PENYARIAN ZEAXANTHIN DARI SAYUR-SAYURAN TEMPATAN : PROSES TERHADAP HASIL SARIAN ZEAXANTHIN
advertisement
PENYARIAN ZEAXANTHIN DARI SAYUR-SAYURAN TEMPATAN : PERBANDINGAN KAEDAH PENYARIAN DAN KESAN PARAMETER PROSES TERHADAP HASIL SARIAN ZEAXANTHIN MARMY ROSHAIDAH BINTI MOHD SALLEH Tesis ini dikemukakan sebagai memenuhi syarat penganugerahan ijazah Sarjana Kejuruteraan (Kimia) Fakulti Kejuruteraan Kimia dan Kejuruteraan Sumber Asli Universiti Teknologi Malaysia APRIL 2005 Untuk Taufik, Irdina dan keluarga tersayang PENGHARGAAN Saya ingin merakamkan penghargaan dan terima kasih kepada penyelia saya, Prof. Madya Dr. Rosli Mohd Yunus di atas segala ilmu, tunjuk ajar, bimbingan, nasihat dan dorongan yang diberikan sepanjang tempoh penyelidikan ini dijalankan. Penghargaan ini juga saya tujukan buat semua staf Loji Pandu Kejuruteraan Kimia yang banyak membantu saya bagi menjalankan penyelidikan ini. Ucapan terima kasih yang tidak terhingga ditujukan buat rakan-rakan yang telah banyak memberi sokongan dari segi ilmu dan moral iaitu Yumi Zuhanis, Naqiah, Fima, Amizah, Rafizan, Amer dan Abdul Rahman. Jutaan terima kasih yang tidak terhingga dikirimkan buat ibu tersayang Jamilah Binti Adom yang sentiasa memberikan galakan, mendoakan kejayaan dan kebahagiaan saya dalam usaha untuk menyiapkan projek penyelidikan ini. Penghargaan ini juga buat suami tercinta Taufik Bin Abdul Rahman yang tidak pernah jemu memberi dorongan dan motivasi, ibu mertua, kakak-kakak dan adikadik yang sentiasa memberikan semangat serta kiriman doa. Terima kasih atas perhatian kalian. Akhir sekali, penghargaan dan ucapan terima kasih buat semua pihak yang terlibat secara langsung ataupun tidak langsung semasa saya menjalankan penyelidikan dan menulis tesis ini. ABSTRAK Kajian adalah dijalankan bagi menilai kaedah penyarian yang terbaik untuk penghasilan zeaxanthin dari sayur-sayuran hijau. Tiga kaedah penyarian yang terlibat adalah kaedah rendaman, kaedah soxhlet dan kaedah ultrasonik. Peringkat permulaan kajian adalah penentuan sampel sayur yang terbaik untuk digunakan bagi penyelidikan ini, iaitu melalui proses penyaringan. Kesan parameter proses terhadap hasil sarian zeaxanthin turut dikaji dalam penyelidikan ini. Rekabentuk kajian yang dikenali sebagai rekabentuk pecahan faktorial telah dijalankan untuk mengkaji kesan parameter proses terhadap hasil sarian zeaxanthin. Parameter proses yang dikaji adalah masa penyarian, jenis pelarut, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan isipadu air di dalam takung rendaman (kaedah ultrasonik). Kesan utama parameter proses terhadap hasil sarian zeaxanthin serta interaksi di antara parameter ditentukan berdasarkan analisis terhadap kaedah tindak balas permukaan (response surface methodology), jadual varians, carta pareto dan jadual anova. Kadar penyarian dan pemalar kadar penyarian dikira bagi menilai kecekapan proses penyarian. Daripada kajian yang telah dilakukan, sayur cekur manis dikenalpasti sebagai sampel yang terbaik untuk digunakan di dalam kajian ini berdasarkan kandungan zeaxanthin yang terbanyak hasil dari pemerhatian kepekatan zeaxanthin yang diekstrak dari ketiga-tiga kaedah penyarian. Melalui rekabentuk pecahan faktorial, hasil sarian zeaxanthin tertinggi dihasilkan daripada sayur cekur manis adalah 93.22% melalui kaedah ultrasonik pada masa 35 minit. Pelarut aseton dengan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut 32g:200ml dikenalpasti sebagai keadaan operasi yang terbaik bagi penyarian ini. Berdasarkan nilai kadar penyarian dan pemalar kadar penyarian yang tertinggi iaitu masing-masing 1.15 mg/min dan 0.0329 min-1, adalah disimpulkan bahawa kaedah penyarian ultrasonik merupakan kaedah yang terbaik untuk mengekstrak zeaxanthin dari sayur cekur manis. ABSTRACT A research was conducted to evaluate the best extraction method for the production of zeaxanthin from green vegetables. Three extraction methods involved in the evaluation, namely the soaking method, soxhlet method, and ultrasonic extraction method. The first stage of research was to select the best sample to be used in the research, via screening process. The effect of processing parameters on the yield of zeaxanthin were investigated in this research. Fractional factorial design method was used as the research design to study the effects of processing parameters on the yield of zeaxanthin. The processing parameters studied were time of extraction, types of solvent, ratio of mass of sample to volume of solvent, and volume of water in ultrasonic bath (ultrasonic method). The main effect of processing parameters on the yield of zeaxanthin and the interaction between parameters were determined via analysis of response surface methodology, varians table, pareto chart and anova table. The rate of extraction and the extraction rate constant were estimated to evaluate the extraction process efficiency. From the research, cekur manis was identified as the best sample to be used in the research based on the highest content of zeaxanthin extracted from the three extraction methods adopted in the study. Based on the fractional factorial design, the highest yield of zeaxanthin from cekur manis was 93.22% using ultrasonic extraction method within 35 minutes of extraction time. Solvent of acetone, with sample to solvent ratio of 32g:200ml were identified as the best operating condition for the extraction. Based on the highest value of extraction rate and the extraction rate constant 1.15 mg/min and 0.0329 min-1 respectively, it was concluded that the ultrasonic extraction method appeared to be the best extraction method for the extraction of zeaxanthin from cekur manis. KANDUNGAN BAB 1 PERKARA MUKA SURAT TAJUK i PENGAKUAN ii DEDIKASI iii PENGHARGAAN iv ABSTRAK v ABSTRACT vi KANDUNGAN vii SENARAI JADUAL xiii SENARAI RAJAH xv SENARAI SIMBOL / SINGKATAN xviii SENARAI LAMPIRAN xix PENGENALAN 1.1 Latar Belakang Kajian 1 1.2 Penyelidikan Zeaxanthin 2 1.3 Pernyataan Masalah 5 1.4 Objektif Kajian 6 1.5 Skop Kajian 6 2 KAJIAN LITERATUR 2.1 Pendahuluan 8 2.2 Sejarah Penggunaan Ubat Tradisional 8 2.3 Sebatian Hasilan Semulajadi 9 2.4 Karotenoid 10 2.5 Zeaxanthin 12 2.5.1 Ciri-Ciri Zeaxanthin 14 2.5.2 Stereokimia dan Isomer Zeaxanthin 14 2.6 Antioksidan 15 2.7 Struktur Mata 16 2.8 Penyakit Buta Kekal “Age Related Macular Degeneration” (AMD) 18 2.9 Punca-Punca AMD 20 2.10 Konsep Penyarian Pepejal-Cecair (Pengurasan) 21 2.11 Konsep Pemindahan Jisim Dalam Proses Penyarian Pepejal-Cecair 2.12 22 Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Proses Penyarian 24 2.12.1 Saiz Bahan 24 2.12.2 Nisbah Bahan Dengan pelarut 24 2.12.3 Masa Penyarian 25 2.12.4 Pelarut 25 2.12.5 Suhu Proses 27 2.13 Resapan Di Dalam Pepejal Mengikut Hukum Fick 28 2.14 Resapan Dalam Pepejal Berliang Yang Bergantung 2.15 Kepada Struktur Pepejal 28 Ultrasonik 30 2.15.1 Teori Bunyi 31 2.15.2 Klasifikasi Gelombang Bunyi 32 2.15.3 Kesan Fizikal Daripada Tenaga Ultrasonik 33 2.15.4 Teknologi Ultrasonik Dalam proses Pengurasan 34 3 METODOLOGI KAJIAN 3.1 Pendahuluan 36 3.2 Proses Pemilihan 36 3.2.1 Kaedah Rendaman 38 3.2.2 Kaedah Soxhlet 40 3.2.3 Kaedah Ultrasonik 42 Proses Pengoptimuman Parameter Kajian 43 3.3.1 Rekabentuk eksperimen 44 3.3 3.3.1.1 Pembolehubah tidak bergantung (Bebas) 3.3.1.2 Pembolehubah Bergantung 3.4 Penganalisian Data 46 49 50 3.4.1 Analisis Zeaxanthin Secara Kualitatif Dengan Menggunakan Thin Layer Chromatography (TLC) 50 3.4.1.1 Kromatografi Lapisan Nipis (TLC) 51 3.4.1.2 Fasa Pepejal Untuk TLC 53 3.4.1.3 Fasa Bergerak Dalam TLC 53 3.4.1.4 Faktor Perlambatan 54 3.4.2 Analisis Zeaxanthin Secara Kuantitatif Dengan Menggunakan Spektrofotometer 4 55 KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN 4.1 4.2 Proses Pemilihan Sampel 57 4.1.1 Analisis Kualitatif 57 4.1.2 Analisis Kuantitatif 59 Proses Pengoptimuman Parameter 61 4.2.1 Kaedah Rendaman 62 4.2.1.1 Kesan Parameter Proses Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 63 4.2.1.2 Peringkat Pengoptimuman Parameter Kajian 64 4.2.1.3 Kesan Penggunaan Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 65 4.2.1.4 Kesan Masa Penyarian Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 67 4.2.1.5 Kesan Nisbah Jisim Sampel Kepada Isipadu Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 68 4.2.1.6 Model Matematik Bagi Keseluruhan Ujikaji 69 4.2.1.7 Kesan Parameter Proses Dan Interaksi Di antara Parameter Proses Berdasarkan Analisis Statistik 71 4.2.2 Kaedah Soxhlet 74 4.2.2.1 Kesan Parameter Proses Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 75 4.2.2.2 Kesan Penggunaan Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 77 4.2.2.3 Kesan Masa Penyarian Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 78 4.2.2.4 Kesan Nisbah Jisim Sampel Kepada Isipadu Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 79 4.2.2.5 Model Matematik Bagi Keseluruhan Ujikaji 80 4.2.2.6 Kesan Parameter Proses Dan Interaksi Di antara Parameter Proses Berdasarkan Analisis Statistik 4.2.3 Kaedah Ultrasonik 82 84 4.2.3.1 Kesan Parameter Proses Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 85 4.2.3.2 Kesan Penggunaan pelbagai Jenis Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 86 4.2.3.3 Kesan Masa Penyarian Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 89 4.2.3.4 Kesan Nisbah Jisim Sampel Dengan Isipadu Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 91 4.2.3.5 Kesan Isipadu Air Di dalam Takung Rendaman Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin 92 4.2.3.6 Model Matematik Bagi Keseluruhan Ujikaji 93 4.2.3.7 Kesan Parameter Proses Dan Interaksi Di antara Parameter Proses Berdasarkan Analisis Statistik 96 4.2.4 Perbandingan Di antara Parameter Proses Optimum Bagi Kaedah Rendaman, Soxhlet Dan Ultrasonik 5 100 4.3 Kadar Penyarian Zeaxanthin 101 4.4 Pemalar Kadar Penyarian 102 KESIMPULAN 5.1 Kesimpulan 103 5.2 Cadangan 105 RUJUKAN 107 LAMPIRAN A 115 LAMPIRAN B 126 SENARAI JADUAL NO JADUAL 2.1 TAJUK MUKA SURAT Kandungan zeaxanthin dalam tumbuh-tumbuhan yang terpilih 13 2.2 Ciri-ciri zeaxanthin 13 2.3 Ciri-ciri fizikal bagi pelarut 26 2.4 Urutan pelarut mengikut polariti 27 3.1 Senarai sampel kajian 37 3.2 Parameter kajian yang ditetapkan dalam proses penyarian zeaxanthin 38 3.3 Pembolehubah kajian bagi kaedah rendaman 46 3.4 Pembolehubah kajian bagi kaedah soxhlet 47 3.5 Pembolehubah kajian bagi kaedah ultrasonik 47 3.6 Matriks eksperimen bagi kaedah rendaman dan soxhlet 48 3.7 Matriks eksperimen bagi kaedah ultrasonik 49 4.1 Faktor Penahanan bagi 16 jenis sampel sayur-sayuran 58 4.2 Hasil sarian zeaxanthin bagi 16 jenis sayur-sayuran 61 4.3 Analisis varian terhadap hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah rendaman 4.4 63 Nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi di antara pembolehubah 70 4.5 Jadual anova untuk hasil sarian zeaxanthin 73 4.6 Analisis varian terhadap hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah soxhlet 75 4.7 Nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi di antara pembolehubah 80 4.8 Jadual anova untuk hasil sarian zeaxanthin bagi kaedah soxhlet 84 4.9 Analisis varian terhadap hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah ultrasonik 4.10 85 Nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi di antara pembolehubah 94 4.11 Jadual anova untuk hasil sarian zeaxanthin bagi kaedah ultrasonik 98 4.12 Parameter proses optimum bagi tiga kaedah penyarian 100 4.13 Pemalar kadar penyarian 102 SENARAI RAJAH NO RAJAH 1.1 TAJUK MUKA SURAT Kandungan zeaxanthin dan lutein di dalam mata manusia 4 2.1 Rantai Karbon Zeaxanthin (ȕ, ȕ-Carotene-3,3’diol) 14 2.2 Perbezaan penglihatan di antara penglihatan normal dan penglihatan yang mengalami macular degeneration 19 2.3 Keratan rentas mata manusia 20 2.4 Rajah proses resapan dalam pepejal berongga 29 2.5 Pergerakan gelombang dan partikel 32 3.1 Proses penyarian zeaxanthin menggunakan kaedah rendaman 39 3.2 Carta alir kajian 40 3.3 Alat untuk penyarian zeaxanthin menggunakan kaedah soxhlet 41 3.4 Komponen radas kaedah soxhlet 41 3.5 Gambaran proses penyarian menggunakan kaedah ultrasonik 43 3.6 Gambarajah turutan proses pengoptimuman 44 3.7 Prinsip penggunaan kaedah kromatografi lapisan nipis 51 3.8 Sistem kromatografi lapisan nipis (TLC) 52 3.9 Analisis sampel dengan menggunakan kaedah kromatografi lapisan nipis 54 3.10 Gambarajah proses pemisahan sampel 55 4.1 Perbandingan kandungan zeaxanthin di dalam sampel sayur-sayuran 59 4.2 Kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.3 65 Kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.4 66 Kesan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.5 Carta Pareto bagi hasil sarian zeaxanthin dengan menggunakan kaedah rendaman 4.6 68 72 Kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.7 76 Kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.8 77 Kesan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.9 Carta Pareto bagi hasil sarian zeaxanthin dengan menggunakan kaedah soxhlet 4.10 78 82 Kesan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut dan jenis pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.11 Kesan perubahan masa penyarian dan jenis pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.12 88 Kesan perubahan isipadu air dan jenis pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.13 87 88 Kesan perubahan masa penyarian dan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin 90 4.14 Kesan perubahan isipadu air dan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.15 Kesan perubahan isipadu air dan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.16 91 Carta Pareto bagi hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah ultrasonik 4.17 90 96 Kadar penyarian bagi kaedah rendaman, soxhlet dan ultrasonik 101 SENARAI SIMBOL / SINGKATAN H0 - hipotesis nul H1 - hipotesis alternatif SST - hasil tambah kuasa dua X1 - jenis pelarut X2 - nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut X3 - masa penyarian X4 - Isipadu air Y - respon (Hasil sarian) H - keliangan Z - jarak resapan L - linear Rf - faktor penahanan p - had keyakinan df - darjah kebebasan TLC - kromatografi lapisan nipis K0 - pemalar kadar penyarian SENARAI LAMPIRAN LAMPIRAN TAJUK MUKA SURAT A Jadual Taburan F 115 B Data Eksperimen 121 BAB 1 PENGENALAN 1.1 Latar Belakang Kajian Tumbuh-tumbuhan merupakan sumber makanan yang penting bagi manusia yang mana mengandungi pelbagai nutrien yang diperlukan oleh badan untuk menjalani proses tumbesaran secara sihat dan normal. Di samping itu juga tumbuhtumbuhan boleh dijadikan sebagai sumber ubatan tradisional. Di Malaysia terdapat banyak tumbuh-tumbuhan yang mempunyai nilai ubatan. Dewasa ini, masyarakat lebih cenderung untuk mencuba sumber ubatan alternatif daripada tumbuh-tumbuhan herba semulajadi bagi menjamin kesihatan keseluruhan sistem di dalam badan. Salah satu daripadanya adalah penghasilan pigmen zeaxanthin daripada sayursayuran berdaun hijau. Zeaxanthin dikategorikan dalam kumpulan xanthophylls di mana mengandungi kumpulan oksigen di dalam struktur kimianya. Nama kimianya ialah ȕ,ȕ-carotene-3,3’diol ataupun dihydroxy-carotene. Ianya sejenis bahan kimia yang tidak stabil dan sangat mudah teroksida sekiranya terdedah kepada udara ataupun bahan peroksida. Zeaxanthin juga sensitif terhadap cahaya dan haba (Schiedt dan Liaaen-Jensen, 1995). Zeaxanthin bertindak sebagai penapis cahaya ultraungu biru serta berperanan melindungi mata dari mengalami kerosakan yang disebabkan oleh pengoksidaan melalui penstabilan radikal bebas di dalam mata. Penemuan pigmen zeaxanthin dalam sayur-sayuran merupakan salah satu penemuan yang agak baru yang mana belum dikomersialkan sepenuhnya. Daripada kajian literatur, di dapati pigmen ini penting bagi menjamin kesihatan mata manusia dan mengurangkan risiko mendapat penyakit Age Related MacularDegeneration (AMD). Zeaxanthin boleh diperolehi secara terus dengan pengambilan sayuran berdaun hijau di dalam diet manusia seperti bayam, kobis, sawi dan sayuran berdaun yang lain. Risiko untuk mendapat barah juga dapat dikurangkan dengan pengambilan sayuran dalam makanan seharian manusia (Steinmetz dan Potter, 1991). Proses pengambilan zeaxanthin secara terus daripada sumber sayuran agak sukar untuk memenuhi keperluan zexanthin yang diperlukan oleh seseorang dalam kuantiti yang sepatutnya. Oleh sebab itu, zeaxanthin juga boleh diperolehi dengan pengambilan makanan tambahan dalam bentuk pil sebagai alternatif bagi mengelakkan kekurangan sumber ini dalam mata. Di Malaysia, penyelidikan tentang zeaxanthin ini masih lagi di peringkat awal di mana kepentingannya dikesan dan dikenal pasti sekitar tahun 90-an. Kajian zeaxanthin secara meluas di Barat dan kepentingannya yang telah diperakui telah menarik minat penyelidik Malaysia agar menjalankan kajian untuk menghasilkan zeaxanthin dengan menggunakan sumber sayur-sayuran tempatan. Laporan ini membentangkan hasil kajian yang telah dijalankan bagi mengenal pasti spesis tumbuhan yang paling sesuai dan kaedah penyarian yang paling sesuai untuk diketengahkan bagi tujuan komersial. 1.2 Penyelidikan Zeaxanthin Saintis pertama yang menganalisis kandungan karotenoid di dalam tumbuhtumbuhan ialah Tswett iaitu pada tahun 1906. Di dalam kajiannya, campuran karotenoid yang diperolehi telah dipisahkan dengan menggunakan kolum terbuka (Hodisan et al., 1997). Kajian tentang karotenoid ini turut menarik minat beberapa saintis lain iaitu Zaechmeister, Isler dan Goodwin. Mereka telah melakukan pembaharuan terhadap kaedah pemisahan yang telah diperkenalkan oleh Tswett. Disamping itu, pengenalan dan kajian struktur karotenoid secara mendalam juga ditekankan (Hodisan et al., 1997). Terdapat pelbagai jenis karotenoid di dalam tumbuh-tumbuhan. Salah satu jenis karotenoid yang telah dikenal pasti terkandung di dalamnya adalah zeaxanthin. Pernyataan ini dibuat berdasarkan kajian yang telah dijalankan oleh Sommerburg pada tahun 1998 di mana zeaxanthin banyak terkandung di dalam sayur-sayuran dan buah-buahan. Penemuan zeaxanthin telah dipelopori oleh Wald, seorang saintis yang menggunakan kaedah spektrofotometer bagi menganalisa retina yang telah diekstrak. Zeaxanthin dikesan wujud di dalam retina mata manusia apabila Wald telah menjalankan kajian ke atas lutein. Daripada kajiannya, satu lagi pigmen kuning dikenal pasti terdapat di dalam tisu retina mata di mana mempunyai gelombang penyerapan dan peranan yang sama dengan lutein. Walaubagaimanapun, zeaxanthin dipercayai memainkan peranan yang utama disebabkan keupayaannya sebagai penapis sinaran ultraungu biru dan penstabil radikal bebas di dalam mata adalah dua kali ganda jika dibandingkan dengan lutein (Virgilli et al., 1999). Secara umumnya, kandungan zeaxanthin banyak dikesan wujud di dalam makula mata dan kandungan lutein banyak dikesan wujud di bahagian luar makula mata berdasarkan analisa yang telah dilakukan oleh penyelidik (Bone et al., 1993). Rajah 1.1 di bawah menunjukkan lokasi kedudukan zeaxanthin dan lutein di dalam mata manusia. Rajah 1.1 : Kandungan zeaxanthin dan lutein di dalam mata manusia (www.zeavision.com) Kandungan zeaxanthin yang mencukupi di dalam pancaindera manusia dapat mencegahnya dari menghidapi sejenis penyakit AMD. Zeaxanthin juga berperanan sebagai antioksidan. Antioksidan boleh mencegah kerosakan sel yang disebabkan oleh penghasilan molekul radikal bebas yang tidak stabil semasa selular sedang berfungsi. Secara umumnya, bolehlah dikatakan bahawa amalan pengambilan makanan yang mengandungi karotenoid yang tinggi seperti zeaxanthin boleh mencegah diri dari dijangkiti pelbagai penyakit (Fackelmann, 1994). Oleh sebab itu, memandangkan keperluan zeaxanthin amat penting bagi menjamin kesihatan mata manusia, maka Courington dan Goodwin telah menjalankan kajian bagi penghasilan zeaxanthin melalui mikrob pula (Garnett et al., 1998). Seterusnya, zeaxanthin ditulenkan melalui sel penapai. Cara pengambilannya dipelbagaikan sama ada melalui pil nutrisi mahu pun sebagai bahan tambah dalam makanan. 1.3 Pernyataan Masalah Berdasarkan kepada kajian literatur, kita didedahkan dengan pelbagai maklumat tentang kepentingan zeaxanthin bagi menjamin kesihatan manusia. Di samping itu juga, statistik buta kekal yang dilihat di Amerika Syarikat memberi kesedaran kepada kita untuk mengambil langkah awal bagi mengurangkan risiko mendapat penyakit AMD. Dewasa ini, ubat yang dapat menyembuhkan AMD belum lagi ditemui . Walaubagaimanapun, AMD dapat dicegah dengan memakan sayur-sayuran yang mengandungi zeaxanthin. Daripada kajian didapati bahawa zeaxanthin banyak terkandung di dalam sayur-sayuran berdaun hijau. Pemakanan yang seimbang selalu disyorkan oleh pakar pemakanan supaya dapat mengurangkan risiko AMD. Walaubagaimanapun, memandangkan kehidupan moden masa kini serta gaya hidup yang sentiasa sibuk dengan aktiviti harian adalah amat sukar untuk mempastikan pemakanan yang seimbang dapat dipraktikkan. Langkah yang terbaik untuk mengatasi pemakanan yang tidak seimbang ini adalah dengan mengambil pil-pil nutrisi atau makanan tambahan yang dihasilkan daripada sayur-sayuran tempatan. Melalui cara ini, aktiviti seharian tidak perlu dikorbankan dan dalam masa yang sama cara hidup sihat dapat diamalkan. Menyedari hakikat ini, banyak kajian telah mula difokuskan dalam menghasilkan zeaxanthin. Dalam aspek yang sama, kajian untuk penghasilan zeaxanthin daripada sayursayuran tempatan telah mula menimbulkan minat pada penyelidik untuk menerokainya. Beberapa kajian tentang zeaxanthin telah dijalankan di Luar Negara tetapi penyelidikan dalam bidang ini masih belum dibuat di Malaysia. Walhal, Malaysia merupakan negara yang terbaik dan sesuai untuk menghasilkan zeaxanthin kerana di sini terdapat banyak sayur-sayuran yang mempunyai kandungan vitamin dan nutrien yang tinggi serta penting untuk kesihatan. Malaysia berpotensi tinggi bagi mengkomersialkan tumbuhannya untuk dijadikan bahan kajian dalam bidang fitokimia. Dari sudut yang lain, Malaysia dan luar negara mempunyai kualiti tumbuhan yang berbeza. Perbezaan kualiti dan kuantiti hasil yang diperolehi mungkin dipengaruhi oleh struktur tanah, iklim, musim dan kelembapan. Penyelidikan ini melibatkan sayur-sayuran tempatan yang mana merupakan pemakanan manusia seharian. Pemilihan sampel di ambil kira faktor kesesuaiannya berdasarkan literatur, sayur-sayuran yang boleh dimakan dan mudah diperolehi. Beberapa jenis sayur-sayuran telah dipilih dalam penyelidikan fasa yang pertama di mana fasa pertama merupakan proses pemilihan sayur-sayuran yang berpotensi tinggi sebagai penyumbang pigmen zeaxanthin yang tertinggi berdasarkan kaedah yang ditetapkan. Kandungan zeaxanthin dalam sayur-sayuran luar negara mungkin tidak sama jika di bandingkan dengan sayur-sayuran tempatan. Namun begitu, Malaysia lebih dikenali dengan sumber sayur-sayuran kaya dengan nutrien dan vitamin serta hasil hutan yang juga pelbagai kegunaan dalam menyembuhkan penyakit. 