The distribution, rate of synthesis and characterization of protein from the eggs of Aulocara elliotti
(Thomas) (Orthoptera, Acrididae) during development
by Richard Wilmer Robinson
A thesis submitted to the Graduate Faculty in partial fulfillment of the requirements for the degree of
DOCTOR OF PHILOSOPHY in Zoology
Montana State University
© Copyright by Richard Wilmer Robinson (1970)
Abstract:
Dry weight, protein content and rate of protein synthesis of whole eggs and separate egg fractions
(embryo, yolk and shell) were followed throughout the embryogenesis of Aulocara elliotti (Thos.).
Protein content was determined by the biuret assay. The protein of whole eggs and the yolk fraction
decreased markedly during the transition from prediapause to diapause development. The embryonic
protein increased during the first 50 days of diapause development and gradually decreased with longer
times in the diapause state. Increases in embryonic protein paralleled morphogenetic changes during
post-diapause development.
There was an increase in the ratio of non-protein to protein material in the embryo during late
pre-diapause which reached a high level that was maintained throughout diapause and decreased during
post-diapause development. Uniformly-labeled valine-C14 was introduced by a desiccation-absorption
technique to allow a 4-day period of in vivo incorporation into protein. The embryo fraction showed a
high rate of protein synthesis at 36 days of pre-diapause development. The rate of protein synthesis was
low in embryos and relatively high in yolk during diapause. The observations indicate that the increase
in the ratio of non-protein to protein material in the diapausing embryo is due to continued hydrolysis
and transfer of yolk reserves to the embryo while a low embryonic metabolic rate allows the
accumulation of the products.
Embryonic proteins and yolk proteins that were soluble in 40 % sucrose were separated
electrophoretically on polyacrylamide disc gels.
Yolk protein not soluble in 40 % sucrose (over 50 %) was dissolved in 0.6 N KC1 and separated. The
number of protein bands was determined by-staining with Amido-Schwarz. Proteins conjugated with
carbohydrates or lipoid material were indicated by use of the PAS reaction and Sudan Black B staining.
The general pattern of protein bands was determined in embryos and yolk during pre-diapause,
diapause and post-diapause development. Protein from embryos and yolk contained the largest number
of bands during diapause. Three lipid-positive bands were found in diapausing embryos while only one
was found during pre-diapause and post-diapause development. Four protein bands in diapausing
embryos correspond with bands in the yolk pattern during diapause. This may mean that intact proteins
are transferred from the yolk to the embryo. Two, five and six lipoprotein bands, respectively, appeared
in 40 % sucrose-soluble yolk during pre-diapause, diapause and post-diapause development. Yolk
soluble in 0.6 N KC1 contained two major protein bands which were positive for both carbohydrate
and lipid. THE - DISTRIBUTION, RATE OF SYNTHESIS AND CHARACTERIZATION
OF PROTEIN FROM THE EGGS OF AULQCARA ELLIOTTI (THOMAS)
(OR.THOPTERA, ACRIDIDAE) DURING DEVELOPMENT
by
RICHARD WILMER ROBINSON
A t h e s i s s u b m i t te d t o t h e G ra d u a te F a c u l t y i n p a r t i a l
f u l f i l l m e n t o f t h e r e q u ir e m e n ts f o r th e d e g re e
of
DOCTOR OF PHILOSOPHY
in
Z o ology
A p p ro v e d :
H eadZ /Maj o r D epartm e n t
C h a irm a n , E x a m in in g C om m ittee
MONTANA STATE UNIVERSITY
Bozem an, Monta n a
J u n e , 1970
iii
ACKNOWLEDGMENT
I am g r a t e f u l to my m a jo r p r o f e s s o r . D r. G eorge R o e m h ild , f o r
s u g g e s t i o n s made d u r in g t h e c o u r s e o f t h i s s tu d y and v a l u a b l e con­
s t r u c t i v e c r i t i c i s m s o f t h e m a n u s c r ip t .
I w is h t o t h a n k ■D r s . H a ro ld
P i c t o n and S a r a l e e V i s s c h e r f o r t h e i r e x c e l l e n t c r i t i c a l r e a d i n g o f
th e m a n u s c rip t.
D r s . A. M. E l-N egoum y, G ordon J u l i a n and G ary S t r o b e l
c o n t r i b u t e d v a l u a b l e t e c h n i c a l a d v ic e d u r in g t h e c o u r s e o f t h i s s tu d y
t h a t was much a p p r e c i a t e d .
I w is h t o th a n k P r o f e s s o r E l ls w o r t h
H a s tin g s f o r p r o v i d i n g g r a s s h o p p e r s and r e a r i n g f a c i l i t i e s .
My w i f e ,
M a r ie , d e s e r v e s s p e c i a l ackn o w led g m en t f o r h e r p a t i e n c e , u n d e r s t a n d i n g ,
e n c o u ra g e m e n t an d h e lp d u r in g t h i s s t u d y .
I a p p r e c i a t e t h e f i n a n c i a l s u p p o r t f o r t h i s s tu d y w h ic h was p r o ­
v id e d by t h e U. S . D e p a rtm e n t o f H e a l t h , E d u c a tio n and W e lf a r e th ro u g h
a T i t l e IV NDEA F e llo w s h ip and t h e Z o o lo g y and E n tom ology D e p a rtm e n t
a t M ontana S t a t e U n i v e r s i t y th r o u g h a t e a c h i n g a s s i s t a n t s h i p .
iv
TABLE OF CONTENTS
P age
V I T A .........................
ii
ACKNOWLEDGMENT ....................................................................................................................
LIST OF TA B L E S..................................' ...........................................................
LIST OF FIGURES
; , . .
...........................................................................................
iii
v
vi
ABSTRACT.....................................
v iii
INTRODUCTION-............................................. ....... ...................................................................
I
METHODS AND MATERIALS ' ................................................................................................
9
• E x p e r im e n ta l D e s i g n ........................................................................ . . .
.
B i o l o g i c a l S am ples ' ...........................................................................................
B i u r e t A ssay
..........................................................................................................
P r o te in E x tra c tio n
...........................................................................................
L i q u id S c i n t i l l a t i o n C o u n tin g
...............................................................
