|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
EXTRACCION, CARACTERIZACION Y EVALUACION DE LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE ENELDO (Anethum graveolens L.) Y
PAICO (Chenopodium ambrosioides L.) OBTENIDOS MEDIANTE LA TECNICA DE
MACERACION Y ASISTIDA POR ULTRASONIDO
Hugo Andrés Gomajoa Enriquez
Universidad de Nariño
Maestría en Ciencias Agrarias
San Juan De Pasto
2017
1
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
EXTRACCION, CARACTERIZACION Y EVALUACION DE LA CAPACIDAD
ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS DE ENELDO (Anethum graveolens L.) Y
PAICO (Chenopodium ambrosioides L.) OBTENIDOS MEDIANTE LA TECNICA DE
MACERACION Y ASISTIDA POR ULTRASONIDO
Hugo Andrés Gomajoa Enriquez.
Tesis presentada para optar al título
de Magister en Ciencias Agrarias enf. Produccion de Cultivos
PhD. Oswaldo Osorio Mora
Director
Universidad de Nariño
Maestría en Ciencias Agrarias
San Juan De Pasto
2017
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
NOTA DE ACEPTACIÓN
________________________________________
ANDRES MAURICIO HURTADO BENAVIDES I.Q. M.Sc. Ph.D.
Jurado delegado
_________________________________________
DAVID EDUARDO ALVAREZ SÁNCHEZ I.A. M.Sc. Ph.D(c).
Jurado
_________________________________________
WILLIAM ALEXANDER DIAZ LOPEZ I.AI. M.Sc.
Jurado
________________________________________
OSWALDO OSORIO MORA I.AI. M.Sc. Ph.D.
Director
San Juan de Pasto, Diciembre de 2017
3
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
“Las ideas y conclusiones aportadas en el trabajo de grado son responsabilidad de los autores”
Artículo 1º de Acuerdo Nº 324 de octubre 11 de 1966 emanado por el Honorable Consejo
Directivo de la Universidad de Nariño.
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Dedicatoria
A mis hijas Abril y Celeste que son las luz que aclaran
los dias grises, quienes con su infinito amor
impulsan cada paso que doy
A mis padres ejemplo de talante y sacrificio
A mis hermanos modelos a seguir de perseverancia y tenacidad
A mis amigos por la buena vibra y apoyo incondicional
5
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
AGRADECIMIENTOS
Al Dr. Oswaldo Osorio Mora, director de este trabajo de investigación, por su amistad, apoyo
constante e incondicional.
Al Dr. Andrés Hurtado Benavides, apoyo incondicional a lo largo de mi carrera academica y
profesional.
Al M.Sc. David Eduardo Álvarez por su valiosa amistad, apoyo y asesoría.
Al M.Sc. Willian Diaz Lopez por su amistad y acompañamiento.
A las ingenieras de procesos Diana Segovia y Estefania Meza por su valiosa colaboracion.
A todas aquellas personas que intervinieron directa e indirctamente al desarrollo de esta
investigación.
Gracias Totales………..
6
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
CONTENIDO
RESUMEN ............................................................................................................................... 15
ABSTRACT ............................................................................................................................. 16
1.
INTRODUCCIÓN ......................................................................................................... 17
2.
OBJETIVOS .................................................................................................................. 20
2.1. Objetivo general. ............................................................................................................ 20
2.2. Objetivos específicos. ..................................................................................................... 20
3.
HIPÓTESIS.................................................................................................................... 21
3.1. Hipótesis efecto del solvente sobre los fenoles totales en los extractos acuosos,
etanolicos y metanolicos obtenidos por maceracion. ............................................................. 21
3.2. Hipotesis efecto de los factores frecuencia y tiempo sobre el contenido de fenoles
totales extraidos mediante la técnica de ultrasonido. ............................................................ 21
4.
MARCO TEÓRICO ...................................................................................................... 22
4.1. GENERALIDADES DE PLANTAS AROMÁTICAS ............................................... 22
4.1.1. Paico......................................................................................................................... 22
4.1.2. Eneldo. ..................................................................................................................... 22
4.2. METABOLITOS SECUNDARIOS DE LAS PLANTAS .......................................... 22
4.2.1. Terpenoides ............................................................................................................. 23
4.2.2. Monoterpenoides .................................................................................................... 24
4.3. Compuestos fenólicos. ................................................................................................... 24
4.3.1. Compuestos fenólicos del paico (Chenopodium ambrosioides L.). .................... 25
4.3.2. Compuestos fenólicos del eneldo (Anethum graveolens L.). .............................. 25
4.4. ANTIOXIDANTES. ...................................................................................................... 26
4.4.1. Fuentes de compuestos fenólicos y polifenólicos con actividad antioxidante. .. 27
4.4.2. Antioxidantes sintéticos. ........................................................................................ 28
4.5. RADICALES LIBRES. ................................................................................................. 29
4.6. MÉTODOS CONVENCIONALES DE EXTRACCIÓN ........................................... 31
4.6.1. Arrastre con vapor. ................................................................................................ 31
4.6.2. Extracción por maceración. .................................................................................. 31
4.6.3. Maceración en frío. ................................................................................................ 32
4.6.4. Extracción con disolventes..................................................................................... 32
7
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
4.6.5. Recomendaciones en los métodos de extracción. ................................................. 32
4.7. METODOS DE EXTRACCION NO CONVENCIONALES .................................... 33
4.7.1. Ultrasonido .............................................................................................................. 33
4.7.2. Aspectos teóricos del ultrasonido. ......................................................................... 34
4.7.3. Ultrasonido de señal. .............................................................................................. 34
4.7.4. Ultrasonido de potencia. ........................................................................................ 34
4.7.5. Extracción asistida con ultrasonido de componentes orgánicos de interés. ...... 35
4.8. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE . .............................................................................. 37
4.8.1. Reacción con el radical 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonato de
amonio) (ABTS). ................................................................................................................... 37
4.9. CROMATOGRAFÍA DE LOS EXTRACTOS. .......................................................... 38
4.10.
5.
COMPOSICIÓN DE LOS EXTRACTOS ........................................................... 38
4.10.1.
Paico. ................................................................................................................ 38
4.10.2.
Eneldo............................................................................................................... 39
METODOLOGÍA.......................................................................................................... 40
5.1. OBTENCIÓN DE MATERIALES VEGETALES DE ENELDO (ANETHUM
GRAVEOLENS L.) Y PAICO (CHENOPODIUM AMBROSIOIDES L.) ............................ 40
5.1.1. Localizacion. ........................................................................................................... 40
5.1.2. Recolección de material vegetal. ........................................................................... 40
5.1.3. Selección del material vegetal................................................................................ 41
5.2. DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICO PROXIMAL DE
ENELDO (Anethum
graveolens L.) Y PAICO (Chenopodium ambrosioides
L.)…………. .............................................................................................................................. 41
5.2.1. Determinación de la humedad. ............................................................................. 41
5.2.2. Determinación de las cenizas totales. .................................................................... 41
5.3. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ................................................................................ 43
5.3.1. Extracción por maceración. .................................................................................. 43
5.3.2. Diseño Experimental .............................................................................................. 43
5.4. DETERMINACION DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN LOS
EXTRACTOS DE ENELDO (Anethum graveolens L.) Y PAICO (Chenopodium
ambrosioides L.), OBTENIDOS MEDIANTE LA TECNOLOGÍA DE EXTRACCIÓN
POR MACERACIÓN CON 3 SOLVENTES DIFERENTES. ............................................. 44
5.4.1. Cuantificacion de Fenoles Totales - Folin y Ciocalteu ....................................... 44
5.4.2. Análisis Estadístico. ................................................................................................ 45
8
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
5.4.3. Determinación de componentes por cromatografía HPLC a los extractos con
mayor contenido de fenoles totales en Eneldo (Anethum graveolens L.) y Paico
(Chenopodium ambrosioides L.) obtenidos por maceracion. ............................................ 45
5.5. DETERMINAR EL EFECTO DE LA TECNOLOGIA DE EXTRACCION
ASISTIDA POR ULTRASONIDO EN FUNCIÓN DE LOS FENOLES TOTALES
PRESENTES EN ENELDO (Anethum graveolens L.) Y PAICO (Chenopodium
ambrosioides L.) Y CARACTERIZAR LOS MEJORES EXTRACTOS MEDIANTE
HPLC. ........................................................................................................................................ 45
5.5.1. Diseño Experimental. ............................................................................................. 45
5.5.2. Analisis de Resultados............................................................................................ 47
5.5.3. Extraccion por ultrasonido. ................................................................................... 47
5.5.4. Análisis Estadístico. ................................................................................................ 47
5.6. EVALUACION A NIVEL IN-VITRO LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE
LOS EXTRACTOS CON MAYOR CONTENIDO DE FENOLES EN ENELDO
(Anethum graveolens L.) Y PAICO (Chenopodium ambrosioides L.), OBTENIDOS
MEDIANTE MACERACION Y ULTRASONIDO. ............................................................. 48
5.6.1. Capacidad antioxidante expresada en equivalentes Trolox (Ensayo TEAC). .. 48
5.6.2. Determinación de componentes por cromatografía HPLC a los extractos con
mayor contenido de fenoles totales en Eneldo (Anethum graveolens L.) y Paico
(Chenopodium ambrosioides L.) obtenidos por ultrasonido. ............................................ 50
6.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN ................................................................................... 51
6.1. Determinación de la composición químico proximal de Eneldo (Anethum
graveolens L.) y Paico (Chenopodium ambrosioides L.)......................................................... 51
6.2. Obtención de extractos acuosos, etanolicos y metanolicos de eneldo (Anethum
graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.) por el método de maceración....... 54
6.2.1. Determinación del contenido de fenoles totales en los extractos de eneldo
(Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.), obtenidos mediante la
tecnología de extracción por maceración con 3 solventes diferentes.. ............................. 55
6.2.2. Análisis de resultados. ............................................................................................ 58
6.2.3. Extracción asistida por ultrasonido de compuestos fenólicos presentes en los
extractos metanolicos de eneldo (Anethum graveolens L.). ............................................. 64
6.2.4. Extracción asistida por ultrasonido de compuestos fenólicos presentes en los
extractos metanolicos de paico (Chenopodium ambrosioides L.). .................................. 66
6.2.5. Caracterizacion tentativa de los extractos de Eneldo y Paico obtenidos por
ultrasonido con mayor contenido de fenoles por cromatografía HPLC a 360nm ......... 72
6.2.6. Evaluación de la actividad antioxidante in vitro d-e los extractos de eneldo
(Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.), con mayor contenido
de fenoles totales. ................................................................................................................... 74
9
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
7.
CONCLUSIONES ......................................................................................................... 80
8.
RECOMENDACIONES ............................................................................................... 81
9.
BIBLIOGRAFÍA. .......................................................................................................... 82
10
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Índice de figuras
Figura 1. Compuestos fenólicos y polifenólicos con actividad antioxidante. ........................... 30
Figura 2. Antioxidantes sintéticos utilizados en las industrias como conservantes .................. 30
Figura 3. Reacciones con el radical ABTS ................................................................................ 38
Figura 4. Prueba de humedad de Eneldo y Paico. ..................................................................... 52
Figura 5. Prueba de cenizas de Eneldo y Paico. ........................................................................ 53
Figura 6. Colorimetría de Eneldo y Paico. ................................................................................ 54
Figura 7. Método de Maceración. .............................................................................................. 55
Figura 8. Centrifugación de los extractos. ................................................................................. 55
Figura 9. Cromatograma de extracto de Eneldo obtenido a partir de Maceración .................... 63
Figura 10. Cromatograma del extracto de Paico obtenido a partir de Maceración ................... 63
Figura 11. Cromatografía de extracto de Eneldo obtenida a partir de la técnica asistida por
ultrasonido. ..................................................................................................................................... 72
Figura 12. Cromatografía de extracto de Eneldo obtenida a partir de la técnica asistida por
ultrasonido. ..................................................................................................................................... 73
Índice de tablas
Tabla 1. Rango de Índice de Color. ........................................................................................... 43
Tabla 2. Factores del diseño experimental para la extracción por ultrasonido.......................... 46
Tabla 3. Diseño experimental para la extracción por ultrasonido ............................................. 46
Tabla 4. Calculo de concentraciones diluidas de trolox 4 mM ................................................. 49
Tabla 5. Resultados de la composición químico proximal del Eneldo y Paico. ........................ 51
Tabla 6. Resultados de absorbancia de ácido gálico para la Curva de calibración ................... 55
Tabla 7. Contenido de fenoles totales en los extractos acuosos, etanolicos y metanolicos de
eneldo (Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.), obtenidos por
maceracion. .................................................................................................................................... 57
Tabla 8. Análisis de varianza para eneldo - maceracion ........................................................... 58
Tabla 9. Prueba de tukey para α=0.05 ....................................................................................... 58
Tabla 10. Análisis de varianza para maceracion - paico ........................................................... 60
Tabla 11. Prueba de tukey para α=0.05 ..................................................................................... 60
Tabla 12. Resultados del análisis de cromatografía. ................................................................. 62
Tabla 13. Cuantificación de fenoles totales por la técnica asistida por ultrasonido a diferentes
condiciones de extracción para eneldo (Anethum graveolens L.). ................................................ 64
Tabla 14. Análisis de Varianza para el diseño experimental de Fenoles Totales del extracto de
Eneldo obtenido por la técnica asistida por ultrasonido. ................................................................ 65
Tabla 15. Cuantificación de fenoles totales por la técnica asistida por ultrasonido a diferentes
condiciones de extracción para paico (Chenopodium ambrosioides L). ........................................ 67
Tabla 16. Análisis de Varianza para el diseño experimental de Fenoles Totales del extracto de
Paico obtenido por la técnica asistida por ultrasonido. .................................................................. 68
11
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Tabla 17. Contenido de fenoles totales en los extractos de Eneldo y Paico, extracción asistida
por ultrasonido a unas condiciones de 37 KHz y 45 minutos. ....................................................... 70
Tabla 18. Resultados analisis cromatografico para etracto de eneldo obtenido por ultrasonido
........................................................................................................................................................ 72
Tabla 19. Resultados análisis cromatograficopara paico, obtenido por ultrasonido. ................ 73
Tabla 20. Resultados del análisis de cromatografía. ....... Ошибка! Закладка не определена.
Tabla 21. Resultados de absorbancia según la concentración de Trolox. ................................. 74
Tabla 22. Resultados de concentración TEAC para los extractos de eneldo y paico. ............... 76
Tabla 23. Porcentaje de inhibición de extractos de diferentes plantas. ..................................... 79
Índice de graficos.
Grafico 1. Curva de calibración del Ácido Gálico. ................................................................... 56
Grafico 2. Evaluación del tipo de solvente sobre la extracción de polifenoles en eneldo. ........ 59
Grafico 3. Evaluación del tipo de solvente sobre la extracción de polifenoles en paico........... 61
Grafico 4. Comparación de la eficiencia de los solventes, sobre la extracción de polifenoles en
eneldo y paico................................................................................................................................. 62
Grafico 5. Diagrama de Pareto estandarizado para Fenoles Totales en el extracto de Eneldo
obtenido a partir de la técnica asistida por ultrasonido. ................................................................. 65
Grafico 6. Efectos principales para fenoles totales en el extracto de Eneldo obtenido a partir de
la técnica asistida por ultrasonido. ................................................................................................. 66
Grafico 7. Diagrama de Pareto estandarizado para Fenoles Totales en el extracto de Paico
obtenido a partir de la técnica asistida por ultrasonido. ................................................................. 68
Grafico 8. Efectos principales para fenoles totales en el extracto de Paico obtenido a partir de
la técnica asistida por ultrasonido. ................................................................................................. 69
Grafico 9. Curva de Calibración de Trolox. .............................................................................. 75
Grafico 10. Porcentaje de inhibición del radical ABTS de los extractos metanolicos de eneldo
y paico, obtenidos mediante maceración........................................................................................ 76
Grafico 11. Porcentaje de inhibición del radical ABTS de los extractos metanolicos de eneldo
y paico, obtenidos mediante ultrasonido. ....................................................................................... 77
Grafico 12. Comparación de métodos (maceracion y ultrasonido) y extractos /Eneldo y Paico
con respecto al porcentaje de inhibición del radical ABTS. .......................................................... 78
Lista de anexos
Anexo A. Resultados desglosados de las pruebas de la composición físico-química ............... 91
Anexo B. Tablas de los resultados de Fenoles totales de las muestras obtenidas por maceración
de Eneldo y Paico. .......................................................................................................................... 92
12
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
GLOSARIO
Extracto: las esencias o extractos son una mezcla compleja de sustancias aromáticas
responsable de las fragancias de las flores. Poseen numerosas acciones farmacológicas, por lo que
constituyen la base de la aromaterapia, pero además son ampliamente utilizados en perfumería y
cosmética, en la industria farmacéutica y en la industria de la alimentación, licorería y confitería
(López, 2004).
Centrifugación: Separación de sustancias de diferente densidad mediante movimiento
giratorio (Huerta, s.f.).
Compuestos activos: Son sustancias que se encuentran en las distintas partes de las plantas y
que alteran o modifican el funcionamiento de órganos y sistemas del cuerpo humano y animal
(Paz, 2007).
Destilación: operación de separar, mediante evaporización y condensación, los diferentes
componentes líquidos, sólidos disueltos en líquidos o gases licuados de una mezcla (Ceballos,
s.f.).
Etnobotánica: etimológicamente se refiere a las plantas útiles, del griego “botanon” y a las
gentes o los pueblos, del griego “etnos”. Se trata por tanto de una disciplina que relaciona las
plantas y la gente. Ciertamente lo que hace es estudiar las relaciones entre las plantas y la gente
(Rivera y Obón, 2007).