1.4 Objektif Kajian Berdasarkan kepada keperluan yang telah dijelaskan di atas, Objektif kajian ini adalah bertujuan untuk mengkaji kandungan zeaxanthin di dalam sayur-sayuran tempatan serta mengenal pasti kaedah penyarian yang terbaik bagi memastikan penghasilan zeaxanthin yang maksima. 1.5 Skop kajian Untuk mencapai objektif kajian seperti yang disarankan di atas, beberapa skop kajian telah dikenal pasti. Sayur-sayuran dipilih sebagai bahan kajian kerana ia merupakan sebahagian daripada menu pemakanan harian manusia serta mudah diterima oleh masyarakat apabila dikomersialkan kelak. Kajian ini meliputi dua bahagian utama yang dikaji iaitu: 1) Mengkaji sayur-sayuran tempatan yang berpotensi sebagai sumber zeaxanthin yang tinggi berdasarkan kajian literatur. Sayur yang mengandungi peratusan zeaxanthin yang tertinggi akan dipilih untuk digunakan di dalam bahagian kedua. Pemilihan akan dibuat berdasarkan keputusan yang diperolehi daripada ujikaji di makmal. 2) Mengkaji tiga kaedah penyarian iaitu kaedah rendaman, kaedah soxhlet dan kaedah ultrasonik untuk menyari zeaxanthin. Daripada literatur, terdapat pelbagai kaedah penyarian yang disyorkan tetapi hanya tiga kaedah saja yang dipilih dalam kajian ini. Kaedah yang terbaik akan ditentukan berdasarkan parameter yang akan dikaji . Antara parameter yang terlibat adalah : i) Mengkaji kesan keterlarutan dan kekutuban pelarut yang diaplikasikan dalam ketiga-tiga kaedah penyarian. ii) Mengkaji kesan masa yang diaplikasikan dalam ketiga-tiga kaedah penyarian. iii) Mengkaji kesan nisbah sampel terhadap isipadu pelarut yang diaplikasikan dalam ketiga-tiga kaedah penyarian. iv) Mengkaji kesan keamatan gelombang yang diaplikasikan dalam kaedah ultrasonik 3) Parameter di atas memberi kesan terhadap hasil penyarian zeaxanthin dan nilai kadar penyarian yang akan diperolehi. Untuk mencapai skop ini, kaedah rekabentuk kajian (experimental design) yang dijanakan oleh STATISTICA V5.0 diaplikasikan. Data yang diperolehi dipersembahkan dengan menggunakan kaedah tindakbalas permukaan (response surface methodology) untuk mengenal pasti kesan parameter yang dikaji. BAB 2 KAJIAN LITERATUR 2.1 Pendahuluan Sepanjang peradaban manusia, hubungan di antara manusia dengan sumber ubatan tradisional amat rapat. Penemuan beberapa pigmen yang bernilai ubatan daripada tumbuhan dan organisma laut telah menimbulkan kesedaran baru pada saintis untuk menjalankan penyelidikan yang lebih sistematik dari bahan yang boleh didapati secara semulajadi (Fasihuddin dan Hasmah, 1993). 2.2 Sejarah Penggunaan Ubat Tradisional Kajian dan laporan sistematik terhadap penggunaan tumbuhan sebagai sumber ubatan telah pertama kali dilakukan oleh Hippocrates yang dikenali sebagai bapa perubatan sekitar tahun 400 S.M. Theophrastur (sekitar 300 S.M.) telah mengumpulkan maklumat sistematik bagi berbagai-bagai jenis tumbuhan manakala Dioscorides (T.M.160) dan Galen (T.M.120) telah menerbitkan banyak makalah mengenai penggunaan tumbuhan sebagai sumber ubatan. Penggunaan tumbuhan sebagai punca ubatan terus berkembang maju diserata dunia sehingga sekarang manusia masih bergantung kepada tumbuhan sebagai sumber ubatan (Fasihuddin dan Hasmah, 1993). . 2.3 Sebatian Hasilan Semulajadi Malaysia merupakan salah sebuah negara yang kaya dengan tumbuhan yang mempunyai nilai ubatan. Dari 7000 spesies angiosperma sekitar 1082 spesies (lebih kurang 15%) dilaporkan bernilai ubatan dan dari 600 spesies paku-pakis, kira-kira 76 spesies dilaporkan mempunyai nilai ubatan (Fasihuddin dan Hasmah, 1993). Penemuan tumbuh-tumbuhan yang berpotensi tinggi dalam penghasilan ubatan yang boleh mencegah pelbagai penyakit amat memberangsangkan dan membanggakan. Dewasa ini kajian secara menyeluruh dilakukan agar hasil yang diperolehi dapat dikomersialkan dengan lebih meluas lagi. Setiap apa yang dikurniakan oleh pencipta di atas muka bumi ini mengandungi pelbagai hikmah disebaliknya begitu juga dengan tumbuh-tumbuhan yang diciptakanNya bukan saja sebagai sumber makanan penghuni dunia namun ia juga dapat digunakan sebagai satu sumber penting pencegah pelbagai penyakit yang merbahaya. Sumber alam semulajadi terlalu banyak gunanya dan kepentingannya hanya akan ditemui jika dikaji secara lebih mendalam dan saintifik. Di barat khususnya, kajian secara biologi terhadap tumbuh-tumbuhan telah lama diceburi dan ia merupakan satu aspek penting dalam bidang kajian di masa kini. Pelbagai buku tentang tumbuh-tumbuhan yang telah dikenal pasti sebagai sumber yang penting dalam kesihatan manusia telah diterbitkan oleh penyelidik-penyelidik di barat dan merupakan pelopor yang pertama dalam menghasilkannya. 2.4 Karotenoid Salah satu pigmen penting yang terdapat di dalam tumbuh-tumbuhan adalah karotenoid. Karotenoid merupakan pigmen yang berwarna kuning, oren dan merah yang wujud secara meluas dalam tumbuhan dan haiwan. Ia juga dikatakan sejenis sebatian yang tidak stabil apabila terdedah pada cahaya dan oksigen (Goodwin, 1980). Karotenoid merupakan sebatian yang boleh larut dalam lemak (Fasihuddin dan Hasmah, 1993). Terdapat kira-kira 600 karotenoid semulajadi yang telah dikenal pasti dan sebahagian daripadanya adalah tulen dan penting dalam biokimia serta perdagangan . Zeaxanthin dan lutein terutamanya penting dalam bidang ini kerana kedua-dua unsur ini terdapat di dalam retina mamalia dan kebanyakan haiwan (Garnett et al., 1998). Karotenoid juga mudah teroksida dalam kehadiran cahaya dan oksigen. Semua organisma fotosintetik mengandungi satu atau dua pigmen karotenoid. Karotenoid biasanya dijumpai di dalam sel kloroplas tumbuhan yang mana terkandung dalam klorofil. Disebabkan oleh struktur kimianya, karotenoid berkebolehan dalam menyerap cahaya foton pada panjang gelombang antara 300nm hingga 700nm. Ini bermakna apabila sesuatu cahaya itu diserap, karotenoid itu berkemampuan memindahkan tenaga yang diperolehi dari cahaya foton yang diserap kepada klorofil untuk penyelenggaraan proses fotosintesis iaitu proses di mana tumbuh-tumbuhan menghasilkan karbohidrat melalui penyerapan cahaya (Thomas et al., 1998). Karotenoid mempunyai ikatan dubel berkonjugat iaitu ikatan ganda dua (tak tepu) yang berselang- seli dengan ikatan tunggal. Dalam ikatan rantai, setiap atom karbon membentuk ikatan dubel dengan atom karbon yang lain. Karotenoid terbahagi kepada dua kelas yang utama iaitu karotin dan xantofil. Karotin tidak mengandungi molekul oksigen kerana ia terbentuk daripada hidrokarbon asli yang mempunyai karbon dan hidrogen. Manakala xantofil yang terdiri daripada lutein dan zeaxanthin ada mengandungi atom oksigen (Garnett et al., 1998). Buah-buahan dan sayur-sayuran merupakan sumber utama karotenoid dalam pemakanan manusia (Sommerburg, 1998). Di dalam tumbuh-tumbuhan, karotenoid boleh dijumpai dalam daun, batang atau tangkai sayur-sayuran, buah-buahan dan bunga (Thomas et al., 1998). Secara umumnya, kandungan karotenoid dapat dianggar berdasarkan kepada keamatan warna yang terdapat pada bahagian tumbuhan yang hendak dikaji. Antara faktor-faktor yang dipercayai mempengaruhi kandungan karotenoid di dalam tumbuhan ialah masa penuaian, masa penyimpanan dan cara pemprosesan itu sendiri. Di samping itu juga, karotenoid merupakan sejenis antioksidan yang berfungsi sebagai penghalang kepada kerosakan sel yang disebabkan oleh molekul radikal bebas yang tidak stabil terhasil semasa tisu sel berfungsi. Karotenoid berasal dari perkataan akarnya iaitu ‘carrot’ pada tahun 1831 di mana pada ketika itu Wackender telah memisahkan pigmen karotin daripada lobak (Hanspeter, 1992). Walaupun jumlah karotenoid dalam sumber semulajadi didapati dengan banyaknya, namun hanya sebilangan kecil sahaja iaitu antara 40 hingga 50 jenis karotenoid yang terdapat dalam pemakanan manusia yang mana diserap atau digunakan dalam badan (Khachik, 2001). Terdapat banyak kajian yang menunjukkan betapa pentingnya karotenoid dalam pemakanan manusia kerana ia merupakan bahan antioksidan yang diperlukan oleh badan manusia sebagai pencegah kerosakan sel seperti yang dinyatakan di atas. Sebagai contoh, kajian yang telah dijalankan oleh penyelidik di Amerika menunjukkan bahawa satu hidangan bayam atau kailan sekurang-kurangnya sekali dalam seminggu dapat mengurangkan sebanyak 39% risiko mendapat penyakit AMD (Brink et al., 1994). Di samping itu, pengambilan makanan yang mempunyai karotenoid yang tinggi dapat mengurangkan risiko daripada mendapat penyakit barah yang mana merupakan penyebab kedua kematian di Amerika dan mengurangkan risiko mendapat penyakit jantung yang boleh menyebabkan kematian (Majchrzak et al., 2000). 2.5 Zeaxanthin Secara umumnya, zeaxanthin merupakan sejenis pigmen berwarna kuning yang secara semulajadi wujud di dalam mata manusia. Zeaxanthin memainkan peranan penting sebagai penapis sinaran ultra ungu daripada memasuki mata secara terus. Namun begitu peningkatan usia manusia dan penggunaannya secara maksimum menyebabkan kekurangan pigmen tersebut di dalam mata dan boleh merosakkan komponen mata yang penting. Zeaxanthin merupakan sejenis karotenoid yang dijumpai dalam tumbuhan berdaun hijau dan berpotensi bagi mengurangkan risiko mendapat penyakit Age Related Macular Degeneration atau AMD (Sommerburg et al., 1998). Penglihatan yang kurang jelas merupakan tanda awal bagi penyakit AMD. Walaubagaimanapun lama kelamaan sel-sel dalam makula akan menjadi rosak dan terdapat satu tompok buta yang kecil di bahagian tengah penglihatan manusia (Tufts University Diet & Nutrition letter, 1995). Keadaan sebegini terus berlarutan dari masa ke semasa dan akhirnya akan menyebabkan kehilangan penglihatan secara kekal. Bagi memastikan kesihatan mata sentiasa terjaga , pemakanan sayur-sayuran berdaun hijau dicadangkan kerana sumber ini kaya dengan zeaxanthin. Sebanyak 35 jenis buah-buahan dan sayur-sayuran pernah dianalisis untuk menentukan kandungan zeaxanthin dan lutein secara tepat. Seterusnya proses pemisahan bagi kedua-dua pigmen ini dilakukan untuk mengetahui kandungannya secara individu (Sommerburg , 2000). Jadual 2.1 di bawah menunjukkan kandungan zexanthin dalam tumbuhan yang terpilih di Amerika Syarikat pada 1998 (USDA-NCC Carotenoid Database for U.S. Foods, 1998). Jadual 2.1: Kandungan zeaxanthin dalam tumbuh-tumbuhan yang terpilih (USDA-NCC Carotenoid Database for U.S. Foods, 1998) Tumbuh-tumbuhan Kandungan Purata (Pg/100g) Kacang Buncis 44 Brokoli 23 Lobak 23 Daun saderi 3 Kailan 266 Salad 187 Kacang Peas 58 Bayam 331 AMD merupakan penyebab utama berlakunya buta kekal di kalangan warga tua (Yates dan Moore, 2000). Selain daripada zeaxanthin, lutein juga merupakan sejenis karotenoid yang memang terdapat di dalam tisu mata manusia dan keduaduanya memainkan peranan penting dalam memastikan kesihatan mata terjamin. Jadual 2.2 di bawah menunjukkan ciri-ciri zeaxanthin (Hills, 1989). Jadual 2.2 : Ciri-ciri zeaxanthin (Hills, 1989) Nama biasa Zeaxanthin Nama kimia 3,3’-dihydroxy-.beta.-carotene Formula molekul C40H56O2 Jisim molekul relatif (JMR) 568.9 Suhu simpanan -18qC Keterlarutan Tidak larut dalam air tetapi larut dalam pelarut organik Kepolaran Berpolar O max 452 nm Kadar Penyerapan 2416 dL/g.cm Kehadiran zeaxanthin di tengah-tengah makula mata menolong menghalang mata daripada mengalami kerosakan yang diakibatkan oleh proses pengoksidaan. Kekurangan kandungannya kesan oleh peningkatan usia dan penggunaan secara maksimum boleh diatasi dengan pengambilan zeaxanthin yang disari dari sayursayuran sebagai nutrisi tambahan dalam bentuk pil vitamin atau bahan tambah dalam makanan (Garnett et al., 1998). 2.5.1 Ciri-Ciri Zeaxanthin Rajah 2.1 di bawah menunjukkan rantai karbon bagi zeaxanthin (Suhaila dan Azizah, 1990) Rajah 2.1: Rantai karbon Zeaxanthin (E,E-carotene-3,3’-diol). Zeaxanthin dibentuk oleh penambahan dua kumpulan hidroksi kepada beta karotin yang mana nama kimianya adalah karotin dihidroksi, namun ada juga ahli kimia yang menggunakan nama karotin diol. Nama penuh bagi bahan kimia zeaxanthin adalah ‘3,3’-dihydroxy-.beta-carotene’. Nama biasa molekul ‘zeaxanthin’ ini diberikan kerana pertama kali dikenal pasti sebagai pigmen yang terdapat dalam jagung yang mana nama saintifik jagung adalah zea mays (Garnett et al., 1998). 2.5.2 Stereokimia Dan Isomer Zeaxanthin Dalam formula molekul zeaxanthin, terdapatnya 3 atom karbon di kedua-dua hujung gelang rantai karbon zeaxanthin yang mana merupakan chiral atau simetri. Disebabkan faktor inilah maka terdapatnya empat stereoisomer di dalam pigmen zeaxanthin. Stereoisomer yang dimaksudkan terdiri daripada isomer 3R-3R’ dan 3S3S’ di mana atom karbon chiral 3 dan 3’ di sebelah kiri dan kanan hujung rantai karbon mempunyai konfigurasi R dan konfigurasi S. Isomer yang menyebabkan putaran di sebelah kanan adalah R stereoisomer yang mana juga dikenali sebagai D stereoisomer. Isomer yang menyebabkan putaran di sebelah kiri pula dikenali sebagai S stereoisomer yang mana dikenali juga sebagai L stereoisomer. Secara ringkasnya kedua-dua stereoisomer ini dirujuk sebagai R-R dan S-S isomer. Bagi isomer yang ketiga dan keempat pula adalah isomer gabungan yang terdiri daripada satu isomer R dan satu lagi isomer S iaitu isomer 3R-3’S dan isomer 3S-3’R. Oleh kerana zeaxanthin adalah simetri maka isomer ini adalah disimpulkan sama dari semua aspek (Garnett et al., 1998). 2.6 Antioksidan Antioksidan didefinisikan sebagai bahan yang hadir dalam makanan atau dalam badan pada kepekatan yang rendah berbanding substrat yang boleh teroksida. Bahan tersebut dapat melambatkan atau menghalang proses pengoksidaan daripada berlaku (Halliwell et al., 1995). Sesuatu agen antioksidan bertindak menstabilkan radikal bebas dengan cara mendermakan elektron kepadanya (Passwater, 1998). Ini melibatkan proses penurunan (reduction-oxidation) dan proses pengoksidaan (Karlsson, 1997). Agen antioksidan mestilah bahan yang mudah teroksida kerana ia akan mendermakan elektronnya kepada radikel bebas yang mengalami proses penurunan. Kumpulan antioksidan terbahagi kepada dua iaitu antioksidan endogenus dan antioksidan eksogenus. Antara contoh antioksidan endogenus adalah seperti katalase, glutathione peroxidase dan superoxide dismutase. Antioksidan eksogenus pula terdiri daripada bahan-bahan yang didapati daripada diet seperti vitamin E, karotenoid, vitamin c, bioflavonoid dan mineral (Passwater, 1998). Sumber-sumber agen antioksidan semulajadi di dapati daripada pelbagai jenis rempah ratus dan herba. Penggunaan tumbuhan sebagai agen antioksidan dapat mempastikan sumbernya sentiasa boleh diperbaharui ( Kikuzaki dan Nakatani, 1993). 2.7 Struktur Mata Cahaya masuk ke dalam kornea dan melalui kanta penumpu yang dikelilingi oleh cecair putih yang dikenali sebagai vitreous humor. Kemudian, cahaya akan mengenai retina dan mengaktifkan sejenis bahan kimia sensitif yang dipanggil rhodopsin. Rhodopsin terdapat di dalam rod dan kon yang terhasil daripada sel saraf yang terdapat di dalam retina. Apabila rhodopsin serta bahan kimia lain yang mempunyai persamaan dengannya tetapi mempunyai gelombang sensitiviti yang berbeza diaktifkan oleh cahaya yang merupakan satu siri tindakbalas biokimia untuk menghasilkan isyarat, isyarat ini akan dihantar ke otak untuk diproses dan menjadi penglihatan. Sebelum cahaya sampai ke retina, ia telah melalui membran penghad dalaman yang memisahkan cecair vitreous humor daripada bendalir sel retina, diikuti oleh stratun opticum yang mengandungi gentian saraf yang membawa isyarat daripada rod dan kon kepada saraf optik yang utama, satu lapisan set ganglionic, plexiform luaran dan dalaman, lapisan nuklear, membran penghad luaran dan lapisan rod dan kon yang biasanya dirujuk sebagai pengumpulan fotoreseptor (Garnett et al., 1998). Terdapat satu lapisan berpigmen yang berada di atas lapisan rod dan kon dipanggil Retinal Pigmented Epitelium (RPE). Ia mengandungi pigmen melanin yang tebal untuk menyerap cahaya dan mengelakkan daripada dipantulkan balik ke dalam mata. Bahagian luar RPE (posterio) terlekat pada struktur yang dipanggil membran bruch iaitu matrik tanpa selular yang membenarkan oksigen dan nutrien meresap ke dalam sel RPE dan membenarkan sisa metabolik meresap keluar daripada RPE dan seterusnya dibuang. Selepas lapisan kapilari ini, terdapat sklera yang merupakan satu struktur berfungsi untuk memegang biji mata dalam bentuk sfera. Secara keseluruhannya, cahaya mesti melalui berbagai lapisan set saraf dan gentian sebelum ia boleh sampai rod dan kon yang menukarkannya kepada isyarat saraf. Satu bahagian kecil yang berbentuk bulat dipanggil fovea terletak di bahagian tengah retina dan berdiameter kurang daripada satu milimeter, yang tidak mempunyai sel atau gentian saraf yang terdapat di laluan cahaya masuk sebelum ia sampai kepada fotoreseptor kon. Ini menyebabkan kon terdedah kepada cahaya masuk yang lebih terbuka, dengan kurang halangan selular dan gangguan sebelum cahaya itu sampai kepada fotoreseptor (Garnett et. al., 1998) Fovea terletak di tengah bulatan besar yang dipanggil makula. Macula lutea atau makula terdapat berhampiran dengan kawasan tengah retina. Garis pusatnya pula di antara 1.0-1.5mm. Makula mempunyai sedikit rod, kerana kebanyakkan fotoreseptor adalah berentuk kon (di fovea iaitu di tengah makula, tidak ada rod langsung). Ia menghasilkan imej yang tajam untuk objek yang dilihat terus oleh mata terutamanya di kawasan yang terang. Bahagian retina lain pula menghasilkan penglihatan pheripheral iaitu membolehkan mata melihat objek di sisi ketika melihat terus ke hadapan. Makula dibezakan dengan warna kuningnya yang disebabkan oleh pigmen yang berwarna kuning iaitu zeaxanthin (Garnett et. al., 1998) 2.8 Penyakit Buta Kekal “Age Related Macular Degeneration”(AMD) Mata merupakan pancaindera yang paling penting bagi manusia. Kurniaan penglihatan dari pencipta mestilah digunakan dengan sebaik mungkin dan menghayati keindahan alam maya. Penjagaan mata amat dititik beratkan supaya penglihatan yang tetap jelas akan terpelihara meski pun berlakunya penghijrahan umur manusia daripada muda ke tua. Mata yang sihat terhasil dari pemakanan yang seimbang dan penjagaan yang sewajarnya. Buta atau pun hilang penglihatan merupakan masalah kesihatan yang agak besar di Malaysia. AMD biasanya menyerang golongan tua yang berumur 60 tahun ke atas. Tanda awal penyakit ini adalah penglihatan seseorang menjadi kabur sedikit tetapi lama kelamaan sel-sel dalam makula akan rosak (Collins, 1995). Macular degeneration disebabkan oleh sel penglihatan mata di dalam zon makula retina kurang berfungsi. Pada masa yang sama penyakit ini akan melemahkan daya penglihatan dan penglihatan akan hilang secara beransur-ansur. Terdapat dua jenis penyakit macular degeneration iaitu jenis kering dan lembab (Newell, 1996). Kebanyakkan pesakit yang menghidapi penyakit mata jenis kering disebabkan oleh faktor umur dan penipisan tisu di dalam makula. Pembentukan penyakit macular degeneration ini secara beransur-ansur serta perlahan dan biasanya akan menyebabkan kehilangan penglihatan secara halus dan kekal. Rajah 2.2 di bawah menunjukkan perbezaan penglihatan bagi penglihatan yang normal dan penglihatan yang mengalami macular degneration. Rajah 2.2 : Kesan daripada macular degeneration (diadaptasikan daripada National Eye Institute, 2004) Pelbagai langkah kerja diambil dalam mengatasi penyakit ini. Namun penyakit ini belum ditemui cara perawatan yang khusus dalam merawatinya. Bagi mengelakkan ianya berlaku, hanya dengan cara mencegah dapat dilakukan buat masa terdekat ini. Banyak kajian telah dilakukan dan salah satu penemuan yang telah diperolehi adalah dengan pengambilan sumber-sumber makanan yang mengandungi zeaxanthin dan lutein akan dapat menghalang seseorang itu daripada mendapat penyakit ini (Sommerburg et al., 1998). Justeru itu di barat telah dijual pil-pil tambahan bagi pengambilan makanan tambahan yang mengandungi unsur ini. Namun ia belum dikomersialkan secara meluas di seluruh dunia. Penyakit ini masih belum diketahui umum kerana tiadanya kesedaran di kalangan kita yang mana peranan kerajaan dalam menyebarkan risalah bagi mengatasinya serta cara untuk menghalangnya dari menular ke serata masyarakat warga tua. Rajah 2.3 di bawah menunjukkan keratan rentas mata manusia. Rajah 2.3 : Keratan rentas mata manusia (www.ama-assn.org) 2.9 Punca-Punca AMD Antara faktor yang menjadi punca kepada AMD ialah kehadiran pengoksida yang reaktif seperti radikal bebas dan atom oksigen tunggal. Kehadiran radikal bebas boleh merosakan sel makula. Manusia boleh terdedah kepada radikal bebas apabila seseorang itu terdedah kepada cahaya matahari yang berlebihan dan merokok. Terdapat juga beberapa jenis penyakit yang boleh membawa kepada macular degeneration. Penyakit-penyakit ini termasuk penyakit Stargardt, penyakit Best, penyakit Batten, sindrom Sjogren-Larsson, cone-rod dystroph, dan ovine ceroid lipofuscinosis. Kebanyakan daripada penyakit ini dipercayai mempunyai komponen genetik, iaitu ia boleh diwarisi (Garnett et al., 1998). 