1 D is c E l e c t r o p h o r e s i s ■.......................................................................................
P r o te in C h a ra c te riz a tio n
................................................ . ....................
9
10
14
15
16
17
20
RESULTS AND DISCUSSION ................................................................................................
22
I s o t o p e I n t r o d u c t i o n an d Egg W eight C hanges ................... . . .
R a d i o a c t iv e V a lin e U p ta k e M easu rem en t
..............................................
Dry W e ig h ts o f W hole Eggs and Egg F r a c t i o n s .....................................
P r o t e i n C o n te n t o f W hole Eggs and Egg F r a c t i o n s ...........................
The R a te o f P r o t e i n S y n t h e s i s i n W hole Eggs and Egg
F r a c t i o n s ..........................................................................................................
D is c E l e c t r o p h o r e s i s .......................................................................................
22
24
27
31
SUMMARY.......................................' ........................................................................... ....
48
64
. .
76
LITERATURE CITED . . . ................................................................................................
79
V-
LIST OF TABLES
T a b le
I.
II.
III.
IV .
V.
V I;
V II,
V III.
Page
C hanges i n t h e w e ig h t o f e g g s fro m A. e t l i o t t i d u r in g
d e s i c c a t i o n an d a b s o r p t i o n ....................................................................
23
V a l i n e - C ^ u p ta k e m e a su re m e n ts e x p r e s s e d i n d i s i n t e ­
g r a t i o n s p e r m in u te p e r A. e l t i o t t i egg o r egg
f r a c t i o n .........................................................
26
P e r c e n t d ry w e i g h t s 3 o f w h o le e g g s and egg f r a c t i o n s
fro m A. e l l i o t t - i .......................................'....................................................
28
P r o t e i n c o n t e n t o f S e r i e s I w h o le e g g s t h r o u g h o u t t h e
e m b ry o g e n e s is o f A.- e Z H e t t i .....................................
34
P r o t e i n c o n t e n t o f S e r i e s I I . e g g f r a c t i o n s a m p le s
fro m A. e l l i o t t - i . . •..................................................................................
36
The am ount o f p r o t e i n e x t r a c t e d fro m w h o le e g g and egg
f r a c t i o n s a m p le s from A. B l X - I o t t i - ................................................
50
The a p p a r e n t r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s 3 i n S e r i e s I
w h o le egg s a m p le s from A. e l l i o t t i m e a su re d a s p e r c e n t
in c o r p o r a tio n o f v a lin e -C -^
...............................................................
52
The r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n S e r i e s I I egg f r a c t i o n
s a m p le s fro m A. e l l i o t t i m e a s u re d a s p e r c e n t i n c o r p De­
ra tio n
...............................................................................................................
55
vi
LIST OF FIGURES
F ig u re
1.
2.
P age
M a jo r s t e p s i n t h e p r o c e d u r e f o r d e te r m in in g t h e p r o t e i n
c o n t e n t and v a l i n e - c l ^ a c t i v i t y o f e x t r a c t e d p r o t e i n i n
A. eZViottv. w h o le •e g g s ■and egg f r a c t i o n s . . . . . . . . .
P e r c e n t a b s o r p t i o n Of valine-C -*-^ by A. QU1I o t t 1V e g g s
d u r in g d e v e lo p m e n t . . . .
.....................................................................
12
25
3.
P e r c e n t d ry w e ig h t o f A. e V l t o t t - i w h o le e g g s and egg
fra c tio n s
.....................................................................................................................29
4.
S h e l l d ry w e ig h t o f A. eVh-iotti e g g s ................................................ 32
5.
P r o t e i n c o n t e n t o f S e r i e s I w h o le e g g s th r o u g h o u t t h e
em bryo g e n e s i s o f A. e V L t o t t i ................................................................... 35
6.
P r o t e i n c o n te n t o f S e r i e s I I e g g f r a c t i o n s a m p le s t h r o u g h ­
o u t t h e e m b ry o g e n e si s o f A.e Z H o t t t ...............................................
7.
P r o t e i n c o n t e n t an d p e r c e n t p r o t e i n i n A. e V l t o t t - i ■
em bryos th r o u g h o u t e m b ry o g e n e s is ...........................................................
37
39
8.
P r o t e i n c o n t e n t o f t h e y o l k f r a c t i o n and s h e l l f r a c t i o n
th r o u g h o u t t h e e m b ry o g e n e s is o f A.e V l - L o t t t .......................................41
9.
An i d e a l i z e d r e p r e s e n t a t i o n o f t h e am ount o f p r o t e i n and
n o n - p r o t e i n m a t e r i a l i n A. eVbt otti. em bryos t h r o u g h o u t
e m b r y o g e n e s i s ................................................... ................................................ 42
10.
P e r c e n t i n c o r p o r a t i o n o f v a li n e - C ^ ^ i n t o p r o t e i n i n
S e r i e s I w h o le egg s a m p le s th r o u g h o u t t h e em bryo­
g e n e s i s o f A. e Z H o t t t ........................................................................................ 53
11.
P e r c e n t i n c o r p o r a t i o n o f v a l i n e - C"^ i n t o p r o t e i n i n
S e r i e s I I egg f r a c t i o n s a m p le s th r o u g h o u t t h e em bryo­
g e n e s i s o f A. e Z Z - vo tt i, ........................................................................................56
12.
The e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f 40 % s u c r o s e - s o l u b l e em­
b r y o n i c p r o t e i n d u r in g t h e e m b ry o g e n e s is o f A. e V l to tt iand an i n d i c a t i o n t h a t some o f t h e p r o t e i n b a n d s a r e con­
j u g a t e d w i t h c a r b o h y d r a te a n d / o r l i p o i d m a t e r i a l .........................
65
v ii
13.
14.
The e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f 40 % s u c r o s e - s o l u b l e
y o l k p r o t e i n d u r in g t h e e m b ry o g e n e s is o f A. e V l to tt iand an i n d i c a t i o n t h a t some o f t h e p r o t e i n b a n d s a r e
c o n ju g a te d w i t h c a r b o h y d r a te a n d / o r l i p o i d m a t e r i a l
. . . .