Humedad: Cantidad de agua, vapor de agua o cualquier otro líquido que está presente en la
superficie o el interior de un cuerpo o en el aire (Alaniz, 2007).
Rendimiento: es la cantidad máxima de producto que se puede obtener por una reacción a
partir de cantidades dadas de reactivos y se calcula a partir de la estequiometría basada en el
reactivo limitante (UNAM, 2002).
13
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Solvente: Un solvente es cualquier material, en general líquido, que tiene la capacidad de
disolver otro material y formar una mezcla homogénea, llamada solución (Castro, 2004).
Fenoles: compuestos orgánicos aromáticos que contienen el grupo hidroxilo como su grupo
funcional. Están presentes en las aguas naturales, como resultado de la contaminación ambiental
y de procesos naturales de descomposición de la materia orgánica.
Radicales libres: Los radicales libres son átomos o grupos de átomos que tienen un electrón
desapareado o libre por lo que son muy reactivos ya que tienden a captar un electrón de
moléculas estables con el fin de alcanzar su estabilidad electroquímica.
Antioxidante: molécula capaz de prevenir o retardar la oxidación (pérdida de uno o más
electrones) de otras moléculas, generalmente sustratos biológicos como lípidos, proteínas ó
ácidos nucléicos.
14
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
RESUMEN
El objetivo principal de este trabajo de investigación fue el valuar la técnica de extracción
asistida por ultrasonido con respecto a una técnica de extracción convensional como lo es la
maceracion, en función al contenido de los polifenoles y la actividad antioxidante de los extractos
obtenidos
Para el desarrollo del trabajo se seleccionaron dos materiales vegetales, usados genéricamente
como plantas aromáticas y de uso medicinal, hojas de eneldo (Anethum Graveolens L.) y paico
(Chenopodium ambrosioides L.), de crecimiento promisorio en el municipio de Pasto;
inicialmente se efectuo una operación de secado y acondicionamiento de la materia prima, para
posteriormente realizar una caracterización químico proximal del material en estudio (color,
humedad y cenizas), de acuerdo a los métodos oficiales de análisis de la A.O.A.C (Official
Methods of Analysis); a continuación se realizo la evaluación de tres solventes polares (agua
destilada, etanol 70% v/v y metanol) en maceracion para los dos materiales vegetales (eneldo y
paico), determinando la eficiencia de cada uno de estos en la cuantificación de fenoles totales a
través del desarrollo de un diseño irrestrictamente al azar (D.I.A), el contenido de polifenoles se
determino, utilizando la metodología expuesta por Folin Ciocalteu, determinado que el Metanol
fue el de mejor eficiencia en el proceso de extraccion, se procedio a la caracterizacion tentativa de los
extractos metanolicos de eneldo((Anethum Graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides
L.) por HPLC-DAD. Posteriormente se procedio a realizar extracciones asistidas por ultrasonido
de los dos materiales vegetales en estudio, utilizando como solvente metanol y realizando
variaciones en la frecuencia (KHz) y tiempo (min), empleando un diseño factorial 32
completamente aleatorizado y aplicando un análisis de varianza con el fin de determinar la
incidencia de los factores evaluados sobre los polifenoles obtenidos; a la mejor condición
encontradas para cada uno de los dos materiales vegetales , para posteriormente ser
caracterizados por HPLC-DAD. Por ultimo, con el objetivo de determinar la capaciad de
inhibibion del proceso de oxidación provocada por el radical α-α- difenil-ß-picrilhidrazilo
(DPPH) de los extractos, se aplicó el método de decoloración TEAC - ABTS, utilizando
antioxidante trolox como patrón.
15
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
ABSTRACT
The main objective of this research work was to evaluate the ultrasound-assisted extraction
technique with respect to a convensional extraction technique such as maceration, based on the
content of polyphenols and the antioxidant activity of the extracts obtained
For the development of the work two vegetal materials were selected, used generically like
aromatic plants and of medicinal use, leaves of dill (Anethum Graveolens L.) and paico
(Chenopodium ambrosioides L.), of promising growth in the municipality of Pasto; Initially, a
drying and conditioning operation of the raw material was carried out, to subsequently perform a
proximal chemical characterization of the material under study (color, humidity and ash),
according to the official methods of analysis of the AOAC (Official Methods of Analysis) ; then
the evaluation of three polar solvents (distilled water, ethanol 70% v / v and methanol) in
maceration for the two plant materials (dill and paico), determining the efficiency of each of
these in the quantification of total phenols to Through the development of an unrestrictedly
random design (DIA), the content of polyphenols was determined, using the methodology
exposed by Folin Ciocalteu, determined that methanol was the best efficiency in the extraction
process, proceeded to the tentative characterization of methanol extracts of dill ((Anethum
Graveolens L.) and paico (Chenopodium ambrosioides L.) by HPLC-DAD. Subsequently,
ultrasound-assisted extractions of the two plant materials under study were carried out, using as
solvent methanol and making variations in the frequency (KHz) and time (min), using a
completely randomized factorial design 32 and applying an analysis of variance with in order to
determine the incidence of the evaluated factors on the obtained polyphenols; to the best
condition found for each of the two plant materials, to later be characterized by HPLC-DAD.
Finally, in order to determine the inhibition capacity of the oxidation process caused by the α-αdiphenyl-β-pyrrylhydrazyl radical (DPPH) of the extracts, the TEAC-ABTS decoloration method
was applied, using trolox antioxidant as Pattern.
16
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
1. INTRODUCCIÓN
La oxidación de moléculas de origen biologico se ha relacionado con la presencia de radicales
libres en el organismo; dicho fenomeno oxidativo puede derivar en efectos destructivos y/o
mortales por la afectación directa de membranas lipídicas, proteínicas y ácidos nucleicos (ElAlami et al., 2017). Así, la oxidación de moléculas biológicas se ha asociado a diversas
enfermedades degenerativas (Amarowicz & Shahidi, 2017) como cáncer, enfermedades
cardiacas, inflamación, artritis, disfunción cerebral, aceleración del envejecimiento, cataratas,
asma, bronquitis, aterosclerosis, entre otras (Lago, Nicolli, Marques, Zini, & Welke, 2017;
Mercado, Carrillo, Wall-Medrano, Díaz, & Álvarez, 2013; Morales & Gutiérrez, 1981). Además
de provocar alteraciones perjudiciales en los organismos, la oxidación produce cambios en el
sabor, el color, la textura y el valor nutricional de los alimentos (Elmastaş, Demir, Genç, Dölek,
& Güneş, 2017; Madhava Naidu et al., 2016). La oxidación es una de las principales causas del
deterioro de pinturas, aceites lubricantes, fibras sintéticas, cauchos y plásticos (Nishiyama &
Eguchi, 2009).
Los radicales libres, responsables de la oxidacion pueden ser neutralizados por sustancias
antioxidantes de origen biologico o quimico (Ping, Mitsuru, Masako, Takuro, & Jun, 2005).
Como biomoléculas podemos mencionar sistemas enzimáticos, tales como la superóxido
dismutasa, la catalasa, la glutatión peroxidasa, la lactoferrina, quinonas reductasas y
hemoxigenasa, y de sistemas no enzimáticos, ácido ascórbico, α- tocoferol, carotenoides,
flavonoides, selenio y zinc (Rho et al., 2017). Como moléculas sintetizadas quimicamente
tenemos el butil hidroxitolueno (BHT),
butil hidroxianisol (BHA),
tert-butilhidroquinona
(TBHQ) y galato de propilo (PG), que son sustancias antioxidantes de uso habitual en la
industria de alimentos y farmacéutica (Huang, Boxin, & Prior, 2005). Estas sustancias ocasionan
efectos secundarios no deseados en humanos y animales, como incremento en los niveles de
colesterol, inflamación del higado e inducción de cáncer hepático, entre otras (Stefanidou,
Athanaselis, & Koutselinis, 2003). Teniendo en consideración lo anteriormente expuesto, se hace
necesario encontrar nuevas fuentes de sustancias con propiedades antioxidantes que no generen
efectos citotóxicos ni genotípicos adversos. Como alternativa válida en la búsqueda de
compuestos con capacidad antioxidante encontramos la plantas aromáticas, medicinales y
17
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
condimentarias, debido a que contienen sustancias como las vitaminas, los ácidos fenólicos, los
flavonoides, las quinonas, las cumarinas, los lignanos, los estilbenos, los taninos, los alcaloides,
las aminas e incluso ciertos terpenoides que estabilizan los radicales libres (Huang et al., 2005)
En la actualidad, se conoce que hay alrededor de 70.000 especies de plantas que han sido
utilizadas con fines medicinales en todo el mundo. Según la Organización Mundial de la Salud
(OMS), las plantas medicinales suplen las necesidades de alrededor del 80% de la población
mundial, especialmente para los millones de personas en las zonas rurales de los países en
desarrollo. Su utilidad radica en que pueden ser la respuesta natural a algunas enfermedades y por
lo general pueden adquirirse y extraerse sus compuestos activos fácilmente (Angulo, Rosero, &
González, 2012).
Para la extracción de metabolitos secundarios de biomateriales, existen técnicas
convencionales (hidrodestilacion,
arrastre con vapor, soxhlet, maceración) y técnicas no
convencionales (fluidos supercríticos y ultrasonido), las cuales cada una de ellas permite obtener
compuestos con diferentes características en cuanto a su rendimiento, concentración y
composición, los ultimos buscan maximizar la cantidad y calidad de los compuestos de interés
que se desean extraer. Acompañado a la técnica de extracción, el éxito también radica en el
solvente que se utilice, sea polar (agua, etanol, metanol) o apolar (diclorometano, acetonitrilo,
acetona, etc) dependiendo del compuesto o grupo de compuestos que se espere esten presentes en
el extracto (Wu, Wang, Liu, Zou, & Chen, 2015) .
Entre los procedimientos más estudiados por la comunidad científica para evaluar la actividad
antioxidante, encontramos el método del TEAC -ABTS. Este es un método espectrofotométrico
en el que se utiliza el radical libre catiónico ABTS, El radical presenta máximos de absorción a
414 nm y en las proximidades del infrarrojo (645, 732 y 815 nm). Esta propiedad da la
posibilidad de evitar interferencias generadas por cromógenos de la muestra a estudiar. El
fundamento de este método consiste en observar la decoloración del radical ABTS debido a la
interacción con especies donantes de hidrógeno(Mareček et al., 2017).
El propósito de este estudio fue el de extraer, caracterizar y evaluar de los extractos de eneldo
(Anethum graveolens L.)
y paico (Chenopodium ambrosioides L.)
obtenidos mediante
maceracion y asistida por ultrasonido
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
, buscando nuevas fuentes naturales de sustancias con capacidad antioxidante y una posible
relación entre el contenido fenólico y la actividad antioxidante, asi como también establecer la
eficiencia entre un método y otro.
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general.
Extraer, caracterizar y evaluar la capacidad antioxidante de los extractos de eneldo (Anethum
graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.) obtenidos mediante maceracion y
asistida por ultrasonido
2.2. Objetivos específicos.

Determinar la eficiencia del agua destilada, etanol 70%v/v y metanol como solventes en el
proceso de extraccion por maceracion en funcion de los fenoles totales y caracterizar los mejores
extractos mediante HPLC.

Determinar el efecto de la tecnologia de extraccion asistida por ultrasonido en función de
los fenoles totales presentes en eneldo (Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium
ambrosioides L.) y caracterizar los mejores extractos mediante HPLC.

Evaluar a nivel in-vitro la capacidad antioxidante de los extractos con mayor contenido de
fenoles en eneldo (Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.), obtenidos
mediante maceracion y ultrasonido.
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
3. HIPÓTESIS
3.1. Hipótesis efecto del solvente sobre los fenoles totales en los extractos acuosos,
etanolicos y metanolicos obtenidos por maceracion.
H0: no se presentan diferencias significativas en la cuantificacion de fenoles totales para los
tres solventes empleados (Metanol, Etanol, Agua), durante la extracción por maceraion de Eneldo
(Anethum graveolens L.) y Paico (Chenopodium ambrosioides L.).
H1: se presentan diferencias significativas en la cuantificacion de fenoles totales para los tres
solventes empleados (Metanol, Etanol, Agua), durante la extracción por maceraion de Eneldo
(Anethum graveolens L.) y Paico (Chenopodium ambrosioides L.).
3.2. Hipotesis efecto de los factores frecuencia y tiempo sobre el contenido de fenoles
totales extraidos mediante la técnica de ultrasonido.
H0. La frecuencia y el tiempo no presentan efecto significativo sobre el rendimiento de la
cantidad de fenoles totales en los extractos por la técnica asistida por ultrasonido.
H1. La frecuencia y el tiempo presentan efecto significativo sobre el rendimiento de la
cantidad de fenoles totales en los extractos por la técnica asistida por ultrasonido.
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
4. MARCO TEÓRICO
4.1. GENERALIDADES DE PLANTAS AROMÁTICAS
4.1.1. Paico.
Es una planta perenne de aproximadamente 40 cm a 100 cm de altura, que crece en suelos
húmedos y bajos, con tallo erguido muy ramificado, numerosas hojas alternadas, simples,
lanceoladas a oblongas, espigas densas de flores amarillentas o verdosas que dan lugar a los
pequeños frutos de color verde. Las infusiones de hojas y flores son utilizadas, entre otros, como
tónico estomacal y carminativo, como antihelmíntico en humanos y animales no rumiantes por su
acción paralizante y narcótica sobre ascárides, oxiuros y anquilostomas, ineficaz contra tenías y
tricocéfalo (Torres, Ricciardi, Agrelo de Nassiff, & Ricciardi, 1997)
4.1.2. Eneldo.
Es una planta de olor fétido, anual, con raíz pivotante, tallo y raíces frágiles. No soporta
trasplante. Los tallos son estriados y huecos; la planta alcanza la plena floración entre los 50 y los
70 días después de sembrada. Requiere entre 100 y 120 días para que maduren los frutos. Las
semillas conservan su capacidad germinativa durante 2 o 3 años: la recolección de hojas se hace
antes de la floración de acuerdo al mercado. No se recomienda asociarla con el hinojo, planta que
atrae insectos polinizadores y repele gusanos tierreros (Victoria, Bonillla, & Sanchez, 2007)
4.2. METABOLITOS SECUNDARIOS DE LAS PLANTAS
Las plantas presentan diferentes vías metabólicas, por las cuales se producen grandes cantidades
de compuestos químicos que en principio no representan un rol específico o esencial en la planta.
Al conjunto de estas vías metabólicas se les conoce como metabolismo secundario (Abreu &
Cuéllar, 2008; Riveros, 2010).
Los metabolitos secundarios de las plantas son aquellos compuestos químicos sintetizados por
éstas que cumplen funciones no esenciales en ellas y donde su ausencia no resalta un riesgo para
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
la planta, ya que no intervienen en el metabolismo primario. Estos metabolitos secundarios
intervienen en las interacciones ecológicas entre la planta y su ambiente (Vivanco & Cosio,
2005).
Además, a diferencia de los metabolitos primarios, estos metabolitos tienen una distribución
restringida a veces a solo una especie o un grupo de ellas. La principal función de algunos de
estos metabolitos se cree que es la protección contra el ataque de predadores y patógenos,
asimismo actuando como agentes alelopáticos (son liberados para ejercer efectos sobre otras
plantas), aunque otros también actúan como atrayentes de insectos para la polinización y
dispersión del fruto y de la semilla. Sin embargo, muchas de las funciones de los metabolitos
secundarios aún nos son desconocidas (Blanco, 2006; Seigler, 1998).
Suelen acumularse en grandes cantidades sin efectos negativos y sin representar un inconveniente
en las células o en la planta. Estos metabolitos tienen la propiedad de formar glicósidos y de esta
forma encontrarse de forma soluble en la planta. Muchos de estos metabolitos tienen efectos
sobre los animales y los humanos a bajas dosis, y pueden ser empleados como medicinas, drogas,
venenos, aromas, materiales industriales, entre otros (Blanco, 2006).
Los metabolitos secundarios de las plantas pueden ser divididos en 3 grandes grupos,
terpenoides, compuestos fenólicos y alcaloides, en base a sus orígenes biosintéticos (Lazar,
2003).
4.2.1. Terpenoides
Todos los terpenoides, tanto los que participan del metabolismo primario (Nelson & Cox, 2002)
como los más de 25.000 metabolitos secundarios, están constituidos por unidades múltiples del
hidrocarburo de cinco átomos de carbono isopreno (2-metil-1,3-butadieno), (Duke et al., 2002;
López, 2008; Vyvyan, 2002).
Una unidad isoprenoide unida a un grupo fosfato activo forma el IPP (Isopentil difosfato o “5carbono isopentil difosfato”) que se forma en la vía del ácido mevalónico. Sin embargo,
recientemente se ha propuesto que algunos terpenoides no se originan por esta ruta, sino por una
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
ruta alternativa que puede involucrar piruvato y gliceraldehído-3-fosfato (Adam, K., Thiel, R.,
Zapp, J. y Becker, 1998; Sponsel, 1995). La biosíntesis de los terpenoides depende de un número
variable de condensaciones consecutivas de los dos monómeros activos (building blocks). Son
producidos principalmente por una gran variedad de plantas, aunque algunos insectos también
emiten terpenos y algunos son producidos sintéticamente (De Liñán, 1997).