2.10 Konsep Penyarian Pepejal-Cecair (Pengurasan) Penyarian pepejal-cecair atau pun ‘leaching’ lebih dikenali sebagai pengurasan. Pengurasan adalah satu kaedah pemisahan di mana bahan terlarut di dalam satu campuran diasingkan daripada bahan tidak larut dengan melarutkannya di dalam pelarut yang bersesuaian (Coulson et al., 1991). Proses penyarian pepejal-cecair melibatkan dua langkah utama iaitu menyentuh cecair pelarut dengan pepejal bagi memindahkan bahan larut ke pelarut dan memisahkan larutan terhasil dari sisa pepejal. Proses sentuhan cecair pelarut dengan pepejal melibatkan langkah berikut (Noorhalieza, 2000): i) Pelarut berpindah dari larutan pukal pelarut ke permukaan pepejal. ii) Pelarut perlu meresap ke dalam pepejal. iii) Bahan larut melarut ke dalam pelarut. iv) Bahan larut kemudiannya meresap melalui campuran pepejal pelarut ke permukaan pepejal. v) Bahan larut berpindah ke larutan pukal. Prinsip penyarian pepejal-cecair melibatkan proses pemindahan jisim daripada fasa pepejal ke fasa cecair. Pemindahan jisim dalam penyarian berlaku melalui resapan dalam keterlarutan zarah. Resapan merupakan satu proses penyerakan bahan kesekitaran iaitu molekul atau ion disingkirkan daripada permukaan pepejal dan masuk ke dalam larutan pukal. Dalam proses penyarian, resapan berlaku pada peringkat pelarut meresap ke dalam pepejal dan bergantung kepada kepekatan komponen yang melarut. Penyarian pepejal-cecair digunakan bagi mendapatkan komponen tersari atau untuk mendapatkan semula sisa pepejal (Rydberg et al., 1992). Dalam industri farmaseutikal, kebanyakan produk yang dihasilkan diperolehi dengan menggunakan proses penyarian ini dan biasanya bahagian yang digunakan dalam tumbuhtumbuhan adalah akar, daun dan batang. Tujuan penyarian adalah untuk (Rohana dan Amir, 1992): i) Mengasingkan dan memekatkan sebatian kimia yang terdapat di dalam sampel untuk kajian yang seterusnya. Pengasingan sesuatu sebatian yang dikehendaki diperolehi dengan penggunaan pelarut tertentu. Kaedah yang biasanya dipilih ialah kaedah penyarian keseimbangan tunggal secara sekumpul dan selanjar. ii) Pemisahan dan penulenan satu komponen sampel daripada campuran di mana proses penyarian yang dilakukan mestilah berulangkali sehingga sampel pada ketulenan yang dikehendaki diperolehi untuk penganalisaan seterusnya. Kaedah yang biasa di aplikasikan untuk proses penyarian pepejal-cecair ialah kaedah konvensional iaitu pencampuran sampel dalam bentuk pepejal dengan pelarut dan di homogenkan dengan menggunakan homogeniser serta dibiarkan semalaman sehingga semua sampel dianggarkan telah tersari. Proses penurasan diperlukan untuk mengasingkan campuran pigmen dan pelarut yang dikehendaki dengan sisa pepejal. Proses ini dilakukan berulang kali bagi meningkatkan hasil penyarian yang diperolehi (Rohana dan Amir, 1992). 2.11 Konsep Pemindahan Jisim Dalam Proses Penyarian Pepejal-Cecair Pemindahan jisim memainkan peranan penting dalam proses penyarian. Ia terjadi apabila komponen di dalam campuran berpindah dalam fasa yang sama atau pun dari fasa ke fasa disebabkan oleh perbezaan kepekatan di antara dua titik (Geankoplis, 1995). Jumlah pemindahan jisim bergantung kepada luas permukaan bahan, masa, kepekatan dan pemilihan pelarut. Pelarut yang mempunyai kebolehlarutan yang tinggi akan menyebabkan lebih banyak zarah yang terlarut di dalamnya, maka jumlah pemindahan jisim juga akan meningkat. Kadar pemindahan jisim dipengaruhi oleh daya pacu dan rintangan. Daya pacuan wujud akibat daripada perbezaan kepekatan bahan yang dipindah manakala rintangan pula wujud akibat daripada medium di mana bahan dipindah akan melaluinya dan keadaan resapan yang tidak mantap (Dechow dan Frederick, 1989). Mekanisme pemindahan jisim berlaku semasa proses resapan. Tujuan proses pemindahan jisim sesuatu bahan daripada suatu fasa homogen kepada fasa homogen yang lain adalah untuk memisahkan komponen campuran tersebut (Robiah, 2000). Pemindahan jisim dalam pepejal penting bagi proses kimia dan biologi kerana ia biasanya diaplikasikan dalam proses penyarian makanan (Geankoplis, 1995). Pemindahan jisim diasaskan mengikut hukum keabadian jisim dan hukum lain seperti Hukum Fick (Robiah, 2000). Apabila pemindahan jisim yang melibatkan dua fasa iaitu pepejal dan cecair, pekali pindah jisim boleh diperolehi melalui persamaan 2.1 di bawah di mana Kd adalah pekali pemindahan jisim dan Cf(1) serta Cf(2) adalah kepekatan keseimbangan bahan larut (Spiro, 1984). Kd Cf (2) Cf (2) (Cf (1) (2.1) Pekali pemindahan jisim akan memberikan gambaran kepada proses pemindahan jisim di mana apabila nilai pekali pemindahan jisim tinggi, kadar pemindahan jisim juga tinggi. Nilai pemalar kadar penyarian (K0) adalah berkadar terus dengan pekali pindah jisim. Apabila nilai pekali pemindahan jisim tinggi, pemalar kadar penyarian juga tinggi di mana ia menunjukkan bahawa rintangan pada permukaan adalah lebih kecil. Dalam keadaan larutan yang lebih bergelora, rintangan yang wujud adalah kecil dan ianya akan menjadikan nilai pemalar kadar penyarian lebih tinggi. Nilai pemalar kadar penyarian boleh diperolehi daripada persamaan 2.2 di bawah di mana Cf adalah kepekatan akhir dan t adalah masa penyarian. ln Cf Cf C K 0t (2.2) 2.12 Faktor-Faktor Yang Mempengaruhi Proses Penyarian Pepejal-Cecair Terdapat beberapa faktor yang mempengaruhi proses penyarian pepejalcecair iaitu saiz bahan yang hendak dikaji, nisbah bahan dengan pelarut, masa pengurasan dan jenis pelarut dan suhu proses. 2.12.1 Saiz Bahan Saiz bahan atau sampel juga mempengaruhi kadar penyarian. Semakin kecil saiz bahan maka semakin besar luas permukaan bersentuhan antara pepejal dan cecair dan semakin kecil jarak yang dilalui oleh bahan larut untuk meresap ke dalam pelarut. Kepentingan saiz bahan dapat diseragamkan supaya setiap bahan memerlukan masa yang hampir sama untuk disari. Walaubagaimanapun penghasilan bahan dalam saiz yang sangat halus perlu dielakkan kerana ia akan menghalang aliran pelarut (Coulson et al., 1991). Apabila bahan berada dalam keadaan suspensi di dalam larutan, pengacauan yang digunakan semasa penyarian tidak dapat membantu mempercepatkan proses penyarian. 2.12.2 Nisbah Bahan Dengan Pelarut Nisbah bahan dengan pelarut ini memberi kesan kepada darjah kelikatan larutan dan jumlah luas permukaan bagi partikel yang bersentuhan (Coulson et al., 1991). Peningkatan isipadu pelarut juga menghasilkan luas permukaan yang besar di antara fasa pepejal dan fasa cecair. Disamping itu juga, lebih banyak bahan larut yang dapat diserap. Walaubagaimanapun, satu takat optimum akan dicapai dimana peningkatan dalam isipadu pelarut tidak lagi mempengaruhi kadar penyarian kerana pada isipadu tersebut kesemua bahan yang hendak disari telah tersari sepenuhnya. 2.12.3 Masa Penyarian Untuk mencapai kadar penyarian yang optimum, masa penyarian juga ditiitk beratkan. Jika masa yang diperuntukkan untuk sesuatu pelarut bertindakbalas dengan pepejal untuk melarutkan bahan larut tidak mencukupi, maka hasil yang maksimum tidak diperolehi. Oleh sebab itu masa penyarian tertentu diperlukan untuk mendapatkan hasil yang maksimum, bergantung kepada kaedah yang akan digunakan dalam proses penyarian pepejal-cecair ini. Apabila masa penyarian yang diperuntukkan adalah lama maka kepekatan bahan larut dalam larutan juga akan bertambah dan akan menghasilkan lebih banyak bahan yang tersari. 2.12.4 Pelarut Pemilihan sesuatu pelarut yang sesuai untuk sesuatu proses adalah penting Pelarut boleh ditakrifkan sebagai satu bahan yang boleh membawa pepejal kepada keadaan bendalir. Pelarut mestilah dalam bentuk cecair iaitu sebatian organik mudah meruap yang mampu mengeluarkan bahan organik tidak mudah meruap tanpa mengalami sebarang perubahan secara kimia. Kebiasaannya metanol, etanol dan aseton, merupakan pelarut yang digunakan untuk proses penyarian pepejal-cecair ini (Tiwari, 1995). Kadar keterlarutan sesuatu bahan di dalam setiap larutan adalah berbeza. Pemilihan pelarut adalah berdasarkan tegangan permukaan, takat didih, ketumpatan dan kelikatan. Tegangan permukaan yang rendah akan memudahkan pembasahan pepejal. Kelikatan yang rendah pula akan memudahkan pengaliran berlaku dan membantu kadar resapan bahan larut dalam pelarut. Ketumpatan yang rendah juga akan mengurangkan jisim pelarut terlekat pada pepejal dan pelarut yang bertakat didih tinggi akan meningkatkan kos perolehannya semula. Di samping itu juga pelarut yang dipilih mestilah selektif, murah, tidak beracun dan mudah diperolehi (Noorhalieza, 2000). Ciri-ciri fizikal bagi pelarut yang biasa digunakan dalam pengurasan ada ditunjukkan dalam jadual 2.3 di bawah. Jadual 2.3 : Ciri-ciri fizikal bagi pelarut Nama pelarut Jisim Molekul Takat Indeks Ketumpatan Relatif didih (qC) biasan (g/ml) (gm/mol) Kelikatan (CP 25qC) (25qC) Aseton 58.080 56.0 1.356 0.791 0.30 Etanol 46.069 78.2 1.3614 0.789 1.1 Klorofom 119.38 62.0 1.443 1.483 0.53 Heksana 86.18 68.7 1.372 0.659 0.30 Metanol 32.04 65.0 1.326 0.791 0.54 Tetrahidrofuran 72.10 66.0 1.405 0.881 0.46 Walaubagaimanapun, pelarut yang dipilih mestilah dikaji dari aspek tindakbalas sampingannya kerana dikhuatiri akan melarutkan komponen yang tidak terlibat di dalam proses yang diperlukan. Jadual 2.4 di bawah menunjukkan susunan pelarut yang di susun mengikut polariti. Jadual 2.4 : Urutan pelarut mengikut polariti Pelarut Kekuatan pelarut 0 Heksana, petroleum ringan Benzena, toluena Polariti bertambah 2.7 Dietil eter 2.8 Klorofom, diklorometana 4.1 Etil asetat 4.4 Butanon, metil etil keton 4.7 Aseton 5.1 Butanol 3.9 Etanol 4.3 Metanol 5.1 Air 10.2 2.12.5 Suhu Proses Apabila suhu yang tinggi diaplikasikan, darjah keterlarutan bahan di dalam pelarut akan meningkat. Hasil penyarian yang lebih pekat akan diperolehi. Di samping itu juga, kelikatan pelarut menurun dan akan meningkatkan kemeresapan bahan larut ke pelarut. Walaubagaimanapun, suhu yang terlalu tinggi tidak sesuai bagi sesetengah bahan makanan dan bahan perubatan kerana boleh menyebabkan bahan yang tidak dikehendaki di sari. Antara kesan yang lain ialah menyebabkan kehilangan pelarut secara penyejatan, berlakunya kerosakan pada pepejal serta membahayakan. (Noorhalieza, 2000). 2.13 Resapan Di dalam Pepejal Mengikut Hukum Fick Dalam kes ini, resapan di dalam pepejal tidak bergantung kepada struktur sebenar sesuatu pepejal. Resapan berlaku apabila cecair atau pelarut melarut di dalam pepejal untuk membentuk larutan yang lebih homogenus. Secara umumnya, persamaan Hukum Fick bagi pemindahan jisim dalam resapan untuk aliran jisim satu dimensi dapat diwakili oleh persamaan 2.3 di bawah: N AB , y DAB dC A dy (2.3) NAB, y = Fluks kepekatan bahan A menembusi bahan B dalam arah y CA = Kepekatan bahan A DAB = Resapan jisim Keresapan yang terlibat ialah keresapan jisim . Daya pacuan ialah perbezaan kepekatan A manakala rintangan pula ialah songsangan keresapan jisim yang bertindak dalam arah y. Dalam proses resapan jisim seperti yang diterangkan oleh Hukum Fick, komponen A meresap menerusi campuran komponen A dan B. 2.13 Resapan Dalam Pepejal Berliang Yang Bergantung Kepada Struktur Pepejal Dalam kes ini, struktur pepejal yang berongga dan mempunyai liang-liang kosong (void) akan mempengaruhi kadar resapan yang berlaku seperti yang ditunjukkan dalam rajah 2.4 di bawah. NA z z1 z2 Rajah 2.4 : Rajah proses resapan dalam pepejal berongga Berdasarkan rajah 2.4 di atas, di dalam keadaan di mana ruang-ruang kosong yang ada telah dipenuhi dengan air, didapati kepekatan garam di dalam air pada titik 1 ialah CA1 dan kepekatan garam pada titik 2 ialah CA2. Resapan garam akan berlaku melalui liang-liang kosong yang telah dipenuhi air dan arah laluannya tidak diketahui. Jarak laluan ini adalah lebih besar daripada jarak (z2-z1) dengan faktor pembetulan W. Contoh resapan dalam pepejal berliang yang bergantung kepada struktur pepejal adalah proses resapan kalium klorida (KCL) di dalam silika berliang. Resapan tidak akan berlaku dalam pepejal yang lengai. Persamaan untuk proses resapannya di tunjukkan di dalam persamaan 2.4 di bawah. NA HDAB (C A1 C A2 ) W ( z 2 z1 ) (2.4) di mana: H = keliangan W = Tegasan ricih kilasan (faktor pembetulan untuk jarak laluan yang melebihi (z2z1) DAB = Aktiviti peresapan oleh bahan larut dalam pelarut (m2/s) CA1 = Kepekatan bahan larut dalam pelarut pada titik 1 (kgmol/s.m3) CA2 = Kepekatan bahan larut dalam pelarut pada titik 2 (kgmol/s.m3) z2-z1= Jarak resapan (m) 2.15 Ultrasonik Ultrasonik merupakan suatu gelombang bunyi yang melebihi had pendengaran manusia. Ia berada dalam frekuensi melebihi 16kHz (Ensminger, 1973). Ultrasonik merupakan suatu cabang akustik di mana ia melibatkan getaran gelombang. Ultrasonik juga merupakan suatu gelombang tekanan di mana ia hanya boleh bergerak atau pun berpindah dengan kehadiran media berjisim seperti cecair. Oleh sebab itu, ultrasonik hanya boleh dihantar daripada suatu media ke media yang lain apabila ia bersentuhan secara terus antara satu sama lain. Ini menunjukkan pergerakan gelombang ultrasonik amat berbeza dengan pergerakan gelombang cahaya mahu pun sebarang radiasi elektromagnet yang mampu bergerak menembusi vakum (Hasrinah, 2001). Gelombang ultrasonik juga boleh dianggap sebagai suatu gelombang elastik kerana ia mempunyai sifat elastik bagi sesuatu media. Ia berfungsi sebagai penyerap getaran yang diperlukan untuk sesuatu gelombang ultrasonik itu tersebar. Penggunaan ultrasonik terbahagi kepada dua kategori iaitu ultrasonik berintensiti tinggi dan ultrasonik berintensiti rendah. Penggunaan ultrasonik berintensiti tinggi lebih tertumpu kepada penghantaran tenaga yang terjana sekadar menembusi media. Kebiasaannya objektif teknik ini adalah untuk mempelajari dan memahami media tersebut atau pun menghantar maklumat dari luar ke media tersebut. Apabila sesuatu bahan terdedah kepada gelombang ultrasonik tinggi, ia mungkin akan berubah dari keadaan asalnya (Hasrinah, 2001). Ultrasonik jenis ini biasanya diaplikasikan untuk rawatan perubatan, pengatoman cecair, pengimpalan plastik dan logam, mengubah keadaan sel biologikal dan juga untuk pembersihan sesuatu bahan mahu pun peralatan. Ultrasonik berintensiti rendah pula biasanya tidak akan merubah keadaan media yang diuji. 2.15.1 Teori Bunyi Apabila partikel dalam sesuatu medium didedahkan kepada tenaga mekanikal, ia akan bergetar. Getaran partikel ini akan dipindahkan dalam bentuk tenaga ke partikel-partikel yang berdekatan. Seterusnya partikelpartikel tersebut juga akan turut bergetar dan tenaga yang terjana akan ditukarkan dalam bentuk gelombang yang dikenali sebagai gelombang mekanikal ataupun gelombang akustik. Gelombang mekanikal yang tersebar dalam medium pepejal dikenali sebagai getaran, manakala gelombang yang tersebar dalam medium cecair dikenali sebagai bunyi (Rosli, 1996). Getaran mekanikal tidak semestinya menghasilkan gelombang bunyi. Ini kerana gelombang bunyi yang mempunyai sifat elastik, memerlukan medium untuk berlakunya getaran. Oleh itu, getaran tidak boleh berlaku dalam keadaan vakum. Getaran berlaku bergantung kepada molekul mediumnya, di mana ia akan memindahkan getaran itu ke molekul-molekul berdekatan sebelum kembali ke kedudukan molekul asalnya. Gelombang bunyi berfungsi sebagai pengangkut tenaga sahaja. Bagi cecair dan gas, ayunan partikel berlaku pada arah yang sama dengan gelombangnya dan menghasilkan gelombang membujur. Pepejal pula bergetar secara bersudut tepat dengan arah pergerakan gelombang yang menghasilkan gelombang melintang (Hasrinah, 2001). Rajah 2.5 di bawah menunjukkan penghasilan gelombang membujur (a) dan gelombang melintang (b). Getaran partikel Arah gelombang Getaran partikel Arah gelombang Gelombang membujur Gelombang melintang (a) (b) Rajah 2.5: Pergerakan Gelombang Dan Partikel 2.15.2 Klasifikasi Gelombang Bunyi Gelombang bunyi boleh diklasifikasikan kepada tiga kategori berdasarkan perbezaan frekuensi di mana ia terjana. Kelas-kelas bunyi dimaksudkan ialah bunyi infra, bunyi audibel dan bunyi ultra. Manusia pada kebiasaannya boleh mendengar gelombang bunyi yang terjana dalam julat frekuensi 16 Hz hingga 16 kHz. Bunyi ultra pula dalam kategori gelombang bunyi yang melebihi had pendengaran manusia biasa iaitu melebihi 20 kHz (Mason dan Lorimer, 1998). Tidak ada had maksima yang tepat bagi frekuensi ultrasonik. Namun, biasanya untuk had maksima gas dikira pada 5 MHz, manakala pepejal dan cecair pula dikira pada 500 MHz (Mason dan Lorimer, 1998). Bagi gelombang bunyi yang kurang daripada 16 Hz pula dikenali sebagai bunyi infra. Semua bentuk getaran mekanikal mempunyai sifat fizikal tertentu tidak kira ia daripada kategori bunyi infra, audibel mahupun ultra. Sesetengah sifat-sifat ini boleh berubah apabila gelombang tersebut bergerak daripada satu medium ke medium yang lain (Hasrinah 2001). 2.15.3 Kesan Fizikal Daripada Tenaga Ultrasonik Terdapat dua kesan fizikal yang ketara apabila tenaga ultrasonik didedahkan ke atas media cecair. Pada intensiti yang rendah, penggumpalan partikel mungkin berlaku apabila sesuatu suspensi itu didedahkan kepada gelombang ultrasonik. Apabila intensiti itu meningkat, tenaga yang terjana akan turut meningkat melebihi daripada daya ikatan antara molekul cecair media. Seterusnya ini akan menggalakkan proses peronggaan (Mason, 1990). Peronggaan di dalam cecair berlaku disebabkan oleh tegangan yang terhasil apabila gelombang bunyi melaluinya. Gelombang bunyi ini melibatkan kitaran pengecutan dan pengembangan terhadap cecair. Sekiranya tekanan yang wujud semasa proses pengembangan cukup rendah, cecair akan menjadi gelembung yang lebih kecil yang dikenali sebagai peronggaan. Pada keadaan ini, gelombang lebih peka terhadap perubahan tegangan yang dihasilkan oleh gelombang bunyi (Mason, 1990). 2.15.4 Teknologi Ultrasonik Dalam Proses Penyarian. Penyarian merupakan satu kaedah yang penting untuk mendapatkan dan menulenkan bahan aktif daripada tumbuhan. Kebanyakan teknik tradisional adalah berdasarkan pemilihan pelarut dan penggunaan haba serta pengadukan untuk meningkatkan keterlarutan bahan dan kadar pemindahan jisim. Kaedah ini memerlukan masa penyarian yang lama dan berkecekapan rendah. Bahan semulajadi adalah tidak stabil haba dan boleh terurai. Dewasa ini, penggunaan ultrasonik yang berkeamatan tinggi diaplikasikan dengan meluas. Penyarian kompaun organik daripada pelbagai tumbuhan boleh ditingkatkan dengan berbantukan keamatan ultrasonik untuk meningkatkan hasil pada masa yang singkat dan mengurangkan penggunaan pelarut. Tambahan pula, penyarian dengan penggunaan ultrasonik boleh dijalankan pada suhu yang rendah, justeru mengelakkan kerosakan terma dan kehilangan komponen mudah meruap ketika proses pendidihan (Jian Yong Wu et. al., 2001). Industri makanan akan memberikan keuntungan yang banyak kesan daripada pembangunan yang berterusan dan pengaplikasian teknik ultrasonik (McClements, 1995). Peningkatan penyarian dengan menggunakan ultrasonik disumbangkan oleh kesan mekanikal peronggaan akustik yang meningkatkan penembusan pelarut ke dalam bahan dan berkebolehan memusnahkan dinding sel serta mengeluarkan bahan yang terdapat dalam sel tersebut (Jian Yong Wu et. al., 2001). Potensi penggunaan ultrasonik dalam meningkatkan proses kimia menarik minat penyelidik kimia industri dalam usaha mereka untuk pengeluaran hasil yang lebih ekonomi. Penggunaan ultrasonik berupaya meningkatkan kadar tindak balas, hasil, menukarkan laluan tindak balas dan mencetuskan tindak balas baru. Selain daripada itu, penggunaan ultrasonik ini juga mewujudkan keadaan operasi yang menggunakan suhu dan tekanan yang rendah bagi mengelakkan kemusnahan hasil serta mengurangkan kos penghasilan. Kelebihan proses ultrasonik ini adalah disebabkan oleh kesan sonokimia terhadap ultrasonik. Ini memerlukan keamatan ultrabunyi yang lebih tinggi daripada 50Wcm-2. Ia adalah berbeza daripada kesan proses sono ultrasonik yang bertindak meningkatkan proses fizikal seperti pengkristalan semula dan penyarian. Kesan ini terjadi pada keamatan ultrasonik yang lebih rendah iaitu kurang daripada 50Wcm-2 (Mason, 1990). Penyumbang utama kepada keberkesanan proses penyarian dengan menggunakan tenaga ultrasonik adalah kadar peronggaan yang berlaku. Buih peronggaan terhasil ketika kitar pemampatan gelombang akustik. Antara faktorfaktor yang mempengaruhi proses peronggaan ini adalah apabila wujudnya kehadiran gas, tekanan luar , kelikatan dan ketegangan permukaan, pemilihan pelarut yang sesuai, suhu dan frekuensi (Mason, 1990). BAB 3 METODOLOGI KAJIAN 3.1 Pendahuluan Bagi mencapai objektif kajian, kerja-kerja penyelidikan telah dibahagikan kepada tiga bahagian yang utama iaitu proses pemilihan sampel berdasarkan literatur dan ujikaji, proses pengoptimuman parameter kajian dan proses penentuan kaedah penyarian yang terbaik. Proses prarawatan bagi kesemua sampel dilakukan sebelum disari. Dalam kajian ini sayur yang terlibat akan dibilas dengan air untuk menyingkirkan bendasing yang berada di permukaan daunnya. Kemudian sayur tersebut ditoskan dan dibiarkan di atas kertas selama 30 minit sebelum digunakan di dalam proses penyarian. 