The e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f 0 .6 N K C l - s o l u b l e .y o l k
p r o t e i n d u r in g t h e e m b ry o g e n e s is o f A. e W i o t t i . and an
i n d i c a t i o n t h a t some o f t h e p r o t e i n b a n d s a r e c o n ­
j u g a t e d w i t h c a r b o h y d r a te a n d /o r l i p o i d m a t e r i a l ...................
66
67
v iii
ABSTRACT
• Dry w e i g h t , p r o t e i n c o n te n t and r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s o f w h o le
e g g s and s e p a r a t e eg g f r a c t i o n s (e m b ry o , y o lk and s h e l l ) w e re fo llo w e d
th r o u g h o u t t h e em bryo g e n e s i s o f Auloeava e lli -o tt -i ( T h o s . ) . P r o t e i n c o n ­
t e n t was d e te r m in e d by t h e b i u r e t a s s a y .
The p r o t e i n o f w h o le e g g s and
t h e y o l k f r a c t i o n d e c r e a s e d m a rk e d ly d u r in g t h e t r a n s i t i o n from p r e ­
d ia p a u s e t o d i a p a u s e d e v e lo p m e n t. The e m b ry o n ic p r o t e i n i n c r e a s e d
d u r in g t h e f i r s t 50 d ay s o f d ia p a u s e d e v e lo p m e n t and g r a d u a l l y d e c r e a s e d
w i t h l o n g e r tim e s i n t h e d i a p a u s e s t a t e .
I n c r e a s e s i n e m b ry o n ic p r o t e i n
p a r a l l e l e d m o r p h o g e n e tic c h a n g e s d u r in g p o s t - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t.
T h e re was an i n c r e a s e i n t h e r a t i o o f n o n - p r o t e i n t o p r o t e i n m a t e r i a l
i n t h e em bryo d u r in g l a t e p r e - d i a p a u s e w h ic h r e a c h e d a h i g h l e v e l t h a t
was m a i n ta i n e d th r o u g h o u t d ia p a u s e and d e c r e a s e d d u r in g p o s t - d i a p a u s e
d e v e lo p m e n t. U n i f o r m ly - l a b e l e d v a l i n e - C l ^ was i n t r o d u c e d by a d e s i c ­
c a t i o n - a b s o r p t i o n t e c h n i q u e t o a llo w a 4 - day p e r i o d o f 'in v i v o i n c o r ­
p o ra tio n in to p r o te in .
The em bryo f r a c t i o n show ed a h ig h r a t e o f p r o t e i n
s y n t h e s i s a t 36 d ay s o f p r e - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t. The r a t e o f p r o t e i n
s y n t h e s i s was low i n em bryos and r e l a t i v e l y h ig h i n y o l k d u r in g d i a p a u s e .
The o b s e r v a t i o n s i n d i c a t e t h a t t h e i n c r e a s e . i n t h e r a t i o o f n o n - p r o t e i n
t o p r o t e i n m a t e r i a l i n t h e d i a p a u s i n g em bryo i s due t o c o n tin u e d h y d r o ­
l y s i s an d t r a n s f e r o f y o l k r e s e r v e s t o t h e em bryo w h i l e a low e m b ry o n ic
m e t a b o li c r a t e a llo w s t h e a c c u m u la tio n o f t h e p r o d u c t s .
E m b ry o n ic p r o t e i n s and y o l k p r o t e i n s t h a t w e re s o l u b l e i n 40 % s u c ­
r o s e w e re s e p a r a t e d e l e c t r o p h o r e t i c a l l y on p o l y a c r y la m id e d i s c g e l s .
Y o lk p r o t e i n n o t s o l u b l e i n 40 % s u c r o s e (o v e r 50 %) was d i s s o l v e d i n
0 .6 N KCl and s e p a r a t e d .
The num ber o f p r o t e i n b a n d s was d e te r m in e d bys t a i n i n g w i t h A m id o -S c h w arz . P r o t e i n s c o n ju g a te d w i t h c a r b o h y d r a te s o r
l i p o i d m a t e r i a l w e re i n d i c a t e d b y u s e o f t h e PAS r e a c t i o n and Sudan
B la c k B s t a i n i n g .
The g e n e r a l p a t t e r n o f p r o t e i n b a n d s w as d e te r m in e d
i n em bryos and y o l k d u r in g p r e - d i a p a u s e , d ia p a u s e and p o s t - d i a p a u s e
d e v e lo p m e n t. P r o t e i n from em bryos and y o l k c o n ta i n e d t h e l a r g e s t
num ber o f b a n d s d u r in g d i a p a u s e .
T h re e l i p i d - p o s i t i v e b a n d s w e re fo u n d
i n d i a p a u s i n g em bryos w h i l e o n ly one was fo u n d d u r in g p r e - d i a p a u s e and
p o s t - d ia p a u s e d e v e lo p m e n t.
F o u r p r o t e i n b a n d s i n d i a p a u s i n g em bryos
c o r r e s p o n d w i t h b a n d s i n t h e y o l k p a t t e r n d u r in g d i a p a u s e . T h is may
mean t h a t i n t a c t p r o t e i n s ' a r e t r a n s f e r r e d fro m t h e y o l k t o t h e em bryo.
Two, f i v e a n d s i x l i p o p r o t e i n b a n d s , r e s p e c t i v e l y , a p p e a r e d i n 40 %
s u c r o s e - s o l u b l e y o l k d u r in g p r e - d i a p a u s e , d ia p a u s e and p o s t - d i a p a u s e
d e v e lo p m e n t. Y olk s o l u b l e i n 0 .6 N KCl c o n ta i n e d two m a jo r p r o t e i n
b a n d s w h ic h w e re p o s i t i v e f o r b o th c a r b o h y d r a te and l i p i d .
INTRODUCTION
The g r a s s h o p p e r s p e c i e s Aulocava e l V i o t t i
(Thomas) i s in d ig e n o u s
t o t h e G r e a t P l a i n s a r e a o f t h e U n ite d S t a t e s and h a s b e e n o f c o n s id ­
e r a b l e i n t e r e s t fro m an e c o n o m ic s t a n d p o i n t f o r many y e a r s .
