
restricción, a lo largo de la molécula de DNA. Cada enzima de restricción diferente (y hay cientos,
sintetizadas por muchas especies y cepas bacterianas distintas) tiene su propio tipo de sitio de
restricción. En general, un sitio de restricción es una secuencia de “4” o “6” pares de bases que es un
palíndromo. Un palíndromo de DNA es una secuencia en la que la hebra "superior" del DNA, leída desde el
extremo 5' hasta el extremo 3', es la misma secuencia que la hebra "inferior", leída también desde el
extremo 5' del DNA hasta el extremo 3' (es decir se lee igual hacia adelante y hacia atrás). Por ejemplo:
5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
Este trozo de DNA es un palíndromo. Para verificar esto, lee la secuencia de la hebra superior y la
hebra inferior desde el extremo 5' hasta el extremo 3'. Esta secuencia también es un sitio de restricción
para la enzima de restricción llamada EcoRI. Su nombre proviene de la bacteria en la que fue
descubierto. Escherichia coli cepa RY 13 (EcoR) e "I" porque fue la primera enzima de restricción
encontrada en este organismo.
Comprueba tu comprensión 1:
1. ¿Qué tipo de molécula es una enzima?
2. ¿Qué tipo de enzimas hacen posible la ingeniería genética?
3. ¿Cuál es la función de las enzimas, aludidas en la pregunta 2?
4. ¿Qué es un sitio de restricción?
5. ¿Cuál sería la cadena opuesta del siguiente DNA palíndromo?
5’ CAATTG 3’
3’
5’
La enzima de restricción EcoRI hace un corte entre G y A en cada una de las hebras de DNA
(ver a continuación). Después de hacer los cortes, el DNA se mantiene unido solo por los enlaces de
hidrógeno entre las cuatro bases situadas en el medio. Los enlaces de hidrógeno son débiles, y el
DNA se separa.
Sitios de corte: 5’ GAATTC 3’
3’ CTTAAG 5’
DNA cortado: 5’ G
3’ CTTAA
AATTC 3’
G 5”
2
Los 2 sitios que corta EcoRI no están uno frente al otro en la molécula de DNA. Cuando EcoRI corta
una molécula de DNA, deja "colas" monocatenarias en los nuevos extremos (ver el ejemplo anterior). Este
tipo de extremo se ha denominado "extremo pegajoso" porque es fácil juntarlo con otros "extremos
pegajosos" complementarios. No todas las enzimas de restricción producen extremos pegajosos; algunos
cortan las dos hebras de DNA directamente uno frente al otro, produciendo un extremo romo.
Cuando los científicos estudian una molécula de DNA, una de las primeras acciones que hacen es
averiguar dónde se encuentran sitios de restricción. Luego crean un mapa de restricción, que muestra la
ubicación de los sitios de corte para muchas enzimas diferentes. Estos mapas se usan como mapas de
carreteras, pero usados en la molécula de DNA. Los siguientes son los sitios de restricción de varias
enzimas de restricción diferentes, con los sitios de corte mostrados:
EcoRI:
5’GAATTC 3’
3’CTTAAG 5’
HindIII:
5’AAGCTT3’
3’TTCGAA5’
BamHI:
5’ GGATCC 3’
3’ CCTAGG 5’
AluI:
5’ AGCT 3’
3’ TCGA 5’
SmaI:
5’ CCC GGG 3’
3’ GGG CCC 5’
HhaI:
5’ GCGC 3’
3’ CGCG 5’
El conocimiento de estas diversas enzimas de restricción ha permitido a los ingenieros en
biotecnología crear DNA recombinante, que es DNA hecho mediante la recombinación de fragmentos de
DNA de diferentes fuentes. La industria, la medicina y la agricultura se han potenciado con la creación de
bacterias recombinantes (bacterias vivas que contienen DNA recombinante y, por lo tanto,
pueden producir proteínas útiles). En la industria, se han diseñado bacterias recombinantes
que degradan el petróleo y que pueden ser usadas para limpiar los derrames de petróleo.