3.2 Proses Pemilihan Tujuan kajian ini adalah untuk mengenal pasti sayur-sayuran yang mempunyai kandungan zeaxanthin yang tinggi. Sayur-sayuran yang dipilih dalam kajian ini berdasarkan sayur-sayuran yang disarankan oleh kajian literatur dan merupakan sumber sayur-sayuran utama bagi rakyat Malaysia. Dalam kajian ini hanya bahagian daun sahaja yang digunakan. Senarai sayur-sayuran yang digunakan dalam kajian ini ada ditunjukkan dalam jadual 3.1 di bawah. Jadual 3.1 : Senarai sampel kajian A1 Bayam hijau A2 Bayam merah A3 Sawi A4 Kangkung A5 Salad A6 Kailan A7 Pegaga A8 Pucuk paku A9 Cekur manis A10 Pudina A11 Brokoli A12 Turi A13 Kubis A14 Kacang bendi A15 Kacang buncis A16 Ulam raja Tiga kaedah penyarian diaplikasikan untuk menentukan sampel sayur yang mengandungi peratusan zeaxanthin paling tinggi. Kaedah tersebut melibatkan kaedah rendaman, kaedah soxhlet dan kaedah ultrasonik. Ketiga-tiga kaedah penyarian digunakan dalam proses pemilihan ini untuk menyakinkan lagi keputusan yang akan diperolehi adalah tepat Ketiga-tiga kaedah diuji kadar kemampuannya untuk menyari zeaxanthin sebanyak yang mungkin berdasarkan parameter kajian yang telah ditetapkan di dalam literatur seperti di dalam jadual 3.2 di bawah. Jadual 3.2 : Parameter kajian yang ditetapkan dalam proses penyarian zeaxanthin Kaedah rendaman Kaedah Kaedah ultrasonik soxhlet Masa penyarian 24 jam 6 jam 20 minit Nisbah sampel (g) 10 : 50 10 : 200 10 : 60 Jenis pelarut Aseton Aseton Aseton Isipadu air (medium) tiada tiada 2.0 liter terhadap isipadu pelarut (ml) 3.2.1 Kaedah Rendaman Penyarian zeaxanthin dengan menggunakan kaedah rendaman adalah kaedah piawai yang biasa digunakan oleh penyelidik-penyelidik terdahulu untuk menyari bahan aktif semulajadi di dalam tumbuh-tumbuhan. Kaedah ini telah dibangunkan oleh Brubacher et al. pada tahun 1985. Ringkasan proses penyarian ini ada ditunjukkan dalam rajah 3.1 di bawah. Sampel segar (sayur-sayuran) Dikisar selama 1 minit menggunakan pengisar Sampel halus (saiz=2.5mm-5mm) Dicampurkan mengikut nisbah yang telah ditetapkan Pelarut Suhu = -18qC mengikut jangkamasa kajian dihomogenkan selama 15 minit Larutan sampel Suhu simpanan adalah pada -18qC mengikut Di simpan di dalam peti ais jangkamasa kajian Proses penurasan Hasil sarian Kitar semula (sisa pepejal) sebanyak 2 kali Rajah 3.1 : Proses penyarian zeaxanthin menggunakan kaedah rendaman Sayur-sayuran yang segar digunakan dalam kajian ini bagi memastikan tidak ada sebatian yang akan terurai semasa penyimpanan atau pengeringan (Fasihuddin dan Hasmah, 1993). Dalam kaedah rendaman ini, sebanyak 10 gram bagi setiap jenis sayur-sayuran yang akan digunakan diasingkan dan dikisar menjadi halus. Kira-kira 50 ml pelarut dimasukkan ke dalam bikar yang mengandungi sayuran tersebut dan dihomogenkan dengan menggunakan homogeniser. Campuran tersebut dibiarkan selama 24 jam. Seterusnya larutan yang dihasilkan dituras bagi memisahkan sisa pepejal dan hasil sarian yang terlarut di dalam pelarut. Bagi mendapatkan hasil yang maksimum proses di atas diulang dua kali dengan menggunakan sisa pepejal selepas penurasan dan sejumlah isipadu pelarut yang baru dengan masa rendaman yang sama iaitu 24 jam (Brubacher et al., 1985). Hasil sarian yang diperolehi dianalisis menggunakan spektrofotometer bagi mengenal pasti jumlah kandungan zeaxanthin di dalamnya. Carta alir kajian bagi proses kitar semula sisa pepejal ada ditunjukkan dalam rajah 3.1 di bawah. Pelarut baru Pelarut baru Pelarut baru Hasil sarian 1 2 3 Sampel Sisa Hasil turasan Hasil turasan Rajah 3.2 : Carta alir kajian 3.2.2 kaedah Soxhlet Kaedah soxhlet ini biasanya digunakan untuk menyari sebatian semulajadi kerana teknik ini mudah dan dapat memberikan kecekapan yang tinggi. Dalam kaedah ini, alat penyarian soxhlet yang digunakan adalah selamat jika dibiarkan beroperasi tanpa perhatian dalam tempoh yang panjang (Rohana dan Amir, 1992). kadar aliran pelarut daripada permulaan proses penyarian hingga ke akhir proses adalah dikawal (Rohana dan Amir, 1992). Ini bermakna alat penyari ini akan mengawal keseluruhan operasi penyarian secara automatik. Masa yang diperlukan bagi kaedah ini untuk mencapai keseimbangan bergantung kepada keupayaan pelarut melarut bahan yang hendak disari. Kaedah soxhlet ini biasanya digunakan untuk menyari sebatian organik daripada sampel semulajadi seperti daun, akar, batang tumbuh-tumbuhan, liken dan fungi. Penggunaannya terhad kepada pelarut bersifat meruap dan sebatian yang diguras mestilah stabil pada suhu pendidihan pelarut. Rajah 3.3 dan rajah 3.4 di bawah menunjukkan gambarajah alat radas untuk penyarian zeaxanthin secara soxhlet. Rajah 3.3 : Alat untuk penyarian zeaxanthin menggunakan kaedah soxhlet Rajah 3.4 : Komponen radas kaedah soxhlet Sistem penyarian soxhlet ini terdiri daripada turus penyarian yang mempunyai salur sisi, kelalang takungan, kondenser dan alat pemanas. Dalam kaedah ini, bahan yang hendak disari dimasukkan ke dalam corong thimble yang diperbuat daripada selulosa dan dimasukkan ke dalam turus penyarian. Pelarut yang diperlukan dimasukkan ke dalam kelalang bulat dalam isipadu yang telah ditetapkan untuk kajian ini. Pelarut tersebut seterusnya dipanaskan dengan menggunakan alat pemanas sehingga mendidih di mana wap pelarut tersebut akan meruap ke atas dan melalui kondenser yang mana akan berlakunya proses kondensasi. Proses kondensasi merupakan satu proses yang melibatkan penukaran fasa wap kepada fasa cecair. Cecair yang terhasil akan mengalir masuk ke dalam thimble yang mengandungi sampel yang hendak disari. Proses penyarian berlaku di dalam thimble di mana bahan larut melarut ke dalam pelarut yang digunakan. Pelarut akan berterusan terkumpul di bahagian thimble sehingga paras limpah di mana limpahan akan turun semula ke dalam kelalang bulat dan proses pengewapan akan berlaku serta meninggalkan bahan larut di dalamnya. Semasa proses penyarian ini berlaku, kepekatan larutan yang terkumpul di dalam kelalang berubah menjadi semakin pekat dari masa ke semasa. Ini kerana bahan larut tersebut terkandung di dalam pelarut yang berada di dalam kelalang tersebut (Rohana dan Amir, 1992). Hasil sarian akan dianalisis menggunakan spektrofotometer bagi menentukan kandungan zeaxanthin di dalamnya. 3.2.3 Kaedah Ultrasonik Kaedah ini merupakan kaedah yang agak baru dalam proses penyarian pepejal cecair di mana masa penyarian yang agak singkat diambil untuk memperolehi hasil sarian berbanding dengan kaedah-kaedah yang lain. Secara umumnya bahan yang hendak disari akan dimasukkan ke dalam sejumlah isipadu pelarut yang diperlukan di dalam kelalang Erlenmeyer. Campuran tersebut dibiarkan di dalam takung rendaman (ultrasonic bath) selama 20 minit. Hasil yang diperolehi akan melalui proses penurasan yang mana sisa pepejal dan hasil cecair dipisahkan (Sargenti dan Vichnewski, 2000). Gambaran proses penyarian menggunakan kaedah ini ada ditunjukkan dalam rajah 3.5 di bawah. Proses penurasan pengisar Pam Peti ais Sampel dan pelarut Hasil sarian Takung rendaman Rajah 3.5 : Gambaran proses penyarian menggunakan kaedah ultrasonik 3.3 Proses Pengoptimuman Parameter kajian Ketiga-tiga kaedah iaitu rendaman, soxhlet dan ultrasonik digunakan untuk menyari zeaxanthin daripada sayur-sayuran tempatan. Bagi proses pengoptimuman parameter, hanya satu sampel sayur yang memberikan hasil sarian zeaxanthin yang tertinggi dipilih sebagai bahan kajian. Tujuan utama proses pengoptimuman ini adalah untuk mendapatkan parameter kajian yang optimum dengan penghasilan zeaxanthin secara maksimum daripada sayuran yang terpilih. Rajah 3.6 di bawah menunjukkan turutan proses pengoptimuman ini berlaku. Proses penyarian Analisis kuantitatif Analisis statistik Rajah 3.6 : Gambarajah turutan proses pengoptimuman Proses penyarian dilakukan menggunakan tiga kaedah penyarian iaitu rendaman, soxhlet dan ultrasonik. Turutan ujikaji adalah mengikut rekabentuk kajian yang diperolehi daripada perisian STATISTICA V5.0. Analisis kuantitatif pula adalah analisis yang melibatkan penggunaan spektrofotometer untuk mendapatkan nilai kandungan zeaxanthin di dalam setiap hasil sarian. Di samping itu juga, kadar penyarian zeaxanthin ditentukan untuk pembandingan bagi ketiga-tiga kaedah penyarian dalam menilai kecekapan dan kelebihan kaedah itu sendiri. Analisis statistik adalah tertumpu kepada penggunaan kaedah gerakbalas permukaan (Response Surface methodology) untuk mencari nilai optimum bagi setiap pembolehubah atau parameter yang terlibat dan mengkaji kesan interaksi diantaranya. 3.3.1 Rekabentuk Eksperimen STATISTICA V5.0 (Statsoft, Inc., 2000) merupakan salah satu perisian yang digunakan untuk merekabentuk eksperimen dan menganalisis keputusan eksperimen. Perisian ini digunakan untuk mengenal pasti hubungan di antara pembolehubah bersandar dan pembolehubah tak bersandar serta interaksi diantara pembolehubah. Eksperimen akan dijalankan berdasarkan matrik eksperimen yang diperolehi daripada kaedah rekabentuk eksperimen yang diperkenalkan oleh STATISTICA ini. Dalam kajian ini, rekabentuk eksperimen yang digunakan adalah reka bentuk pecahan faktorial. Keseluruhan keputusan eksperimen boleh dianalisa dalam bentuk graf kontor dan graf rekabentuk tindak balas permukaan tiga dimensi. Carta pareto dan jadual anova yang diperolehi daripada perisian ini akan membantu dalam mengenalpasti pembolehubah dan interaksi di antara pembolehubah yang signifikan terhadap pembolehubah bersandar. Kesan utama parameter dan kesan interaksi parameter terhadap hasil boleh ditentukan melalui perisian ini (Devore & Farnum, 1999). Rekabentuk eksperimen yang digunakan dalam kajian ini ialah Rekabentuk Pecahan Faktorial (Fractional Factorial Design) iaitu (3(3-1)) dengan 27 ujikaji termasuk dua kali ulangan untuk kaedah rendaman dan kaedah soxhlet dijalankan terhadap tiga pembolehubah (parameter kajian) di dalam proses penyarian. Pembolehubah tersebut ialah jenis pelarut, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan masa penyarian. Manakala kaedah ultrasonik pula memerlukan 81 ujikaji iaitu (3(4-1)) untuk dijalankan terhadap empat pembolehubah (parameter kajian) termasuk dua kali ulangan di dalam proses penyarian. Pembolehubah tersebut adalah jenis pelarut, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut, masa penyarian dan isipadu air di dalam takung rendaman. Sayur yang terpilih semasa proses pemilihan 16 jenis sayur-sayuran di permulaan kajian digunakan sebagai sampel di dalam ketiga-tiga proses penyarian ini. Kaedah rekabentuk eksperimen digunakan untuk menilai kesan pembolehubah tak bergantung yang terlibat (parameter kajian) terhadap pembolehubah bergantung (hasil sarian dan kadar penyarian). Perisian STATISTICA Version 5.0 digunakan untuk mereka bentuk kajian ini dan menganalisa secara grafik data-data yang diperolehi daripada rekabentuk eksperimen yang telah dijalankan. Nilai-nilai optimum bagi penghasilan zeaxanthin diperolehi daripada perisian STATISTICA ini dengan menyelesaikan persamaan regresi dan juga daripada plot kontur gerak balas permukaan (Response surface). 3.3.1.1 Pembolehubah Tidak Bergantung (Bebas) Rekabentuk eksperimen yang digunakan adalah berdasarkan nilai tiga aras faktor bagi setiap pembolehubah iaitu pada peringkat (aras) rendah (-1), peringkat pertengahan (0) dan pada peringkat tertinggi (+1) dengan dua kali ulangan. Penentuan peringkat bagi setiap pembolehubah ini ditentukan berdasarkan kajian literatur. Sebagai contoh, bagi kaedah rendaman, soxhlet dan ultrasonik, tiga pelarut yang dikaji adalah etanol, aseton dan tetrahidrofuran. Ketiga-tiga pelarut ditentukan kedudukan (peringkat) berdasarkan keupayaannya secara teori dalam menyari zeaxanthin daripada sampel sayur. Berdasarkan literatur didapati tetrahidrofuran mempunyai keupayaan yang tinggi dalam proses penyarian zeaxanthin, maka tetrahidrofuran diletakkan pada peringkat tertinggi (+1) diikuti oleh aseton pada peringkat pertengahan (0) dan etanol pada peringkat terendah (-1). Bagi pembolehubah masa penyarian, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan isipadu air, nilai yang paling kecil diletakkan pada aras terendah (0) dan nilai yang paling besar diletakkan pada aras tertinggi (+1). Nilai pertengahan (0) adalah nilai yang berada di antara nilai yang paling kecil dan nilai yang paling besar. Nilai setiap peringkat (-1, 0,+1) bagi faktor-faktor pembolehubah untuk setiap kaedah penyarian ini ada ditunjukkan di dalam jadual 3.3, jadual 3.4 dan jadual 3.5 di bawah. Jadual 3.3 : Pembolehubah kajian bagi kaedah rendaman Pembolehubah A Nama pembolehubah Jenis pelarut B Nisbah jisim sampel (g) terhadap isipadu pelarut (ml) Masa penyarian C Peringkat (Aras) Etanol (-1), Aseton (0), Tetrahidrofuran (+1) 10:200 (-1), 20:200 (0), 30:200 (+1) 24 jam (-1), 48 jam (0), 72 jam (+1) Jadual 3.4 : Pembolehubah kajian bagi kaedah soxhlet Pembolehubah A Nama pembolehubah Jenis pelarut B Nisbah jisim sampel (g) terhadap isipadu pelarut (ml) Masa penyarian C Peringkat (Aras) Etanol (-1), Aseton (0), Tetrahidrofuran (+1) 10:200 (-1), 20:200 (0), 30:200 (+1) 2 jam (-1), 6 jam (0), 10 jam (+1) Jadual 3.5 : Pembolehubah kajian kaedah ultrasonik Pembolehubah A Nama Pembolehubah Jenis pelarut Peringkat (Aras) Etanol (-1), Aseton (0), Tetrahidrofuran (+1) 10:200 (-1), 20:200 (0), 30:200 (+1) B C Nisbah jisim sampel (g) terhadap isipadu pelarut (ml) Masa penyarian 20 minit (-1), 40 minit (0), 60 minit (+1) D Isipadu air 2.0 L (-1), 3.0L (0), 4.0L (+1) Matriks eksperimen bagi setiap kaedah penyarian ditentukan oleh perisian STATISTICA V5.0 dengan mengambil kira semua pembolehubah yang terlibat. Jadual 3.6 di bawah menunjukkan matriks eksperimen tanpa ulangan untuk kaedah rendaman dan kaedah soxhlet di mana melibatkan pembolehubah tidak bergantung (parameter kajian) iaitu jenis pelarut, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan masa penyarian. Jadual 3.6 : Matriks eksperimen bagi kaedah rendaman dan kaedah soxhlet Bilangan Pembolehubah A Pembolehubah B Pembolehubah C 1 -1 -1 -1 2 -1 0 +1 3 -1 +1 0 4 0 -1 +1 5 0 0 0 6 0 +1 -1 7 +1 -1 0 8 +1 0 -1 9 +1 +1 +1 Matriks eksperimen untuk kaedah ultrasonik adalah berbeza dengan kaedah rendaman dan kaedah soxhlet kerana jumlah pembolehubah tidak bergantung yang dikaji dalam kajian ini adalah berbeza. Dalam kaedah ultrasonik ini terdapat satu pembolehubah lain yang ditambah memandangkan kepentingan pembolehubah ini dalam mempengaruhi hasil yang akan diperolehi. Pembolehubah yang terlibat adalah jenis pelarut, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut, masa penyarian dan isipadu air di dalam takung rendaman (sebagai medium untuk gelombang ultrasonik). Jadual 3.7 di bawah menunjukkan matriks eksperimen tanpa ulangan untuk kaedah ultrasonik. Jadual 3.7 : Matriks eksperimen bagi kaedah ultrasonik Bilangan 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Pembolehubah Pembolehubah Pembolehubah Pembolehubah A B C D -1 -1 -1 -1 -1 -1 0 +1 -1 -1 +1 0 -1 0 -1 +1 -1 0 0 0 -1 0 +1 -1 -1 +1 -1 0 -1 +1 0 -1 -1 +1 +1 +1 0 -1 -1 +1 0 -1 0 0 0 -1 +1 -1 0 0 -1 0 0 0 0 -1 0 0 +1 +1 0 +1 -1 -1 0 +1 0 +1 0 +1 +1 0 +1 -1 -1 0 +1 -1 0 -1 +1 -1 +1 +1 +1 0 -1 -1 +1 0 0 +1 +1 0 +1 0 +1 +1 -1 +1 +1 +1 0 0 +1 +1 +1 -1 3.3.1.2 Pembolehubah Bergantung Terdapat dua pembolehubah bergantung dikaji dalam kajian ini. Pembolehubah tersebut adalah hasil sarian zeaxanthin (mg) dan kadar penyarian zeaxanthin (mg/min). Nilai pembolehubah bergantung ini diperolehi berdasarkan analisis zeaxanthin secara kuantitatif dengan menggunakan spektrofotometer. 3.4 Penganalisaan Data Kandungan zeaxanthin yang telah disari dianalisis dengan menggunakan kaedah analisis secara kualitatif dan kuantitatif. Analisis kualitatif adalah analisis yang dapat membuktikan kehadiran dan kewujudan zeaxanthin di dalam hasil sarian daripada proses penyarian. Kebiasaannya, analisis ini dilakukan bersama-sama dengan sampel piawainya bagi pembuktian yang lebih kukuh. Walaubagaimanapun, analisis ini masih boleh dilakukan tanpa kehadiran sampel piawai dengan membandingkan nilai faktor penahanan (Rf) yang diperolehi hasil daripada eksperimen yang dilakukan dengan nilai yang diperolehi daripada literatur. Analisis kuantitatif diperlukan untuk menentukan hasil sarian zeaxanthin yang dapat disari daripada sampel dengan menggunakan spektrofotometer. 3.4.1 Analisis Zeaxanthin Secara Kualitatif Dengan Menggunakan Thin Layer Chromatography (TLC) Kaedah kromatografi lapisan nipis (Thin Layer Chromatography) melibatkan proses pemisahan bahan larut apabila berlaku penghijrahan bahan larut tersebut (zeaxanthin) melalui fasa pegun dengan adanya aliran fasa bergerak. Empat bahan erapan yang sering digunakan ialah gel silika, alumina, kieselguhr dan selulosa. Bahan erapan ini berfungsi sebagai fasa pegun dalam kaedah kromatografi cecair pepejal. Dalam kajian ini, gel silika digunakan berdasarkan kesesuaiannya dalam mekanisma pemisahan bahan yang hendak dikaji. Faktor yang mempengaruhi kecekapan pemisahan hendaklah diambil kira di mana melibatkan pemilihan jenis fasa pegun yang bersesuaian dengan jenis sampel dan pemilihan sistem pelarut yang hendak digunakan untuk berfungsi sebagai fasa bergerak (Rohana dan Amir, 1992). Rajah 3.7 di bawah menunjukkan proses analisis data secara kualitatif dengan menggunakan kaedah kromatografi lapisan nipis. Analisis (sampel diletakkan sebagai spot halus) Proses kembang maju Pengeringan Pengesanan melalui sinaran ultralembayung Rajah 3.7 : Prinsip penggunaan kaedah kromatografi lapisan nipis 3.4.1.1 Kromatografi Lapisan Nipis (TLC) Kromatografi lapisan nipis atau lebih dikenali sebagai TLC merupakan satu teknik pemisahan yang ringkas, cepat dan murah dalam menganalisis sampel secara kualitatif. TLC biasa digunakan bagi menentukan ketulenan hasil sintesis dan pemisahan hasilan semulajadi. Rajah 3.8 di bawah menunjukkan ciri ringkas sistem kromatografi lapisan nipis (Marsin, 1998). Rajah A adalah permandangan dari sisi yang menunjukkan atmosfera yang tepu dengan wap pelarut. Rajah B adalah pemandangan dari depan menunjukkan zon-zon zat terlarut setelah pemisahan dijalankan. Penutup A B Kertas tebal dibasahi pelarut Permukaan fasa pepejal Pelarut Rajah 3.8 : Sistem kromatografi lapisan nipis (TLC) Berdasarkan rajah di atas, plat yang bersalut dengan fasa pepejal pada sebelah permukaannya diletakkan di dalam balang pembangunan yang mengandungi sedikit fasa cecair. Plat ini boleh disandarkan pada dinding balang atau digantung menggunakan penyepit. Balang tersebut mesti ditutup bagi mengekalkan atmosfera yang tepu dengan wap pelarut yang digunakan serta mengelakkan pengewapan fasa bergerak dari permukaan plat itu. Dalam proses TLC, pengelusi akan bergerak ke atas (melawan graviti) melalui lapisan nipis yang terbentuk daripada bahan fasa pepejal. Pergerakan ini disebabkan oleh fenomena tarikan liang-liang halus di dalam fasa pepejal tersebut iaitu aktiviti rerambut (Marsin, 1998). Sampel dititikkan ke atas plat pada bahagian atas sedikit daripada paras permukaan cecair pembangunan. Semasa proses pembangunan dijalankan, zat-zat terlarut yang berlainan bergerak pada kadar yang berlainan mengekori bahagian depan pelarut pembangun itu yang dikenali sebagai depan pelarut. Depan pelarut selalunya dibiarkan sehingga hampir mencapai atas plat barulah pembangunan dihentikan. Sebelum kesemua pelarut pada plat itu sempat meruap, depan pelarut hendaklah segera ditandakan dengan pensil . Zat-zat terlarut itu berada pada jarak- jarak yang berlainan dari titik permulaan. Titik zat terlarut itu dinamakan zon zat terlarut (Marsin, 1998). 3.4.1.2 Fasa Pepejal Untuk TLC Fasa pepejal TLC biasanya terdiri daripada bahan yang disalutkan di atas permukaan plat kaca atau plastik di mana mempunyai ketebalan 0.20-0.25mm. Zarah yang terkandung dalam fasa pepejal ini halus, berdiameter kurang dari 15µm. Silika gel merupakan fasa pepejal yang paling banyak digunakan. Silika gel ialah SiO2 terhidrat yang terbentuk daripada pemendakan larutan asid silikat diikuti dengan pembasuhan dan pengeringan. Bahan ini mempunyai luas permukaaan sekitar 500m2g-1. Tapak aktif yang berinteraksi dengan zat terlarut ialah kumpulan silanol, Si-OH dengan anggaran 0.5nm antara satu sama lain. Fasa pepejal lain yang digunakan dalam TLC ialah alumina dalam bentuk Al2O3 (Marsin, 1998). 3.4.1.3 Fasa Bergerak Dalam TLC Pelarut fasa bergerak memainkan peranan dalam penahanan zat terlarut dengan memberi saingan kepada zat terlarut untuk berinteraksi dengan tapak aktif di atas fasa pepejal penjerap. Jika pelarut itu mempunyai tarikan yang agak lemah terhadap penjerap, zat terlarut itu akan lebih melekat kepada penjerap itu dan ia akan bergerak perlahan-perlahan relatif terhadap fasa bergerak. Jika fasa bergerak itu tertarik kuat kepada penjerap itu, pelarut akan menyesarkan zat terlarut daripada fasa pepejal itu dan zat terlarut itu akan bergerak pada kadar yang hampir sama dengan pelarut (Marsin, 1998). 