A lth o u g h
c o n t r o l o f t h i s i n s e c t i s p o s s i b l e by c h e m ic a l m e a n s , an u n d e r s t a n d in g
o f t h e f a c t o r s w h ic h c a u s e p o p u l a t i o n c h a n g e s and s u b s e q u e n t eco n o m ic
damage w o u ld b e o f v a lu e when p l a n n i n g any s o r t . o f c o n t r o l p ro g ra m .
C o n s e q u e n tly , d u r in g t h e p a s t d e c a d e a num ber o f b i o c h e m ic a l s t u d i e s
h a v e b e e n u n d e r ta k e n on t h e egg s t a g e o f t h i s s p e c i e s w i t h t h e i d e a
t h a t an i n t i m a t e k n o w le d g e o f t h e p h y s io l o g y m ig h t r e s u l t i n some
u n d e rs ta n d in g o f th e re a s o n s f o r p o p u la tio n change.
S e v e r a l c l a s s e s o f compounds h a v e b e e n i n v e s t i g a t e d .
Svoboda
(1 9 6 4 ) s t u d i e d t h e l i p i d f r a c t i o n o f d e v e lo p in g e g g s a n d fo u n d t h a t
t h e r e was a m ark ed i n c r e a s e o f l i p i d s w i t h i n t h e em bryo d u r in g e a r l y
d ia p a u s e d e v e lo p m e n t.
The l i p i d
c o n t e n t and e s p e c i a l l y t h e t r i ­
g l y c e r i d e f r a c t i o n o f w h o le e g g s d e c r e a s e d c o n s i d e r a b l y d u r in g t h e
p o s t - d i a p a u s e p e r i o d s u g g e s t i n g t h a t t h e s e m a t e r i a l s w e re b e in g
u t i l i z e d f o r e n e rg y o r a s a c a rb o n s o u r c e .
B o e ll (1 9 3 5 ) r e p o r t e d t h a t
73 % o f t h e oxygen consum ed d u r in g t h e d e v e lo p m e n t o f Melanoplus
d i f f e v e n t i a l i s can b e a c c o u n te d f o r on t h e b a s i s o f o x i d a t i o n o f f a t s .
Thus i t a p p e a r s t h a t t h e p a t t e r n o f u t i l i z a t i o n i n A. e l l l o t t l i s
s i m i l a r t o t h a t fo u n d i n M. OiiffeventyLaU s.
-2 Q u ic k e n d e n and R o em h ild (1969) and Q u ic k e n d en (1 9 7 0 ) d e te r m in e d
t h e c a r b o h y d r a te l e v e l s .i n e g g s th r o u g h o u t e m b ry o g e n e s is ..
i n c r e a s e s i n m a n n i to l a n d t r e h a l o s e d u r in g d i a p a u s e .
They n o te d
S in c e g ly c o g e n
l e v e l s d i d n o t d e c l i n e and t h e q u a n t i t y o f f r e e m an n o se.w as i n s u f ­
f i c i e n t t o s e r v e as t h e o n l y . p r e c u r s o r f o r m a n n ito l s y n t h e s i s , i t was
p o s t u l a t e d t h a t t h e h y d r o l y s i s o f p r o t e i n - c a r b o h y d r a t e co m p lex es
c o u ld p r o v i d e p r e c u r s o r s f o r m a n n i to l a n d / o f t r e h a l o s e s y n t h e s i s .
Bunde (1 9 6 5 ) and Bunde an d P e p p e r (19 6 8 ) s t u d i e d t h e f r e e amino
a c i d s p r e s e n t a t v a r i o u s s t a g e s i n t h e d e v e lo p m e n t o f A.1 eV lioitti,
eggs.
They fo u n d t h a t t h e t o t a l f r e e am ino a c i d l e v e l w as much h i g h e r
d u r in g t h e d ia p a u s e p e r i o d th a n d u r in g o t h e r d e v e lo p m e n ta l p e r i o d s .
They s u g g e s t e d t h a t t h e i n c r e a s e d u r in g d ia p a u s e m ig h t b e due t o a •
d e c r e a s e i n t h e u t i l i z a t i o n o f am ino a c i d s f o r p r o t e i n s y n t h e s i s w h ile
t h e h y d r o l y s i s o f y o l k p r o t e i n s c o n ti n u e d .
F l u c t u a t i o n s ,in f r e e am ino a c i d l e v e l s may b e r e f l e c t e d i n t h e p r o t e i n m e ta b o lis m o f t h e e g g .
C hanges i n t h e d i s t r i b u t i o n o f p r o t e i n
and t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s . s h o u ld p r o v id e i n f o r m a t i o n r e l a t i n g
t o g ro w th and p h y s i o l o g i c a l . a c t i v i t y d u r in g e m b r y o g e n e s is .
Such f i n d ­
i n g s w o u ld b e . v a l u a b l e i n t h e i n t e g r a t i o n o f t h e p h y s i o l o g i c a l p i c t u r e
o f t h i s o rg a n is m .
Num erous s t u d i e s on p r o t e i n m e ta b o lis m i n i n s e c t s h a v e b e e n r e ­
v ie w e d r e c e n t l y by G ilm o u r ( 1 9 6 5 ) , A g r e l l ( 1 9 6 4 ), C h e fu rk a (1965) and
—
Chen ( 1 9 6 6 ).
3“
I t i s g e n e r a l l y a c c e p te d t h a t t h e t o t a l n i t r o g e n o f t h e
i n s e c t e g g re m a in s c o n s t a n t t h r o u g h o u t ■e m b r y o g e n e s is .
The d i s t r i ­
b u t i o n o f - n i t r o g e n h a s b e e n f o llo w e d i n t h e egg o f M. d i f f e v e n t i d l i s
by T ro w b rid g e and B o d in e ■( 1 9 4 0 ).
They fo u n d a n i n c r e a s e i n t h e n i t r o ­
gen o f t h e em bryo a n d a c o n c o m ita n t d e c r e a s e i n t h e n i t r o g e n . o f t h e
y o l k , w h i l e s h e l l n i t r o g e n i n c r e a s e d a t t h e b e g in n in g o f em bryog e n e s i s and d e c r e a s e d a t t h e e n d . ■No c h a n g e was fo u n d d u r in g d i a p a u s e .