Las compañías mineras están utilizando esta tecnología con bacterias diseñadas que
extraen minerales en yacimientos de baja ley, a bajo costo y amigables con el ambiente. En
medicina, el DNA recombinante se usa para producir diversas hormonas, como la hormona de crecimiento
humana y la insulina. El gen de la insulina humana se inserta en una bacteria y, como estas bacterias viven
y se reproducen normalmente, producen grandes cantidades de insulina que usan los diabéticos. En la
agricultura, las bacterias recombinantes ayudan a prevenir el daño por heladas en algunos cultivos y
ayudan a convertir el nitrógeno atmosférico en nitratos, un fertilizante natural utilizado por las plantas.
Comprueba tu comprensión 2:
6. ¿Qué es un "Extremo pegajoso"?
7. ¿Cuál de las enzimas anteriores deja extremos pegajosos cuando es usada para cortar DNA?
8. ¿Cuál de las enzimas anteriores deja extremos romos cuando es usada para cortar DNA?
9. ¿Qué es DNA recombinante y cuál es su uso?
10. Para hacer DNA recombinante, ¿usarías DNA con extremos pegajosos o romos? Explica por qué.
3
Ejercicio 1 Simulación con papel sobre la acción de las enzimas de
restricción
PROCEDIMIENTO PARTE 1
1.Recorta las tiras de DNA a lo largo de los bordes. Estas tiras representan moléculas de DNA
bicatenario.
2.Ahora simularás la actividad de EcoRI. Examina la secuencia de DNA de la tira 1 hasta que encuentres
el sitio que corta la enzima EcoRI (consulta la lista de la pág. 2 para conocer la secuencia correcta).
Realiza cortes a través de la secuencia de bases cortando solo entre la G y la primera A del sitio de
restricción en AMBAS HEBRAS. - ¡NO DEBES CORTAR COMPLETAMENTE LA TIRA....SÓLO HASTA LA
MITAD! Recuerde que EcoRI corta cada cadena de DNA por separado.
3.Ahora separa los enlaces de hidrógeno entre los sitios de corte CORTANDO A TRAVÉS DE LAS LÍNEAS
VERTICALES. Separa los dos pedazos de DNA. Mira los nuevos extremos de DNA producidos por EcoRI.
4.Escribe "EcoRI" en los extremos de los trozos de DNA cortados. Mantenlos en tu mesa pues los usarás
más tarde.
5.Repite el procedimiento con la tira 2, esta vez simulando la actividad de SmaI. Busca hasta encontrar el
sitio de SmaI y corta las bases en los sitios de corte indicados anteriormente. Rotula los nuevos
extremos "SmaI" y guarda los fragmentos de DNA en tu mesa.
6.Simula la actividad de HindIII con la tira 3. Rotula los nuevos extremos "HindIII" y conserva los
fragmentos.
7.Repite el procedimiento una vez más con la tira 4, nuevamente simulando la acción de EcoRI.
PREGUNTAS PARTE 1:
1.¿Son pegajosos o romos los extremos que deja la enzima EcoRI?
2.¿Hay enlaces de hidrógeno entre los sitios de corte en SmaI?
3.¿Son pegajosos o romos los extremos que deja la enzima SmaI?
4.¿Son pegajosos o romos los extremos que deja la enzima HindIII?
PROCEDIMIENTO Y PREGUNTAS PARTE 2:
2.1. Toma el "extremo pegajoso anterior” del trozo de DNA que dejó la tira 4 (un fragmento EcoRI) y el
"extremo pegajoso posterior” que se formó de la tira 3 al usar HindIII. Ambos fragmentos tienen
colas monocatenarias de 4 bases.
Escribe la secuencia de las dos colas y rotúlalas "EcoRI" y "HindIII". Rotula los extremos 5' y 3'.