3.4.1.4 Faktor Perlambatan Pemisahan TLC selalunya dibiarkan berjalan sehingga depan pelarut hampir mencecah hujung plat TLC itu. Dengan perpindahan setiap zat terlarut yang dikesan dengan cara yang telah diterangkan di atas boleh diukur dengan menggunakan faktor perlambatan atau faktor penahanan (Rf). Untuk pengiraan nilai perlambatan itu, jarak yang dilalui oleh zat terlarut diukur dari titik permulaan hingga ke pusat zon terlarut apabila zat terlarut itu boleh dilihat sebagai titik nyata (Marsin, 1998). Rajah 3.9 di bawah merupakan contoh hasil analisis sampel yang dilakukan menggunakan TLC. Garisan pelarut kembang maju x x x x x x x y Garis sampel Ɣ x x y Rajah 3.9 : Analisis sampel dengan menggunakan kaedah kromatografi lapisan nipis Analisis zeaxanthin secara kualitatif dilakukan menggunakan konsep yang sama seperti rajah 3.9. Plat silika gel dipotong mengikut saiz yang bersesuaian dengan analisis yang akan dilakukan. Saiz yang bersesuaian bermaksud saiz yang diperlukan mengikut anggaran bilangan sampel yang akan dikaji bagi setiap plat dan ketinggian maksimum berdasarkan teori yang akan dicapai oleh setiap fasa bergerak. Fasa bergerak yang dipilih untuk pemisahan bahan larut (zeaxanthin) berdasarkan nisbah pelarut heksana ke atas pelarut aseton iaitu 65:35 (U.S Patent : 6,262,284). Campuran pelarut tersebut dihomogenkan selama 20 minit. Sampel piawai zeaxanthin dan sampel yang ingin diuji ditandakan di atas garisan yang telah dilakarkan pada plat TLC . Selepas proses pemisahan berlaku dengan sempurna, hasil pemisahan yang diperolehi diperhatikan di bawah alat pengesan UV pada gelombang ganda 254 / 365nm (Cole-parmer 9818 series, Illinois). Retardation factor (Rf) atau faktor penahanan dikira dengan menggunakan persamaan di bawah. Gambarajah proses pemisahan yang berlaku ada ditunjukkan dalam rajah 3.9 di bawah. Rf = Jarak sampel daripada garis suntikan sampel Jarak garis depan pelarut dari garis suntikan sampel Garis pelarut Sampel X Spot asal sampel di atas garisan sampel Rajah 3.10 : Gambarajah proses pemisahan sampel 3.4.2 Analisis Zeaxanthin Secara Kuantitatif Dengan Menggunakan Spektrofotometer Analisis kuantitatif zeaxanthin dilakukan dengan menggunakan kaedah spektrofotometer pada gelombang 452nm (Eric dan Harry, 1997). Air ternyahion digunakan sebagai sampel kosong (blank). Sampel piawai zeaxanthin digunakan sebagai sampel rujukan. Semua sampel yang diuji dijalankan dalam dua replikat. Jumlah kandungan zeaxanthin ditentukan dengan menggunakan persamaan 3.1 di bawah (Britton et al., 1995). x di mana A u y u1000 % A11cm u100 x = kandungan zeaxanthin (mg) A = kadar penyerapan y = Hasil sarian (ml) 1% A1cm = Pekali penyerapan spesifik (3.1) BAB 4 KEPUTUSAN DAN PERBINCANGAN 4.1 Proses Pemilihan Sampel Sayur Sayuran yang mengandungi zeaxanthin yang paling tinggi telah dikenal pasti hasil daripada proses pemilihan 16 jenis sayuran tempatan yang dikaji berdasarkan kajian literatur dan ujikaji menggunakan ketiga-tiga kaedah iaitu rendaman, soxhlet dan ultrasonik. Ujikaji awal ini dapat menentukan kandungan zeaxanthin bagi setiap sayur-sayuran melalui analisis kualitatif (Kromatografi Lapisan Nipis) dan analisis kuantitatif (Spektrofotometer). 4.1.1 Analisis Kualitatif Jadual 4.1 di bawah menunjukkan keputusan analisis kualitatif menggunakan kaedah Kromatografi Lapisan Nipis (TLC) yang telah dijalankan ke atas 16 jenis sampel sayur-sayuran yang telah disari berdasarkan kaedah rendaman. Faktor penahanan dikira berdasarkan jarak sampel daripada garis suntikan sampel terhadap jarak garis depan pelarut dari garis suntikan sampel. Jadual 4.1 : Faktor Penahanan bagi 16 jenis sampel sayur-sayuran Sampel Nama sampel Nama Saintifik Faktor penahanan (Rf) A1 Bayam hijau Amaranthus gangeticus 0.51 A2 Bayam merah Amaranthus gangeticus 0.47 A3 Sawi Brassica nigra 0.56 A4 Kangkung Ipomea reptans L. 0.54 A5 Salad Lactuca sativa 0.47 A6 Kailan B.Oleracea L. var. Alboglabra 0.48 A7 Pegaga Centella asiatica 0.53 A8 Pucuk paku Diplazium esculentum 0.56 A9 Cekor manis Sauropus androgynus 0.48 A10 Pudina Mentha arvensis 0.46 A11 Brokoli A12 Turi A13 Kubis B.Oleracea var italica Sesbania grandiflora B.Oleracea L. var. capitata 0.48 0.53 0.48 A14 Kacang bendi Hibiscus esculentus 0.47 A15 Kacang buncis Vigna unguiculata 0.48 A16 Ulam raja Cosmo caudatus 0.48 Berdasarkan beberapa kajian yang telah dilakukan oleh penyelidik, didapati julat faktor penahanan (Rf) bagi zeaxanthin adalah dari 0.44 (Hodison et al., 1997) hingga 0.56 (Indofine Chemical Company, 2000-2001). Dari jadual 4.1 di atas, nilai faktor penahanan yang diperolehi daripada ujikaji menggunakan kromatografi lapisan nipis menunjukkan kehadiran zeaxanthin di dalam setiap sampel yang dikaji. Daripada keputusan tersebut dapatlah disimpulkan bahawa semua jenis sayuran sesuai untuk dijadikan sampel ujikaji kerana mengandungi zeaxanthin. Walaubagaimana pun secara praktikalnya, pemilihan perlu dibuat berdasarkan kuantiti zeaxanthin yang paling banyak di dalam sayuran disamping faktor-faktor yang lain iaitu harga sayur yang murah dan sayur yang mudah diperolehi. Oleh sebab itu analisis kuantitatif perlu dijalankan untuk mencapai hasrat tersebut. Analisis kuantitatif dilakukan menggunakan spektrofotometer. Nilai Rf yang diperolehi dari ujikaji adalah sedikit berbeza jika dirujuk kepada nilai sebenar di dalam literatur kerana disebabkan oleh beberapa faktor seperti jenis pelarut, faktor alam sekitar dan cara perlaksanaan ujikaji ( Hamilton dan Hamilton, 1987). 4.1.2 Analisis Kuantitatif Rajah 4.1 di bawah menunjukkan peratus bagi kandungan zeaxanthin di dalam setiap sampel sayur-sayuran yang dikaji. Peratus Zeaxanthin Di dalam 16 Jenis Sayur Menggunakan Kaedah Rendaman, Soxhlet dan Ultrasonik peratus kandungan zeaxanthin (%) 0.12000 0.10000 0.08000 0.06000 0.04000 0.02000 0.00000 A1 A2 A3 A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 Sampel rendaman soxhlet ultrasonik Rajah 4.1 : Perbandingan kandungan zeaxanthin di dalam sampel sayur-sayuran A16 Merujuk kepada rajah 4. 1 di atas, ketiga-tiga kaedah memberikan kesimpulan yang sama di mana menyetujui bahawa cekur manis (A9) merupakan sayuran yang paling tinggi mempunyai peratusan kandungan zeaxanthin iaitu masing-masing 0.03150% (rendaman), 0.0968% (soxhlet) dan 0.0780% (ultrasonik). Manakala kubis didapati mempunyai peratusan kandungan zeaxanthin yang terendah di kalangan 16 jenis sayur-sayuran yang dikaji iaitu masing-masing 0.0000535% (rendaman), 0.000739% (soxhlet) dan 0.00741% (ultrasonik). Perbezaaan peratusan kandungan zeaxanthin yang agak besar boleh dilihat di antara cekur manis dan kubis untuk ketiga-tiga kaedah ujikaji yang telah dijalankan iaitu 0.0314% (rendaman), 0.0961% (soxhlet) dan 0.0706% (ultrasonik). Skop kerja ini hanya mengaplikasikan kaedah yang dibangunkan oleh penyelidik terdahulu berdasarkan literatur tanpa melibatkan pengoptimuman parameter proses. Hasil sarian zeaxanthin dalam miligram bagi 16 jenis sayur untuk tiga kaedah penyarian iaitu rendaman, soxhlet dan ultrasonik ditunjukkan dalam jadual 4.2 di bawah Jadual 4.2 : Hasil sarian zeaxanthin bagi 16 jenis sayur-sayuran Rendaman Soxhlet Ultrasonik Hasil (mg/10g) Hasil (mg/10g) Hasil (mg/10g) Bayam hijau 1.368 2.532 2.989 Bayam merah 1.424 2.654 2.915 Sawi 0.6635 2.736 3.320 Kangkung 0.6023 2.532 2.915 Salad 0.5717 0.9391 0.962 Kailan 0.9953 3.165 2.450 Pegaga 1.720 4.573 2.291 Pucuk paku 0.4543 3.369 1.886 Cekor manis 3.149 9.677 7.803 Daun pudina 2.077 4.859 1.164 Brokoli 0.1543 0.5240 1.868 Daun turi 1.909 6.819 3.853 Kubis 0.005347 0.07389 0.741 Kacang bendi 0.1006 0.6533 0.686 Kacang buncis 0.05712 0.246 0.612 Ulam raja 1.322 5.696 2.677 Jenis sayur 4.2 Proses Pengoptimuman Parameter Di dalam proses penyarian, setiap parameter proses memainkan peranan penting untuk memastikan proses ini efektif dan memberikan hasil yang maksimum. Kesan daripada penggunaan parameter yang terlibat dikaji untuk mendapatkan parameter proses yang optimum. Sayur cekur manis telah dipilih sebagai sampel untuk kajian ini kerana mempunyai peratusan kandungan zeaxanthin yang tertinggi daripada 16 jenis sayuran lain. 4.2.1 Kaedah Rendaman Kaedah ini merupakan salah satu kaedah yang biasa digunakan untuk proses penyarian sebatian semulajadi. Sebanyak 27 ujikaji telah dijalankan beserta minimum dua kali ulangan terhadap tiga parameter proses iaitu jenis pelarut, masa penyarian dan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang digunakan untuk mendapatkan hasil sarian zeaxanthin yang maksimum. Rekabentuk eksperimen dan analisis secara statistik dilakukan menggunakan Perisian STATISTICA V5.0. Parameter proses optimum boleh diperolehi melalui graf kontur ataupun graf gerakbalas permukaan tiga dimensi yang diperolehi melalui perisian ini. Bagi menentukan sama ada pengoptimuman parameter diperlukan atau sebaliknya bagi kaedah ini, maka pengujian hipotesis digunakan. Ujian hipotesis digunakan untuk menunjukkan bahawa tiada perbezaan di antara nilai yang diukur dan nilai sebenar. Kebanyakkan ujian statistik bermula dengan hipotesis nol (H0) (Azli, 2000). Ujian ini dimulakan dengan ujian hipotesis di mana terdapat dua jenis hipotesis iaitu hipotesis nol dan hipotesis alternatif. Hipotesis nol menyatakan bahawa hasil sarian zeaxanthin yang diperolehi tidak dipengaruhi oleh perubahan nilai parameter kajian yang digunakan. Hipotesis alternatif pula menyatakan bahawa hasil sarian zeaxanthin yang diperolehi dipengaruhi oleh perubahan nilai parameter kajian yang digunakan. Bagi menentukan sama ada hipotesis nol harus diterima atau ditolak maka ujian taburan F digunakan. Nilai varian fisher yang diperolehi daripada jadual anova seperti yang ditunjukkan di dalam jadual 4.3 digunakan untuk menjalankan pengujian terhadap model polinomil. Nilai F jadual ditentukan daripada jadual taburan F (lampiran A). Nilai F ditentukan dengan mengambil aras keertian pada 1% serta darjah kebebasan regrasi dan ralat pada 8 dan 18 (F8,18,0.01). Aras keertian ditandakan dengan menulis P (kebarangkalian)=0.01 iaitu kebarangkalian menolak hipotesis nol yang benar (Wan Aini dan Zuhaimy, 1991). Terdapat tiga aras keertian yang biasa digunakan dalam analisis statistik iaitu 0.1%, 1% dan 5%. Walaubagaimana pun, dalam menentukan sama ada hipotesis nol harus diterima atau ditolak, aras keertian 1% digunakan bagi menyakinkan lagi bahawa keputusan yang dibuat adalah betul (Wan Aini dan Zuhaimy, 1991). Jadual 4.3 di bawah menunjukkan analisis varian terhadap hasil sarian zeaxanthin dengan menggunakan kaedah rendaman. Jadual 4.3 : Analisis varian terhadap hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah rendaman Kuasa dua min R2 Punca Hasil tambah kuasa Darjah F ubahan dua kebebasan Regresi 1852.345 8 231.543 17.13 0.884 Ralat 243.321 18 13.518 - - Jumlah 2095.666 26 - - - Nilai F yang diperolehi daripada model polinomil seperti dalam jadual 4.3 di atas adalah 17.13. Nilai F daripada jadual statistik pada nilai P=0.01 adalah 3.71. Nilai F model polinomil adalah lebih besar daripada nilai F di dalam jadual statistik, maka hipotesis nol ditolak dan hipotesis alternatif diterima (Azli, 2000). Oleh sebab itu proses pengoptimuman diperlukan untuk merealisasikan hipotesis alternatif dimana hipotesis ini menyatakan bahawa hasil sarian zeaxanthin yang diperolehi dipengaruhi oleh perubahan nilai parameter kajian yang digunakan. 4.2.1.1 Kesan Parameter Proses Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin. Kajian terhadap parameter proses dilakukan untuk mendapatkan parameter proses yang optimum. Di samping itu juga, perubahan hasil sarian yang diperolehi kesan dari perubahan nilai parameter yang diaplikasikan juga dikaji. Keputusan yang diperolehi di dalam proses pemilihan sampel sayur digunakan dalam kajian kesan parameter proses terhadap hasil sarian zeaxanthin ini. Berdasarkan 16 jenis sayur yang telah dipilih, didapati sayur cekur manis merupakan sayur yang mengandungi kuantiti zeaxanthin tertinggi. Oleh sebab itu sayur cekur manis telah dipilih sebagai sampel bagi mengkaji kesan parameter proses terhadap hasil sarian zeaxanthin ini. Bagi mencapai objektif kajian ini, sebanyak tiga parameter proses yang dikaji. Parameter ini dipilih berdasarkan kepentingan peranannya dalam menentukan keupayaan sesuatu proses penyarian. Parameter yang dimaksudkan adalah jenis pelarut, masa penyarian dan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut. Pelarut yang digunakan adalah etanol, aseton dan tetrahidrofuran. Tiga masa penyarian yang terlibat adalah 24 jam, 48 jam dan 72 jam. Manakala bagi nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut masing-masing 10g:200ml, 20g:200ml dan 30:200ml. Keputusan ujikaji ditunjukkan melalui plot gerak balas permukaan seperti yang ditunjukkan di dalam rajah 4.2, 4.3 dan 4.4 di bawah. Rajah 4.2 merupakan kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin. Rajah 4.3 pula merupakan kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin dan rajah 4.4 menunjukkan kesan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin. Berpandukan kesemua graf tersebut, parameter kajian yang optimum akan dapat dicapai. Merujuk kepada graf tiga dimensi tersebut, permukaan yang berwarna gelap merupakan kawasan yang maksimum di mana hasil sarian zeaxanthin tertinggi telah diperolehi. Peningkatan kepekatan warna daripada warna yang lebih cerah kepada warna yang lebih tua menunjukkan peningkatan hasil sarian zeaxanthin kesan daripada interaksi kesemua parameter proses yang terlibat di dalam kajian ini. 4.2.1.2 Peringkat Pengoptimuman Parameter Kajian Di dalam bahagian ini, kesan parameter proses terhadap hasil sarian zeaxanthin dibincangkan dan dikaji. Ujikaji telah dilakukan berpandukan rekabentuk kajian yang diperolehi melalui perisian STATISTICA V5.0 (Statsoft inc, 2000). Keputusan ujikaji dianalisa melalui graf tindakbalas permukaan tiga dimensi. Kesemua graf yang diperolehi memainkan peranan dalam menentukan kesan tindak balas parameter yang terlibat dalam menentukan parameter proses yang optimum. Graf ini terbahagi kepada tiga paksi di mana paksi z diwakili oleh hasil sarian zeaxanthin manakala paksi x dan y pula diwakili oleh parameter kajian. 4.2.1.3 Kesan Penggunaan Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Rajah 4.2 dan rajah 4.3 merupakan plot gerak balas permukaan bagi hasil sarian zeaxanthin sebagai fungsi kepada nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap jenis pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap jenis pelarut. Daripada kedua-dua rajah tersebut, dapatlah disimpulkan bahawa penggunaan pelarut yang polar iaitu dari julat pelarut tetrahidrofuran kepada pelarut aseton telah menunjukkan peningkatan hasil sarian zeaxanthin yang tinggi. Ini bermakna peningkatan kepolaran pelarut yang digunakan memberikan kesan positif terhadap peningkatan hasil sarian zeaxanthin. Rajah 4.3 menunjukkan graf optimum telah dicapai di mana hasil sarian zeaxanthin tertinggi yang dapat disari daripada kaedah ini adalah 35.17mg. Ini bermakna 83.64% zeaxanthin dapat disari daripada nilai maksimum kandungan zeaxanthin di dalam sampel cekur manis yang dianggarkan sebanyak 42.05mg.berdasarkan keputusan ujikaji pengoptimuman parameter bagi ketiga-tiga kaedah penyarian. Rajah 4.2 : Kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin Rajah 4.3 : Kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin. Zeaxanthin tergolong di dalam kumpulan karotenoid dan merupakan pigmen yang berpolar. Oleh sebab itu komponen yang berpolar akan disari oleh pelarut yang berpolar juga (Houghton dan Raman, 1998). Walaubagaimanapun, penggunaan pelarut yang berpolar terhad sehingga kepada pelarut etanol mengikut dalam jadual turutan kekutuban pelarut yang telah dibincangkan di dalam literatur pada bab II. Pelarut yang akan memberikan hasil sarian yang maksimum mungkin akan dapat dicapai melalui pengubahsuaian kepekatan pelarut (Gaikar dan Dandekar, 2001). Pelarut yang mempunyai kepolaran yang terlalu tinggi juga akan mempengaruhi keputusan ujikaji bagi hasil sarian zeaxanthin ini. Ianya berlaku kerana pelarut yang mempunyai kepolaran yang tinggi akan menyari pelbagai komponen berpolar lain yang terdapat di dalam sampel sayur. Ini akan menyebabkan kesukaran untuk proses pengasingan komponen yang dikehendaki nanti. Pemilihan pelarut turut bergantung kepada biologi bahan, prawatan awal (pre-treatment) sampel, komposisi karotenoid serta objektif ujikaji itu sendiri sama ada separa penyarian mahu pun penyarian lengkap (Sommerburg et al., 1998). Air dikenal pasti sebagai salah satu pelarut yang baik bagi proses penyarian. Air mempunyai kepolaran yang tinggi tetapi air tidak sesuai untuk dijadikan sebagai pelarut bagi menyari zeaxanthin kerana zeaxanthin merupakan bahan hidrofobik dan tidak larut dalam air (Garnett et. al, 1998). Pemilihan pelarut juga mesti memenuhi kriteria keselamatan dan bersesuaian dengan penggunaannya dalam proses penyarian yang dijalankan. Aseton merupakan pelarut yang biasa digunakan untuk menyari karotenoid. Di samping itu juga, aseton merupakan pelarut yang seringkali digunakan dalam proses penyarian pepejal-cecair seperti ini (Tiwari, 1995). Berdasarkan rajah 4.3 , lengkungan ke atas yang berwarna gelap menunjukkan kawasan di mana pelarut terbaik dikenal pasti dicapai dengan hasil sarian zeaxanthin yang maksimum. Pelarut aseton dipilih sebagai pelarut yang terbaik berdasarkan titik tengah kawasan maksimum (gelap) lebih dekat ke arah aseton jika dibandingkan dengan tetrahidrofuran. 4.2.1.4 Kesan Masa Penyarian Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Berdasarkan rajah 4.3 dan rajah 4.4, jelas menunjukkan bahawa masa yang optimum telah dapat dicapai dalam kajian ini di mana lengkungan ke atas yang berwarna gelap pada rajah 4.3 memberikan hasil sarian tertinggi iaitu 83.64% Penambahan masa penyarian memberikan kesan positif kepada hasil sarian zeaxanthin. Hasil sarian zeaxanthin bertambah dari 21.16% kepada 83.64% apabila masa penyarian dipanjangkan dari 24 jam kepada 53 jam. Pertambahan hasil sebanyak 62.48% telah diperolehi. Masa penyarian merupakan faktor yang penting dalam menentukan sesuatu proses penyarian itu telah mencapai keseimbangan (Houghton & Raman, 1998 dan Tiwari, 1995). Masa optimum yang diperolehi dari kajian ini adalah 53 jam di mana pada jangkamasa ini dianggap ke semua zeaxanthin telah dapat disari sepenuhnya dan proses penyarian telah mencapai keseimbangan. Selepas masa yang ke 53 jam, peratus hasil sarian yang diperolehi akan menjadi malar atau mengalami penurunan kerana pendedahan kepersekitaran yang agak lama telah memusnahkan hasil sarian. Menurut kajian yang telah dilakukan oleh penyelidik terdahulu menunjukkan masa yang terbaik dapat dicapai adalah 24 jam untuk penyarian secara rendaman ini. Walaubagaimanapun peratus hasil sarian zeaxanthin yang diperolehi daripada kajian ini didapati lebih tinggi jika dibandingkan dengan kajian yang telah dilakukannya. Rajah 4.4 : Kesan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.2.1.5 Kesan Nisbah Jisim Sampel Kepada Isipadu Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Jisim sampel yang berpadanan dengan isipadu pelarut akan memberikan hasil sarian yang maksimum. Berdasarkan rajah 4.2 dan 4.4 di atas menunjukkan peningkatan hasil sarian yang diperolehi berikutan penambahan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang digunakan. Walaubagaimanapun dalam kajian ini nisbah yang optimum tidak dapat dicapai kerana di luar julat nisbah yang dikaji di mana graf masih menunjukkan trend peningkatan dan bukannya menunjukkan graf optimum dicapai. Hasil sarian zeaxanthin tertinggi iaitu 35.17mg (83.64%) dicapai pada nisbah tertinggi yang dikaji iaitu 0.16. Nisbah 0.16 adalah bersamaan dengan 32g jisim sampel di dalam 200ml pelarut. Oleh sebab itu, dapatlah disimpulkan bahawa jisim sampel yang lebih besar diperlukan untuk memperolehi nisbah yang optimum. Nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang optimum menunjukkan isipadu pelarut yang dibekalkan berpadanan dengan sampel yang disari supaya tidak berlakunya pembaziran dan kerugian dalam aspek kos penghasilan. Interaksi di antara parameter nisbah dengan jenis pelarut dan masa penyarian menunjukkan interaksi yang positif terhadap hasil sarian zeaxanthin. Interaksi positif yang dimaksudkan d isini adalah dengan peningkatan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan peningkatan masa penyarian yang diaplikasikan dalam proses penyarian ini menunjukkan peningkatan terhadap hasil sarian zeaxanthin yang diperolehi. 4.2.1.6 Model Matematik Bagi Keseluruhan Ujikaji Keseluruhan nilai ujikaji bagi kaedah ini diwakili oleh persamaan model tertib kedua. Bagi membentuk persamaan polinomil tertib kedua sekurangkurangnya tiga titik diperlukan. Persamaan ini diperolehi dengan gabungan nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi yang terlibat seperti di dalam jadual 4.4 di bawah. Nilai-nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi ini diperolehi daripada analisa yang telah dijalankan melalui program STATISTICA V5.0. Di dalam kajian ini parameter proses yang diwakili oleh pembolehubah adalah tiga. Persamaan bagi model matematik yang dibentuk ini dapat menjangkakan tingkah laku bagi setiap pembolehubah dan respon yang terlibat Oleh sebab itu persamaaan yang menghubungkan setiap pembolehubah dengan respon (hasil sarian zeaxanthin) akan diperolehi seperti dibawah. Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 + B23X2X3 +B11X12 + B22X22 + B33X32 (4.1) Di mana B0 = Pemalar B1, B2, B3 = Pekali linear B12, B13, B23 = Pekali interaksi B11, B22, B33 = Pekali kuadratik X1, X2, X3 = Pembolehubah Jadual 4.4 : Nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi di antara pembolehubah Pembolehubah Pekali pembolehubah B0 2.1822 B1 1.3456 B2 95.9444 B3 0.2096 B11 -4.1878 B22 421.5556 B33 -0.0020 B12 -66.3444 Persamaan polinomil tertib kedua yang terhasil daripada nilai pekali pembolehubah yang diperolehi adalah seperti di bawah. Y = 2.1822 + 1.3456X1 + 95.9444X2 + 0.2096X3 – 66.3444X1X2 – 4.1878X12 + 421.5556X22 – 0.0020X32 (4.2) Melalui persamaan 4.2 di atas, Tingkah laku atau kesan yang dapat dilihat untuk setiap pembolehubah dan interaksi di antara pembolehubah yang signifikan dapat dilihat. Pembolehubah X1 adalah mewakili jenis pelarut, X2 nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan X3 mewakili masa penyarian. Y pula mewakili hasil sarian zeaxanthin. Nilai pembolehubah yang positif menunjukkan kesan positif terhadap hasil sarian zeaxanthin di mana peningkatan masa penyarian, penambahan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan peningkatan kepolaran pelarut yang digunakan akan meningkatkan hasil sarian yang diperolehi. Nilai pembolehubah yang negatif pula menunjukkan kesan yang sebaliknya berlaku terhadap hasil sarian zeaxanthin. Ini bermaksud, pengurangan masa penyarian, penggunaan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang semakin kecil dan kepolaran pelarut yang makin menurun memberikan peningkatan terhadap hasil sarian zeaxanthin. Nilai optimum untuk setiap pembolehubah boleh juga dperolehi dengan menyelesaikan model matematik ini menggunakan perisian MATLAB. Walaubagaimanapun dalam kajian ini nilai optimum bagi setiap pembolehubah atau parameter yang dikaji telah ditentukan dengan kaedah gerak balas permukaan tiga dimensi. 4.2.1.7 Kesan Parameter Proses Dan Interaksi Di antara Parameter Proses Berdasarkan Analisis Statistik Kesan anggaran parameter proses dan interaksi di antara parameter proses juga ditunjukkan di dalam carta pareto melalui nilai secara statistik. Di dalam carta ini, nilai mutlak bagi setiap parameter adalah pada paksi yang melintang dan paksi menegak menunjukkan parameter kajian dan interaksi di antara parameter yang terlibat. Parameter yang melebih nilai P= 0.05 merupakan parameter yang signifikan. Nilai P=0.05 merupakan aras keertian yang telah ditetapkan di dalam perisian STATISTICA ini untuk digunakan di dalam carta pareto bagi menentukan parameter proses yang signifikan Signifikan dalam konteks ini bermaksud bererti, berpengaruh atau memainkan peranan penting dalam menentukan keupayaan proses penyarian ini bagi mendapatkan hasil sarian yang terbanyak. Di dalam carta pareto pada rajah 4.5 di bawah, L bermaksud linear dan Q bermaksud kuadratik. Parameter 1 merupakan jenis pelarut, parameter 2 adalah nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan parameter 3 adalah masa penyarian. Interaksi secara linear adalah interaksi secara terus atau songsang dengan peningkatan kepolaran, masa atau pun peningkatan nisbah yang dikaji. Graf garis lurus yang meningkat atau menurun dan akhirnya akan malar akan diperolehi di akhir ujikaji ini. Interaksi kuadratik diwakili oleh graf yang melengkung ke atas atau ke bawah di mana nilai optimum dapat diperolehi. CARTA PARETO HASIL SARIAN ZEAXANTHIN p=.05 (2)Nisbah(L) 10.4002 (1)Jenis pelarut(L) 3.186156 Jenis pelarut(Q) 2.790012 1Lby2L 2.386945 Nisbah(Q) -.70213 1Lby2Q -.663515 Masa penyarian(Q) .5302424 (3)Masa penyarian(L) .4306448 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Effect Estimate (Absolute Value) Rajah 4.5 : Carta Pareto bagi hasil sarian zeaxanthin dengan menggunakan kaedah rendaman Carta pareto di atas menunjukkan kesan parameter proses secara linear, kuadratik dan interaksi antara parameter yang dipersembahkan secara grafik menggunakan perisian STATISTICA V5.0. Bagi mendapatkan parameter yang signifikan, carta pareto ini biasanya digunakan. Carta pareto berupaya menunjukkan dan mengenal pasti kesan anggaran yang penting berlaku terhadap parameter yang terlibat. Carta bar di dalam carta pareto disusun secara mendatar mengikut saiz kesan yang diperolehi iaitu bermula dari parameter yang memberikan kesan yang paling signifikan di bahagian paling atas supaya kesan yang penting dapat dikenal pasti. Seperti yang kita dapat lihat di dalam carta pareto di atas, dua parameter iaitu nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut secara linear dan jenis pelarut secara linear dan kuadratik secara statistiknya menunjukkan signifikan terhadap hasil sarian zeaxanthin pada nilai p=0.05 (had keyakinan). Interaksi antara parameter jenis pelarut (linear) dengan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut (linear) juga menunjukkan signifikan pada nilai had kenyakinan yang telah ditetapkan. Berdasarkan ketiga-tiga parameter dan interaksi parameter yang signifikan itu, jenis pelarut (linear) memberikan kesan yang besar kepada hasil sarian zeaxanthin iaitu 10.40. Ini bermakna parameter tersebut memberikan pengaruh yang kuat terhadap proses penyarian zeaxanthin dalam konteks penghasilan zeaxanthin. Selain daripada carta pareto, jadual anova yang juga diperolehi daripada perisian STATISTICA juga dapat membantu dalam proses mengenalpasti parameter yang signifikan terhadap proses penyarian zeaxanthin. Jadual 4.5 di bawah menunjukkan jadual anova bagi setiap parameter yang telibat dalam proses penyarian ini. Dalam jadual ini juga ditunjukkan parameter yang bertanda bintang merupakan parameter yang signifikan dalam proses bagi penyarian zeaxanthin ini. Parameter yang dimaksudkan adalah jenis pelarut (linear), jenis pelarut (kuadratik), nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut (linear) dan interaksi antara jenis pelarut (linear) dengan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut (linear). Jadual 4.5 : Jadual anova untuk hasil sarian zeaxanthin Faktor SS df MS F P Jenis pelarut (L) 137.227* 1* 137.227* 10.1516* 0.005* Jenis pelarut (Q) 105.225* 1* 105.225* 7.7842* 0.012* Nisbah (L) 1462.143* 1* 1462.143* 108.1642* 0.000* Nisbah (Q) 6.664 1 6.664 0.4930 0.492 Masa penyarian (L) 2.507 1 2.507 0.1855 0.672 Masa penyarian(Q) 3.801 1 3.801 0.2812 0.602 1L by 2L 77.018* 1* 77.018* 5.6975* 0.028* 1L by 2Q 5.951 1 5.951 0.4403 0.515 Ralat 243.321 18 13.518 - - Jumlah SS 2095.666 26 - - - *signifikan pada D=0.05, R2= 0.8839 SS = Hasil tambah kuasa dua, df = Darjah kebebasan, MS = kuasa dua min, F =Ujian statistik, p=had keyakinan 4.2.2 Kaedah Soxhlet Kaedah ini juga biasa digunakan di dalam proses penyarian pepejal-cecair atau pun dikenali sebagai pengurasan. Sebanyak 27 ujikaji berserta dengan dua ulangan dilakukan terhadap tiga parameter proses iaitu jenis pelarut, masa penyarian dan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut. Rekabentuk eksperimen dan analisis secara statistik juga dilakukan menggunakan perisian STATISTICA V5.0 seperti di dalam kaedah rendaman yang telah dibincangkan dan kaedah ultrasonik yang akan dibincangkan selepas kaedah soxhlet ini. Tujuan ujikaji ini adalah untuk mendapatkan hasil sarian zeaxanthin yang maksimum melalui proses pengoptimuman parameter proses yang terlibat dalam kaedah ini. Parameter proses optimum ditentukan melalui graf kontur ataupun melalui gerakbalas permukaan tiga dimensi yang terhasil daripada perisian STATISTICA ini. Analisis statistik dilakukan untuk menentukan sama ada kaedah ini memerlukan pengoptimuman parameter atau sebaliknya. Langkah kerja yang sama seperti yang dilakukan ke atas kaedah rendaman dilakukan ke atas kaedah soxhlet ini. Ujian yang terlibat adalah ujian hipotesis di mana merangkumi hipotesis nol dan hipotesis alternatif. Hipotesis nol menyatakan bahawa hasil sarian zeaxanthin yang diperolehi tidak dipengaruhi oleh perubahan nilai parameter proses atau kajian yang digunakan. Hipotesis alternatif pula menyatakan bahawa hasil sarian zeaxanthin yang diperolehi dipengaruhi oleh perubahan nilai parameter kajian yang digunakan. Bagi menentukan sama ada hipotesis nol harus diterima atau ditolak maka ujian taburan F diaplikasikan. Jadual 4.6 di bawah menunjukkan analisis varian terhadap hasil sarian zeaxanthin dengan menggunakan kaedah soxhlet. Jadual 4.6 : Analisis varian terhadap hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah soxhlet Punca Hasil tambah kuasa Darjah Kuasa dua min F R2 ubahan dua kebebasan Regresi 1543.327 8 192.916 10.80 0.827 Ralat 321.468 18 17.860 - - Jumlah 1864.795 26 - - - Nilai F yang diperolehi daripada model polinomil seperti dalam jadual 4.6 di atas adalah 10.80. Nilai F daripada jadual statistik pada nilai P=0.01 adalah 3.71. Nilai F model polinomil seperti di dalam jadual di atas adalah lebih besar daripada nilai F di dalam jadual statistik, maka hipotesis nol ditolak dan hipotesis alternatif diterima (Azli, 2000). 4.2.2.1 Kesan Parameter Proses Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Tiga parameter yang terlibat dalam kaedah ini adalah jenis pelarut, masa penyarian dan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut. Tiga jenis pelarut yang dikaji adalah etanol, aseton dan tetrahidrofuran. Tiga masa penyarian yang dikaji adalah 2 jam, 6 jam dan 10 jam. Masa penyarian yang berbeza dikaji bagi ketiga-tiga kaedah penyarian kerana jumlah masa yang diambil untuk setiap proses penyarian mencapai keseimbangan berdasarkan literatur adalah berbeza. Manakala bagi nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut pula masing-masing 10g:200ml, 20g:200ml dan 30g:200ml. Parameter proses optimum diperolehi hasil daripada proses pengoptimuman yang telah dilakukan bagi tiga parameter proses dalam kaedah soxhlet ini. Sayur cekur manis digunakan sebagai sampel kajian kerana terbukti mengandungi kuantiti zeaxanthin yang paling tinggi di antara 16 jenis sayur-sayuran lain yang telah dikaji. Keseluruhan keputusan ujikaji yang diperolehi dianalisa melalui plot gerakbalas permukaan seperti yang ditunjukkan di dalam rajah 4.6, rajah 4.7 dan rajah 4.8 di bawah. Rajah 4.6 menunjukkan kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin. Rajah 4.7 pula menunjukkan kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin. Manakala rajah 4.8 menunjukkan kesan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin. Berdasarkan pemerhatian terhadap plot atau graf gerakbalas permukaan ini, parameter optimum bagi ketiga-tiga parameter proses akan dapat ditentukan. Parameter proses yang optimum akan menyumbangkan hasil sarian yang maksimum. Di samping itu juga, interaksi bagi ketiga-tiga parameter yang terlibat juga boleh dilihat berdasarkan plot gerakbalas permukaan ini. Rajah 4.6 : Kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin Rajah 4.7 : Kesan penggunaan pelbagai jenis pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.2.2.2 Kesan Penggunaan Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Penggunaan pelarut etanol, aseton dan tetrahidrofuran telah memberikan kesan yang berbeza terhadap hasil sarian zeaxanthin dalam kaedah soxhlet ini. Berdasarkan rajah 4.6 dan rajah 4.7 yang ditunjukkan di atas, didapati ketiga-tiga pelarut yang berpolar ini memberikan kesan yang agak sama terhadap hasil sarian di mana kawasan yang gelap mewakili ketiga-tiga pelarut tersebut. Walaubagaimana pun, merujuk kepada rajah 4.7 di mana graf pelana terhasil, parameter optimum dapat ditentukan daripada titik pertemuan garisan yang dibentuk dari titik maksimum setiap lengkung. Daripada rajah 4.7 tersebut, pelarut aseton didapati berada dipertemuan garisan itu. Oleh sebab itu, aseton merupakan pelarut yang terbaik dalam penyarian ini. Pelarut yang dimaksudkan masih lagi terletak dalam kumpulan yang berpolar. Ini dijelaskan oleh kajian literatur di dalam bab dua di mana zeaxanthin merupakan pigmen yang berpolar dan hanya boleh dilarutkan oleh pelarut yang berpolar. 4.2.2.3 Kesan Masa Penyarian Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Berdasarkan rajah 4.7 dan rajah 4.8, plot gerakbalas permukaan tiga dimensi yang diperolehi menunjukkan kewujudan titik pelana (saddle point). Titik pelana adalah titik pegun minimum di antara dua maksimum (Rodziah, 1999). Dalam kes graf yang mempunyai titik pelana, nilai optimum parameter diperolehi daripada titik pertemuan garisan yang dibentuk dari titik maksimum setiap lengkung. Rajah 4.8 : Kesan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut dan perubahan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin Berdasarkan graf tersebut, masa optimum yang dicapai dianggarkan pada masa ke 360 minit iaitu 6 jam masa penyarian. Nilai hasil sarian zeaxanthin tertinggi yang dapat dicapai berdasarkan rajah 4.8 adalah 34.29mg iaitu 81.54% daripada nilai sebenar kandungan zeaxanthin di dalam sampel. Penambahan masa penyarian memberikan kesan positif kepada hasil sarian zeaxanthin. Merujuk kepada graf 4.8, hasil sarian zeaxanthin bertambah dari 40.02% kepada 62.78%mg apabila masa penyarian dipanjangkan dari 50 minit kepada 200 minit. Pertambahan hasil sebanyak 22.76% adalah kurang memberangsangkan jika dibandingkan dengan masa penyarian yang agak lama iaitu 200 minit. Ianya berlaku mungkin disebabkan oleh faktor kemusnahan zeaxanthin yang telah disari itu apabila sampel terlalu lama didedahkan untuk menjalani proses penyarian kerana dalam kaedah soxhlet ini proses pemanasan juga terlibat. Walaupun kaedah ini mempunyai kondenser yang dapat mengimbangkan kadar pemanasan semasa proses penyarian ini dijalankan namun kehadiran haba ini akan turut menjejaskan kandungan zeaxanthin di dalam sampel jika disari dalam masa yang agak lama. 4.2.2.4 Kesan Nisbah Jisim Sampel Kepada Isipadu Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Berdasarkan plot gerakbalas permukaan tiga dimensi pada rajah 4.6 dan rajah 4.8, dapatlah disimpulkan bahawa nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang optimum dapat dicapai dalam kajian ini untuk memberikan hasil sarian zeaxanthin yang maksimum. Parameter ini memberikan kesan yang positif terhadap hasil sarian zeaxanthin.di mana peningkatan nisbah yang digunakan menunjukkan peningkatan terhadap hasil sarian. Dalam masa yang sama, jenis pelarut juga menunjukkan kesan positif terhadap hasil sarian di mana peningkatan kepolaran pelarut yang diaplikasikan memberikan peningkatan terhadap hasil sarian zeaxanthin seperti yang ditunjukkan oleh rajah 4.6. Kesan yang positif atau reaksi positif dapatlah ditafsirkan sebagai hubungan parameter yang berkadar terus atau langsung dengan pembolehubah bersandar iaitu hasil sarian zeaxanthin. Nisbah yang optimum dapat dicapai adalah 0.12 iaitu bersamaan dengan 24g jisim sampel di dalam 200ml pelarut. Pada nisbah ini dijangkakan ke semua kandungan zeaxanthin di dalam sampel dapat disari sepenuhnya dalam isipadu pelarut yang berpadanan dengannya. 4.2.2.5 Model Matematik Bagi Keseluruhan Ujikaji Persamaan model tertib kedua yang mewakili keseluruhan nilai ujikaji bagi kaedah soxhlet ada ditunjukkan dalam persamaan 4.4 di bawah. Persamaan ini diperolehi dengan gabungan nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi yang terlibat ditunjukkan dalam jadual 4.7 di bawah. Jadual 4.7 : Nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi di antara pembolehubah Pembolehubah Pekali pembolehubah B0 -939.19 B1 17.73 B2 1182.74 B3 0.03 B11 -0.09 B22 -7917.11 B33 0.00 B12 -2.75 B23 -0.45 Nilai pekali-pekali ini diperolehi daripada perisian STATISTICA V5.0. Tiga pembolehubah yang terlibat dalam ujikaji ini menghasilkan persamaan polinomil tertib kedua seperti yang di bawah. Persamaan asas untuk model polinomil tertib kedua Y = B0 + B1X1 + B2X2 + B3X3 + B12X1X2 + B13X1X3 + B23X2X3 +B11X12 + B22X22 + B33X32 (4.3) Persamaan polinomil tertib kedua yang terhasil daripada nilai pekali pembolehubah yang diperolehi daripada perisian STATISTICA V5.0. Y = -939.19 + 17.73X1 + 1182.74X2 + 0.03X3 – 2.75X1X2 – 0.45X2X3 - 0.09X12 + -7917.11X22 – 0.000X32 (4.4) Melalui persamaan 4.4 di atas, tingkah laku atau kesan untuk setiap pembolehubah dan interaksi di antara pembolehubah yang signifikan juga dapat diperhatikan. Seperti di dalam kaedah rendaman yang telah dibincangkan pembolehubah X1 adalah mewakili jenis pelarut, X2 nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan X3 mewakili masa penyarian. Y pula mewakili hasil sarian zeaxanthin. Berdasarkan persamaan polinomil tertib kedua yang terbentuk, nilai pembolehubah yang positif akan menunjukkan kesan positif terhadap hasil sarian zeaxanthin di mana peningkatan masa penyarian, penambahan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan peningkatan kepolaran pelarut yang digunakan telah meningkatkan hasil sarian zeaxanthin yang diperolehi. Manakala nilai pembolehubah yang negatif pula menunjukkan kesan yang sebaliknya berlaku terhadap hasil sarian zeaxanthin. Ini bermakna, pengurangan masa pengurasan, penggunaan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang semakin kecil dan kepolaran pelarut yang makin menurun memberikan peningkatan terhadap hasil sarian zeaxanthin. Berdasarkan persamaan 4.4 tersebut, ketiga-tiga pembolehubah menunjukkan nilai yang positif. Maka, ketiga-tiga pembolehubah iaitu peningkatan kepolaran pelarut, penambahan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan peningkatan masa penyarian telah meningkatkan hasil sarian zeaxanthin. Dalam kaedah ini, nilai optimum bagi setiap pembolehubah atau parameter yang dikaji ditentukan dengan kaedah gerak balas permukaan. 4.2.2.6 Kesan Parameter Proses Dan Interaksi Di antara Parameter Proses Berdasarkan Analisis Statistik Proses untuk mengenal pasti parameter yang signifikan terhadap proses sarian secara soxhlet ini dapat dilakukan dengan menggunakan carta pareto. CARTA PARETO HASIL SARIAN ZEAXANTHIN p=.05 (2)Nisbah(L) 6.429064 Nisbah(Q) 4.447295 Jenis pelarut(Q) 3.192418 1Lby2L -2.94383 Masa penyarian(Q) -2.2362 (3)Masa penyarian(L) -1.77905 (1)Jenis pelarut(L) .5175823 1Lby2Q -.040157 -1 0 1 2 3 4 5 6 7 Effect Estimate (Absolute Value) Rajah 4.9: Carta Pareto bagi hasil sarian zeaxanthin dengan menggunakan kaedah soxhlet Carta pareto di atas (rajah 4.9) menunjukkan kesan anggaran parameter dan interaksi antara parameter yang terlibat terhadap hasil sarian zeaxanthin secara statistik bagi kaedah soxhlet. Parameter yang signifikan ditentukan melalui carta pareto ini. Simbol L menunjukkan linear manakala simbol Q menunjukkan kuadratik. Parameter 1 merupakan jenis pelarut, parameter 2 adalah nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan parameter 3 adalah masa penyarian. Nilai mutlak bagi setiap parameter dan interaksi di antara parameter juga diberikan di dalam carta pareto ini. Berdasarkan carta pareto, didapati parameter yang melebihi nilai P=0.05 menunjukkan parameter tersebut adalah signifikan. Parameter yang 8 lebih signifikan memberikan nilai mutlak yang tinggi dan berada di bahagian paling atas carta pareto. Parameter yang kurang signifikan dan tidak signifikan mempunyai nilai mutlak yang kecil dan berada di bahagian bawah carta pareto. Parameter di dalam carta pareto ini telah disusun secara menurun tahap kepentingannya (pengaruh) di dalam kaedah penyarian soxhlet. Oleh sebab itu, berdasarkan carta pareto tersebut, nisbah jisim sampel terrhadap isipadu pelarut (linear), Nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut (kuadratik), Jenis pelarut (kuadratik), masa penyarian (kuadratik) dan interaksi antara jenis pelarut(linear) dengan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut (linear) merupakan parameter yang signifikan. Nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut secara linear menunjukkan kesan yang paling signifikan dan berpengaruh terhadap hasil sarian dengan nilai mutlak 6.43 pada had keyakinan, P=0.05. Kesan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut secara kuadratik pula merupakan parameter kedua signifikan terhadap hasil sarian dengan nilai mutlaknya 4.45 pada had nilai P yang sama. Selain daripada carta pareto, dalam kaedah soxhlet ini, jadual anova yang diperolehi daripada perisian STATISTICA dipersembahkan agar dapat membantu dan memperjelaskan lagi kaedah mengenal pasti parameter yang signifikan terhadap proses penyarian zeaxanthin. Parameter yang signifikan juga boleh ditentukan berdasarkan jadual anova seperti yang ditunjukkan dalam jadual 4.8 di bawah. Di dalam jadual tersebut, setiap parameter yang terlibat dalam proses penyarian ini ditunjukkan. Parameter seperti hasil tambah kuasa dua, darjah kebebasan, kuasa dua min, ujian statistik dan had keyakinan diperolehi daripada perisian STATISTICA yang digunakan dalam kajian ini. Parameter yang bertanda bintang merupakan parameter yang signifikan dalam proses penyarian zeaxanthin ini. Parameter yang dimaksudkan adalah nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut (linear), nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut (kuadratik), jenis pelarut (kuadratik), masa penyarian (kuadratik) dan interaksi antara jenis pelarut (linear) dengan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut (linear). Jadual 4.8 : Jadual anova untuk hasil sarian zeaxanthin bagi kaedah soxhlet Faktor SS df MS F P Jenis pelarut (L) 4.784 1 4.7844 0.26789 0.611 Jenis pelarut (Q) 182.014* 1* 182.0137* 10.19153* 0.005* Nisbah (L) 738.176* 1* 738.11763* 41.33286* 0.000* Nisbah (Q) 353.229* 1* 353.2291* 19.7784* 0.000* Masa penyarian (L) 56.525 1 56.5253 3.16504 0.09 Masa penyarian(Q) 89.307* 1* 89.307* 5.00061* 0.038* 1L by 2L 154.771* 1* 154.7707* 8.66611* 0.009* 1L by 2Q 0.029 1 0.0288 0.00161 0.968 Ralat 321.468 18 17.8593 - - Jumlah SS 1864.795 26 - - - 2 *signifikan pada D=0.05, R = 0.82761 SS = Hasil tambah kuasa dua, df = Darjah kebebasan, MS = kuasa dua min, F = Ujian statistik, P=had keyakinan 4.2.3 Kaedah Ultrasonik Kaedah ini merupakan satu kaedah yang agak baru di dalam industri penghasilan makanan dan ubat-ubatan daripada sumber alam semulajadi (tumbuhtumbuhan). Ianya diaplikasikan bagi memudahkan proses penghasilan produk yang diperlukan berdasarkan penjimatan dari segi ekonomi iaitu dari aspek masa, kos dan kuantiti hasil. Bagi industri farmaseutikal, kaedah ini disarankan untuk diaplikasikan dalam penyediaan bahan ekstrak berkualiti tinggi kerana kaedah ini menggunakan sumber tenaga yang kecil (Sulman et al., 1997). Sebanyak 81 ujikaji berserta dua kali ulangan dilakukan berdasarkan kajian terhadap empat parameter proses iaitu jenis pelarut, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut, masa penyarian dan isipadu air di dalam takung rendaman sebagai medium kepada pergerakan gelombang ultrasonik. Data ujikaji dianalisa melalui plot gerakbalas permukaaan tiga dimensi menggunakan perisian STATISTICA V5.0 Jadual 4.9 : Analisis varian terhadap hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah ultrasonik Punca Hasil Darjah Kuasa dua ubahan tambah kebebasan min F R2 kuasa dua Regresi 4314.845 26 165.9556 243.66 0.99155 Ralat 36.782 54 0.681148 - - Jumlah 4351.627 80 - - - Analisis secara statistik telah dilakukan ke atas kaedah ini. Jadual 4.9 di atas menunjukkan analisis varians terhadap hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah ultrasonik. Nilai F yang diperolehi daripada model polinomial seperti di dalam jadual di atas adalah 243.66. Nilai F daripada jadual statistik pada nilai P=0.01 pula adalah 2.16. Berdasarkan perbandingan nilai F yang telah diperolehi, didapati nilai F polinomil adalah lebih besar daripada nilai F di dalam jadual, maka hipotesis nol ditolak dan hipotesis alternatif diterima. Seterusnya proses pengoptimuman dilakukan untuk mendapatkan parameter kajian yang terbaik untuk mendapatkan hasil sarian zeaxanthin yang maksimum dalam meneruskan misi hipotesis alternatif itu tadi. Jadual 4.9 di bawah menunjukkan analisis varian terhadap hasil sarian zeaxanthin dengan menggunakan kaedah ultrasonik. 