A g r e l l (1964) s t a t e s
t h a t u r i c a c i d s h o u ld b e t h e e n d p r o d u c t
o f n i t r o g e n m e ta b o lis m i n i n s e c t e g g s , h o w e v e r, f i n d i n g s a r e c o n tr o ­
v e rs ia l.
Shaw (1 9 5 5 ) h a s fo u n d h i g h l e v e l s o f e th a n o la m in e p h o s p h o r ic
a c id in g ra ssh o p p e r e g g s.
gen e l i m i n a t i o n
T h is compound c o u ld b e i m p o r ta n t i n n i t r o ­
(A g r e l l , 1 9 6 4 ) .
B o d in e (1946) h a s r e p o r t e d t h a t t h e
u r i c a c i d c o n t e n t c o u ld b e . e q u i v a l e n t t o no m ore t h a n 6 .6 % o f.;,th e
■
n i t r o g e n o f t h e eg g p r o t e i n o f M. d i f f e r e n t i a l i s .
Ludw ig and R o th ..
s te in
(1 9 5 2 ) i n d i c a t e d t h a t p r o t e i n w as n o t u t i l i z e d a s an e n e rg y
s o u r c e i n P o p i t l i a Qaponioa s i n c e t o t a l n i t r o g e n re m a in e d c o n s t a n t .and
t h e r e was no e v id e n c e f o r t h e a c c u m u la tio n o f w a s te n i t r o g e n .
M e ta b o lic c h a n g e s a r e d i f f i c u l t t o d e m o n s tr a te i n i n s e c t eggs
due t o t h e i r s m a l l . s i z e and t h e l a r g e n um bers n e e d e d f o r b io c h e m ic a l
a n a ly s e s .
An u n d e r s t a n d i n g o f t h e b a s i c . s t r u c t u r a l c h a n g e s and tem ­
p e r a t u r e r e q u i r e m e n ts o f a c r i d i d e g g s d u r in g e m b ry o g e n e s is i s e s s e n ­
t i a l t o d e s ig n a m e a n in g f u l s t u d y .
-4 No s t u d i e s o f t h e A. e H - io tti egg s h e l l h a v e b e e n p e r f o r m e d ,
h o w e v e r, t h e g e n e r a l f e a t u r e s o f a c r i d i d egg s h e l l s a p p e a r t o be t h e
sam e.
H a rtle y
(1 9 6 1 ) p e rfo rm e d l i g h t m ic r o s c o p e s t u d i e s o f t h e s h e l l
o f n e w ly -la id eggs in sev en a c r id id s p e c ie s .
th e n e w ly - la id egg th e c h o rio n .
He c a l l s
th e s h e l l o f
I t i s o f m a t e r n a l o r i g i n and i s d i ­
v i d e d i n t o ; a t h i c k i n n e r l a y e r c o n s i s t i n g o f an i n t e r l o c k i n g , t a n g l e d
s y s te m o f f i n e s t r u t s ; a t h i n b u t m ore d e n s e l a y e r o r a r e a a d j a c e n t
to i t ;
and a t h i n . g r a n u la r o u te r l a y e r .
H e ,a l s o n o te d t h a t t h e com plex
i n n e r l a y e r w a s •much t h i c k e r a t t h e p o s t e r i o r end o f t h e egg and i n
some c a s e s h a d p i t s p a s s i n g i n t o - i t ■fro m t h e o u t s i d e .
Such an a r r a n g e ­
m ent w o u ld a p p e a r t o b e c o n d u c iv e t o w a t e r a b s o r p t i o n and m ig h t be
r e s p o n s i b l e f o r t r a p p i n g c e r t a i n m o le c u le s .
The c h o r io n re m a in s on
t h e e g g th r o u g h o u t e m b ry q g e n e s is a lth o u g h i t may becom e c r a c k e d and
d is c o n tin u o u s in o ld e r e g g s.
T h is may b e . o f l i t t l e
im p o r ta n c e s i n c e
t h e s e r o s a l c u t i c l e s , w h ic h a r e o f e m b ry o n ic o r i g i n , becom e t h e p r i n c i ­
p le la y e r s o f th e s h e l l soon a f t e r la y in g .
S life r
(1 9 3 7 ) and M athee
(1 9 5 1 ) h a v e s t u d i e d t h e c u t i c u l a r l a y e r s i n a c r i d i d e g g s h e l l s and h a v e
fo u n d t h a t t h e r e i s an o u t e r l a y e r ( y e llo w c u t i c l e ) an d an i n n e r ,
t h i c k e r l a y e r ( w h ite c u t i c l e ) .
The g ro w th .and m o rp h o g e n e s is . o f em bryos o f ' A. eV h io tti, h a v e b e e n
d e s c r i b e d i n te rm s o f 27 d i s c r e t e m o r p h o lo g ic a l s t a g e s
1 9 6 6 a ).
(Van Horn 1 9 6 3 ,
An o b l i g a t o r y d ia p a u s e u s u a l l y b e g in s a t s t a g e 1 9 .
F ifty
d ay s o f e x p o s u re t o te m p e r a t u r e s o f 8 ° C o r .l o w e r a r e r e q u i r e d t o b r e a k
-5 th e . d ia p a u s e s t a t e
(R q e m h ild , 1 9 6 5 a ) .
R p em h ild (1967) h a s shown t h a t w hen e g g s a r e h e l d a t 25°C f o r
a b o u t :25 d ay s a f t e r l a y i n g c e r t a i n m em branes i n t h e eg g a llo w t h e
f o r m a tio n o f d i s t i n c t c o m p a r tm e n ts .
The em bryo becom es s e p a r a t e d from
t h e y o l k b y t h e p r o v i s i o n a l d o r s a l c l o s u r e fo rm in g t h e e p i n e u r a l s i n u s .
The s e r o s a t h e n d e ta c h e s fro m t h e c u t i c l e a llo w in g t h e f o r m a tio n o f
t h e h y d r o p y l a r , y o l k .a n d e x t r a - s e r o s a l co m p artm en ts,.