4.2.2. Monoterpenoides
Los terpenos que contienen dos unidades de isopreno se llaman monoterpenos (10 carbonos),
fueron llamados así porque resultaron ser los primeros terpenoides aislados del aguarrás en 1850,
y fueron considerados la unidad base a partir de la cual se hizo el resto de la nomenclatura. Los
monoterpenos son bien conocidos como componentes de las esencias volátiles de las flores y
como parte de los aceites esenciales de hierbas y especias (Angelini et al., 2003). Ellos forman
parte de hasta el 5 % en peso de la planta seca. Muchos monoterpenos son tóxicos para los
insectos, como por ejemplo las piretrinas, las resinas de coníferas y algunos aceites esenciales
que poseen actividades antibacterianas y antifúngicas. Los monoterpenos son subdivididos dentro
de tres grupos: acíclicos, monocíclicos y bicíclicos (Ikan, 1991). Los que contienen tres unidades
de isopreno se llaman sesquiterpenos (15 carbonos) y los que contienen cuatro, seis, ocho o más
unidades reciben el nombre de diterpenos (20 carbonos), triterpenos (30 carbonos), tetraterpenos
(40 carbonos), y politerpenos (n carbonos) respectivamente (Ikan, 1991; McMurry, 1994).
4.3. Compuestos fenólicos.
Los más de 8000 compuestos fenólicos que se conocen están formados o bien por la vía del ácido
shikímico o bien por la vía del malonato/acetato. Son aquellos productos biosintetizados en las
plantas que poseen la característica biológica de ser productos secundarios de su metabolismo y
la característica química de contener al menos un grupo fenol (un anillo aromático unido al
menos a un grupo funcional hidroxilo) en su estructura molecular (Einhellig, 2003).
La vía del ácido shikímico participa en la biosíntesis de la mayoría de los fenoles de las plantas
superiores. Utiliza como sustratos la eritrosa-4-fosfato (de la vía de las pentosas fosfato) y el
ácido fosfoenol pirúvico (proveniente de la glucólisis). Uno de los productos de esta vía es la
fenilalanina, un aminoácido esencial el cual va del metabolismo primario de las plantas, y entra
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
en el secundario cuando la enzima fenilalanina amonio liasa (PAL) cataliza la eliminación de un
amonio convirtiendo a la fenilalanina en ácido cinámico (López, 2008).
La vía del ácido malónico es una importante fuente de fenoles en bacterias y hongos y en las
plantas superiores existe aunque no es tan utilizada. Su sustrato es el acetil-CoA. Entre los
compuestos fenólicos encontramos fenoles simples y complejos. Los simples pueden ser
fenilpropanoides simples los cuales tienen un esqueleto básico de fenilpropanoide, es decir, un
anillo unido a una cadena de 3 carbonos (ej: ácido trans-cinámico), lactonas fenilpropanoides
(ésteres cíclicos), también llamadas cumarinas. Éstos también poseen un esqueleto
fenilpropanoide pero el propano aquí esta ciclado (ej: umbeliferona), o derivados del ácido
benzoico, donde el esqueleto es un anillo aromático unido a un carbono (ej: la vainillina). Dentro
de los fenoles complejos encontramos la lignina y los flavonoides (Cseke et al., 2006; C. García,
Martínez, Ortega, & Castro, 2010).
Se ha demostrado que cientos de compuestos fenólicos naturales poseen grandes propiedades
antioxidantes. Sin embargo, su uso en los alimentos es limitado debido a ciertos requerimientos
de seguridad y solo unos cuantos pueden ser comercialmente aplicados en alimentos. (Mercado et
al., 2013).
4.3.1. Compuestos fenólicos del paico (Chenopodium ambrosioides L.).
La actividad antioxidante de los aceites esenciales de C. ambrosioides puede ser atribuida a
diversas razones, como son: la presencia de compuestos fenólicos como el estragol, timol y
carvacrol, que aunque están en pequeñas proporciones en el AE pueden ejercer una actividad
antioxidante como captadores de radicales. El compuesto mayoritario encontrado en aceite
esencial de C. ambrosioides es α-terpineno (60,29 %), seguido de p-cimeno (20,49 %), 4-careno
(7,96 %) y trans-ascaridol (1,91 %) (Jaramillo, Duarte, & Delgado, 2012).
4.3.2. Compuestos fenólicos del eneldo (Anethum graveolens L.).
El estudio fotoquímico de la planta completa señala como principales componentes fenólicos:
taninos, flavonoides, aceites esenciales, triterpenos y esterodides, lo cual coincide con reportes
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|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
que señalan a constituyentes químicos como: la carvonona (acetona), eugenol, miristinol
(fenoles), limoneno, y felandreno terpineno (Shekhawat & Jana, 2010).
4.4. ANTIOXIDANTES.
Los antioxidantes son compuestos que disminuyen la extensión de las reacciones de oxidación
espontáneas del oxígeno atmosférico con sustancias orgánicas provocando cambios en sus
atributos de calidad, de los cuales los principales son la disminución de la vida útil de muchos
productos alimenticios, cosméticos y de la industria química (Cseke et al., 2006).
Las sustancias antioxidantes comenzaron a popularizarse mundialmente en las últimas décadas
a partir de la difusión de numerosos estudios científicos obtenidos a partir de componentes
naturales de alimentos, material vegetal y animal. Estas evidencias impulsaron las aplicaciones
farmacológicas de los antioxidantes en la prevención de enfermedades como cáncer u
osteoporosis. En el área de los cosméticos, los antioxidantes surgieron como protectores de
dichos productos o como inhibidores del proceso de envejecimiento de la piel. A nivel de la
industria de alimentos, los antioxidantes resultaron de interés para la preservación y estabilidad
de los mismos, reduciendo la velocidad de degradación de compuestos por la oxidación y la
pérdida de su calidad nutritiva (Duke et al., 2002).
Hay una estrecha relación entre el área farmacológica y alimenticia por la ingesta de
antioxidantes, sea como nutracéutico en el primer caso o como alimentos funcionales en el
segundo. La diferencia está en la definición de ambos. Los alimentos funcionales están
constituídos por sustancias como glutatión, vitamina A y otras, con valores nutritivos y
fisiológicos. Estos pueden ser definidos como sustancias que contienen niveles significativos de
componentes biológicamente activos que brindan beneficios a la salud (Hüsnü, Baśer, & Demirci,
2007).
Por su parte, los nutracéuticos, son alimentos que deben ser consumidos bajo supervisión
médica, para tratamientos específicos de enfermedades con requerimientos nutricionales
particulares, ya que contienen sustancias o agentes bioactivos con efectos farmacológicos sobre la
salud, científicamente comprobados y pueden ser presentados en otras formas distintas a la del
26
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
alimento. Por ejemplo, los productos marinos del cartílago de tiburón se formulan para
enfermedades articulares (Gordillo et al., 2016). La antocianina de las bayas y los β-carotenos de
la zanahoria reducen el riesgo de cáncer y mejoran el sistema inmunológico (Saini & Keum,
2018).
Los antioxidantes se pueden incorporar al organismo humano mediante la ingesta equilibrada
de alimentos ricos en estos compuestos, o como fármacos o como suplementos dietéticos. Estos
últimos son combinaciones de varios antioxidantes y otras sustancias que en conjunto ejercen un
sinergismo favorable para la función protectora contra la oxidación. A su vez, se incorporan
minerales como cinc, cobre y/o selenio para potenciar el efecto de los suplementos. Los
antioxidantes mas consumidos son la vitamina C, E, β-caroteno y selenio mineral (Birben et al.,
2012; Dybvik, Falch, & Rustad, 2008) pero han surgido las proantocianidinas, flavonoides de las
semillas de uva, de la corteza de pino y de los vinos, la N-acetilcisteína, la coenzima Q10, el
Ginko biloba, el té verde, y fórmulas de carotenoides y polifenoles(Dybvik et al., 2008) .
Las hierbas culinarias y medicinales han demostrado tener propiedades antioxidantes tales
como el orégano, la salvia, la menta, el tomillo, el clavo de olor y las medicinales chinas tienen
antioxidantes a concentraciones mayores a 75 mmol por cada 100 g (Z. Chen et al., 2017). Una
ingesta de este tipo de hierbas en la dieta normal mejora significativamente el total de
antioxidantes incorporados a través de alimentos ricos en estos compuestos y presentes en frutas,
cereales y vegetales (Belwal, Giri, Bhatt, Rawal, & Pande, 2017).
Las industrias de antioxidantes presentan atención especial en el poder antioxidante de hierbas
y plantas, como los extracto de frambuesa, de semillas de uva, de madera de roble y de otras
variedades más exóticas. Este aspecto es de suma importancia para tener en cuenta el desarrollo
sostenible de las plantas en su aprovechamiento para la extracción o utilización de sus principios
activos (Saini & Keum, 2018).
4.4.1. Fuentes de compuestos fenólicos y polifenólicos con actividad antioxidante.
Este tipo de compuestos constituyen el grupo más numeroso de antioxidantes, encontrándose
en un amplio número de plantas. Por ejemplo, algunos subproductos obtenidos en la producción
27
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
de aceite de oliva, como el extracto etanólico del orujo y el alpechín, han mostrado propiedades
antioxidantes (Amro, Aburjai, & Al-Khalil, 2002), identificándose los ácidos caféico (14),
ferúlico (15), cumárico (16), el ácido cinámico (44) y el ácido protocatéquico (45) (Bobinait,
Viškelis, & Venskutonis, 2012). El propio aceite de oliva contiene quercetina (46) y transresveratrol (47) (ver. Figura 1) (Gordon, Paiva-Martins, & Almeida, 2001).
La infusión acuosa de té (Camellia sinensis, Theaceae), es rica en antioxidantes de tipo
polifenólico (Harbowy, Balentine, Davies, & Cai, 1997). Los componentes mayoritarios se
pueden observar en la figura 1: galato de theaflavino (48) y el galato de epigalocatequina (49).
Este último presenta actividad anticancerígena junto con las flavonas tangeretina (50) y
nobiletina (51), presentes en cítricos (Gordon et al., 2001).
Las especies Ginko biloba (Ginkgoaceae) (DeFeudis & Drieu, 2000) y la yerba mate (Ilex
paraguariensis) (Aquifoliaceae) (Actis-Goretta, Ottaviani, & Fraga, 2006), son muy conocidas en
medicina tradicional para el tratamiento de problemas cardíacos, del sistema nervioso central,
entre otros. Se ha estudiado que presentan actividad antioxidante debido al contenido de
flavonoides y compuestos fenólicos. Del Ginko biloba se han identificado el galato de
epigalocatequina (48) y galato de theaflavino (49), el 3-O-glucósido de kaempferol (52) y 3-Orutinosido de kaempferol (53) (Bors, Heller, Michel, & Saran, 1990) De la yerba mate, se
encuentra la quercetina (46) y los ácidos: caféico (14) (Figura 10), clorogénico (54),
isoclorogénico (55) y cafeoilquínico (56) (Alikaridis, Papadakis, Pantelia, & Kephalas, 2000)
(Figura 1).
Otras fuentes de antioxidantes naturales son los organismos marinos. Se han estudiado una
serie de metabolitos aislados de esponjas, algas y cianobacterias marinas, entre ellos, el cymopol
(57) (aislado de Cymopolia barbata), 7-hidroxicymopol (58) (aislado de C. barbata),
avrainvilleol (59) (aislado de Avrain villia ssp.), fragilamida (60) (aislado de Martensia fragilis),
puupehenona (61) (aislado de Hyrtios ssp.), aaptamina (62) e isoaaptamina (63) (aislado de
Aaptos aaptos) (Takamatsu et al., 2003).
4.4.2. Antioxidantes sintéticos.
28
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Los antioxidantes sintéticos se usan industrialmente como aditivos. Estos antioxidantes
retrasan o previenen los procesos oxidativos que causan el deterioro de los alimentos, el
endurecimiento del caucho, el cambio de color y/o enranciamiento de los aceites y grasas, etc.
Butil-hidroxitolueno
(BHT)
(104),
terc-butilhidroquinona
(TBHQ)
(105)
y
di-terc-
butilhidroquinona (DTBHQ) (106) son antioxidantes utilizados en las industrias agro-alimentaria,
cosmética y de plásticos como conservantes (Figura. 2) (Yu, Mandlekar, Harvey, Ucker, & Kong,
1998).
4.5. RADICALES LIBRES.
Por radical libre se entiende cualquier átomo o molécula que contenga algún electrón no
apareado en su orbital externo y que puede existir en forma independiente. Los electrones no
apareados provocan inestabilidad y un aumento en la reactividad. Los radicales libres, en un
intento por completar sus pares de electrones interaccionan con moléculas adyacentes quitándoles
electrones y como en una reacción en cadena, generan nuevos radicales libres. Los radicales
libres se forman a nivel celular, las fuentes más importantes son el metabolismo anaeróbico, a
través de la cadena de transporte de electrones a nivel mitocondrial, así como la oxidación de los
ácidos grasos, en las reacciones de citocromos y en las células fagocíticas (bomba oxidativa).
Existen además, enzimas capaces de generar radicales libres bajo condiciones normales o
patológicas; también existen fuentes exógenas como el humo del tabaco, la radiación ultravioleta,
rayos x, ciertos fármacos, solventes industriales, el ejercicio, la contaminación ambiental, etc
(Gutiérrez, Droguet, & Odeur, 2002).
Los radicales libres también tienen efectos fisiológicos importantes como la regulación de la
respuesta inmunológica de defensa (inactivación de virus y eliminación de bacterias y hongos),
en señales de transducción etc., por lo que se pueden considerar benéficos o tóxicos dependiendo
de su concentración y de los mecanismos antioxidantes que los producen.
29
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Figura 1. Compuestos fenólicos y polifenólicos con actividad antioxidante.
Figura 2. Antioxidantes sintéticos utilizados en las industrias como conservantes
Fuente:(Alikaridis et al., 2000)
30
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Cuando la formación de radicales libres excede la capacidad de defensa, falla el “balance
oxidativo” y se produce daño a las moléculas biológicas. El ataque a los grupos funcionales de las
proteínas, provoca oxidación de aminoácidos y modificación de las proteínas como
fragmentación y agregación lo que posteriormente genera la proteólisis (Pham-Huy, He, & PhamHuy, 2008).
4.6. MÉTODOS CONVENCIONALES DE EXTRACCIÓN
4.6.1. Arrastre con vapor.
Generalmente es llamado destilación por arrastre con vapor. Este método se lo define como el
proceso para obtener el extracto o aceite esencial de una planta aromática, mediante el uso del
vapor saturado a presión atmosférica. El generador de vapor no forma parte del recipiente donde
se almacena la materia prima, es externo y suministra un flujo constante de vapor. Su presión es
superior a la atmosférica, pero el vapor efluente, que extrae está a la presión atmosférica. La
materia prima forma un lecho compacto y se desprecia el reflujo interno de agua debido a la
condensación del vapor circundante (Estrada-cely et al., 2012).
6.3.2. Extracción sólido-líquido (soxhlet). La extracción Soxhlet se fundamenta en las
siguientes etapas: 1) disposicion del solvente en un balón. 2) ebullición del solvente que se
evapora hasta un condensador a reflujo. 3) el condensado cae sobre un recipiente que contiene un
cartucho poroso con la muestra en su interior. 4) ascenso del nivel del solvente cubriendo el
cartucho hasta un punto en que se produce el reflujo que vuelve el solvente con el material
extraído al balón. 5) Se vuelve a producir este proceso la cantidad de veces necesaria para que la
muestra quede agotada. Lo extraído se va concentrando en el balón del solvente (Cuassolo,
Ladio, & Ezcurra, 2010).
4.6.2. Extracción por maceración.
La maceración es un proceso de extracción sólido-líquido, dónde la materia prima posee una
serie de compuestos solubles en el líquido de extracción que son los que se pretende extraer. El
proceso de maceración genera dos productos que pueden ser empleados dependiendo de las
necesidades de uso, el sólido ausente de esencias o el propio extracto. La naturaleza de los
31
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
compuestos extraídos depende de la materia prima empleada, así como del líquido de extracción
(Gónzalez, 2004). Existen dos métodos de maceración de acuerdo a la temperatura, caliente y
frío. Para la extracción, las plantas son generalmente maceradas con agua destilada,
posteriormente filtradas (Morales & Gutiérrez, 1981)
4.6.3. Maceración en frío.
Consiste en sumergir el producto a macerar en un recipiente con la cantidad suficiente de
solvente para cubrir totalmente lo que se desea macerar. Esto se lleva a cabo por un lapso de
tiempo largo, dependiendo de la materia prima que se vaya a macerar (Deng et al., 2017). Las
ventajas de la maceración en frío consisten en la utilización de equipos simples que requieren
mínimas cantidades de energía y en la capacidad de extraer la mayoría de las propiedades de lo
que se macera (dependiendo del solvente), prácticamente en su totalidad sin alterarla por efectos
de temperatura. Sin embargo se necesitan períodos de tiempo mucho más extensos para lograr
una extracción adecuada (Chemat & Esveld, 2013)
4.6.4. Extracción con disolventes.
Es una técnica de separación de compuestos muy utilizada no solo en los laboratorios de
química sino también en las diversas industrias. La técnica consiste en que a partir de una matriz
sólida o líquida, aprovechando las diferencias de solubilidad de los componentes de la mezcla,
separarlos con un disolvente adecuado; tradicionalmente, la extracción de estos compuestos de
interés se ha realizado mediante técnicas convencionales donde se emplean solventes como: agua,
metanol, etanol, acetato de etilo, entre otros; obteniendo un bajo rendimiento del proceso (Ávalos
& Elena, 2009).
4.6.5. Recomendaciones en los métodos de extracción.
La relación Material Vegetal/disolvente, influye de manera positiva sobre los sólidos
extraídos, esto es debido a que la difusión se ve favorecida por el aumento del balance de
concentraciones según la ley de Fick. Existe mayor capacidad de saturación del disolvente, lo que
ocasiona un agotamiento más eficiente de los compuestos presentes en el material vegetal, por el
acrecentamiento de la cantidad de sustancia soluble a difundir (Deng et al., 2017).