______________________________
______________________________
¿Son complementarias las secuencias de bases de los "extremos" dejados por HindIII y EcoRI? Explica.
_________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________
4
2.2. Ahora toma el "extremo pegajoso posterior" del fragmento de DNA de la tira 1 (tira 1 cortada con
EcoRI) y deja en la mesa el fragmento de HindIII. Compara las colas monocatenarias del fragmento
EcoRI de la tira 1 y el fragmento EcoRI de la tira 4.
Escribe las secuencias de las colas monocatenarias y rotula los extremos 3 'y 5'.
______________________________
______________________________
¿Son complementarias estos extremos? Explica.
_________________________________________________________________________________
_________________________________________________________________________________
2.3. Imagina que cortas con EcoRI un fragmento de DNA completamente desconocido. ¿Crees que las
colas monocatenarias de estos fragmentos serían complementarias a las colas monocatenarias de
los fragmentos de las tiras 1 y 4. Explica.
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
2.4. Existe una enzima llamada DNA ligasa que, mediante el uso de ATP como fuente de energía, cataliza
la formación de enlaces entre los nucleótidos. Para que la DNA ligasa funcione, deben aproximarse
dos nucleótidos en la orientación adecuada para formar un enlace (el extremo 5' de un trozo de DNA
debe estar al lado del extremo 3' del otro). ¿Crees que sería más fácil para la DNA ligasa reconectar
dos fragmentos cortados por EcoRI o un fragmento cortado por EcoRI con otro cortado por HindIII?
Explica.
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________________
Gustavo Toledo C, Prof de Biología, SFC, 2018
5
Ejercicio 2 Mapas de plásmidos
La figura 1 es un mapa de restricción del plásmido circular YIP5. Este plásmido contiene
5.541 pares de bases nitrogenadas. Hay un sitio de restricción EcoR1 en el par de bases 1. En el
mapa de este plásmido se muestran las ubicaciones de otros sitios de restricción que fueron
determinadas por expertos biotecnólogos. Los números después de los nombres de las enzimas
indican a cuál par de bases del DNA plasmidial cortará la enzima de restricción. Si usaras EcoR1
para cortar el plásmido YIP5, obtendrás una muestra lineal de DNA de 5.541 pares de bases de
longitud.
EcoRI 1/5541
HindIII 32
PvuI 4916
EagI 942
YIP 5
5541
ApaI 2035
PvuII 3247
SmaI 2540
1. ¿Cuáles serían las longitudes (en números de pares de bases) de los productos lineales de una
digestión con las enzimas EcoR1 y Eag1?
2. ¿Cuáles serían las longitudes de los productos de una digestión con las enzimas HindIII y ApaI?
3. ¿Cuáles serían las longitudes de los productos de una digestión con las enzimas HindIII, ApaI y PvuI?
4. Si tomaras los productos de la digestión de la pregunta 10 y los digieres con PvuII, ¿cuál sería la
longitud de los productos?
5. ¿Qué técnicas podrías usar para separar las diferentes pedazos de DNA producidos en la
pregunta 4? https://learn.genetics.utah.edu/content/labs/gel/gel_electrophoresis.swf
6
Secuencias de DNA. Tiras de DNA para usar tijeras químicas o
enzimas de restricción
1
1
5’-TAGACTGAATTCAAGTCA-3’
3’-ATCTGACTTAAGTTCAGT-5’
2
2
5’-ATACGCCCGGGTTCTAAA-3’
3’-TATGCGGGCCCAAGATTT-5’
3
3
5’-CAGGATCGAAGCTTATGC-3’
3’-GTCCTAGCTTCGAATACG-5’
4
4
5’-AATAGAATTCCGATCCGA-3’
3’-TTATCTTAAGGCTAGGCT-5’
7
Un resumen del uso de Bacterias en Minería
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