R o em h ild (1 9 6 7 ,
1968) h a s fo u n d t h a t t h e p h y s i c a l ;a n d c h e m ic a l c h a r a c t e r i s t i c s o f
t h e s e co m p artm en ts- d i f f e r and s u g g e s t e d t h a t c o m p a r tm e n ta tio n y i e l d s
c o n d i t i o n s u n f a v o r a b l e f o r f u r t h e r . m o r p h o l o g i c a l d e v e lo p m e n t.
The
m em branes a r e r u p t u r e d d u r in g b l a s t o k i n e s i s w h ic h m ark s t h e e n d .o f
d ia p a u s e .
The c o m p a rtm e n ts a r e o b l i t e r a t e d a t t h i s . tim e a n d m orpho­
g e n e tic a c ti v it y
resum es.-
D u rin g c o m p a r tm e n ta tio n t h e em bryo was i n an e n v iro n m e n t o f pH
7 .4 and h ig h .s o d iu m i o n c o n c e n t r a t i o n .
A f t e r b l a s t o k i n e s i s t h e em bryo
comes i n c o n t a c t w i t h f l u i d s o f pH 6 .6 and low so d iu m c o n c e n t r a t i o n .
R o em h ild (1 9 6 8 ) h a s n o t e d t h a t i n c o r p o r a t i o n o f v a l i n e - C ^ and a c e t a t e C-*-^ i n t o em bryo p r o t e i n i n v i t v o i s . h i g h e r a t lo w e r pH v a lu e s i n th e
ran g e o f 6 .8 - 7 .0 .
A g r e l l (1952) h a s fo u n d t h a t h i s t o l y s i s i s a s s o c i ­
a t e d w i t h h i g h pH v a l u e s w h i l e p e r i o d s . o f h i s t o g e n e s i s o c c u r when pH
v a lu e s a r e lo w .
The low so d iu m i o n c o n c e n t r a t i o n i n V iu c a f t e r b l a s t o ­
k i n e s i s c o u ld a l s o e f f e c t a n - i n c r e a s e i n t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s .
S te v e n s o n and W y att (1 9 6 2 ) and P r i c e
(1 9 6 7 ) h a v e fo u n d t h a t sodium
-6 le v e ls a re c r i t i c a l to th e r a t e o f p r o te in s y n th e s i s .
so d iu m i s
A p p a r e n tly
i n h i b i t o r y t o t h e a c t i v a t i o n s y s te m .a s i t i s i n mammals
( S a c h s , 1 9 5 7 ).
S in c e p r o t e i n s a r e i n t i m a t e l y i n v o lv e d i n g ro w th a n d f u n c t i o n ,
t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s s h o u ld r e f l e c t . t h e g ro w th r a t e and
o t h e r p h y s i o l o g i c a l a c t i v i t i e s - d u r i n g e m b r y o g e n e s is .
M o s t .s t u d i e s o f
p r o t e i n s y n t h e s i s i n i n s e c t s h a v e i n v o lv e d t h e in w itv o i n c o r p o r a t i o n
o f l a b e l e d am ino a c i d s i n t o t i s s u e s o r t i s s u e m in c e s o r in v iv o i n ­
c o r p o r a t i o n a f t e r t h e . i n j e c t i o n o f l a b e l e d am ino a c i d s .
One o f t h e
r e q u i r e m e n ts f o r p r o t e i n s y n t h e s i s i s t h e f u n c t i o n i n g o f o x i d a t i v e
m e ta b o lis m
(C h e fu rk a , 1 9 6 5 ).
The d i a p a u s e p e r i o d a p p e a r s t o b e u n ­
f a v o r a b l e f o r p r o t e i n .s y n t h e s i s i n some i n s e c t s b e c a u s e t h e O2 con­
s u m p tio n i s lo w .
' The d i a p a u s e p e r i o d i n i n s e c t s h a s b e e n c h a r a c t e r i z e d a s one o f
lo w e re d m e ta b o lis m
( K e i s t e r and B uck, 1 9 6 4 ) .
D e creases in th e r e s p i r ­
a t o r y r a t e o f M. d i f f e r e n t i a t i s d u r in g d ia p a u s e h a v e b e e n n o te d by
B o d in e ( 1 9 2 9 ) , a n d B u r k h o l d e r . (1 9 3 4 ) and B o e l l ( 1 9 3 5 ).
i n g s have, b e e n r e p o r t e d f o r Bombyx by A s h b e l ( 1 9 3 0 ).
S im ila r f in d ­
Q u ite d i f f e r e n t
o b s e r v a t i o n s h a v e b e e n o b t a i n e d f o r d i a p d u s i n g A. e V L io tti e g g s .
The
r e s p i r a t o r y r a t e , a s m e a s u re d by Og c o n s u m p tio n , i s m a i n ta i n e d a t t h e
r e l a t i v e l y h ig h l a t e p r e - d i a p a u s e l e v e l th r o u g h o u t d i a p a u s e ■(R o e m h ild ,
1965b; L a in e , 1 9 6 6 ).
H arvey (1 9 6 2 ) h a s e n u m e ra te d t h r e e p r o c e s s e s
r e s p o n s i b l e . f o r Og c o n s u m p tio n ; m o r p h o g e n e s is ; m a in te n a n c e and f u n c t i o n .
—7—
I n s p e c i e s w i t h low
c o n s u m p tio n d u r i n g ■d i a p a u s e , o n e :w o u ld e x p e c t
o n ly m a in te n a n c e s i n c e t h i s r e q u i r e s l e s s Qg th a n b i o s y n t h e s i s
1 9 5 5 ).
(L ees,
Bunde (1 9 6 5 ) fo u n d t h a t acetate-C -* -^ was i n c o r p o r a t e d i n t o 8
am ino a c i d s d u r in g d i a p a u s e i n A. e V H o ttii t h u s , a t . l e a s t some b i o ­
s y n th e s is o c c u rs .