32
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
4.7. METODOS DE EXTRACCION NO CONVENCIONALES
Dentro de las técnicas no convencionales de extracción se pueden mencionar además del uso
de los solventes anteriormente nombrados, algunas bases (hidróxido de sodio, hidróxido de
potasio, etc.) y la utilización de ácidos (ácido clorhídrico), los cuales logran una mejor extracción
de compuestos (Ladero, 2009). Dentro de las llamada técnicas no convencionales también se
encuentran las tecnologías de fluidos supercríticos (gas carbónico,), extracción asistida con
microondas y extracción asistida con ultrasonido, las cuales buscan mejorar el rendimiento en la
extracción de los compuestos de interés.
4.7.1. Ultrasonido
En la actualidad la industria de alimentos ha incorporado con bastante éxito estas tecnologías,
llamadas emergentes, combinadas con tecnologías convencionales o en aplicaciones específicas
relacionadas con el procesamiento, conservación y extracción de componentes de los alimentos.
Una de estas tecnologías es la del ultrasonido, de aplicaciones en el área de la salud utilizado en
sistemas de diagnóstico como doopler, ecografías, ecocardiografías y también en sesiones
terapéuticas, que aprovechan las vibraciones mecánicas y el efecto térmico producido, paso a
emplearse con bastante éxito y de manera eficiente en la industria de los alimentos, la razón de su
éxito en este campo especifico se debe a su efectividad en procesos tales como la congelación, el
secado, el revenido, el blanqueado, la esterilización, y la extracción de compuestos de interés,
(Chemat & Esveld, 2013).
Algunas de las ventajas que obtienen al utilizar el ultrasonido en los procesos de alimentos
son: un mezclado más eficaz y micro-mezcla, la energía es más rápida en la transferencia de
masa, se reducen los gradientes térmicos y de concentración, hay reducción en la temperatura, la
extracción es selectiva, la reducción de equipos es significativa, se tiene una respuesta más rápida
al control del proceso de la extracción de compuestos en general, es más rápida la puesta en
marcha, se aumenta la producción, hay eliminación de etapas de proceso, y se aumenta la
eficiencia y eficacia en los procesos alimentarios; buena parte de estas ventajas del ultrasonido se
33
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
deben al aprovechamiento de una de sus principales propiedades conocida con el nombre de
cavitación, de allí la mejora sustancial en la transferencia de masa (Reyes et al., 2014).
4.7.2. Aspectos teóricos del ultrasonido.
A continuación se presentan algunos aspectos teóricos generales acerca de los principios que
aplican a esta nueva tecnología; aspectos acerca de las formulaciones matemáticas que gobiernan
esta tecnología no serán tratadas aquí debido a su alta complejidad.
Por definición el ultrasonido es un tipo especial de vibración de onda de sonido con frecuencia
más allá de la audición humana (20000 Hz), es decir, a más de 20 kHz., y de acuerdo al centro de
sonoquímica de la Universidad de Coventry en el Reino Unido el ultrasonido puede ser dividido
en dos tipos: ultrasonido de señal y de potencia (Deng et al., 2017).
4.7.3. Ultrasonido de señal.
En el ultrasonido de señal el rango de frecuencia de las ondas se sitúa en el rango de 100 kHz
hasta 1 MHz, conocido también como ultrasonido de baja frecuencia; esta señal es afectada por
los elementos que entran en contacto con ella, permitiendo de esta manera obtener información
acerca del producto, principalmente en el estudio de sus propiedades reológicas (M. Chen, Zhao,
& Yu, 2015).
4.7.4. Ultrasonido de potencia.
En el ultrasonido de potencia el rango de frecuencia de las ondas se sitúa desde 18 kHz hasta
100 kHz, conocido también como ultrasonido de alta frecuencia; al haber una frecuencia más baja
y una potencia más alta se logran producir cambios fisicoquímicos en el medio a través de la
generación y subsiguiente colapso de burbujas de cavitación (fenómeno donde las ondas de
sonido que pasan a través de un medio (solvente) generan procesos de compresión y de
expansión), significa que la producción, el crecimiento y el colapso de burbujas es debido a una
gran cantidad de energía que se puede producir a partir de la conversión de energía cinética de
movimiento esto ocurre asimétricamente en las interfaces y golpes sobre la superficie sólida. Para
lograr el efecto antes mencionado se requiere de un medio líquido (agua, u otro), un generador de
34
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
energía y un transductor, el cual convierte la energía eléctrica, magnética o cinética en energía
acústica (González-Centeno et al., 2014).
Los factores que afectan el fenómeno de cavitación del ultrasonido son: las propiedades físicas
del solvente empleado, la temperatura, la frecuencia, la potencia del ultrasonido, la presión
hidrostática, la tensión superficial y la potencia de irradiación. Otras propiedades de los
materiales orgánicos como el contenido de humedad, el grado de molienda, el tamaño de
partículas y el tipo de disolvente son factores también muy importantes que influyen y se deben
tener presente para tener una extracción eficiente y de calidad por medio de esta tecnología
(Hani, Torkamani, Abidin, Mahmood, & Juliano, 2017).
Normalmente el soluto de interés se encuentra dentro de la célula, en la pared celular, en el
citoplasma y/o los organelos, lograr su extracción de manera convencional con solventes no es
fácil y la eficiencia es mucho menor, sin embargo con la utilización del ultrasonido se superan
estas dificultades debido a la acción del ultrasonido que abre poros en la pared celular y porque
disminuye el tamaño de los solutos, este mecanismo de extracción asistida por ultrasonidos
implica dos principales tipos de fenómenos físicos, a saber: (a) difusión a través de la pared
celular y (b) lavado del contenido de la célula después de romper las paredes. En la industria de
los alimentos se realizan las extracciones sobre materiales bien sean líquidos o solidos las cuales
vibran por la acción de la onda ultrasónica, como resultado se logra que el soluto de interés, pase
de la fase solida al solvente, de esta manera se favorece entonces la difusión del soluto hacia el
solvente al existir una mayor área de contacto y porque se favorecen los gradientes de
transferencia de masa por los fenómenos de cavitación ultrasónica (Sharmila et al., 2016).
4.7.5. Extracción asistida con ultrasonido de componentes orgánicos de interés.
En este ítem también de forma general se realizara un retrato de algunas investigaciones
acerca de esta tecnología, en especial las relacionadas con la extracción de compuestos bioactivos
(antioxidantes, principalmente fenoles)
González Centeno y colaboradores (2014) realizaron la extracción asistida por ultrasonido
acuoso (EAU) de orujo de uva investigando a través de la metodología de superficie de respuesta
(RSM) el efecto de la frecuencia acústica (40, 80, 120 kHz), la potencia ultrasónica (50, 100, 150
35
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
W / L) y el tiempo de extracción (5, 15, 25 min) en fenoles totales, flavonoles totales y la
capacidad antioxidante. El autor mencionado encontró que todas las variables del proceso
mostraron un efecto significativo sobre la EAU acuosa de orujo de uva, encontrando la mejor
condición de extracción a 40 kHz, una densidad de potencia de 150 W / L y 25 min de la
extracción. En otra investigación también por superficie de respuesta sobre la extracción de los
compuestos fenólicos del rizoma sparganii, (Ze Wang, Dang, Lin, & Song, 2017), se estudió la
concentración de etanol (%), el tiempo de extracción (MIN) y la proporción de disolvente al
material (mL/g).
Los resultados mostraron que la condición óptima EAU se obtuvo con una concentración de
etanol de 75,3%, un tiempo de extracción de 40 min y una proporción de disolvente a material de
19,21 mL/ g de fenoles totales, y una mezcla de etanol de concentración de 80%, en un tiempo de
extracción de 33,54 min y el disolvente al material en proporción de 22,72 ml/g para la
combinación de α-hidroxibenzaldehído, ácido α cumárico, ácido vanílico, ácido ferúlico, rutina y
kaempferol.
Son muchas las investigaciones actuales que se adelantan sobre la aplicación de la tecnología
del ultrasonido en la extracción de compuestos fenólicos difíciles de consignar en su totalidad en
este ítem, a manera de referencia se han mencionado las dos anteriores con el propósito de
mostrar que los estudios de investigación que se adelantan tienen centrado su interés en conocer
cuáles son las condiciones óptimas de extracción con el ultrasonido, de allí que se enfocan en
estudiar sus principales variables como son: temperatura, frecuencia, potencia, y tiempo en lo que
aplica directamente con el uso de esta tecnología para obtener el máximo rendimiento de
extracción (Alonso et al., 2017; Costa et al., 2015; Popa et al., 2012) sin embargo existen también
muchos estudios que se centran no solo en las variables anteriores, sino en otros factores claves
como por ejemplo el tipo de solvente y sus amplias posibilidades bien sean en combinación con
las variables antes mencionadas o solos (Das, Goud, & Das, 2017).
Sumado a lo anterior son destacables las diferentes investigaciones que se apoyan en estudios
anteriores y centran su actividad investigativa en la identificación y cuantificación de los
36
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
principales compuestos fenólicos presentes en diferentes materiales mediante técnicas modernas
de cromatografía como HPLC acoplada a una amplia gama de detectores.
4.8. CAPACIDAD ANTIOXIDANTE .
Se han desarrollado varios métodos espectrofotométricos para la determinación del potencial
antioxidante de diferentes sistemas bioquímicos. Estos métodos son de rápida aplicación, escasa
manipulación de material biológico y bajas necesidades instrumentales por lo que su aplicación
es sencilla. La eficacia antioxidante de las muestras ensayadas se compara con patrones
conocidos como ácido ascórbico o Trolox. Algunos utilizan el retraso en la oxidación como
parámetro de la actividad antioxidante, otros analizan la capacidad de captación del radical libre o
reducción del ión metálico o catión radical. Los métodos que se mencionan a continuación son
ampliamente usados en diferentes estudios de la capacidad antioxidante de sistemas biológicos
(como plasma sanguíneo o tejidos), tanto de extractos y compuestos aislados de especies
vegetales como productos derivados de procesos industriales (Amarowicz & Shahidi, 2017)
4.8.1. Reacción con el radical 2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfonato de amonio)
(ABTS).
El método consiste en formar un radical catiónico ABTS (cromóforo verde) basado en la
acción oxidativa de peroxidasas u oxidasas sobre ABTS (Figura 3). Una solución estable de
ABTS también puede ser preparada con agentes oxidantes tales como dióxido de manganeso o
persulfato de potasio (Pannala & Rice-Evans, 2001).
El radical ABTS presenta máximos de absorción a 414 nm y en las proximidades del
infrarrojo (645, 732 y 815 nm). Esta propiedad da la posibilidad de evitar interferencias
generadas por cromógenos de la muestra a estudiar. El fundamento de este método consiste en
observar la decoloración del radical ABTS debido a la interacción con especies donantes de
hidrógeno (Kuskoski, Asuero, Troncoso, Mancini-Filho, & Fett, 2005).
37
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Figura 3. Reacciones con el radical ABTS
-1eABTS (Incoloro)
ABTS + (verde)
ABTS + + RH
ABTS + R
Fuente: (Pannala & Rice-Evans, 2001)
El radical ABTS se produce utilizando ABTS (7mM) y persulfato de potasio (2,45 mM) en
tampón fosfato pH 7,0. La mezcla reaccionante se prepara 12 h antes de su uso y se mantiene a
temperatura ambiente y en ausencia de luz. Se ajusta la absorbancia de la disolución ABTS a 0,7
unidades a 732 nm con tampón. La actividad antioxidante se evalúa midiendo el cambio de
absorción a 732 nm de la solución de ABTS cuando se alcanza el estado estacionario (Pannala &
Rice-Evans, 2001).
4.9. CROMATOGRAFÍA DE LOS EXTRACTOS.
La cromatografía se ha convertido en una herramienta indispensable para establecer el perfil
de de los extractos, haciendo posible su cualificación y cuantificación (Rivera, 2006). Hoy en día
la cromatografía es una herramienta muy importante y fundamental para determinar la calidad, la
composición completa de diversas sustancias dando resultados cuantitativos que se obtienen en
un espacio de tiempo relativamente corto. También, es clasificada por su utilidad y de acuerdo a
esta la cromatografía es utilizada para determinar los químicos presentes en una mezcla y en qué
concentración (Edelenbos, Christensen, & Grevsen, 2001).
4.10.
COMPOSICIÓN DE LOS EXTRACTOS
4.10.1. Paico.
En el estudio de la extracción y determinación de la composición química del aceite esencial
de paico (Chenopodium ambrosoides L.) el autor logro identificar
alrededor de 16
compuestos, entre los cuales están: 1,4-peroxido de p-menta- 2-eno, alia-terpineno, p-cimeno,
ascaridol (Pochettino, M., et al. 2009). aceite esencial con ascaridol, mircenno, felandreno,
limoneno, alcanfor, aritasona, safrole, geraniol, terpenos, carotenoides, taninos, resinas, aterpineno, p.cimeno, b-pineno, N-octacosano, N-hentriacontano, quercetina, anetol,
38
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
santonina, calcio, acido músico, acido oxálico (Callan, Johnson, Westcott, & Welty, 2007;
León, 2009)
4.10.2. Eneldo.
El aceite de eneldo, entre sus componentes principales encontramos: Carvona cetonaterpénica-, limoneno, felandreno, pineno, dipenteno, diapiol y miristicina (El Mansouri,
Bousta, Balouiri, Ouedrhiri, & Elyoubi, 2014)
39
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
5. METODOLOGÍA.
5.1.
OBTENCIÓN
DE MATERIALES VEGETALES DE ENELDO (ANETHUM
GRAVEOLENS L.) Y PAICO (CHENOPODIUM AMBROSIOIDES L.)
5.1.1.
Localizacion.
El trabajo de investigación se llevo a cabo en el departamento de Nariño, en el corregimiento
de Genoy se realizó la recolección de las plantas aromáticas y medicinales de eneldo (Anethum
graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.) Y en el municipio de San Juan de Pasto,
en los laboratorios del grupo de investigación GAIDA de la Universidad de Nariño
se realizaron pruebas específicas para determinar algunas características fisicoquímicas de las
2 especies vegetales en estudio y en la sede Alvernia de la Universidad Mariana se obtuvieron los
extractos de Eneldo y Paico mediante la extracción por maceración.
5.1.2.
Recolección de material vegetal.
El material vegetal a trabajar se recolectó en el corregimiento de Genoy, ubicado al
noroccidente del municipio de Pasto a 2.700 msnm. Las muestras de cada especie fueron
provenientes de plantas jóvenes de acuerdo al tiempo descrito por los productores con respecto a
la etapa de floracion, de las cuales se recolectaron la parte foliar, se seleccionaron aquellas que
estuvieran sanas, libres de ataques por hongos, plagas y/o insectos, estas se empacaron en bolsas
con sello hermético (Ziploc) de 500 gramos y se transportaron a las instalaciones de la planta
Alvernia de la Universidad Mariana para realizar un proceso de secado en un Horno Digital de
Precisión PINZUAR Modelo PG190, por aire forzado, a una temperatura de 50°C y velocidad del
aire de 2 m/s durante aproximadamente 3 horas, con el fin de llevar la humedad del material
vegetal hasta un porcentaje de humedad en base húmeda de 10 a 12%, posterior a esto las hojas
secas se redujeron de tamaño en un molino de discos para obtener un tamaño de partícula de
aproximadamente 0,59 mm, retenida en un tamiz N° 30 ASTM correspondiente a una molienda
media (Peredo-Luna, Palou-García, & López-Malo, 2009).
40
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
5.1.3.
Selección del material vegetal.
Se seleccionó el material vegetal separándolo de impurezas que pudieron existir, se utilizaron
cuchillos o tijeras para separar la parte aprovechable de la planta de aquellas que no fueron útiles
en la extracción, seguido se pesó el material vegetal aprovechable.
5.2. DETERMINACIÓN DE LA COMPOSICIÓN QUÍMICO PROXIMAL DE
ENELDO (Anethum
graveolens L.) Y PAICO (Chenopodium ambrosioides L.).
5.2.1. Determinación de la humedad.
El método se fundamenta en la determinación gravimétrica de la pérdida de masa de la
muestra desecada hasta masa constante en estufa de aire, para lo cual se utilizo una balanza
analítica determinadora de humedad PCE, sensibilidad 0.01 g, dotada de una lámpara de
infrarrojo; cápsulas de vidrio y porta objetos propios de la balanza. Se efectuó el análisis por
triplicado, se pesó aproximadamente 2 g de muestra previamente homogeneizada, y se dispuso
dentro de la balanza en crisoles de vidrio previamente tarados, se cerró el portamuestras y se
inició la determinación por parte de la balanza, hasta que se alcanzó un peso constante, los
resultados se expresaron en porcentaje de humedad (AOAC, 2007).
5.2.2. Determinación de las cenizas totales.
El método se basa en la destrucción de la materia orgánica presente en la muestra por
calcinación y determinación gravimétrica del residuo de acuerdo a lo establecido en los métodos
de la AOAC 923.03 (AOAC, 2007), para ello se utilizo una balanza analítica de sensibilidad 0,1
mg; mufla marca terrígeno serie 655 regulada a 550 ± 2 °C; desecador con deshidratante
adecuado (silicagel) y placa calefactora. El análisis se efectuo por triplicado y se pesaron 3
gramos de material vegetal, realizando el siguiente procedimiento:
1.
Se calcinaron los crisoles vacíos a 550°C durante 2 h, se dejó enfriar (hasta ±40°C) en la
mufla, y se llevaron al desecador, posteriormente se pesaron a temperatura ambiente (m0).
41
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
2.
Para muestras sólidas. Se pesaron 3 g de muestra en un crisol previamente tarado y
deshumedecido (m1).
3.
Se colocaron los crisoles con la muestra en la mufla y se calcinó a 550°C durante 3 h
hasta obtener cenizas de color blancas o grisáceas.
4.