4.2.3.1 Kesan Parameter Proses Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Dalam kajian yang melibatkan kaedah ultrasonik ini, empat parameter proses yang terlibat adalah masa penyarian, jenis pelarut, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut dan isipadu air di dalam takung rendaman. Sebanyak 81 ujikaji yang telah dilakukan berdasarkan rekabentuk kajian hasil daripada perisian STATISTICA V5.0 adalah melibatkan keempat-empat parameter proses yang telah dinyatakan di atas. Sayur cekur manis telah dipilih sebagai sampel bagi mengkaji kesan parameter proses terhadap hasil sarian ini. Tiga masa penyarian yang terlibat dalam proses penyarian menggunakan kaedah ultrasonik ini adalah 20 minit, 40 minit dan 60 minit. Pelarut yang digunakan dalam kaedah ini adalah sama dengan pelarut yang digunakan dalam kaedah rendaman dan soxhlet iaitu etanol, aseton dan tetrahidrofuran. Manakala bagi parameter nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut masing-masing 10g:200ml, 20g:200ml dan 30g:200ml. Isipadu air yang dikaji pula adalah 2 liter, 3 liter dan 4 liter. Keseluruhan keputusan ujikaji yang diperolehi dianalisa melalui plot gerak balas permukaan tiga dimensi seperti yang ditunjukkan dalam rajah 4.10, rajah 4.11, rajah 4.12, rajah 4.13, rajah 4.14 dan rajah 4.15 di bawah. Berdasarkan pemerhatian terhadap plot gerak balas permukaan ini, parameter optimum bagi empat parameter proses dapat ditentukan. 4.2.3.2 Kesan Penggunaan Pelbagai Jenis Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Berdasarkan rajah 4.10, 4.11 dan 4.12 di bawah, kawasan yang paling gelap adalah mewakili julat pelarut aseton dan tetrahidrofuran. Walaubagaimana pun, didapati pelarut yang kurang polar dari aseton tetapi lebih polar dari tetrahidrofuran diperlukan dalam kajian ini untuk mendapatkan hasil sarian zeaxanthin yang maksimum. Setelah Pemerhatian yang dibuat ke atas ketiga-tiga rajah tersebut, dapatlah disimpulkan bahawa aseton merupakan pelarut terbaik dalam penyarian ini jika dibandingkan dengan tetrahidrofuran. Ini kerana kedudukan pelarut aseton lebih hampir di bahagian tengah kawasan yang paling gelap di dalam rajah tersebut berbanding tetrahidrofuran. Hasil sarian zeaxanthin tertinggi yang dicapai melalui kaedah ini adalah 39.20mg iaitu 93.22% zeaxanthin dapat disari darpada kandungan asal zeaxanthin di dalam sampel. Pengubahsuaian kepolaran pelarut boleh dilakukan bagi mendapatkan kualiti pelarut yang diperlukan seperti di dalam kajian ini selaras dengan tujuan untuk mendapatkan hasil sarian zeaxanthin yang maksimum. Pengubahsuaian kepolaran pelarut boleh dilakukan dengan melakukan pengubahsuaian kepekatan sesuatu pelarut tersebut. Kos pelarut boleh dikurangkan berdasarkan pencairan yang dilakukan terhadap pelarut ini bagi mendapatkan kepolaran yang diperlukan. Interaksi positif diperolehi hasil dari interaksi pelarut dengan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut, masa penyarian dan isipadu air. Rajah 4.10 : Kesan perubahan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut dan jenis pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin Rajah 4.11 : Kesan perubahan masa penyarian dan jenis pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin Rajah 4.12 : Kesan perubahan isipadu air dan jenis pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.2.3.3 Kesan Masa Penyarian Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Rajah 4.11, rajah 4.13 dan rajah 4.15 adalah plot gerak balas permukaan tiga dimensi yang merujuk kepada kesan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin. Daripada ketiga-tiga rajah itu, rajah 4.15 dapat memberikan nilai masa penyarian optimum yang lebih tepat kerana kawasan yang lebih gelap iaitu kawasan yang memberikan hasil sarian zeaxanthin tertinggi jelas terbentuk jika dibandingkan dengan rajah 4.11 dan 4.13. Peningkatan masa penyarian yang diaplikasikan dalam kaedah ini telah meningkatkan hasil sarian zeaxanthin. Oleh sebab itu, masa penyarian telah memberikan kesan positif terhadap hasil sarian zeaxanthin. Namun demikian, setelah masa yang optimum dicapai, peningkatan masa dalam kaedah ultrasonik ini tidak lagi meningkatkan hasil sarian kerana proses penyarian ini telah mencapai keseimbangan. Berdasarkan rajah 4.15, didapati masa optimum yang dicapai dalam kajian ini adalah pada masa penyarian 35 minit. Hasil sarian zeaxanthin meningkat dari 3.79mg (9.01%) kepada 38.02mg (90.42%) dalam jangkamasa 35 minit masa penyarian. Peningkatan hasil sarian sebanyak 81.41% menunjukkan peningkatan yang agak baik dalam jangkamasa yang singkat. Rajah 4.13 : Kesan perubahan masa penyarian dan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin Rajah 4.14 : Kesan perubahan isipadu air dan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin Rajah 4.15 : Kesan perubahan isipadu air dan masa penyarian terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.2.3.4 Kesan Nisbah Jisim Sampel Kepada Isipadu Pelarut Terhadap Hasil Sarian Zeaxanthin Rajah 4.10, rajah 4.13 dan rajah 4.14 menunjukkan kesan nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut terhadap hasil sarian zeaxanthin. Isipadu pelarut yang berpadanan dengan jisim sampel akan memberikan hasil sarian yang maksimum. Kajian untuk mendapatkan nisbah yang ideal berdasarkan sesuatu komponen dan kaedah penyarian yang digunakan akan dapat mengelakkan berlakunya pembaziran dari segi kuantiti pelarut yang digunakan. Parameter ini penting dan dijangka akan mempengaruhi hasil sarian yang diperolehi. Merujuk kepada ketiga-tiga rajah, nisbah jisim sampel kepada isipadu pelarut yang optimum tidak dapat dicapai kerana graf optimum tidak dicapai. Graf tersebut masih menunjukkan peningkatan hasil sarian jika penambahan jisim sampel dibuat dalam 200ml isipadu pelarut kerana nilai optimum bagi parameter ini berada di luar kawasan plot gerakbalas. Ini bermakna jisim sampel yang dikaji tidak berpadanan dengan isipadu pelarut yang digunakan. penambahan jisim sampel di dalam 200ml pelarut perlu dibuat jika nisbah yang optimum ingin dicapai. Walaubagaimanapun, nisbah terbaik yang ditunjukkan melalui plot gerakbalas tiga permukaan yang telah diperolehi adalah 0.16 bersamaan dengan 32 gram sampel dengan 200ml pelarut. Kemampuan sesuatu pelarut melarut pigmen yang dikehendaki adalah bergantung kepada kuantiti pelarut dan kuantiti sampel. Merujuk kepada rajah 4.14, hasil sarian tertinggi dapat dicapai adalah 39.20mg (93.22%). 4.2.3.5 Kesan Isipadu Air Di dalam Takung Rendaman terhadap hasil sarian zeaxanthin Gelombang ultrasonik memerlukan medium untuk bergerak. Air merupakan salah satu medium yang sesuai untuk gelombang ini. Perubahan kepada isipadu air di dalam takung rendaman akan memberikan perbezaan kepada nilai intensiti gelombang tersebut. Rajah 4.12, rajah 4.14 dan rajah 4.15 menunjukkan kesan isipadu air di dalam takung rendaman terhadap hasil sarian zeaxanthin. Nilai intensiti gelombang akan meningkat dengan peningkatan isipadu air yang digunakan di dalam proses penyarian. Pada intensiti yang rendah, suspensi yang terdedah kepada gelombang ini akan menyebabkan berlakunya pengumpalan partikel. Apabila intensiti ini meningkat, proses peronggaan berlaku disebabkan oleh tenaga yang diperolehi telah melebihi daya ikatan antara molekul cecair media. Dalam proses ini, tenaga yang terhasil akan meningkatkan penembusan pelarut ke dalam sampel dan dapat mengeluarkan bahan yang diperlukan di dalam sampel tersebut (Jianyong Wu. et al., 2000). Melalui peronggaan, penyarian akan berlaku lebih cepat. Ini kerana apabila gelembung mikro pecah, wujudnya sempadan fasa antara pepejal dan cecair yang akan menghasilkan sedutan. Proses peronggaan juga akan menghasilkan gelora di dalam cecair di mana gelora tersebut dapat memusnahkan atau menipiskan lapisan yang terbentuk di antara fasa. Oleh sebab itu, rintangan terhadap pemindahan jisim dapat dikurangkan (Rosli, 1996). Berdasarkan ketigatiga rajah (4.12, 4.14 dan 4.15), dapatlah diperhatikan bahawa isipadu air optimum di dalam takung rendaman yang dicapai adalah 3.3 L. Kawasan yang paling gelap (melengkung ke atas) di dalam ketiga-tiga rajah tersebut menunjukkan isipadu air optimum dicapai dengan hasil sarian zeaxanthin maksimum diperolehi. Isipadu air mempunyai hubungan yang positif dengan hasil sarian zeaxanthin di mana peningkatan isipadu air yang digunakan telah meningkatkan hasil sarian. Ini bermakna peningkatan isipadu air lebih dari 3.3L tidak akan memberikan sebarang kesan kepada peningkatan hasil sarian zeaxanthin. 4.2.3.6 Model Matematik Bagi Keseluruhan Ujikaji Persamaan model tertib kedua yang mewakili keseluruhan nilai ujikaji bagi kaedah ultrasonik ditunjukkan di dalam persamaan 4.5 di bawah. Persamaan ini diperolehi melalui gabungan nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi yang terlibat seperti yang ditunjukkan di dalam jadual 4.10 di bawah. Nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi di antara pembolehubah diperolehi daripada perisian STATISTICA yang digunakan untuk rekabentuk eksperimen dan analisis data. Jadual 4.10 : Nilai pekali pembolehubah linear, kuadratik dan interaksi di antara pembolehubah Pembolehubah Pekali pembolehubah B0 -28.11 B1 -21.28 B2 -651.35 B3 2.80 B4 12.23 B11 1.65 B22 690.59 B33 -0.01 B44 -2.06 B12 152.66 B13 -0.30 B14 13.77 B23 2.64 B24 453.78 B34 -1.29 Persamaan polinomil tertib kedua yang terhasil daripada nilai pekali pembolehubah yang diperolehi adalah seperti di bawah. Pekali pembolehubah diperolehi daripada perisian STATISTICA V5.0. Y=-28.11 - 21.28X1 - 651.35X2 + 2.80X3 + 12.23X4 + 1.65X12 + 690.59X22 0.01X32 – 2.06X42 + 152.66X1X2 – 0.30X1X3 +13.77X1X4 + 2.64X2X3 +453.78X2X4 – 1.29X3X4 (4.5) Dimana : B0 = Pemalar B1, B2, B3, B4 = Pekali linear B12, B22, B33, B44 = Pekali kuadratik B12, B13, B14, B23, B24, B34 = Pekali interaksi X1, X2, X3, X4 = Pembolehubah Berdasarkan persamaan polinomil ini, kesan bagi setiap pembolehubah dan interaksi di antara pembolehubah dapat dikenal pasti. Pembolehubah X1 adalah jenis pelarut, X2 adalah nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut, X3 adalah masa penyarian dan X4 adalah isipadu air di dalam takung rendaman. Nilai pembolehubah yang positif akan menunjukkan kesan positif terhadap hasil sarian zeaxanthin iaitu Y. Manakala nilai pembolehubah yang negatif pula akan menunjukkan kesan negatif terhadap hasil sarian zeaxanthin. Kesan yang positif bermaksud peningkatan masa penyarian, penambahan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut, peningkatan kepolaran pelarut yang digunakan dan peningkatan isipadu air di dalam takung rendaman akan meningkatkan hasil sarian yang diperolehi. Nilai pembolehubah yang negatif pula menunjukkan kesan yang sebaliknya berlaku terhadap hasil sarian zeaxanthin. Ini bermaksud, pengurangan masa penyarian, penggunaan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang semakin kecil, kepolaran pelarut yang makin menurun dan pengurangan isipadu air di dalam takung rendaman memberikan peningkatan terhadap hasil sarian zeaxanthin 4.2.3.7 Kesan Parameter Proses Dan Interaksi Di antara Parameter Proses Berdasarkan Analisis Statistik Rajah 4.16 di bawah merupakan satu carta pareto yang menunjukkan parameter-parameter proses yang signifikan terhadap hasil sarian zeaxanthin bagi kaedah ultrasonik. CARTA PARETO HASIL SARIAN ZEAXANTHIN p=.05 (2)Nisbah(L) Jenis pelarut(Q) 1Lby2L (1)Jenis pelarut(L) 1Qby2L 1Qby3Q 3Lby4Q Isipadu(Q) 2Lby4Q 1Lby4Q Masa penyarian(Q) 1Qby4L 2Lby4L 1Qby2Q (3)Masa penyarian(L) 1Lby3Q 1Lby4L 1Qby4Q 1Lby2Q 3Lby4L Nisbah(Q) 1Qby3L 2Lby3Q 2Lby3L 1Lby3L (4)Isipadu air(L) 62.7257 23.57071 19.62084 17.57021 15.27241 13.36068 -12.3961 11.8044 10.48837 8.304012 8.046029 7.769006 7.637635 -6.86089 6.793287 -5.30722 -4.5415 -4.51292 3.707913 -3.4347 3.008217 -2.43228 2.227604 -1.87823 .9030235 -.161588 -10 0 10 20 30 40 50 60 Effect Estimate (Absolute Value) Rajah 4.16 : Carta Pareto bagi hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah ultrasonik Rajah 4.16 di atas menunjukkan carta pareto bagi hasil sarian zeaxanthin menggunakan kaedah ultrasonik. Merujuk kepada carta pareto di atas, Sebutan L merujuk kepada linear manakala sebutan Q merujuk kepada kuadratik. Jenis pelarut diwakili oleh (1), nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut diwakili oleh (2), masa penyarian diwakili oleh (3) dan isipadu air pula diwakili oleh (4). Parameter yang paling atas adalah parameter yang paling signifikan. Semakin ke bawah kedudukan parameter, parameter tersebut semakin kurang signifikan Berdasarkan carta pareto ini, parameter proses yang signifikan secara linear, kuadratik dan 70 interaksi antara parameter secara linear dan kuadratik dapat dikenal pasti. Bar yang mewakili setiap parameter dan interaksi antara parameter disusun secara melintang dalam carta ini. Nilai mutlak bagi setiap kesan anggaran parameter ditunjukkan di penghujung setiap bar. Selain daripada carta pareto, jadual anova juga boleh digunakan dalam mengenal pasti parameter yang signifikan dalam mempengaruhi proses penyarian yang berlaku. Parameter yang paling signifikan berada di bahagian paling atas. Daripada carta pareto tersebut, parameter nisbah jisim sampel terhadap isipadu Pelarut (linear) merupakan parameter yang paling signifikan dalam kaedah ultrasonik ini dengan nilai kesan anggarannya sebanyak 62.72. Parameter yang tidak signifikan pada P=0.05 dalam kaedah ini adalah isipadu air (linear), Interaksi antara jenis pelarut (linear) dengan masa penyarian (linear) dan interaksi nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut (linear) dengan masa penyarian (linear). Secara umumnya, keempat-empat parameter iaitu jenis pelarut, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut, masa penyarian dan isipadu air sebagai medium kepada gelombang yang dikaji adalah signifikan pada nilai P=0.05. Keseluruhan gambaran bagi semua nilai statistik ada ditunjukkan di dalam jadual anova 4.11 di bawah. Jadual 4.11 : Jadual anova untuk hasil sarian zeaxanthin bagi kaedah ultrasonik Faktor SS df MS F P Jenis pelarut (L) 210.278 1 210.278 308.712 0* Jenis pelarut (Q) 378.431 1* 378.431 555.579 0* Nisbah (L) 2679.988 1* 2679.988 3934.523 0* Nisbah (Q) 6.164 1* 6.164 9.049 0.003986* Masa penyarian (L) 31.434 1* 31.434 46.149 0* Masa penyarian(Q) 44.096 1* 44.096 64.739 0* Isipadu air (L) 0.018 1 0.018 0.026 0.872233 Isipadu air (Q) 94.914 1* 94.914 139.344 0* 1L by 2L 262.226 1* 262.226 384.977 0* 1L by 2Q 9.365 1* 9.365 13.749 0.00494* 1Q by 2L 158.875 1* 158.875 233.247 0* 1Q by 2Q 32.063 1* 32.063 47.072 0* 1L by 3L 0.555 1 0.555 0.815 0.370524 1L by 3Q 19.186 1* 19.186 28.167 0.000002* 1Q by 3L 4.030 1* 4.030 5.916 0.18349* 1Q by 3Q 121.590 1* 121.590 178.508 0* *signifikan pada D=0.05, R2= 0.99155 SS = Hasil tambah kuasa dua, df = Darjah kebebasan, MS = kuasa dua min, F = Ujian statistik, p=had keyakinan Jadual 4.11 : Jadual anova untuk hasil sarian zeaxanthin bagi kaedah ultrasonik Faktor SS df MS F P 1L by 4L 14.049 1* 14.049 20.625 0.00032* 1L by 4Q 46.970 1* 46.970 68.957 0* 1Q by 4L 41.112 1* 41.112 60.357 0* 1Q by 4Q 13.873 1* 13.873 20.366 0.000035* 2L by 3L 2.403 1 2.403 3.528 0.065753 2L by 3Q 3.380 1* 3.380 4.962 0.030095* 2L by 4L 39.734 1* 39.734 58.333 0* 2L by 4Q 74.930 1* 74.930 110.006 0* 3L by 4L 8.036 1* 8.036 11.797 0.001147* 3L by 4Q 104.667 1* 104.667 153.663* 0* 36.782 54 0.681 - - 4351.627 80 - - - Ralat Jumlah SS *signifikan pada D=0.05, R2= 0.99155 SS = Hasil tambah kuasa dua, df = Darjah kebebasan, MS = kuasa dua min, F = Ujian statistik, p=had keyakinan Parameter yang signifikan juga boleh ditentukan berdasarkan jadual anova seperti di dalam rajah 4.10 di atas. Berdasarkan rajah tersebut, parameter yang mempunyai nilai SS, df, MS dan F dan p yang bertanda bintang menunjukkan parameter tersebut adalah signifikan atau berpengaruh. 4..2.4 Perbandingan Di antara Parameter Proses Optimum Bagi Kaedah Rendaman, Soxhlet Dan Ultrasonik Parameter proses yang optimum bagi kaedah rendaman, soxhlet dan ultrasonik ditunjukkan di dalam jadual 4.12 di bawah. Jadual 4.12 : Parameter proses optimum bagi tiga kaedah penyarian Rendaman Soxhlet Ultrasonik Pelarut Aseton Aseton Aseton Nisbah jisim sampel 32g : 200ml 24g : 200ml 32g : 200ml Masa penyarian 53 jam 6 jam 35 minit Isipadu air - - 3.3L terhadap isipadu pelarut Berdasarkan jadual 4.12 di atas, aseton terbukti sebagai pelarut terbaik bagi ketiga-tiga kaedah penyarian. Walaubagaimana pun, masa penyarian optimum yang dicapai adalah berbeza untuk kaedah rendaman, soxhlet dan ultrasonik di mana masa penyarian yang diambil masing-masing 53 jam, 6 jam dan 35 minit. Kaedah ultrasonik menberikan hasil sarian zeaxanthin tertinggi dengan masa penyarian yang paling singkat jika dibandingkan dengan kaedah rendaman dan soxhlet iaitu 35 minit. Bagi parameter nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut pula, hanya kaedah soxhlet telah mencapai takat optimum iaitu pada nisbah 24g : 200ml. Manakala bagi kaedah rendaman dan ultrasonik nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut terbaik yang dapat dicapai adalah 32g : 200ml. 4.3 Kadar Penyarian Zeaxanthin Berdasarkan keputusan bagi ketiga-tiga kaedah penyarian yang telah dijalankan, Kecekapan kaedah penyarian dapat ditentukan melalui penentuan kadar penyarian yang diperolehi. Rajah 4.17 di bawah menunjukkan perbezaan kadar penyarian tertinggi yang dapat dicapai oleh ketiga-tiga kaedah penyarian yang telah dijalankan. GRAF KADAR PENYARIAN BAGI KAEDAH RENDAMAN, SOXHLET DAN ULTRASONIK PADA JISIM SAMPEL 30g 1.4 Ultrasonik, 1.15 Kadar Penyarian (mg/min) 1.2 1 0.8 0.6 Soxhlet, 0.35 0.4 0.2 Rendaman, 0.0216 0 Kaedah Penyarian Rajah 4.17 : Kadar penyarian bagi kaedah rendaman, soxhlet dan ultrasonik Daripada rajah di atas, Kaedah ultrasonik menunjukkan kadar penyarian zeaxanthin yang paling tinggi jika dibandingkan dengan kedua-dua kaedah yang lain. Kadar penyarian yang tinggi menunjukkan kecekapan yang tinggi bagi proses penyarian. Kadar penyarian bagi kaedah ultrasonik, soxhlet dan rendaman masingmasing adalah 1.15mg/min, 0.35mg/min dan 0.0216mg/min. Berdasarkan kadar penyarian yang diperolehi, dapatlah disimpulkan bahawa kaedah ultrasonik merupakan kaedah yang paling efektif dalam penghasilan zeaxanthin yang maksimum berdasarkan parameter proses optimum yang telah dicapai. Masa memainkan peranan penting dalam menentukan kadar penyarian sesuatu kaedah. Masa optimum yang dicapai oleh kaedah ultrasonik adalah 35 minit, kaedah soxhlet adalah 6 jam dan kaedah rendaman adalah 53 jam. 4.3 Pemalar Kadar Penyarian Pemalar kadar penyarian dikira melalui persamaan 2.2 dan jadual 4.13 di bawah menunjukkan nilai pemalar kadar penyarian bagi tiga kaedah penyarian iaitu rendaman, soxhlet dan ultrasonik. Jadual 4.13 : Pemalar kadar penyarian Kaedah penyarian Pemalar kadar penyarian (K0) Rendaman 0.000921 min-1 Soxhlet 0.00278 min-1 Ultrasonik 0.0329 min-1 Berdasarkan jadual 4.13 di atas, didapati bahawa pemalar kadar penyarian bagi kaedah ultrasonik adalah lebih tinggi iaitu 0.0329 min-1 jika dibandingkan dengan kaedah rendaman dan kaedah soxhlet, masing-masing 0.000921min-1 dan 0.00278min-1. Nilai pemalar yang lebih tinggi menunjukkan kadar penyarian berlaku dengan lebih cepat dan rintangan yang dihadapi semasa proses pemindahan jisim berlaku adalah kecil. BAB 5 KESIMPULAN 5.1 Kesimpulan Daripada kajian yang telah dijalankan, jumlah zeaxanthin yang boleh dihasilkan daripada sayur cekur manis menggunakan kaedah rendaman, soxhlet dan ultrasonik telah pun diperolehi. Proses pengoptimuman parameter kajian menggunakan kaedah rekabentuk eksperimen bagi penghasilan hasil sarian zeaxanthin yang maksimum juga dapat dicapai bagi ketiga-tiga kaedah. Beberapa kesimpulan dapat dibuat kesan daripada keseluruhan keputusan kajian yang diperolehi. Sayur cekur manis merupakan sayur yang mengandungi zeaxanthin tertinggi