孢子型乳酸菌之高菌量發酵培養
A fermentation study for the sporogenous lactic bacterium
李國陽 李順來 郭志彬
Kwong-Yang Lee, Shun-Lai Li and Chi-Pin Kuo
南台科技大學 化學工程系
Department of Chemical Engineering, Southern Taiwan University of Technology
摘要
乳酸菌在現代之日常生活中扮演著相當重要的角色, 它不但可以產生乳酸,
降低腸道中之PH而達到抑制腸內腐敗菌及致病菌之生長, 同時它亦可能產生多
種抗菌物質可以殺死腸道中之壞菌. 由於這些優秀之功能, 使相關產品在世界
各國大為風行.
本研究計畫進行孢子型乳酸菌之篩選與培養;菌種之耐酸性,溫度穩定性, 貯
存安定性, 抑菌性及加工穩定性等特性為篩選時之判斷標準, 期望能透過此一標
準而篩選出一株具優良特性之孢子型乳酸菌出來. 除此之外, 我們亦將針對此一
菌種進行深入之發酵條件, 加工條件, 以及其貯存條件等之研究.
關鍵詞：乳酸菌、孢子型乳酸菌
ABSTRACT
Lactic bacteria have been used as healthy supplement for years . It is well known
that by adding lactobacillus species to the human or animal diet ,
a series of
advantages can be achieved , such as promoting the growth of the animal and
protecting it from certain disorders . This is due to lactic acid and /or antibiotic
-like substances produced, and the positive interferences in the functional reflexes of
the digestive system .
In this project ,we screen the sporogenous type of lactic bacterial with some
special characteristics , such as acidic pH resistance , high temperature torelence , and
good storage stability. In this study we isolate a sporogenous bacteria . Lactobacillus
sporoagenes and optimize the culture conditions for this strain was performed in a 5L
fermentor. In particular , evaluating the effect of culture temperature , medium
PH , and medium composition on cell growth and sporogenation were well studies in
this project .
Key words: Lactic bacteria , sporogenous bacteria
1
1.前言
乳酸菌通常是泛指能夠發酵碳水化合物，以產生乳酸為主要產物之微生物，
乳酸菌在多數動物消化道中為優勢菌，細胞較大，通常以成隻或成串出現；少數
具有芽胞及莢膜，能在很廣圍的溫度(15℃~45℃)中生長。其具有抑制腸道中有害
微生物的生長，調節及建立腸道內菌相外，其還具有治療腸內不適所引起之腹
瀉，降低血中膽固醇，並且改善乳糖不耐症以及抑制致癌因子及癌細胞等等療
效，就因乳酸菌具有這些優點的存在，因而乳酸菌至今才會被世界各地延用多年。
雖然在市面上利用乳酸菌所製造出的產品十分眾多，例如優酪乳(統一AB優
酪乳，光泉晶球優酪乳…等) ，優格，起司，乳酪，三共胃腸藥，表飛鳴，泡菜…
等等相關的產品。但在這些產品之中能夠真正在人體中發生其作用的乳酸菌之菌
種十分的少，其主要原因乃是人體的胃酸值介於PH值2~3之間，而使得許多乳酸
菌種根本無法在此低PH值之下生存，所以市面上有的產品的確有很強之健胃整
腸的效果，但有的產品其功能卻令人十分的值得懷疑。
根據許多文獻中記載中孢子本身具有高度的耐酸性，耐高溫性，及高度貯存安
定性，但乳酸菌中會產生孢子的菌種卻十分的少見，目前文獻上的孢子型乳酸
菌有Sporolactobacillus、Bacillus laevolacticus、Bacillus racemilacticus、Bacillus
coagulans 被應用於益生菌，且具有很好之保健效果。
2.研究動機與目的
由於Bacillus coagulans 已被廣泛地應用於腸胃疾病，安全性較無問題，且
其在好氧環境生長快速。因此我們將篩選此菌株，對其特性、高菌量發酵培養及
產孢性作一詳細研究，以建立一套可以量產化的商業化製程，未來期望能進一步
轉移給業界進行量產。
3.實驗方法與步驟
a. 菌種篩選與鑑定
動物糞便中分離出多株菌種，將菌體倒入液態培養基（如表一、二），培養
24hr，37℃。將菌液移至 45 ℃培養箱培養 48hr，使其產孢。產孢菌液以 90 ℃，
30min 隔水加熱，使其未產孢的菌種死亡。以連續稀釋 10-2, 10-3 後取 0.1mL
的稀釋菌液培養 24hr 37 ℃，以求得單一菌落，再以劃線法求得更純的菌株，
並以顯微鏡觀察。利用革蘭氏染色、顯微鏡觀察、作 catalase 測定、作 oxidase
測定初步判定是否為凝結芽孢桿菌 ，再以 Biolog 鑑定系統做進一步鑑定。
b. 5升發酵槽發酵分析
利用控制攪拌速率達到合適的溶氧量，利用發酵溫度、發酵時間、分批進料
2
法等，尋求高菌量培養。
c.菌種的生長條件與營養需求分析
不同溫度下的生長性－我們分別考慮25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、,50