Se enfrió en la mufla apagada (hasta ±40°C) y luego se traspasó a desecador y se pesó a
temperatura ambiente (m2).
5.2.2.1.1. Cálculo y expresión de los resultados. Se calculó el porcentaje de las cenizas de
los materiales vegetales en estudio en base húmeda y en base seca respectivamente, mediante las
siguientes ecuaciones
Cálculo de cenizas en base húmeda
𝑚 −𝑚
% 𝐶𝑒𝑛𝑖𝑧𝑎𝑠 (𝑏ℎ) = [𝑚2 −𝑚0 ] ∗ 100 Ec. 1
1
0
Dónde:
m2: masa de los crisoles con las cenizas, en gramos.
m1: masa de los crisoles con la muestra, en gramos.
m0: masa del crisol vacío, en gramos.
5.2.2.2.
Colorimetría.
Se identificó el color de los materiales vegetales eneldo y paico, tomando muestras de cada
planta en base húmeda, para la determinación Se utilizó el espectrofotómetro CM-5, KONICA
MICOLTA encontrado en los laboratorios de GAIDA de la Universidad de Nariño, se colocó la
muestra de cada planta en el porta muestras del equipo, se configuró con el sistema de color
CIELAB y este proporcionó las coordenadas del color para calcular el Índice de Color de cada
especia vegetal, el índice de color se calculo empleando la siguiente fórmula
𝐼𝐶 =
(𝑎∗)(1000)
(𝐿∗)(𝑏∗)
Ec. 2
42
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Tabla 1. Rango de Índice de Color.
Valores de IC
Color
-40 a -20
Azul violeta al verde profundo
-20 a -2
Verde profundo al verde amarillento
-2 a +2
Amarillo verdoso
+2 a +20
Amarillo pálido al naranja intenso
+20 a +40
Naranja intenso al rojo profundo
Fuente: (Vignoni, cesari, Forte, & Mirábile, 2006).
5.3. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS
5.3.1. Extracción por maceración.
Para los procedimientos de extracción metanólica, etanólica y acuosa se utilizó la metodología
expuesta por (Koike, T y Bolda, M, 2016), para lo cual se preparó el material vegetal y se
deposito en un recipiente de 150 ml, utilizando una relación material vegetal/solvente en base
seca de 1:30 gr/ml de solvente (agua, etanol 70% v/v y metanol puro) donde se sumergió y se
dejó en reposo 7 días con agitación esporádica, cada ensayo se realizo por triplicado, luego del
periodo de tiempo establecido se filtró el líquido y secuencialmente se exprimio el residuo hasta
obtener una solución de solvente y extracto del material vegetal. Finalmente todos los extractos
obtenidos se almacenaron en frascos color ámbar hasta su posterior análisis.
5.3.2. Diseño Experimental
Se construyo un diseño irrestrictamente al azar (D.I.A.) con arreglo factorial, en donde el
factor A corresponde a los dos materiales vegetales y el factor B, a los 3 solventes (agua
destilada, etanol y metanol), la variable de respuesta corresponde a la cuantificación de fenoles
totales medida en mg AG/100g de muestra, la unidad experimental consistio en un frasco ambar
de 175 mL, con 3 repeticiones para un total de 24 unidades experimentales.
43
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
5.4. DETERMINACION DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES EN LOS
EXTRACTOS DE ENELDO (Anethum graveolens L.) Y PAICO (Chenopodium
ambrosioides L.), OBTENIDOS MEDIANTE LA TECNOLOGÍA DE EXTRACCIÓN POR
MACERACIÓN CON 3 SOLVENTES DIFERENTES.
Para la determinación del contenido de fenoles totales en los extractos de las plantas en
estudio se utilizó el método de Folin-Ciocalteu, para lo cual los extractos obtenidos en la
maceración se sometieron a centrifugación en un equipo VELOCITY 18R y para la medición de
la absorbancia se utilizó un espectrofotómetro Genesis 10 UV-Vis Scanning Thermo Fisher
Scientific. Los extractos obtenidos se centrifugaron a 5.500 rpm por un tiempo de 10 minutos
para luego extraer el sobrenadante, el extracto de cada solvente se almacenó a menos 23 °C en
viales ámbar hasta su posterior evaluación (Popa et al., 2012).
5.4.1. Cuantificacion de Fenoles Totales - Folin y Ciocalteu
Se realizó una curva de calibración de ácido gálico con soluciones de 25, 50, 100, 150, 250 y
500 ppm, para poder expresar los resultados en miligramos de ácido gálico/100 gramos de
extracto, se llevaron las muestras al espectofotómetro para realizar la lectura de la absorbancia a
765 nm (Huang et al., 2005).
El contenido de fenoles totales se determinó utilizando el método publicado por Folin y
Ciocalteu (1997). La reacción se realizó con 0,1 ml de la solución a analizar, 0,5 ml del reactivo
de Folin-Ciocalteu y 1,5 ml de una solución acuosa de carbonato de sodio (Na2CO3) al 20 % p/v;
aforando a 10 ml con agua destilada. Al transcurrir dos horas se tomó lectura de absorbancia a
765 nm en el espectrofotómetro, luego interpolando los resultados con la curva de ácido Gálico
se elaboró a la concentración en un rango de 50-500 ug/ml y se determinó el contenido de fenoles
totales(A Agbor, Vinson, & Donnelly, 2014).
Una vez se cuantificaron los fenoles totales de cada uno de los extractos, se selecciono el
solvente que presento mayor rendimiento para su posterior uso en el proceso de extracción
asisitida por ultrasonido.
44
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
5.4.2. Análisis Estadístico.
Para el análisis estadístico se aplico un análisis de varianza (ANOVA) a un nivel de
significancia de α = 0.05, encontradas diferencias significativas se procedio a realizar una prueba
de comparación de medias de tukey al 0.05.
5.4.3.
Determinación de componentes por cromatografía HPLC a los extractos con
mayor contenido de fenoles totales en Eneldo (Anethum graveolens L.)
y Paico
(Chenopodium ambrosioides L.) obtenidos por maceracion.
5.4.3.1.Condiciones cromatográficas.
El perfil cromatográfico se realizó en un equipo HPLC Waters Breeze equipado con una
columna X-Terra, Waters C18 (250 mm x 4,6 mm x 3,5μm) para separar los diferentes ácidos, el
detector un PDA a 254 y 330 nm, Inyector: Loop de 20 μL. Rheodhyne 7525I. Se utilizarón dos
solventes para la fase móvil, Acetonitrilo: Agua acidificada a pH 2,5 x|, la inyección de los
extractos filtrados se realizó con acrodiscos de jeringa GHP (Pall) de 0,45 μm. El flujo se ajusto a
1mL/min y la detección se realizo a 354 nm UV para los ácidos hidroxicinámicos y 360 nm UV
para los ácidos clorogénicos (Stan, Lung, Opris, & Soran, 2014; Tarmidi et al., 2005).
5.5. DETERMINACION DEL EFECTO DE LA TECNOLOGIA DE EXTRACCION
ASISTIDA POR ULTRASONIDO EN FUNCIÓN DE LOS FENOLES TOTALES
PRESENTES EN ENELDO (Anethum graveolens L.) Y PAICO (Chenopodium
ambrosioides L.) Y
CARACTERIZACION DE LOS MEJORES EXTRACTOS
MEDIANTE HPLC.
5.5.1. Diseño Experimental.
Para identificar la influencia de las condiciones en la extracción asistida con ultrasonido de
compuestos fenólicos de las plantas en estudio, se realizaron variaciones en las condiciones de
trabajo del ultrasonido, frecuencia (37 y 80 KHz,) y tiempo (15, 30 y 45 min.) con unos factores
fijos de temperatura (ambiente) y potencia (100%).
45
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Se utilizó un diseño experimental completamente al azar con arreglo factorial. El Diseño Base
tuvo 2 factores experimentales con una variable de respuesta, con dos replicas, obteniendo así 18
corridas.
Tabla 2. Factores del diseño experimental para la extracción por ultrasonido
Niveles
Factores
Unidades
1
2
3
TIEMPO
15
30
45
FRECUENCIA
37
80
-
MINUTOS
kHz
Fuente: Esta investigacion
Tabla 3. Diseño experimental para la extracción por ultrasonido
TIEMPO FRECUENCIA
Minutos
kHz
15
80
30
37
45
80
15
37
30
80
45
37
FENOLES
TOTALES
mg AG/g muestra
Fuente: Esta investigacion
El contenido de fenoles totales (variable de respuesta) se determinó utilizando el método
publicado por Folin y Ciocalteu (1997), empleado por Kuskoski (Kuskoski et al., 2005) y
explicado de forma detallada anteriormente.
46
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
5.5.2. Analisis de Resultados.
Finalmente a los resultados obtenidos se les aplicaron los análisis estadísticos
correspondientes para aceptar o rechazar la hipótesis nula, de que los factores frecuencia y tiempo
no inciden sobre la cantidad de compuestos fenólicos; o aceptar o rechazar la hipótesis alternativa
de que los factores frecuencia y/o tiempo si tienen influencia sobre la cantidad de compuestos
fenólicos.
5.5.3. Extraccion por ultrasonido.
La extracción asistida por ultrasonido utilizando el solvente mas eficiente en la extracción por
maceracion, se realizó en un equipo de ultrasonido Fisherbrand con capacidad de 10 litros,
posteriormente el extracto se centrifugó; el sobrenadante al cual se le evaporó el solvente por
destilación empelando un rotaevaporador y para la medición de la absorbancia se utilizó un
espectrofotómetro, para ello se procesaron 500g del material vegetal los cuales se sometieron a
extracción asistida con el ultrasonido variando como se describe en el diseño experimental,
frecuencia y tiempo con el solvente elegido anteriormente en relación 1:30 w/v materia
seca/solvente, posteriormente, el material vegetal se centrifugó a 5.500 rpm en un equipo
VELOCITY 18R por espacio de 10 minutos, enseguida se extrajo el sobrenadante, el extracto de
cada solvente se almacenó a -23 °C en viales ámbar hasta su posterior evaluación. El contenido
de fenoles totales fue determinado utilizando el método publicado por Folin y Ciocalteu (1997),
empleado por Kuskoski (2005). La reacción se realizó con 0,1 ml de la solución a analizar, 0,5 ml
del reactivo de Folin Ciocalteu y 1,5 ml de una solución acuosa de carbonato de sodio Na2CO3 al
20 % p/v; aforando a 10 ml con agua destilada. Transcurridas 2 horas se tomó lectura de
absorbancia a 765 nm en un espectrofotómetro Genesis 10 UV-Vis Scanning Thermo Fisher
Scientific. Para expresar los resultados en mg de ácido Gálico/ 100 g de extracto se utilizó una
curva de calibración de ácido Gálico con soluciones de 25, 50, 100, 150, 250 y 500 ppm
(Jovanović et al., 2017).
5.5.4. Análisis Estadístico.
Los datos se sometieron a un análisis de varianza ANOVA con el programa estadístico
Infostat/L.
47
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
5.6. EVALUACION A NIVEL IN-VITRO LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS
EXTRACTOS CON MAYOR CONTENIDO DE FENOLES EN ENELDO (Anethum
graveolens L.) Y PAICO (Chenopodium ambrosioides L.), OBTENIDOS MEDIANTE
MACERACION Y ULTRASONIDO.
5.6.1. Capacidad antioxidante expresada en equivalentes Trolox (Ensayo TEAC).
Para la disposicion del radical ABTS, se preparó una solución madre mezclando los reactivos
ABTS y persulfato de potasio en cantidades de 7 mm y 2,45 mm, respectivamente. Se pesó en un
balón aforado de 10 ml; 38,41 mg de ABTS y 6,62 mg de persulfato de potasio, diluyendo con
agua destilada hasta la tercera parte, se sonifico (f =80KHz, P = 50 W y t =10 min) y se terminó
de aforar (González-Centeno et al., 2014). Se cubrió el balón aforado con papel aluminio dejando
reaccionar en la oscuridad a temperatura ambiente por 24 horas. Cuando el radical se activó
presentó una coloración verdeazulada(Mareček et al., 2017).
Posteriormente las muestras se llevaron al espectrofotómetro Genesis 10 UV-Vis Scanning
Thermo Fisher Scientific. Para analizar la muestra se seleccionó una longitud de onda a 734 nm
en el espectrofotómetro, como blanco se tomo etanol absoluto 98.9 % en la cubeta y celda
respectiva. Se tomó 1 ml de la solución madre ABTS•+, diluyéndola en etanol y agitando en un
beaker, hasta ajustar su absorbancia a 0,7 ± 0,2. Por cada dilución se dejó reaccionar por
aproximadamente 6 minutos (Zhihong Wang, Wang, Zhang, & Li, 2017).
Por otro lado se prepara una solución madre de trolox a una concentración de 4 mM, pesando
100,116 mg, diluyendo con etanol hasta la tercera parte, se sonifico (f =70KHz, P = 50W y t =10
min) y termino de aforar en el balón de 100 mL, para después preparar las diluciones a partir de
la solución madre de trolox (Ec. 3), obteniendo el volumen para cada concentración de 0,5 a 4
Mm (Moreira et al., 2017).
𝐶1 𝑉1 = 𝐶2 𝑉2 Ec. 3
Donde:
C1= concentración de la solución madre de trolox 4 mM
48
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
V1= volumen que se debe tomar de la solución madre de trolox 4 mM
C2= concentraciones diluidas de ácido gálico (0,5 a 4 mM)
V2= volumen total en el balón aforado de 10 ml
Tabla 4. Calculo de concentraciones diluidas de trolox 4 mM
C1: Solución
madre trolox [mM]
4
4
4
4
4
4
V1: Volumen a
tomar de trolox (mL)
1,25
2,5
3,75
5
6,25
7,5
C2: Diluciones
de trolox [mM]
0,5
1
1,5
2
2,5
3
V2: Volumen total en
el balón aforado (mL)
10
10
10
10
10
10
Para la preparación de la reacción de ABTS•+, se realizó lo siguiente: en una cubeta se tomó 3
mL de la solución de ABTS•+ y se agregó 30µL de cada una de las disoluciones de trolox, se
agitó constantemente por un minuto. Se dejó reposar las soluciones por 6 minutos (Mareček et
al., 2017). Se encendió el Espectrofotómetro Genesis 10 UV-Vis Scanning Thermo Fisher
Scientific. Para analizar la muestra se seleccionó una longitud de onda a 734 nm en el
espectrofotómetro. Se verificó que este en absorbancia. Luego se colocó agua destilada en la
cubeta y celda respectiva, se realizó la lectura correspondiente presionando “Medir blanco”. Se
incorporaron las cubetas en cada celda y hacer la lectura respectiva, para cada concentración a
analizar(G. L. Chen, Chen, Xiao, & Fu, 2018).
Posteriormente se realizó la curva de calibración para determinar la capacidad antioxidante
expresada como TEAC o mM Trolox (Absorbancia vs. mM Trolox). Con las absorbancias
obtenidas se calculó el porcentaje de inhibición con la siguiente ecuación:
%𝐼 =
𝐴𝑜 −𝐴𝑒
𝐴𝑜
∗ 100 Ec. 4
Donde:
Ao = Absorbancia del blanco de ABTS•+
49
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Ae = es la absorbancia de cada una de las soluciones que contienen Trolox (o de cualquier otra
muestra que se desee analizar).
5.6.2.
Determinación de componentes por cromatografía HPLC a los extractos con
mayor contenido de fenoles totales en Eneldo (Anethum graveolens L.)
y Paico
(Chenopodium ambrosioides L.) obtenidos por ultrasonido.
5.6.2.1.Preparación de la muestra para cuantificación de los compuestos fenólicos
(Clorogénicos y ácidos hidroxicinámicos) por HPLC-UV.
5.6.2.2.Condiciones cromatográficas.
El perfil cromatográfico se realizara en un equipo HPLC Waters Breeze equipado con una
columna X-Terra, Waters C18 (250 mm x 4,6 mm x 3,5μm) para separar los diferentes ácidos, el
detector un PDA a 254 y 330 nm, Inyector: Loop de 20 μL. Rheodhyne 7525I. Se utilizarón dos
solventes para la fase móvil, Acetonitrilo: Agua acidificada a pH 2,5 x|, la inyección de los
extractos filtrados se realizó con acrodiscos de jeringa GHP (Pall) de 0,45 μm. El flujo se debió
ajustar a 1mL/min y la detección se efectuara a 354 nm UV para los ácidos hidroxicinámicos y
360 nm UV para los ácidos clorogénicos (Stan et al., 2014; Tarmidi et al., 2005).
50
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Determinación de la composición químico proximal de Eneldo (Anethum graveolens
L.) y Paico (Chenopodium ambrosioides L.)
Una vez desarrollada la metodología expuesta para determinación de porcentaje de humedad,
cenizas e Índice de Color (Anexo E) se obtuvieron lo siguiente resultados:
Tabla 5. Resultados de la composición químico proximal del Eneldo y Paico.
Planta
Eneldo
Paico
% Humedad
promedio
80,7 % ± 0,015
67,1 % ± 0,044
% Cenizas
promedio
3,4 % ± 0,001
4,9 % ± 0,021
Índice de Color
promedio
-17,4719842 ± 4,7
-7,32123831 ± 0,44
Para Eneldo se determinó una humedad del 80,7 %, presentando una minima diferencia a los
resultados obtenidos por Madhava, Vedashree, Satapathy, Khanum, Ramsamy y Umesh (2015)
en su estudio de los efectos del método de secado sobre hojas de eneldo, en la cual obtuvieron
una humedad del 85%, usando un secador de flujo continuo (velocidad del aire de 1,3 m / s) con
controlador de temperatura y secado se llevó a cabo a 50 ± 2 C, 58-63% de HR.