S in c e t h e r e s p i r a t o r y . r a t e i s m a i n ta i n e d a t t h e
r e l a t i v e l y h ig h p r e - d ia p a u s e , l e v e l d u r in g d ia p a u s e i n A* e tX io tti'
(R o e m h ild , 1 9 6 5 b ; L a i n e , 1 9 6 6 ) , t h e b i o c h e m ic a l t r a n s f o r m a t i o n s d u r in g
t h i s p e r i o d may b e c o n s i d e r a b l e
(Van .Horn,; 1963; S v o b o d a , 1 9 6 4 ;
Q u ic k e n d e n , 1 9 6 9 ; U rb a n , 1 9 7 0 ).
C hanges i n ; p r o t e i n s y n t h e t i c a c t i v i t y m ig h t b e i n d i c a t e d b y . t h e '
s e p a r a t i o n and p a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o t e i n s i n t h e e g g .
C o m p a riso n s o f hem oly m p h ; an d y o l k p r o t e i n s w e re made e l e c t r o p h o r e t i c a l l y
i n P ertiplan eta amerieana- b y N e i l s e h an d M i l l s
maderae b y S h e e r e r ( 1 9 6 9 ).
(1968) and i n Leuoophaea
Dtike (1 9 6 6 ) u s e d t h i s m eth o d t o s tu d y t h e
hemo lym ph p r o t e i n s i n Lqousta m ig r a to r ia m ig r a to rio id .e s .
T h e se w o rk e rs
h a v e i n d i c a t e d t h a t some hemolymph p r o t e i n s a r e d e p o s i t e d d i r e c t l y i n t o
t h e y o l k d u r in g v i t e l l o g e n e s i s .
S in c e t h e y o lk i s t h e s o u r c e o f e n e rg y
and m e t a b o l i c m a t e r i a l s f o r e m b r y o g e n e s is ; i t c o u ld b e i n f o r m a t i v e t o
s e p a r a t e an d com pare t h e e m b r y o n i c .p r o t e i n s and y o l k p r o t e i n s th r o u g h ­
out t h is p e rio d .
P a r t i a l c h a r a c t e r i z a t i o n o f t h e p r o t e i n b a n d s can b e a c c o m p lis h e d
u s in g h i s t o c h e m ic a l t e c h n i q u e s .
W ang. and P a t t o n
(1 9 6 8 ) fo u n d p o s i t i v e
r e a c t i o n s f o r f i v e t y p e s o f c o n ju g a te d p r o t e i n i n t h e l a r v a l hemolymph
-
8“
o f G d tle v ia m eV lonella3 A eheta dom esttaus . and Tenebrio moI i to r .
D ejm al and B ro o k e s
(1 9 6 8 ) h a v e i d e n t i f i e d t h e m a jo r com ponent .o f ■
Leucophaea maderae y o l k a s a l i p o p r o t e i n b y a h i s t o c h e m i c a l te c h n iq u e
and V in s o n an d L ew is
(1 9 6 9 ) h a v e d e t e c t e d 4 g l y c o p r o t e i n s a n d 2 l i p o ­
p r o t e i n s i n s u b - a d u l t s and a d u l t s o f t h r e e s p e c i e s o f H e li,o th is.
S in c e ■
c a r b o h y d r a te s and l i p i d s a r e p r o b a b ly t h e m o st i m p o r ta n t e n e rg y s o u r c e s
d u r in g i n s e c t e m b ry o g e n e s is
( R o t h s t e i n , 1 9 5 2 ; L u d w ig .a n d R a m o z z o tto ,
1 9 6 5 ) , t h e d e t e c t i o n o f t h e s e m a t e r i a l s . c o n j u g a t e d w i t h p r d t e i n was
u n d e rta k e n .
I n t h e p r e s e n t s t u d y , w h o le e g g s , e m b ry o s, y o l k a n d s h e l l s w e re
a n a ly z e d s e p a r a t e l y to d e te r m in e p r o t e i n c o n t e n t .a n d t h e r a t e o f p r o ­
t e i n . s y n t h e s i s th r o u g h o u t e m b r y o g e n e s is .
E m bryonic p r o t e i n and y o lk
p r o t e i n w e re s e p a r a t e d on p o ly a c r y la m id e g e l s A d d i t i o n a l g e ls w ere
ru n t o t e s t f o r p r o t e i n - c a r b o h y d r a t e and l i p o p r o t e i n c o m p le x e s .
MATERIALS AND METHODS
E x p e r im e n ta l D e s ig n
Egg s a m p le s .of k n o w n -ag e r e p r e s e n t i n g v a r i o u s s t a g e s i n em bryog e n e s i s .w ere c o l l e c t e d i n 1 9 6 7 . . T h e se e g g s w e re a llo w e d t o a b s o rb
v a l i n e - C ^ a s a t r a c e r t o d e te r m in e t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s .
R a d i o a c t iv e v a l i n e u p t a k e , p r o t e i n c o n t e n t and sa m p le d ry w e ig h ts w e re
d e te r m in e d . . The e g g s w e re d i v id e d i n t o tw o g r o u p s , h e r e a f t e r c a l l e d
S e r i e s I and. S e r i e s I I .
The f i r s t s e r i e s was com posed o f w h o le egg
s a m p le s w h i l e t h e s e c o n d s e r i e s was made up o f s e p a r a t e e g g f r a c t i o n s ;
th a t i s ,
t h e e m b ry o , y o l k a n d . s h e l l .
A w h o le ,e g g s a m p le h e l d a t 25°C
f o r 140 d a y s i n t h e d i a p a u s e s t a t e t o d e te r m in e t h e e f f e c t o f no c o ld
e x p o s u re i s m ark ed (* ) b e lo w .
Sam ple a g e , c o n d i t i o n a n d t e m p e r a tu r e
re g im e a r e r e p r e s e n t e d s c h e m a t i c a l l y a s :
Pr e - d ia p a u s e .