℃、55℃、60℃發酵槽發酵培養。
不同碳源培養基之篩選－我們將分別改變Glucose，Sucrose，fructose，glycerol
及starch，以探討不同碳源的影響。
d.尋求凝結芽孢桿菌最佳產孢溫度
我們將考慮在35℃~60℃間，尋求一較適的產孢溫度。分別考慮不同的溫度
35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃培養使其產孢，我們將以眼視與顯微鏡觀
察未產孢與產菌的差異。
e.孢子對於溫度及PH耐受性之測試
孢子菌對於不同溫度的耐受性測試：
將產孢的菌液分別取1mL後，各經80℃、85℃、90℃、95℃隔水加熱30分鐘、60
分鐘、90分鐘，後取1mL使用連續稀釋法，稀釋後取1mL接於BCP上，放於37℃
培養48小時後計算菌數。
孢子菌對於不同pH值的耐受性測試：
將產孢的菌液分別取1mL放入pH2、pH3、pH4之液態培養液以37℃培養後30分鐘
取菌液分別取1mL接於BCP上，放於37℃培養48小時後計算菌數。
4.結果與討論
a.菌種篩選與鑑定
目前我們已篩選得一株 Bacillus coagulans 其鑑定特徵如表三，進一步委託
食品研究所作Biolog 系統鑑定。
b.菌種的生長條件與營養需求分析
生長溫度測試：在不同之溫度下，我們共測試了25℃， 30℃， 35℃， 40
℃，45℃，50℃，55℃，60℃。 等八種不同成長溫度。實驗結果如圖一所示，
由圖中可知，30℃以下，以及45℃以上菌體成長均不甚理想，50℃以上，菌體成
長則完全停滯。溫度在35~45℃之間，菌體之成長情況差異不大，由此可知本株
菌是屬中溫菌屬，未來應用在人體，動物之保健用途上甚為適合。
碳源之篩選，本研究共測試了包括Glucose，Sucrose，fructose，glycerol及
starch。等多種不同碳源，經測試結果以sucrose，glucose，starch可達較佳之成長，
但與其他碳源之比較其優勢並不很明顯〈圖二〉，因此可以推論本菌株對碳源需
求並不具特異性，這可能歸因於此株菌屬野生型，又營養需求較為寬鬆。
最佳產孢條件，為獲得較好之產孢率，本研究亦針對產孢溫度進行篩選比
3
較，由圖三可知，菌體培養溫度要在45℃以上，才開始進行產孢。低於40℃
以下產孢情況非常差，產孢速率亦很慢，而在55℃以上，菌體在未產孢前到大量
死亡，產孢率亦不佳。在45~50℃應為最佳狀況。若配合糖濃度之偵測，可以發
現在45℃時，耗糖速率加快，在8~12小時內，發酵液中之糖濃度會降至零。這可
能是造成在此溫度範圍內,產孢率較佳的原因。
孢子對pH耐受性測試，由於保健用乳酸菌需通過胃酸之嚴苛挑戰，才能順
利到達腸道。因此乳酸菌對酸性條件之耐受性是一個非常重要的特性。由圖四可
知，本株菌在pH3以上，耐受兩小時其菌體存活率幾乎不受影響。在PH2時，一
小時內，菌體存活率仍在90%以上，2小時以上存活率降為80%左右。因此本株
菌在商業使用上，應較一般市面上所販售之乳酸菌製品，具有更佳之耐酸性。
孢子對溫度之耐受性測試，在加工過程中，乳酸菌製通常會接觸到高溫條
件，尤其是粉末或錠劑製品均需由高溫加以乾燥，因此對高溫度之耐受度是乳酸
菌製品另一個非常重要的特性。由圖五結果可知，既使溫度在90℃以上，30分鐘
內，菌體存活率仍不受影響。1小時以上，生菌數才會下降，這個結果亦較一般
之乳酸菌為佳。綜合以上結果可知，即使溫度在90℃以上，30分鐘內，菌體存活
力仍不受影響。1小時以上，生菌數才會下降，這個結果亦較一般之乳酸菌為佳。
綜合以上結果可知，我們篩選到之乳酸菌的確具有較佳的耐酸性，抗溫性及加工
穩定性，未來應用在商業化生產上應有很大之潛力。
5.結論
目前已篩得菌株Bacillus coagulans，並已用5L發酵槽發酵得OD值達到10(菌
數大約為5*109隻/c.c)，已達商業化生產標準。接下來將利用多次進料進行高菌量
培養及用100L發酵槽進行試量產試驗。
6.謝誌
感謝國科會（NSC 89-2214-E-218-003）計畫的經費補助
7.參考文獻
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14.蔡英傑.乳酸菌應用綜論.生物產業.1998.
15.廖啟成.乳酸菌之分類及應用.食品工業.1998.
5
8.圖表
表一. 固態培養基(BCP)
表二. 液態培養基
Glucose
1g/L
Glucose
0-15 g/L
酵母萃取物
3g/L
Peptone
0-7.5 g/L
Bromocresol purple
酵母萃取物
0.04g/L
L-Cystein
0.2g/L
Maltose extract
Peptone
5g/L
PH=6.8
Agar
15g/L
Tween80
1㏄/L
PH=7.0
表三.凝結芽孢桿菌鑑定特徵
特徵
反應
細胞形態
桿狀細胞
芽孢形狀
卵圓或球形
厭氧生長
色素
革蘭氏染色
最高生長溫度
Catalase活性
Oxidase活性
_
+
+
60℃
+
_
6
0-4.5 g/L
0-4.5 g/L
OD
OD
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
25℃
30℃
35℃
40℃
45℃
50℃
55℃
60℃
生長溫度
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
圖一. 凝結芽孢桿菌在各發酵溫度的
OD值
Glucose Surose Frustose Glycerol Starch
圖二. 碳源對菌體成長之影響
120
100
150
pH=2
pH=3
pH=4
pH=5
存活率(%)
%
80
60
40
100
50
20
0
0
35℃ 40℃ 45℃ 50℃ 55℃ 60℃
溫度
0
120
80℃
存活率(%)
100
80
85℃
60
90℃
40
95℃
20
0
100℃
0
20
40
60
80
100
120
50
100
時間(min)
圖四.孢子對pH耐受性測試
圖三. 產孢溫度對產孢率的影響
140
時間(min)
圖五. 孢子對溫度耐受性測試菌体存活率
7
150
8