Para paico (Chenopodium ambrosioides L.) se encuentran humedades de aproximadamente 58
% (Callan et al., 2007), valor obtenido en Callao, Perú, donde se registra una temperatura
minima promedio de 21 °C, comparando con el resultado obtenido en esta investigación se tiene
una diferencia de 9,1 %, diferencia debida principalmente a que la temperatura minima promedio
registrada en Genoy, Nariño, es de 8 °C . Siendo este es un factor importante al considerar el
porcentaje de humedad, afectando directamente los resultados ya que esto se encuentra
directamente relacionado con el % de humedad relativa (Viloria, 2007).
51
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Figura 4. Prueba de humedad de Eneldo y Paico.
Fuente: Esta investigación.
Para cenizas en eneldo, se obtuvo en promedio un porcentaje de 3.4, el cual comparado con
diferentes autores (Słupski, Lisiewska, & Kmiecik, 2005; Stan et al., 2014), reportan resultados
de 2,06 % y 9,8%; el valor obtenido en esta investigación se encuentra dentro de este rango, sin
embargo la variación en los resultados puede deberse a la cantidad de minerales absorbidos por
las plantas y el estado nutricional del suelo, teniendo en cuenta lo anterior, hay que manifestar
que los suelos del corregimiento de Genoy se clasifican como Typic Melanudands, el cual es un
tipo de suelo ligeramente ácido (Genoy, Castillo, & Bacca, 2013), esta propiedad influye en la
absorción de numerosos elementos nutritivos por parte de la planta, tales como Calcio, Magnesio,
Fósforo, Hierro, entre otros elementos, finalmente se sabe que este tipo de características se ven
reflejadas en los extractos de la investigación en cuanto a su composición (Lora, 2010; Pardos,
2004)
En Paico el % promedio de cenizas obtenido en esta investigación fue 4,9 %, y en un estudio
realizado por Ibarra y Paredes (2013) se encontró que este se encuentra en 2,8 %, además de los
factores anteriormente mencionados, la variación de los resultados en esta característica puede
deberse a factores ambientales, como temperatura y % humedad relativa. Se tiene en cuenta que
el porcentaje de cenizas o minerales en las plantas aromáticas está entre 2 y 5% (Ibarra &
Paredes, 2013).
52
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Figura 5. Prueba de cenizas de Eneldo y Paico.
El Índice de Color calculado para Eneldo se encuentra en un rango de -20 a -2, esto significa
un color Verde Profundo por su resultado de -17,472. De acuerdo con el estudio realizado por
Madhava (2015), se obtuvieron resultados para coordenadas CIELAB de L, a*, b* de 30,4; 8,9;
11,9; respectivamente, obteniendo un Índice de Color de aproximadamente de -24,6. La
diferencia en los valores se pudo deber a la edad de la planta utilizada en cada estudio, ya que en
esta investigación se obtuvo un Índice de Color mayor al de Madhava, debida a la concentración
de compuestos clorofílicos (Gordillo et al., 2016).
El índice de color para paico se encuentra en un rango de -20 a -2, el resultado obtenido en
esta investigacion fue de -7,32 indicando un Verde Amarillento. Según el estudio realizado por
(R. García, Lemus, Rivera, & Erazo, 1997) , el Índice de Color del Paico fue de -17
aproximadamente, la variación significativa está en el valor de a* (rango del verde), se analiza
que esto puedo suceder debido a la deficiencia de Hierro (clorosis férrica) en la muestra tomada
en esta investigación la cual se pudo identificar por el color amarillamiento de las hojas
(Barbazán, 1998; Jimenez, Arizmendi, & Cabrera, 1988) .
Por otro lado, de acuerdo al contenido de clorofila de la planta, no solo se influencia el color,
sino que también afecta en el porcentaje de humedad. Se sabe que los pigmentos clorofílicos son
con toda seguridad el pigmento biológico más abundante en la tierra y debe su color verde a su
capacidad de absorber las fracciones roja y azul de la luz solar, transmitiendo los demás colores
53
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
cuya mezcla se aprecia en diversos tonos de verde. Las hojas pueden llegar a contener hasta 1 g
de clorofila m─2 (varia entre especies), esta concentración depende, entre otros factores, del
estado nutricional, la edad o la historia lumínica previa de la planta (Sarwar et al., 2010). La
clorofila presenta una cabeza hidrofílica, por esta razón la planta contiene menor porcentaje de
humedad cuando la concentración de clorofila aumenta (colores fuertes de verde) (Martinazzo,
Silva, Bianchi, & Bacarin, 2012).
Figura 6. Colorimetría de Eneldo y Paico.
6.2. Obtención de extractos acuosos, etanolicos y metanolicos de eneldo (Anethum
graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.) por el método de maceración
Teniendo en cuenta el diseño iirestrictamente al azar, palnteado en la metodología, las
maceraciones se conservaron por 7 días con agitación esporádica, para luego ser sometidos a
filtración al vacio en kitasato y centrifugación a 5.500 rpm durante 10 minutos a 10°C con el fin
de separar el material particulado de los extractos, realizado este procedimiento se almacenaron
de forma rigurosa para su posterior análisis.
54
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Figura 7. Método de Maceración.
Figura 8. Centrifugación de los extractos.
Fuente: Esta investigación.
6.2.1.
Determinación del contenido de fenoles totales en los extractos de eneldo
(Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.), obtenidos mediante la
tecnología de extracción por maceración con 3 solventes diferentes. se realizó la curva de
calibración de ácido gálico con concentraciones de 25, 50, 100, 150, 250 y 500 ppm, dando como
resultado los siguientes resultados de absorbancia a 764 nm.
Tabla 6. Resultados de absorbancia de ácido gálico para la Curva de calibración
Ac. Gálico (ppm)
25
50
100
150
250
Absorbancia (764 nm)
0,047
0,108
0,158
0,241
0,371
55
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
500
0,668
A partir de la curva de calibración se obtuvo una regresión lineal con la siguiente ecuación:
𝑦 = 0,0013𝑥 + 0,0352 Ec. 5
Con un R2 de 0,9961, la anterior ecuación se la utilizó para conocer la concentración de
compuestos fenólicos totales en cada muestra de extractos de las dos plantas con los diferentes
solventes, despejando X, la ecuación se transforma en:
𝑥=
𝑦−0,0352
0,0013
Ec. 6
Grafico 1. Curva de calibración del Ácido Gálico.
0,8
Absorbancia, 764 nm
0,7
0,668
0,6
0,5
0,4
0,371
0,3
0,241
0,2
0,158
0,108
0,047
0,1
0
0
100
200
300
400
500
600
ppm de Ácido Gálico
Fuente:Esta investigación.
Tomando como referencia la curva de calibración obtenida por Cruz (2015), en donde obtuvo
como resultado un R2 de 0,990428, la variación de los resultados no es significativa, aunque se
podría justificar por la cantidad de diluciones de ácido gálico observadas, ya que en esta
investigación se determinaron 6 (25, 50, 100, 150, 250 y 500 ppm) y en la de Cruz se utilizó 5
(50, 100, 150, 250 y 500 ppm). Con el valor obtenido en esta investigación, se procedio a
56
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
interpolar con el propósito de calcular los valores de fenoles totales presentes en los diferentes
extractos obtenidos de eneldo (Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.).
Siguiendo la metodologia anteriormente descrita para la elaboración de la curva patrón, se
procedio a prepar las diluciones de polifenoles de los extractos, usando reactivo de Folin,
carbonato sódico al 7,5% (Na2CO3) y los extractos acuosos, etanolicos y metanolicos de eneldo
(Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.) obtenidos por maceracion.
obtenidos los siguientes valores de absorbancia:
Tabla 7. Contenido de fenoles totales en los extractos acuosos, etanolicos y metanolicos de
eneldo (Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.), obtenidos por
maceracion.
Plantas
Eneldo
Fenoles Totales
Absorbancia
Concentración
(764 nm)
(mg AG/L)
Etanol
0,461
327,5384615
13,10153846
1310,153846
PROMEDIO
0,459
326
13,04
1304
DESVIACIÓN
0,001779513
1,368856186
0,054754247
5,475424745
%CV
0,39%
0,42%
0,42%
0,42%
Metanol
0,6155
446,3846154
17,85538462
1785,538462
PROMEDIO
0,643
467,5384615
18,70153846
1870,153846*
DESVIACIÓN
0,032921624
25,32432623
1,012973049
101,2973049
%CV
5%
5%
5%
5%
Agua D.
0,5355
384,8461538
15,39384615
1539,384615
PROMEDIO
0,53825
386,9615385
15,47846154
1547,846154
DESVIACIÓN
0,002901149
2,231653229
0,089266129
8,926612916
%CV
1%
1%
1%
1%
Etanol
0,596
431,3846154
17,25538462
1725,538462
PROMEDIO
0,62275
451,9615385
18,07846154
1807,846154
DESVIACIÓN
0,031760825
24,43140379
0,977256152
97,72561516
%CV
5%
5%
5%
5%
Metanol
0,673
490,6153846
19,62461538
1962,461538
PROMEDIO
0,680375
496,2884615
19,85153846
1985,153846*
DESVIACIÓN
0,008518363
6,552586553
0,262103462
26,21034621
%CV
1%
1%
1%
1%
Solvente
(mg AG/g de
muestra)
Fenoles Totales (mg
AG/100g de muestra)
Paico
57
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Agua D.
0,4055
284,8461538
11,39384615
1139,384615
PROMEDIO
0,4055
284,8461538
11,39384615
1139,384615
DESVIACIÓN
0,000408248
0,314037147
0,012561486
1,256148586
%CV
0,10%
0,11%
0,11%
0,11%
* Muestra con mayor contenido de fenoles totales.
Fuente: Esta investigación.
6.2.2. Análisis de resultados.
6.2.2.1. Analisis de varianza para la evaluación del solvente en función de la cantidad de
fenoles totales para los extractos de eneldo(Anethum graveolens L.) obtenidos por
maceracion
Tabla 8. Análisis de varianza para eneldo - maceracion
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V.
SC
Modelo.
Solvente
Error
Total
gl CM
645164,5 2
322582,25
645164,5 2
322582,25
31112,43 9
3456,94
676276,92 11
Fuente: Esta investigación.
F
p-valor
93,31 <0,0001
93,31 <0,0001
Tabla 9. Prueba de tukey para α=0.05
Error:
Solvente
Etanol
Agua_D
3456,9362
gl: 9
Medias
n E.E.
1304 4 29,40 A
1547,85 4 29,40 B
1870,15 4 29,40
C
Metanol
Medias con una letra común no son significativamente diferentes (p > 0,05)
Fuente: Esta investigación
El uso de diferentes solventes como factores para evaluar la extracción de compuestos
fenólicos en eneldo, permitio determinar que existen diferencias significativas entre cada solvente
utilizado en la maceracion con respecto a la cuantificación de fenoles totales (mg AG/100g de
58
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
muestra) al final del proceso. El grafico 2, representa de manera mas clara la incidencia de los
factores sobre la respuesta.
El metanol debido a tener una mayor polaridad que el etanol 70% v/v y agua destilada, tendrá
la capacidad de extraer compuestos que tengan igual polaridad, en este caso compuestos
fenólicos, (Vergara-Salinas, Cuevas-Valenzuela, & Pérez-Correa, 2015) aseguran que la
polaridad de los solventes cambia con la temperatura. Diversos disolventes tales como metanol,
etanol, metanol acuoso, etanol acuoso, metanol acuoso ácido y etanol acuoso ácido, 1-propanol
acuoso, acetona acuosa se usan comúnmente . Siguiendo la regla de oro en la selección de
solventes (es decir, 'like disolve like'), las consideraciones principales son la polaridad del
solvente y el tipo de fitoquímicos. Los solventes polares como agua, etanol, ácido acético, etc.
son los mejores para extraer compuestos polares(Panja, 2017).
Madhava et al (2016), evaluaron la eficiencia de metanol, etanol e isopropanol en la extracción
de compuestos fenólicos en eneldo, encontrando de que en ese orden se obtuvo mayor cantidad
de polifenoles 44 ± 1.64, 38 ± 1.63, 28 ± 1.63 equivalentes de ácido gálico, respectivamente. Si
bien es cierto se encuentran diferencias significativas en la cantidad de polifenoles extraidos en
esta investigación (1870,15 mg AG/100g de muestra) y las obtenidas por Madhava y
colaboradores (3452 mg / 100 g demuestra), fue el metanol el que mejor rendimiento presento.
Grafico 2. Evaluación del tipo de solvente sobre la extracción de polifenoles en eneldo.
2500,00
mg_AG.100g-1
2000,00
1500,00
1000,00
500,00
0,00
Etanol
Metanol
Agua_D.
Fuente: Esta investigación.
59
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Para la familia Anethum se reporta en literatura resultados para polifenoles, inferiores en
comparación con los obtenidos en la presente investigación; según Nagy y colaboradores (2014),
en un estudio realizado empleando la misma especie (Anethum graveolens) obtuvieron fenoles
totales en una concentración de 773,14 mg AG/100 g de muestra, por otro lado, Rekha (2008),
obtuvieron polifenoles en concentracion de 540 mg GA/100 g de muestra; utilizando como
método de extracción maceracion en frio.
Teniendo en cuenta lo anterior, se selecciono el solvente metanol para proceder hacer la
extracción asistida por ultrasonido para el material vegetal eneldo.
6.2.2.2.Analisis de varianza para la evaluación del solvente en función de la cantidad de
fenoles totales para los extractos de paico (Chenopodium ambrosioides L.) obtenidos
por maceracion
Tabla 10. Análisis de varianza para maceracion - paico
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC tipo III)
F.V.
SC
Modelo.
1591472,58
1591472,58
30716,57
1622189,15
Solvente
Error
Total
gl CM
F
p-valor
2
795736,29
233,15 <0,0001
2
795736,29
233,15 <0,0001
9
3412,95
11
Tabla 11. Prueba de tukey para α=0.05
Test:Tukey Alfa=0,05 DMS=115,33640
Error: 3412,9520 gl: 9
Solvente
Agua_D
Etanol
Metanol
Medias
n E.E.
1139,38 4 29,21 A
1807,85 4 29,21 B
1985,15 4 29,21
C
Fuente: Esta investigación.
Al igual que en eneldo, para paico, entre solventes se presentan diferencias significativas con respecto
a lar eficiencia en la extracción de polifenoles, siendo el metanol el de mejor comportamiento, dado las
características ya mencionadas para el caso de eneldo, sin embargo en paico,el agua tuvo una menor
eficiencia que el etanol, caso contrario a lo sucedido para eneldo, y la diferencia entre etanol y metanol no
fue tan amplia como la presentada en la maceracion de eneldo.
60
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Para la familia Chenopodium se encontró que los resultados obtenidos en esta investigación
son mayores en comparación a los obtenidos con otras especies de la misma familia. Tomando
como referencia murale, quinoa Willd y pallidicaule, los estudios realizados con estas plantas
obtuvieron valores de 81 mg AG/100 g de muestra, 792 mg AG/100 g de muestra y 1.400 mg
AG/100 g de muestra, respectivamente, en estas investigaciones las muestras fueron obtenidas
por el método convencional con diferentes solventes también como las mezclas de estos (Abdelaziz, Shaheen, El-Nekeety, y Abdel-Wahhab, 2013; Abderrahim et al., 2015; Abderrahim et al.,
2012).
Grafico 3. Evaluación del tipo de solvente sobre la extracción de polifenoles en paico.
2500,00
mg_AG.100g-1
2000,00
1500,00
1000,00
500,00
0,00
Etanol
Metanol
Agua_D.
Fuente: Esta investigación.
Se pudo observar que existe una diferencia en cuanto a los resultados de la composición de
polifenoles en los diferentes extractos obtenidos en las dos plantas en estudio, ya que el solvente
que mayor compuestos fenólicos arrastró fue el Metanol, seguido del Etanol y finalmente el Agua
Destilada, donde se evidencia que la diferencia en cuanto a cantidad de fenoles totales extraídos,
se puede deber a la polaridad de los solventes y su afinidad con los componentes, en este caso
con los fenoles tal como lo registra Cruz ( 2015).
Los resultados obtenidos en esta investigación son superiores a los encontrados en literatura
tanto para eneldo (Anethum graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.), esto podría
verse influenciado por el estado nutricional del suelo que provee de alimento a las plantas que se
61
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
utilizaron para este estudio, además de las familias de las especies empleadas en esta
investigación son ricas en compuestos fenólicos (Abdel-aziz et al., 2013).
Grafico 4. Comparación de la eficiencia de los solventes, sobre la extracción de polifenoles en
eneldo y paico.
2500,00
mg_AG.100g-1
2000,00
1500,00
1000,00
500,00
0,00
Etanol
Metanol
Eneldo (mg_AG.100g-1)
Agua_D.
Paico (mg_AG.100g-1)
Fuente: Esta investigación.
El extracto etanólico de eneldo obtuvo los valores mas bajos de contenido de compuestos
fenólicos (1304 mg AG/100g de muestra); para el Paico, el solvente que arrastró menor contenido
de compuestos fenólicos fue el agua destilada (1139,38 mg AG/100g de muestra), por el
contrario el solvente con mayor extracción de compuestos fenólicos en ambos especies vegetales
fue el Metanol 1870,15 mg AG/100g de muestra,para eneldo y 1985,15 mg AG/100g, para
paico,
selecciononandose para efectuar la extracción asistida por ultrasonido para los dos
materiales vegetales objetos de este estudio.
6.2.2.3.Caracterizacion tentativa de los extractos de Eneldo y Paico obtenidos por maceracion
con mayor contenido de fenoles por cromatografía HPLC a 360nm
Tabla 12. Resultados del análisis de cromatografía.