dibandingkan dengan 15 jenis sayur yang lain berdasarkan tiga kaedah penyarian iaitu rendaman, soxhlet dan ultrasonik. Parameter proses seperti jenis pelarut, nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut, masa penyarian dan isipadu air di dalam takung rendaman terbukti memberi kesan dan mempengaruhi hasil sarian zeaxanthin. Parameter proses yang optimum dan terbaik telah diperolehi hasil daripada kajian ini. Bagi kaedah rendaman, parameter proses optimum yang dicapai adalah pada masa penyarian 53 jam dengan menggunakan aseton sebagai pelarut dan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut terbaik adalah 0.16 iaitu 32g : 200ml. Bagi kaedah soxhlet pula masa optimum yang lebih singkat diperolehi untuk masa penyarian adalah 360 minit bersamaan 6 jam dengan menggunakan pelarut aseton dan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang optimum ialah 0.12 iaitu 24g : 200ml. Bagi kaedah ultrasonik, masa penyarian optimum dicapai pada masa 35 minit menggunakan aseton sebagai pelarut dengan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang terbaik 0.16 iaitu 32g : 200ml. Isipadu air di dalam takung rendaman yang optimum dicapai pada 3.3 liter di mana air berperanan sebagai medium kepada gelombang ultrasonik. Setiap kaedah penyarian memberikan kesan yang berbeza terhadap hasil sarian kerana ia bergantung kepada parameter proses yang digunakan di mana akan mempengaruhi kecekapan kaedah yang digunakan. Masa didapati memainkan peranan yang penting dalam proses penyarian ini. Di dalam kajian ini didapati kaedah ultrasonik memberikan keputusan yang agak membanggakan jika dibandingkan dengan kaedah soxhlet dan rendaman kerana dapat menghasilkan hasil sarian zeaxanthin tinggi dalam masa penyarian yang agak singkat. Penggunaan pelarut yang berpolar akan meningkatkan hasil sarian zeaxanthin. Di dalam kajian ini, aseton didapati berpotensi dan sesuai bagi ketiga-tiga proses penyarian iaitu rendaman, soxhlet dan ultrasonik untuk memperolehi hasil sarian zeaxanthin yang tinggi. Nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang optimum dicapai oleh kaedah soxhlet. Manakala bagi kaedah rendaman dan ultrasonik nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang terbaik sahaja dapat dicapai. Merujuk kepada nisbah yang diperolehi, didapati penggunaan pelarut yang banyak diperlukan dalam kaedah ini iaitu bersamaan 24 gram sampel terhadap 200ml pelarut dan ianya turut meningkatkan kos penghasilan jika diaplikasikan dalam skala loji pandu kelak. Kajian bagi kaedah rendaman dan kaedah ultrasonik perlu diteruskan untuk mendapatkan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut yang optimum dengan menambahkan nisbah jisim sampel terhadap isipadu pelarut. Parameter isipadu air di dalam takung rendaman hanya digunakan dalam kaedah ultrasonik kerana kaedah ini memerlukan medium bagi pergerakan gelombang. Daripada hasil kajian, terbukti bahawa parameter isipadu air yang digunakan memberi kesan kepada nilai intensiti gelombang dan seterusnya mempengaruhi hasil sarian zeaxanthin. Peningkatan isipadu air di dalam takung rendaman akan meningkatkan intensiti gelombang dan seterusnya menggalakkan proses peronggaan bagi mempercepatkan proses penyarian. Berdasarkan nilai kadar penyarian dan nilai pemalar kadar penyarian yang diperolehi untuk ketiga-tiga kaedah penyarian, didapati kaedah ultrasonik memberikan kadar penyarian yang tertinggi iaitu 1.15mg/min dengan pemalar kadar penyarian iaitu 0.0329min-1. Kadar penyarian dan pemalar kadar penyarian yang tinggi menunjukkan kaedah ultrasonik merupakan kaedah yang terbaik dalam penyarian zeaxanthin jika dibandingkan dengan kaedah rendaman dan ultrasonik. 5.2 Cadangan Berdasarkan keputusan yang diperolehi daripada kajian yang telah dilakukan ini, beberapa cadangan dapat diketengahkan bagi memastikan keputusan yang lebih baik diperolehi untuk kajian yang akan datang. Di antara cadangan tersebut adalah: i) Keadaan persekitaran banyak mempengaruhi hasil kajian disebabkan oleh faktor sensitifnya bahan aktif zeaxanthin terhadap cahaya, kehadiran oksigen dan asid. Berdasarkan faktor tersebut, maka ujikaji yang berkaitan dengan bahan aktif ini seharusnya dilakukan di dalam bilik gelap yang khas di mana bebas daripada bahan yang boleh mempengaruhinya dari segi kualiti dan kuantiti. ii) Kajian ini hanya melibatkan 16 jenis sayuran tempatan di Asia. Seperti yang diketahui, negara kita mempunyai pelbagai jenis sayuran yang mempunyai pelbagai peranan dalam sistem perubatan secara tradisional. Oleh sebab itu dicadangkan agar kajian yang seterusnya mestilah melibatkan banyak jenis sayuran lain yang menjadi sumber makanan dan sumber ubatan secara serentak bagi mengenalpasti sayuran yang sebenarnya merupakan sumber terbaik dalam penghasilan zeaxanthin pada masa akan datang. iii) Sistem penyarian secara ultrasonik mesti dibangunkan dengan lebih kreatif bagi memastikan penghasilan zeaxanthin yang maksimum dan mengelakkan kehilangan pelarut berlaku semasa proses penyarian. iv) Seiring dengan kemajuan sains dan teknologi, terdapat pelbagai kaedah penyarian diaplikasikan bagi penyarian bahan semulajadi. Dalam kajian ini, hanya tiga kaedah penyarian yang digunakan dalam menentukan kaedah yang terbaik dalam penghasilan zeaxanthin. Bagi kajian yang akan datang, disyorkan agar kaedah lain diaplikasikan. v) Perpindahan teknologi daripada ujikaji berskala makmal kepada skala loji pandu di masa akan datang untuk proses mengkomersialkan teknologi ini. RUJUKAN A.R. Mangels (1993) “Lutein, Phytonutrient With Burgeoning Utility.” Journal of The American Dietic Assoc.93. hlm 284-296. Azli Sulaiman (Ed). (2000). “Kimia Analisis I.” Skudai : Universiti Teknologi Malaysia. Bone, R.A., Landrum, J.T, Hime, G.W. dan Cains, A. (1993). “Stereochemistry of the Human Macular Carotenoids.” dlm Kwok-Wai Lam dan But, P. “The Content of Zeaxanthin in Gou Qi Zi, a Potential Health Benefit to Improve Visual Acuity.” Journal of Food Chemistry. 67. hlm 173176. Britton, G., Liaaen-Jensen, S. dan Pfander, H. (1995). “Carotenoids Vol 1A: Isolation and Analysis.” Birkhauser Verlag, Bassel . Britton, G., Liaden-Jensen, S. dan Pfander, H. .(1996). “Carotenoids Vol 2: Synthesis.” Birkhauser Verlag, Bassel. Brink, S., Wright, A.R dan Newman, R.J. (1994) “Greens over Carrots for Vision.” U.S.News & World Report. 117. hlm 97. Brubacher, G.,Muller-Mulot, W. dan Southgate, D.A.T. (1985). “Methods for the Determination of Vitamins in Food.” Applied Science Publishers, London. Collins, J.F., M.D., F.A.C.S. (1995). “Your Eyes an Owner’s Guide.” Prentice Hall, United States of America. Coulson, J.M., Richardson, J.F., Backhurst, J.R. dan Harker, J.H. (1991). “Chemical Engineering vol. 2. 4th Ed. Particle Technology and Separation Processes.” Oxford : Pergamon Press. Dechow dan Frederick, J. (1989). “Separation and Purification Techniques in Biotechnology.” Noyes Publication, New Jersey. Devore, J.L dan Farnum, N.R. (1999). “Applied Statistics For Engineers And Scientists.” Pacific Grove : Duxbury Press Ensminger, D. (1973). “Ultrasonics:The Low and High Intensity Applications.” Marcel Dekker Inc, New York. Eric, J.M.K. dan Harry, H.S.R. (1997). “Evaluation and Validation of an LC Method for the Analysis of Carotenoids in Vegetables and Fruit.” Journal of Food Chemistry. 59. hlm 599-603. Fackelmann, K.A. (1994). “Nutrients May Prevent Blinding Disease.” Science News.146. hlm 310. Fasihuddin, A. dan Hasmah (1993). “Kimia Hasilan Semulajadi dan Tumbuhan Ubatan.” Dewan Bahasa dan Pustaka, Kementerian Pendidikan Malaysia, Kuala Lumpur. Gaikar, V.G dan Dandekar, D.V. (2001). “Process For Extraction of Curcuminoids From Curcuma Species.” (U.S. Patent 6,224,877). Garnett, Kevin, M., Gierhart, Dennis, L., Guerra-santos dan Luis, H. (1998). “Zeaxanthin Formulations for Human Ingestion.” (U.S Patent: 5,827,652). Garnett, Kevin, M., Gierhart, Dennis, L., Guerra-santos dan Luis, H. (1998). “Method of Making Pure 3R-3’R Stereoisomer of Zeaxanthin for Human Ingestion.” (U.S Patent: 5,854,015). Geankoplis, C.H. (1995). “Transport Processes and Unit Operations.” Prentice Hall, Singapura. Goodwin T.W. (1980). “The Biochemistry of the Carotenoids Vol 1: Plants.” 2nd edition. Chapman and Hall, London. Haliwell, B., Aeschbach, R., Lologer, J. dan Aruoma, O.I. (1995). “Natural Antioxidants:An Overview.” dlm. F. Shahidi. “Natural Antioxidants:Chemistry Health Effects and Application”. AOCS Press, Zllinois. hlm 1-11 Hamilton, S. Dan Hamilton, R. (1987). “Thin Layer Chromatography, Analytical Chemistry by Open Learning.” London : John Wiley and Sons. Hanspeter, P. (1992). “Carotenoids : an Overview”.” dlm Packer, L. “Carotenoids: Chemistry, Separation, Quantitation and Antioxidant.” Methods in Enzymology Vol 213, Academic Press, United States of America. Hasrinah, A. (2001). “Pengoptimum Penurasan Menggunakan Penuras Dedaun Dengan Bantuan Gelombang Ultrasonik Berdasarkan Nisbah Antara Masa Penurasan Terhadap Masa Pengaplikasian Gelombang.”Tesis. Universiti Teknologi Malaysia. Hills (1989). “Extraction of Anti-Mutagenic Pigments from Algae and Vegetables.” (U.S Patent: 4,851,339). Hodisan, T., Socaciu, C., Ropan, I. dan Neamtu, G. (1997). “Carotenoid Composition of Rosa canina Fruits Determined by Thin Layer Chromatography and High Performance Liquid Chromatography.” Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis .16. hlm 521-528. Houghton P.J. dan Raman Amala (1998). “Laboratory Handbook for the Fractionation of Natural Extracts.” Chapman and Hall, London. Indofine Chemical Company, Inc (2001). “Standards For Herbal Extracts Add Nutritional Product.” hlm 23. JianYong Wu, Lidong Lin dan Foo tim Chau (2001) “Ultrasound Assisted Extraction of Ginseng Saponins from Ginseng Roots and Cultured Ginseng Cells.” Ultrasonic Sonochemistry .8. hlm 347-352. Karlsson J. (1997) “Principles of Radical Formation.” dlm Karlsson J. “Antioxidant and Exercise.” United States: Human kinetics. Khachik, F., Beecher, G. R. dan Whittaker, N.F. (1989). “Separation, identification and Quantification of the Major Carotenoids and Chlorophyll Constituents in Extracts of Several Green Vegetables by Liquid Chromatography.” Journal of Agricultural & Food Chemistry. 34. hlm 603-616. Khachik, F. (2001). “Process for Extraction and Purification of Lutein, Zeaxanthin and Rare Carotenoids from Marigold Flowers and Plants.” (U.S. Patent:6,262,284). Kikuzaki, H., dan Nakatani, N. (1993). “Antioxidant Effects of Some Ginger Constituents.” Journal of Food Science..58. hlm 1407-1410. Kull D. dan Pfander, H. (1995). “Isolation and Identification of carotenoids from the Petals of rape (Brassica Napus).” Journal of Agricultural & Food Chemistry. 43. hlm 10-12. Kwok-wai Lam, dan But, P. (1999). “The Content of Zeaxanthin in Qou Qi Zi, a Potential Health Benefit to Improve Visual Acuity.” Journal of Food Chemistry. 67. hlm 173-176. Madley H. Rebecca (2000) “Seeing is Believing” Nutraceuticals World, May/June 2000. Majchrzak, D., Frank, U., dan Elmadfa, I. (2000). “Carotenoid Profile and Retinol Content of Baby Food Products.” Eur Food Res Technol. 210. hlm 407-413. Marsin Sanagi (1998). “Teknik Pemisahan Dalam Analisis Kimia.” Universiti Teknologi Malaysia. Mason, T.J. (1990). “Sonochemistry:The Uses of Ultrasound in Chemistry” The Royal Society of Chemistry, Cambridge. Mason T.J. dan Lorimer, J.P. (1998). “Sonochemistry.” Ellis Horwood Ltd. McClements, D.J. (1995). “Ultrasonic in Food Processing.” Elsevier Science B.V., Netherlands Meloan, C.E. (1999). “Chemical Separations : Principles, Techniques and Experiments” John Wiley and Sons, United States of America. Muhammad Hisyam Lee (2000). “Jadual Statistik Untuk Kejuruteraan Dan Sains” Universiti Teknologi Malaysia. Newell, F.W. (1996). “ Ophtalmology: Principal and Concepts (8th edition).” Mosby Year Book, United States of America. Norhalieza, A. (2000). “Ensiklopedia Sains dan Teknologi (Kejuruteraan Kimia dan Sumber Asli) : Penyarian.” Dewan Bahasa dan Pustaka, Malaysia. hlm: 557563. Packer, L. (1992). “Carotenoids: Chemistry, Separation, Quantitation and Antioxidant.” Methods in Enzymology Vol 213, Academic Press, United States of America. Passwater, R.A. (1998) “All About Antioxidants.” New York : Avery Publishing Group. Richard, K.H.W (2000) “Eye on Eye Health (Recent research on nutraceuticals for eye health).” Nutraceuticals World.3. No.5. hlm: 44-49. Robiah, Y. (2000). “Ensiklopedia Sains dan Teknologi (Kejuruteraan Kimia dan Sumber Asli) : Operasi Unit.” Dewan Bahasa dan Pustaka, Malaysia. hlm: 339-341. Rodziah, A. (1999). “Kamus Kejuruteraan Kimia” Dewan Bahasa dan Pustaka, Kuala Lumpur Rohana, A. dan Amir, H.K.(1992) “ Kimia Analisis: Kaedah Pemisahan.” Dewan Bahasa dan Pustaka, Kuala Lumpur. Rosli Mohd Yunus. (1996). “Ultrasound Fields in Crossflow Microfiltration.” University of Wales Swansea : Tesis Ph.D. Rydberg, J., Musikas, Claude, Choppin dan Gregory, R. (1992) “Principles and Practices of Solvent Extraction.” 270 Madison Avenue, New York. Sargenti, S.R. dan Vichnewski,W. (2000). “Sonication and Liquid Chromatography as a Rapid Technique for Extraction and Fractionation of Plant Material.” Phytochemical Analysis.11. hlm 69-73. Schiedt, K. Dan Liaaen-Jensen, S. (1995). “Isolation and Analysis”. dlm Britton, G., Liaaen-Jensen, S. Dan Pfander, H. (Ed). “Carotenoids. Vol IA : Isolation and Analysis.” Basel : Birkhauser Verlag. 107. Siong, T. E (1988). “Carotenoids and Retinoids in Human Nutrition.” Institute of Medical Research, Kuala Lumpur. Sommerburg, O., Keunen, J.E.E., Bird, A.C. dan Kuijk, F.J.G. (1998). “Fruits and Vegetables That are Sources for Lutein and Zeaxanthin: The Macular Pigment in Human Eyes.” British Journal of Opthalmology. 82. hlm 907-910. Spiro, M., dan Kandiah, M. (1990). “Discovering Herbs.” J. Food Sci. Technol. 85, hlm 1866-1875. StatSoft, Inc. (2000). “STATISTICA Version 5.0.” Tulsa. Software. Steinmetz, K.A. dan Potter, J.D. (1991). “Vegetables, Fruit and Cancer” dlm Erik, J.M. Konings and Harry, H. S. Roomans . “Evaluation and Validation of an LC Method for the Analysis of Carotenoids in Vegetables and Fruit.” Journal of Food Chemistry. 59. hlm 599. Suhaila, M., dan Azizah, O. (1990). “Seminar on Advances in Food Research III” Universiti Pertanian Malaysia, Malaysia. hlm 188- 216. Sulman, M.G., Pirog, D.N., Ankudinova, T.V., Sulman, E.M dan Semagina, N.V. (1997). “The Extraction Process From the Vegetable Raw Material in the Ultrasonic Field.” 1st European Congress on Chemical Engineering:Florence, Italy.4. hlm 3017-3018 Teodor, H., Carmen, S., Ioana, R. dan Gavril, N., (1997). “Carotenoid Composition of Rosa Canina Fruits Determine by Thin Layer Chromatography and High Performance Liquid Chromatography.” Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis.16.hlm 521-528. Thomas, Ronald, L., Deibler, Kathryn Diane, Barmore dan Charles Rice (1998). “Extraction of Pigment from Plant Material.” (U.S Patent: 5,830,738). Tiwari, K.K. (1995) “Extraction technologies related to food processing.” Elsevier Science B.V., Netherlands Tufts University Diet & Nutririon Letter (1995). “Sighted : Foods for Better Vision.” 12. isu 11. USDA-NCC Carotenoid Database For U.S. Foods (1998). “Zeaxanthin Content of Selected U.S. Foods.” United States of America. Virgilli, S., Nuria, Martorell, F., Carles, J., De Bloss De Clercq, Mildred, Martin, F., dan Juan, A. (1999) “Process for Preparing Carotenoids Pigments.” (U.S Patent: 5,998,678). Wan Aini dan Zuhaimy (1991). “Statistik untuk Kimia Analisis” Unit Penerbitan Akademik, Universiti Teknologi Malaysia. Yates, J. R.W., dan Moore, A. T. (2000) “Genetic Susceptibility to Age Related Macular Degeneration.” Journal of Medical Geneticts. 37. hlm 83-87. Young, A. dan Britton, G. (1993). “Carotenoids in photosynthesis” Chapmon and hall, Great Britain. hlm 409-452. http : // www. Ama-assn.org (5 Oktober 2003) http : // www.zeavision.com (13 September 2003) LAMPIRAN A JADUAL TABURAN F LAMPIRAN B DATA EKSPERIMEN Eksperimen A1(1) A2(1) A3(1) A4(1) A5(1) A6(1) A7(1) A8(1) A9(1) A1(2) A2(2) A3(2) A4(2) A5(2) A6(2) A7(2) A8(2) A9(2) A1(3) A2(3) A3(3) A4(3) A5(3) A6(3) A7(3) A8(3) A9(3) Jisim sampel (mg) 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 Masa pengurasan (min) 1440 4320 2880 4320 2880 1440 2880 1440 4320 1440 4320 2880 4320 2880 1440 2880 1440 4320 1440 4320 2880 4320 2880 1440 2880 1440 4320 Absorbance 0.158 0.329 0.492 0.386 0.445 0.576 0.17 0.428 0.644 0.164 0.312 0.298 0.201 0.443 0.626 0.2 0.449 0.725 0.162 0.276 0.451 0.199 0.416 0.611 0.184 0.171 0.673 Hasil (mg) 7.83 16.31 24.39 19.14 22.06 28.56 8.43 21.22 31.93 8.13 15.47 14.78 9.97 21.96 31.04 9.92 22.26 35.95 8.03 13.68 22.36 9.87 20.63 30.29 9.12 8.48 33.37 Hasil (%) 0.08 0.08 0.08 0.19 0.11 0.10 0.08 0.11 0.11 0.08 0.08 0.05 0.10 0.11 0.10 0.10 0.11 0.12 0.08 0.07 0.07 0.10 0.10 0.10 0.09 0.04 0.11 Kadar pengurasan (mg/min) 0.0054 0.0038 0.0085 0.0044 0.0077 0.0198 0.0029 0.0147 0.0074 0.0056 0.0036 0.0051 0.0023 0.0076 0.0216 0.0034 0.0155 0.0083 0.0056 0.0032 0.0078 0.0023 0.0072 0.0210 0.0032 0.0059 0.0077 B1 : Hasil pengurasan zeaxanthin dengan menggunakan kaedah rendaman Eksperimen B1(1) B2(1) B3(1) B4(1) B5(1) B6(1) B7(1) B8(1) B9(1) B1(2) B2(2) B3(2) B4(2) B5(2) B6(2) B7(2) B8(2) B9(2) B1(3) B2(3) B3(3) B4(3) B5(3) B6(3) B7(3) B8(3) B9(3) Jisim sampel (mg) 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 10000 20000 30000 Masa pengurasan (min) 120 600 360 600 360 120 360 120 600 120 600 360 600 360 120 360 120 600 120 600 360 600 360 120 360 120 600 Absorbance 0.125 0.416 0.491 0.254 0.483 0.847 0.214 0.528 0.303 0.145 0.412 0.493 0.25 0.581 0.487 0.17 0.54 0.31 0.115 0.42 0.309 0.252 0.365 0.5 0.201 0.536 0.311 Hasil (mg) 6.20 20.63 24.34 12.59 23.95 42.00 10.61 26.18 15.02 7.19 20.43 24.44 12.40 28.81 24.15 8.43 26.77 15.37 5.70 20.82 15.32 12.49 18.10 24.79 9.97 26.58 15.42 Hasil (%) 0.06 0.10 0.08 0.13 0.12 0.14 0.11 0.13 0.05 0.07 0.10 0.08 0.12 0.14 0.08 0.08 0.13 0.05 0.06 0.10 0.05 0.12 0.09 0.08 0.10 0.13 0.05 Kadar pengurasan(mg/min) 0.05 0.03 0.07 0.02 0.07 0.35 0.03 0.22 0.03 0.06 0.03 0.07 0.02 0.08 0.20 0.02 0.22 0.03 0.05 0.03 0.04 0.02 0.05 0.21 0.03 0.22 0.03 B2 : Hasil pengurasan zeaxanthin dengan menggunakan kaedah soxhlet Eksperimen C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 Jisim sampel (mg) 10000 10000 10000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 10000 10000 10000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 10000 10000 10000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 Masa pengurasan (min) 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 Absorbance 0.206 0.215 0.151 0.24 0.301 0.361 0.407 0.301 0.327 0.174 0.252 0.255 0.407 0.43 0.393 0.452 0.76 0.576 0.229 0.165 0.148 0.339 0.296 0.45 0.431 0.617 0.52 Hasil (mg) 10.21 10.66 7.49 11.90 14.92 17.90 20.18 14.92 16.21 8.63 12.49 12.64 20.18 21.32 19.49 22.41 37.68 28.56 11.35 8.18 7.34 16.81 14.68 22.31 21.37 30.59 25.78 Hasil (%) 0.10 0.11 0.07 0.06 0.07 0.09 0.07 0.05 0.05 0.09 0.12 0.13 0.10 0.11 0.10 0.07 0.13 0.10 0.11 0.08 0.07 0.08 0.07 0.11 0.07 0.10 0.09 Kadar pengurasan (mg/min) 0.51 0.27 0.12 0.59 0.37 0.30 1.01 0.37 0.27 0.43 0.31 0.21 1.01 0.53 0.32 1.12 0.94 0.48 0.57 0.20 0.12 0.84 0.37 0.37 1.07 0.76 0.43 B3 : Hasil pengurasan zeaxanthin dengan menggunakan kaedah Ultrasonik (replikat 1) Eksperimen C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 Jisim sampel (mg) 10000 10000 10000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 10000 10000 10000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 10000 10000 10000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 Masa pengurasan (min) 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 Absorbance 0.2 0.21 0.148 0.233 0.295 0.334 0.4 0.228 0.316 0.162 0.241 0.245 0.389 0.425 0.372 0.421 0.7 0.56 0.221 0.158 0.14 0.321 0.287 0.43 0.421 0.601 0.515 Hasil (mg) 9.92 10.41 7.34 11.55 14.63 16.56 19.83 11.30 15.67 8.03 11.95 12.15 19.29 21.07 18.44 20.87 34.71 27.77 10.96 7.83 6.94 15.92 14.23 21.32 20.87 29.80 25.53 Hasil (%) 0.10 0.10 0.07 0.06 0.07 0.08 0.07 0.04 0.05 0.08 0.12 0.12 0.10 0.11 0.09 0.07 0.12 0.09 0.11 0.08 0.07 0.08 0.07 0.11 0.07 0.10 0.09 Kadar pengurasan (mg/min) 0.50 0.26 0.12 0.58 0.37 0.28 0.99 0.28 0.26 0.40 0.30 0.20 0.96 0.53 0.31 1.04 0.87 0.46 0.55 0.20 0.12 0.80 0.36 0.36 1.04 0.74 0.43 B3 : Hasil pengurasan zeaxanthin dengan menggunakan kaedah Ultrasonik (replikat 2) Eksperimen C1 C2 C3 C4 C5 C6 C7 C8 C9 C10 C11 C12 C13 C14 C15 C16 C17 C18 C19 C20 C21 C22 C23 C24 C25 C26 C27 Jisim sampel (mg) 10000 10000 10000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 10000 10000 10000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 10000 10000 10000 20000 20000 20000 30000 30000 30000 Masa pengurasan (min) 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 20 40 60 Absorbance 0.217 0.222 0.161 0.252 0.315 0.302 0.415 0.31 0.35 0.179 0.26 0.262 0.415 0.435 0.4 0.464 0.77 0.589 0.235 0.17 0.155 0.35 0.3 0.464 0.444 0.628 0.531 Hasil (mg) 10.76 11.01 7.98 12.49 15.62 14.97 20.58 15.37 17.35 8.88 12.89 12.99 20.58 21.57 19.83 23.01 38.18 29.20 11.65 8.43 7.69 17.35 14.87 23.01 22.01 31.14 26.33 Hasil (%) 0.11 0.11 0.08 0.06 0.08 0.07 0.07 0.05 0.06 0.09 0.13 0.13 0.10 0.11 0.10 0.08 0.13 0.10 0.12 0.08 0.08 0.09 0.07 0.12 0.07 0.10 0.09 Kadar pengurasan (mg/min) 0.54 0.28 0.13 0.62 0.39 0.25 1.03 0.38 0.29 0.44 0.32 0.22 1.03 0.54 0.33 1.15 0.95 0.49 0.58 0.21 0.13 0.87 0.37 0.38 1.10 0.78 0.44 B3 : Hasil pengurasan zeaxanthin dengan menggunakan kaedah Ultrasonik (replikat 3)