Longitudes de Onda
Identificación tentativa
Máxima (nm)
de Flavonoides
Paico
---------------------
NI*
0
Eneldo
254-360
Identificación
2
Muestra No.
muestra
1
2
No. de Picos
Fuente: Esta investigación.
62
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
6.2.2.4. Composición de Eneldo
Figura 9. Cromatograma de extracto de Eneldo obtenido a partir de Maceración
Fuente: Esta investigación.
6.2.2.5.Composición de Paico
Figura 10. Cromatograma del extracto de Paico obtenido a partir de Maceración
Fuente: Esta investigación.
De acuerdo a los tiempos de retención y a la técnica utilizada, los picos detectados
corresponderían tentativamente a flavonoides, en un estudio realizado por Barros et al( 2013), Se
detectaron 35 compuestos, ocho de los cuales fueron derivados de ácido fenólico, derivados de
ácido hidroxicinámico, derivados del ácido p-cumaroil, derivados de ácido fenólico, derivados de
ácido ferúlico y flavonoides tales como, Quercetina y Kaempferol (Barros et al., 2013), por lo
cual se podría deducir que para los extractos metanolicos de paico y eneldo obtenidos por
maceración son Quercetina y Kaempferol, los picos detectados.
63
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
6.2.3. Extracción asistida por ultrasonido de compuestos fenólicos presentes en los
extractos metanolicos de eneldo (Anethum graveolens L.).
Ejecutando el diseño
experimental planteado en la metodología se análizo estadísticamente los resultados con
el objetivo de aceptar o rechazar las hipótesis formuladas.
Tabla 13. Cuantificación de fenoles totales por la técnica asistida por ultrasonido a diferentes
condiciones de extracción para eneldo (Anethum graveolens L.).
ENSAYO
1
2
3
4
5
1
FRECUENCIA
(KHZ)
TIEMPO
(MIN)
FENOLES TOTALES
(mgAG/g muestra)
FENOLES TOTALES
(mgAG/100g muestra)
80
PROMEDIO
DESVIACIÓN
%CV
37
PROMEDIO
DESVIACIÓN
%CV
80
PROMEDIO
DESVIACIÓN
%CV
37
PROMEDIO
DESVIACIÓN
%CV
80
PROMEDIO
DESVIACIÓN
%CV
37
PROMEDIO
DESVIACIÓN
%CV
45
16,4185
16,6821
0,5135
3,08%
19,9631
19,5867
0,5464
2,79%
19,0523
18,8410
0,1836
0,97%
18,8246
18,6564
0,1558
0,84%
17,8923
17,2277
0,6724
3,90%
17,5754
17,4779
0,1054
0,60%
1642
1668
51
3,08%
1996 *
1959
55
2,79%
1905
1884
18
0,97%
1882
1866
16
0,84%
1789
1723
67
3,90%
1758
1748
11
0,60%
45
15
30
30
15
* Muestra con mayor contenido de Fenoles Totales
Fuente: Esta investigación.
Para la evaluación y validación estadística del diseño experimental, se introdujeron los
resultados obtenidos en el software Infostat/L® y se realizo un análisis de varianza de la cantidad
64
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
de fenoles totales para cada uno de los efectos, probando la significancia estadística de cada
efecto comparando su cuadrado medio contra un estimado del error experimental (Díaz, 2009).
Tabla 14. Análisis de Varianza para el diseño experimental de Fenoles Totales del extracto de
Eneldo obtenido por la técnica asistida por ultrasonido.
Fuente
A:Frecuencia
B:Tiempo
AB
BB
Falta de ajuste
Error puro
Total (corr.)
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
44302,7
1
44302,7
24,68
0,0003
21,3333
1
21,3333
0,01
0,9150
136533,
1
136533,
76,07
0,0000
1681,0
1
1681,0
0,94
0,3523
4312,11
1
4312,11
2,40
0,1471
21538,0
12
1794,83
208389,
17
Fuente: Esta investigación.
A continuación, se presentan las gráficas de pareto y efectos principales donde se evidencia
que la variacion de frecuencia y la interaccion de frecuencia y tiempo en los diferentes niveles
evaluados presentaron diferencias significativas con relación a la cantidad de polifenoles
cuantificados para el extracto de eneldo, los cuales se indican en la figura 2 y 3.
Grafico 5. Diagrama de Pareto estandarizado para Fenoles Totales en el extracto de Eneldo
obtenido a partir de la técnica asistida por ultrasonido.
Fuente: Esta investigación.
65
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Grafico 6. Efectos principales para fenoles totales en el extracto de Eneldo obtenido a partir
de la técnica asistida por ultrasonido.
Fuente: Esta investigación.
Según los resultados obtenidos se encontró que la frecuencia y la interaccion de esta con el
tiempo, obtuvieron un valor de P menor a 0,05, mostrando influencia significativa sobre el
contenido de fenoles totales en los extractos de Eneldo.
Se incluyó la prueba de falta de ajuste para determinar si el modelo seleccionado es adecuado
para describir los datos. La prueba se realizó comparando la variabilidad de los residuos del
modelo actual con la variabilidad entre observaciones obtenidas en condiciones repetidas de los
factores. Dado que el valor-P para la falta de ajuste en la tabla ANOVA es mayor que 0,05, el
modelo parece ser adecuado para los datos observados al nivel de confianza del 95,0%,
generandose la ecuación del modelo ajustado así:
𝐹𝑒𝑛𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 = 1433,36 + 7,61499 ∗ 𝐹𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 + 13,7933 ∗ 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 − 0,330749 ∗
𝐹𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 ∗ 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 + 0,0911111 ∗ 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 2 Ec. 7
6.2.4. Extracción asistida por ultrasonido de compuestos fenólicos presentes en los
extractos metanolicos de paico (Chenopodium ambrosioides L.). Ejecutando el diseño
66
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
experimental planteado en la metodología se análizo estadísticamente los resultados con
el objetivo de aceptar o rechazar las hipótesis formuladas.
Tabla 15. Cuantificación de fenoles totales por la técnica asistida por ultrasonido a diferentes
condiciones de extracción para paico (Chenopodium ambrosioides L).
BLOQUE
FRECUENCIA TIEMPO FENOLES TOTALES FENOLES TOTALES
(KHZ)
(MIN)
(mgAG/g muestra)
(mgAG/100g muestra)
1
80
45
17,0554
PROMEDIO
16,8369
DESVIACIÓN
0,1931
%CV
1,15%
2
37
45
19,2277
PROMEDIO
19,1344
DESVIACIÓN
0,1262
%CV
0,66%
3
80
15
18,9600
PROMEDIO
18,8697
DESVIACIÓN
0,0782
%CV
0,41%
4
37
30
18,8769
DESVIACIÓN
0,2671
PROMEDIO
18,6523
%CV
1,43%
5
80
30
17,8615
PROMEDIO
17,5251
DESVIACIÓN
0,5536
%CV
3,16%
6
37
15
17,7662
PROMEDIO
17,5718
DESVIACIÓN
0,1684
%CV
0,96%
* Muestra con mayor contenido de Fenoles Totales
1706
1684
19
1,15%
1923 *
1913
13
0,66%
1896
1887
8
0,41%
1888
27
1865
1,43%
1786
1753
55
3,16%
1777
1757
17
0,96%
Fuente: Esta investigación.
67
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Para la evaluación y validación estadística del diseño experimental, se introdujeron los
resultados obtenidos en el software Infostat/L® y se realizo un análisis de varianza de la cantidad
de fenoles totales para cada uno de los efectos, probando la significancia estadística de cada
efecto comparando su cuadrado medio contra un estimado del error experimental (Cruz, 2015).
Tabla 16. Análisis de Varianza para el diseño experimental de Fenoles Totales del extracto de
Paico obtenido por la técnica asistida por ultrasonido.
Fuente
A:Frecuencia
B:Tiempo
AB
BB
Falta de ajuste
Error puro
Total (corr.)
Suma de Cuadrados Gl Cuadrado Medio Razón-F Valor-P
22613,6
1
22613,6
29,20
0,0002
1633,33
1
1633,33
2,11
0,1721
96481,3
1
96481,3
124,58 0,0000
7,11111
1
7,11111
0,01
0,9252
3927,11
1
3927,11
5,07
0,0438
9293,33
12
774,444
133956,
17
Fuente: Esta investigación.
El factor frecuencia y la interaccion de este con el tiempo presentan valores de P inferiores a
0,05,estableciéndose de esta manera la influencia significativa de estos sobre el contenido de
fenoles totales en los extractos de Paico.
se presentan las gráficas de pareto y efectos principales donde se evidencia que la variacion de
frecuencia y la interaccion de frecuencia y tiempo en los diferentes niveles evaluados presentaron
diferencias significativas con relación a la cantidad de polifenoles cuantificados para el extracto
de eneldo, los cuales se indican en la figura 4 y 5.
Grafico 7. Diagrama de Pareto estandarizado para Fenoles Totales en el extracto de Paico
obtenido a partir de la técnica asistida por ultrasonido.
68
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Grafico 8. Efectos principales para fenoles totales en el extracto de Paico obtenido a partir de
la técnica asistida por ultrasonido.
Fuente: Esta investigación.
A traves de la prueba de falta de ajuste se pudo determinar si el modelo seleccionado es
adecuado para describir los datos observados ó si se debería usar un modelo más ajustado. Dado
que el valor-P para la falta de ajuste en la tabla ANOVA es menor que 0,05, existe una falta de
ajuste estadísticamente significativa con un nivel de confianza del 95,0%. Esto significa que el
modelo así ajustado no representa adecuadametne a los datos. Según lo anterior la ecuación del
modelo ajustado es la siguiente:
𝐹𝑒𝑛𝑜𝑙𝑒𝑠 𝑇𝑜𝑡𝑎𝑙𝑒𝑠 = 1446,16 + 6,69251 ∗ 𝐹𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 + 15,1318 ∗ 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 − 0,278036 ∗
𝐹𝑟𝑒𝑐𝑢𝑒𝑛𝑐𝑖𝑎 ∗ 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 + 0,00592593 ∗ 𝑇𝑖𝑒𝑚𝑝𝑜 2 Ec. 8
En condiciones de frecuencia 37 KHz y tiempo de 45 minutos se presentaron los mejores
resultados en cuanto a cuantificación de polifenoles en eneldo(Anethum graveolens L.) y
paico(Chenopodium Ambrosiodes L) como se evidencia en la tabla 13.
69
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Tabla 17. Contenido de fenoles totales en los extractos de Eneldo y Paico, extracción asistida
por ultrasonido a unas condiciones de 37 KHz y 45 minutos.
Plantas
ENELDO
PAICO
Fenoles totales
Fenoles totales
(mg AG/g
(mg AG/100g
muestra)
muestra)
499,08
19,9631
1.996 *
0,680
495,92
19,8369
1.984
3
0,651
474,00
18,9600
1.896
1
0,659
479,62
19,1846
1.918
2
0,660
480,69
19,2277
1.923 *
3
0,652
474,77
18,9908
1.899
Absorbancia
Concentración
(765 nm)
(mg AG/L)
1
0,684
2
Muestra
* Muestras obtenida con mayor contenido de fenoles totales.
Fuente: Esta investigación.
Para el caso del extracto de Eneldo se obtuvieron 1.996 mg AG/100g de muestra y para el
Paico se obtuvo 1.923 mg AG/100g de muestra bajo las condiciones de extracción de 37 KHz y
45 minutos.
Con respecto a los valores obtenidos por la extracción convencional con el mismo solvente
(Eneldo: 1.879,15 mg AG/100g de muestra; Paico: 1.985,15 mg AG/100g de muestra), se
determinó que la variación no es significativa con P<0,05, ya que los valores obtenidos con la
extracción asistida por ultrasonido son aproximados a los obtenidos con la extracción por
maceración.
El mayor contenido de fenoles se obtuvo con el método de extracción asistida por ultrasonido,
en comparación con los métodos convencionales, en el cual intervienen factores como la
preparación y naturaleza de la muestra, el tamaño de partícula, así como el tipo de solvente; otros
parámetros importantes influyentes en el rendimiento de compuestos fenólicos extraídos son el
tiempo y la temperatura, donde el aumento de estos factores favorecen la extracción de estos
compuestos (Khoddami, Wilkes, & Roberts, 2013). Además se debe tener en cuenta que la
potencia en este método de extracción asistido por ultrasonidos es uno de los parámetros claves
70
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
para mejorar la eficiencia de la extracción mediante la ruptura de la estructura celular de la planta
para extraer contenido de fenoles totales (Sharmila et al., 2016).
Según un estudio realizado por Proestos y colaboradores (2005), en el que analizaron
compuestos fenólicos de extractos de plantas y evaluacion de su capacidad antioxidante y
actividad antimicrobiana, obtuvieron 1.250 mg AG/100g de muestra en el extracto de Eneldo
(Proestos, Chorianopoulos, Nychas, & Komaitis, 2005), el cual presenta una diferencia
considerable al obtenido en esta investigación, probablemente debido al metodod e extracción
utilizado y al origen, edad, condiciones edafoclimaticas y de nuticion del eneldo y paico.
Barros y colaboradores (2013) en su estudio sobre Bioactividad y caracterización química en
compuestos hidrófilos y lipófilos de Chenopodium ambrosioides L., obtuvieron 823 mg AG/100
g de muestra seca de fenoles totales en el extracto de Paico, presentándose
diferencias
significativas entre los resultados obtenidos en esta investigación y el estudio citado, debida a
diferentes factores como origen del material vegetal, ya que la investigación citada fue realizada
en Portugal, donde existen diferentes condiciones edafoclimáticas, el método de extracción
empleado (liofilización); pudiendo ser estas condiciones determinantes sobre la cantidad de
fenoles totales obtenidos; el estado de madurez de la planta y la zona de cultivo, y el hecho de
utilizar plantas jovenes, es decir que fueron cosechadas una semana después de floracion , las
cuales cuentan con mayor capacidad de absorción de nutrientes, además de esto se debe recordar
el tipo de suelo del cual se escogieron las muestras de las plantas en estudio, el cual es un suelo
ligeramente ácido lo que influye en los elementos absorbidos por la planta en su proceso de
maduración, donde elementos nutritivos como Calcio, Magnesio, Fósforo, Hierro, entre otros,
estarían en mayor presencia en la planta (Sánchez, 2007).
En el estudio realizado por (Sulaiman, Sajak, Ooi, Supriatno, & Seow, 2011) se pudo concluir
que el agua destilada fue el solvente que presento menores rendimientos en la extracción de
polifenoles de 37 especies vegetales, se podría inferir que esto se debe a la oxidación de los
fenoles totales por la polifenol oxidasa, activa en el medio acuoso, mientras que en los extractos
de metanol, etanol y acetona la enzima se encuentra inactiva. Esto se podría relacionarse con los
resultados obtenidos en la presente investigación debido a que el agua arrastró menor cantidad de
fenoles totales en comparación con etanol 70% (v/v) y metanol .
71
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Con respecto a las codiciones en las cuales se obtuvo mayor cuantificacion de contenido
fenólico (menor frecuencia utilizada, 37 KHz, y el mayor tiempo,45 minutos), en un estudio
realizado por Gonzáles-Centeno (2014), afirman que las bajas frecuencias y tiempos mayores
pueden promover a la interrupción de la pared celular requerida, lo cual facilita el acceso de
solvente al contenido celular que intensifica la tasa de transferencia de masa (González-Centeno
et al., 2014).
6.2.5. Caracterizacion tentativa de los extractos de Eneldo y Paico obtenidos por
ultrasonido con mayor contenido de fenoles por cromatografía HPLC a 360nm
6.2.5.1.Composición de Eneldo
Figura 11. Cromatografía de extracto de Eneldo obtenida a partir de la técnica asistida por
ultrasonido.
Fuente: Esta investigación.
Tabla 18. Resultados analisis cromatografico para etracto de eneldo obtenido por ultrasonido
N° Picos
Tiempo de Retención
Área
% Área
1
12.273
464108
5.99
2
13.325
580537
7.49
3
17.879
6709086
86.53
Fuente: Esta investigación.
De acuerdo a los tiempos de retención y a la técnica utilizada, los picos detectados
corresponderían tentativamente a flavonoides, en un estudio realizado por Shyu (2009), se
72
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
lograron identificar en extractos de eneldo, flavonoides y acidos fenólicos tales como: acido
clorogenico (Tr, 16.38), Miricetina (Tr, 30.55), Acido ρ-cumerico (Tr, 22.57), Quercetina (Tr,
32,98) y Kaempferol (Tr, 43.67 min). Justesen y Knuthsen (2001), lograron identificar 3
flavonoides en hojas frescas de eneldo; Quercetina, Kaempferol y Isorhamnetina, a traves de
cromatografía liquida HPLC – DAD.
Teniendo en cuenta lo anterior, se podría llegar a considerar que el pico 3, correspondería a algún
acido fenólico debido al % de área que presenta.
6.2.5.2.Composición del Paico
Figura 12. Cromatografía de extracto de Eneldo obtenida a partir de la técnica asistida por
ultrasonido.
Fuente: Esta investigación.
Tabla 19. Resultados análisis cromatograficopara paico, obtenido por ultrasonido.
N° Picos
Tiempo de Retención(min)
Área
% Área
1
6.080
3457987
3.17
2
6.723
1596859
1.46
3
9.452
12800063
11.73
4
10.227
10834248
9.92
5
11.255
11300275
10.35
6
16.648
27445136
25.14
7
18.350
41733920
38.23
Fuente: Esta investigación.
73
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
En estudios de identificación cromatografica realizados por (Ajaib, Hussain, Farooq, & Ashiq,
2016; States & Wei, 2016; Xu, Wang, Pu, Tao, & Zhang, 2017), se logro identificar arededor de
35 componentes, entre los cuales los de mayor concentración son: Quercetin; Kaempferol y en
menor proporción acidos fenólicos.
El extracto de paico obtenido mediante la técnica de ultrasonido, presentó el mayor número de
picos una vez realizado el análisis cromatografico, presentando un total de 6 picos, los cuales
corresponderían a flavonoides, lo cual coincidiria con lo reportado por Barros y colaboradores
(2013), por su parte la muestra del extracto metanolico de eneldo presento un total de 3 picos,
identificados tentativamente como flavonoides. mediante la técnica de Maceración para el Eneldo
se identificaron 2 picos y para el Paico no se presentó ningún número de picos.
Los flavonoides están entre los más potentes antioxidantes en este tipo de plantas, debido a
que poseen uno ó más de los siguientes componentes estructurales que están involucrados en la
actividad antirradical o antioxidante: un grupo o-difenol en el anillo B, un doble enlace
conjugado en 2-3, con una función oxo en el C4 y grupos hidroxilo en las posiciones 3 y 5,
siendo útiles este tipo de extractos tanto de Eneldo como Paico en los diferentes tipos de
industrias, pero principalmente su aplicación en la industria farmacéutica (Barrón, 2012). Una
dieta rica en frutas y vegetales con alto contenido de polifenoles está asociada con una menor
incidencia de enfermedades cardiovasculares, infarto, cáncer y otras enfermedades crónicas. De
hecho, 7 de 12 estudios epidemiológicos que evaluaron el riesgo de enfermedades
cardiovasculares reportan un efecto protector de los flavonoides atribuido principalmente a su
actividad antioxidante, puesto que el hecho común de estas patologías es un desbalance oxidativo
(Londoño, 2011).
6.2.6. Evaluación de la actividad antioxidante in vitro d-e los extractos de eneldo (Anethum
graveolens L.) y paico (Chenopodium ambrosioides L.), con mayor contenido de
fenoles totales. Una vez realizada la curva patron con el antioxidante análogo Trolox (6hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid), en concentraciones de 0; 0,5; 1;
1,5; 2; 2,5; 3 y 4 mM, se obtuvo los siguientes valores de absorbancia:
Tabla 20. Resultados de absorbancia según la concentración de Trolox.
74
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Trolox (mM) Abs (734 nm)
0
0,691
0,5
0,613
1
0,553
1,5
0,463
2
0,421
2,5
0,351
3
0,272
4
0,131
Fuente:Esta investigación.
A partir de los datos registrados se obtuvo la siguiente gráfica con su respectiva regresión
lineal y el porcentaje de variación:
Grafico 9. Curva de Calibración de Trolox.
Absorbancia, 734 nm
Curva de Calibración
0,80,691
0,6
0,613
0,553
y = -0,138x + 0,6871
R² = 0,9977
0,463 0,421
0,4
0,351
0,272
0,131
0,2
0
0
1
2
3
4
5
mM Trolox
Fuente: Esta investigación.
Al realizar la regresión lineal se obtuvo la siguiente ecuación
𝑌 = −0,138 ∗ 𝑋 + 0,6871 Ec. 9
De la cual se despejó X para conocer la concentración de Trolox en mM para cada una de las
muestras seleccionadas anteriormente, siendo Y
la absorbancia de la muestra y X la
concentración en TEAC o mM de Trolox de la muestra.
𝑋=
𝑌−0,6871
−0,138
Ec. 10
Evidenciado en la gráfica 6, se puede ver que la curva de calibración presentó una alta
linealidad con un R2 de 0,9977, por lo tanto la curva elaborada es optima para dar respuesta
75
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
directa a la proporcionalidad de las concentraciones utilizadas, por lo cual se puede realizar una
interpolación para encontrar los valores de la actividad antioxidante correspondiente para cada
uno de los ensayos aplicados a los extractos de eneldo y paico con los dos métodos de extracción
(maceración y ultrasonido) con alta precisión.
Utilizando la ecuación 10 se calculó la concentración en mM de Trolox de los extractos de
Eneldo y Paico, a través de la ecuación 4 se cálculo del porcentaje de inhibición de cada extracto
en función de la absorbancia obtenida, obteniendose los resultados registrados en la tabla 16.
Tabla 21. Resultados de concentración TEAC para los extractos de eneldo y paico.
MÉTODO DE
EXTRACCIÓN
MACERACIÓN
ULTRASONIDO
PLANTA
ENELDO
ENELDO
ENELDO
PAICO
PAICO
PAICO
ENELDO
ENELDO
ENELDO
PAICO
PAICO
PAICO
Resultados
(mg TEAC/ml)
Concentración
Promedio
(mg TEAC/ml)
2,827
2,914
2,865
2,856
4,138
4,175
4,153
4,146
3,783
3,856
3,899
4,059
4,341
4,341
4,346
4,356
Fuente: Esta investigación.
%
Inhibición
Desv.
Std
% CV*
58,33%
0,044
1,55%
83,71%
0,019
0,46%
78,71%
0,143
3,66%
87,52%
0,008
0,19%
Los valores promedio de la actividad antioxidante (mg TEAC/ml) de cada una de las muestras
presentan coeficientes de variación menores al 5 %, valores que se encuentran en los rangos
recomendados para este tipo de análisis(Díaz, 2009).
Grafico 10. Porcentaje de inhibición del radical ABTS de los extractos metanolicos de eneldo
y paico, obtenidos mediante maceración.
76
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
100
80
60
83,71
58,33
40
20
0
Eneldo
Paico
% inhibicion
Fuente: Esta investigación.
En cuanto a la capacidad antioxidante de los extractos de Eneldo, en literatura se reporta
valores de 4,56 mM de Trolox/g de extracto (Shyu, Lin, Chang, Chiang, & Yang, 2009),
evidenciandose que el promedio de la actividad antioxidante del extracto de eneldo obtenido por
maceración (2,865 mM TEAC/g de muestra) es significativamente diferente, mientras que la
actividad antioxidante de los extractos obtenidos por ultrasonido (3,899 mM TEAC/g de muestra)
presentaron valores cercanos a los obtenidos por Shyu en 2009 y significativamente diferentes a
los obtenidos por maceracion.
Con respecto a la capacidad antioxidante de los extractos de Paico, los valores obtenidos por
los dos métodos no presentan diferencia significativa entre los factores evaluados (% cv = 3).
Estudios realizados por Ajaib, (2016) donde evaluaron la capacidad antioxidante de los extractos
de Paico, obtuvieron valores de TEAC para el extracto metanólico de Paico entre 5,3 y 6,5 mM
TEAC/g de muestra, concluyendo que uno de los factores que influencio en los resultados, fue el
método de extracción, donde intervino el porcentaje de rendimiento de estos y la polaridad del
solvente, donde son directamente proporcionales, entre mayor sea la polaridad del solvente,
mayor será el porcentaje de rendimiento; aquí se tiene en cuenta que el índice de polaridad del
solvente utilizado (Metanol) se lo considera alto y por lo tanto el arrastre de los componentes que
intervienen en la capacidad antioxidante es alto, al igual que su rendimiento (Ajaib et al., 2016)
Grafico 11. Porcentaje de inhibición del radical ABTS de los extractos metanolicos de eneldo
y paico, obtenidos mediante ultrasonido.
77
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
100
80
87,52
78,71
60
40
20
0
Eneldo
Paico
% inhibicion
Fuente: Esta investigación.
Con respecto a la capacidad antioxidante de los extractos de Paico, los valores obtenidos por
los dos métodos no presentan diferencia significativa entre los factores evaluados (% cv = 3).
Grafico 12. Comparación de métodos (maceracion y ultrasonido) y extractos /Eneldo y Paico
con respecto al porcentaje de inhibición del radical ABTS.
83,71
87,52
78,71
58,33
Eneldo
Paico
maceracion
Eneldo
Paico
ultrasonido
Fuente: Esta investigación.
Estudios realizados por Ajaib, (2016) donde evaluaron la capacidad antioxidante de los
extractos de Paico, obtuvieron valores de TEAC para el extracto metanólico de Paico entre 5,3 y
6,5 mM TEAC/g de muestra, concluyendo
que uno de los factores que influencio en los
resultados, fue el método de extracción, donde intervino el porcentaje de rendimiento de estos y
la polaridad del solvente, donde son directamente proporcionales, entre mayor sea la polaridad
78
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
del solvente, mayor será el porcentaje de rendimiento; aquí se tiene en cuenta que el índice de
polaridad del solvente utilizado (Metanol) se lo considera alto y por lo tanto el arrastre de los
componentes que intervienen en la capacidad antioxidante es alto, al igual que su rendimiento
(Ajaib et al., 2016; Selen Isbilir & Sagiroglu, 2011)
comparando el porcentaje de inhibición de eneldo y paico con extractos de otras especies
vegetales, se encontró los siguientes valores referenciandos en otras investigaciones:
Tabla 22. Porcentaje de inhibición de extractos de diferentes plantas.
Planta
% Inhibición
Hojas de olivo (Olea europea L.)
91,55 - 94,16 %
Arrayán (Myrcianthes leucoxyla)
41,04 - 89,99 %
Ceborrancha (Urginea maritima)
69,59 %
Referencia
De la Fuente, 2004
Granados, Yáñez y Acevedo,
2013
Belhaddad et al., 2017
Fuente: (Belhaddad et al., 2017; de la Fuente, 2004; Granados, Yáñez, & Acevedo, 2014)
Los valores para TEAC obtenidos en esta investigación se encuentran dentro del rango de los
resultados obtenidos en los extractos de las diferentes plantas presentadas en la tabla 17, las
cuales son consideradas como excelentes fuentes de antioxidante (Belhaddad et al., 2017; de la
Fuente, 2004; Granados et al., 2014).
79
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
7. CONCLUSIONES

Las variaciones en los porcentajes de humedad y cenizas de las plantas en estudio tienen
influencia directa de factores edafoclimaticos como: humedad relativa del lugar donde se
tomaron las muestras, cantidad de minerales absorbidos, estado nutricional del suelo, el
momento de cosecha y su posterior almacenamiento.

Se determinó por medio de la extracción convencional – maceración, que el mejor
solvente para la extracción asistida por ultrasonido fue Metanol, por ser un solvente
polar, afín a los compuestos de interés en esta investigación, fenoles totales.

La presente investigación permitió evaluar la efectividad del método de extracción
asistida por ultrasonido de Eneldo (Anethum graveolens L.) y Paico (Chenopodium
ambrosioides L.), teniendo resultados relativamente mayores en cuanto a polifenoles y
actividad antioxidante obtenidos mediante la extracción convencional.

Las mejores condiciones (frecuencia y tiempo) de extracción asistida por ultrasonido, en
las cuales se obtuvo el mayor contenido de fenoles totales, fueron 37 Hz a 45 minutos
(Eneldo: 1.996 g AG/100g de muestra y Paico: 1.923 g AG/100g de muestra)
respectivamente.

El mayor porcentaje de inhibición para el extracto de Eneldo y Paico fue de 78,71 % y
87,52 %, respectivamente, ambos resultados fueron obtenidos con técnica asistida por
ultrasonidos.

Se logró identificar tentativamente los principales compuestos fenólicos presentes en el
extracto de Paico, los cuales fueron flavonoides como: quercetina, flavonas, antocianinas
y flavonoles, aplicables en la producción de medicamentos fatmaceuticos.
80
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
8. RECOMENDACIONES

Debido a que se encontró un vacío en cuanto a investigación de las plantas aromáticas
y medicinales se recomienda seguir con estudios que evalúen sus múltiples
propiedades analizando su composición.

Evaluar las composiciones de los extractos de las plantas que existen en la región con
técnicas no convencionales y solventes orgánicos con sus respectivas validaciones.

Se recomienda para siguientes investigaciones tener en cuenta factores físico químicos
y biológicos del lugar de donde se recoleta la muestra ya que pueden llegar a ser
influyentes en la composición de las especies.
81
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
9. BIBLIOGRAFÍA.
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90
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
ANEXOS
Anexo A. Resultados desglosados de las pruebas de la composición físico-química
Tabla 1. Resultados de porcentaje de humedad de las diferentes muestras de Eneldo y Paico.
Planta
Eneldo
Paico
No.
Muestra
Peso
Inicial (g)
Peso
Final (g)
%
Humedad
1
2
3
1
2
3
1,92
1,76
1,76
1,93
1,42
1,56
0,34
0,36
0,35
0,58
0,54
0,48
82,3%
79,5%
80,1%
69,9%
62,0%
69,2%
%
Humedad
promedio
Desviación
Estándar
80,7%
0,0144962
67,1%
0,0441265
Tabla 2. Resultados de colorimetría de las diferentes muestras de Eneldo y Paico.
Planta
Eneldo
Paico
No.
Muestra
1
2
3
1
2
3
L
a*
b*
IC
25,42
26,22
26,41
37,75
37,26
36,41
-7,73
-8,34
-8,09
-6,83
-6,95
-6,85
14,61
26,28
15,71
26,07
25,81
24,13
-20,814
-12,103
-19,499
-6,940
-7,227
-7,797
IC
Promedio
Desviación
Estándar
-17,472
4,696
-7,321
0,436
Tabla 3. Resultados de cenizas totales de las diferentes muestras de Eneldo y Paico.
Planta
Peso crisol
No.
Peso crisol
con muestra
Muestra vacío (g)
(g)
Peso crisol
con cenizas
(g)
%
Cenizas
%
Desviación
Cenizas
Estándar
promedio
91
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Eneldo
Paico
1
2
3
1
2
3
15
13,5
19,3
14,6
14,8
14,3
17,9
16,5
22,3
17,3
17,5
17
15,1
13,6
19,4
14,7
15
14,4
3,4%
3,3%
3,3%
3,7%
7,4%
3,7%
3,4%
0,000664
4,9%
0,021383
Anexo B. Tablas de los resultados de Fenoles totales de las muestras obtenidas por
maceración de Eneldo y Paico.
Tabla 1. Resultados de Fenoles totales de la muestra No. 1 de Maceración. Medición 1
Plantas
Eneldo
Paico
Solvente
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Metanol
Agua D.
Absorbancia
0,353
0,633
0,465
0,592
0,671
0,392
Concentración
244,4615385
459,8461538
330,6153846
428,3076923
489,0769231
274,4615385
Tabla 2. Resultados de Fenoles totales de la muestra No. 1 de Maceración. Medición 2
Plantas
Eneldo
Paico
Solvente
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Metanol
Agua D.
Absorbancia
0,35
0,632
0,466
0,589
0,674
0,392
Concentración
242,1538462
459,0769231
331,3846154
426
491,3846154
274,4615385
Tabla 3. Resultados de Fenoles totales de la muestra No. 1 de Maceración. Medición 3
Plantas
Eneldo
Paico
Solvente
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Absorbancia
0,281
0,673
0,476
0,685
Concentración
189,0769231
490,6153846
339,0769231
499,8461538
92
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Metanol
Agua D.
0,687
0,393
501,3846154
275,2307692
Tabla 4. Resultados de Fenoles totales de la muestra No. 1 de Maceración. Medición 4
Plantas
Eneldo
Paico
Solvente
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Metanol
Agua D.
Absorbancia
0,284
0,673
0,475
0,689
0,687
0,391
Concentración
191,3846154
490,6153846
338,3076923
502,9230769
501,3846154
273,6923077
Tabla 5. Resultado de Fenoles totales de la muestra No. 2 de Maceración. Medición 1
Plantas
Eneldo
Paico
Solvente
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Metanol
Agua D.
Absorbancia
0,569
0,598
0,606
0,6
0,675
0,419
Concentración
410,6153846
432,9230769
439,0769231
434,4615385
492,1538462
295,2307692
Tabla 6. Resultados de Fenoles totales de la muestra No. 2 de Maceración. Medición 2
Plantas
Eneldo
Paico
Solvente
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Metanol
Agua D.
Absorbancia
0,57
0,595
0,606
0,6
0,672
0,418
Concentración
411,3846154
430,6153846
439,0769231
434,4615385
489,8461538
294,4615385
Tabla 7. Resultados de Fenoles totales de la muestra No. 2 de Maceración. Medición 3
Plantas
Eneldo
Paico
Solvente
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Metanol
Agua D.
Absorbancia
0,634
0,671
0,606
0,615
0,689
0,419
Concentración
460,6153846
489,0769231
439,0769231
446
502,9230769
295,2307692
93
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
Tabla 8. Resultados de Fenoles totales de la muestra No. 2 de Maceración. Medición 4
Plantas
Eneldo
Paico
Solvente
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Metanol
Agua D.
Absorbancia
0,631
0,669
0,606
0,612
0,688
0,42
Concentración
458,3076923
487,5384615
439,0769231
443,6923077
502,1538462
296
Tabla 9. Resultados promedio de Fenoles totales de las muestras No. 1 obtenidas por
Maceración.
Plantas
ENELDO
PAICO
Solvente
Absorbancia
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Metanol
Agua D.
0,317
0,65275
0,4705
0,63875
0,67975
0,392
Concentración
(mg/L)
216,7692308
475,0384615
334,8461538
464,2692308
495,8076923
274,4615385
Fenoles Totales
(mgAG/gmuestra)
867,0769231
1900,153846
1339,384615
1857,076923
1983,230769
1097,846154
Tabla 10. Resultados promedio de Fenoles totales de las muestras No. 2 obtenidas por
Maceración.
Plantas
ENELDO
PAICO
Solvente
Absorbancia
Etanol
Metanol
Agua D.
Etanol
Metanol
Agua D.
0,601
0,63325
0,606
0,60675
0,681
0,419
Concentración
(mg/L)
435,2307692
460,0384615
439,0769231
439,6538462
496,7692308
295,2307692
Fenoles Totales
(mgAG/gmuestra)
1740,923077
1840,153846
1756,307692
1758,615385
1987,076923
1180,923077
94
|Evaluacion de compuestos fenólicos y actividad antioxidante
95