D ia p a u s e
P o s t-d ia p a u s e
S ta te
S ta te
S ta te
________________________ Eggs a t 25°C________ Eggs a t 8°C_______ Eggs a t 25°C
S e rie s I
Days o f d e v e lo p m e n t
i n s t a t e when sa m p le
was t a k e n :
8 15 26 36 42 52
26 50 76 140 140* I 3 5 10 15
M o rp h o lo g ic a l .s t a g e
(Van H o rn , 1 9 6 6 ) :
I
S e rie s I I
Days o f d e v e lo p ­
m ent
8 15
M o r p h o lo g ic a l
s t a g e : _________________ I
5 10 13 18 19
5
20 28 35 41
7 10 13 18
19 19 19
19
19
26 45 51 H O
19 19 19
19
2 0 -2 4 25 26
13
■
5 10 15
2 0 -2 4 25 26
—10—
F u r t h e r i n f o r m a t i o n a b o u t t h e eg g p r o t e i n s was o b t a i n e d th ro u g h
an e l e c t r o p h o r e t i c s t u d y o f - th e p r o t e i n s i n t h e em bryo f r a c t i o n and
y o lk f r a c t i o n o f S e r ie s I I :
F o r t h i s s t u d y two a d d i t i o n a l egg f r a c t i o n
s a m p l e s , one i n d ia p a u s e and t h e o t h e r i n t h e p o s t - d i a p a u s e s t a t e , w e re
p r e p a r e d fro m e g g s w h ic h h a d .n o t b e e n e x p o s e d t o , v aline-C -*-^.
B i o l o g i c a l S am ples
The r e p r o d u c t i v e a d u l t s o f A.-
w e re r e a r e d fro m a popu­
l a t i o n n e a r D e c k e r, M o n ta n a , irj t h e summer o f 1 9 6 7 . . The g r a s s h o p p e r s
w e re r e a r e d u n d e r g r e e n h o u s e ,c o n d i t i o n s i n c y l i n d r i c a l I n c i t e c a g e s i
2 0 .5 cm i n d i a m e te r an d 2 7 .5 cm h i g h ,, s e t . o n d i r t - f i l l e d p a n s a c c o r d in g
t o . t h e p r o c e d u r e s , d e s c r i b e d by A n d e rso n an d H a s tin g s
(1 9 6 6 ).
They w e re
m a i n ta i n e d i n 20 c a g e s , e a c h w i t h a d e n s i t y o f t h r e e p a i r s p e r c a g e ,
and w e re f e d f r e s h w e s t e r n w h e a t g r a s s , Agropyron SmithLi3 one o f t h e
p r e f e r r e d f o o d - p l a n t s o f A. e V l i o t t i
( P f a d t , 1 9 4 9 ; A n d e rs o n , 1 9 6 4 ).
Egg p o d s w e re , c o l l e c t e d on a l t e r n a t e d a y s by s i f t i n g t h e d i r t , i n
t h e p a n s .,
The p o d s w e re th e n s t o r e d i n p l a s t e r o f P a r i s b lo c k s a t
25°C f o r d e v e lo p m e n t (Van H o rn , 1 9 6 6 b ) .
A f t e r a p e r i o d o f 52. d a y s ,
egg po d s s e l e c t e d f o r d i a p a u s e . o r p o s t - d i a p a u s e s a m p le s w e re p l a c e d . i n
an ,.S0G r e f r i g e r a t o r .
A f t e r a b o u t 4 m o n th s o f c o ld e x p o s u r e egg p o d s '
t b . b e u s e d f o r p o s t - d i a p a u s e s a m p le s w e re r e t u r n e d t o 2 5°C .
At t h e
a p p r o p r i a t e ,tim e - e g g s .f o r e a c h o f t h e p r e - d i a p a u s e ,. d i a p a u s e and p o s t r
d i a p a u s e s a m p le s w e re rem oved and t r e a t e d u s in g m eth o d s d e s c r i b e d l a t e r
To p r e v e n t d e s i c c a t i o n , e g g p o d s m a i n ta i n e d a t 25°C w e re w a te r e d l i g h t l y
-1 1 tw ic e a week, and t h o s e k e p t a t 8 ° C o n ly o n c e a w e e k . .
The spheine by w h ic h e g g s w e re - p ro c e s s e d i s sh o w n , on t h e f o llo w in g
page.
W hen■t h e e g g s h a d r e a c h e d t h e d e s i r e d ag e th e y w e re rem oved fro m
t h e p o d s , w a sh e d j a i r - d r i e d and w e ig h e d .
I s o t o p e i n t r o d u c t i o n was ac-r
c o m p lis h e d b y a d e s i c c a t i o n - a b s o r p t i o n t e c h n i q u e
Q u ie k e n d e n , .1 9 6 9 ).
(B u n d e , 1 9 6 5 ;
The e g g s w e re d e s i c c a t e d f o r a p e r i o d o f f o u r d ay s
o v e r .a n h y d r o u s ■c a l c i u m - s u l f a t e .
E a r ly p r e - d i a p a u s e e g g s w e re d e s i c ­
c a t e d f o r s h o r t e r p e r i o d s due t o r a p i d w e ig h t l o s s ,
W eig h t l o s s i n
a l l s a m p le s was l i m i t e d t o l e s s t h a n o n e - t e n t h o f t h e s t a r t i n g w e i g h t .
The e g g s w e re t h e n im m ersed i n a r a d i o a c t i v e s o l u t i o n c o n s i s t i n g o f
25 y ic o f u n if o r m ly l a b e l e d L - v a lin e ^ C - ^
p e r m l .o f d i s t i l l e d - v a t e r .
( s p e c i f i c a c t i v i t y = 190 mc/mM)
T h is am ino a c i d was c h o s e n b e c a u s e Bunde .
(19 6 5 ) fo u n d t h a t t h e c o n c e n t r a t i o n o f f r e e v a l i n e was q u i t e c o n s t a n t
and t h a t i t was n o t s y n t h e s i z e d fro m a c e t a t e - C " ^ d u r in g t h e em bryog e n e s i s o f A. e l l i o t t i . . D u rin g a b s o r p t i o n t h e l i d s o f t h e i n c u b a t i o n
v i a l s w e re l i f t e d p e r i o d i c a l l y t o p r e v e n t oxygen - d e p l e t i o n . • A f t e r
a b s o r p t i o n f o r - f o u r - d a y s . t h e e g g s w e re w ash ed th o ro u g h ly - i n d i s t i l l e d
w a t e r , a i r - d r i e d and w e ig h e d .
The- a g e i n . d a y s r e p o r t e d f o r a l l s a m p le s
i n c l u d e s t h e 4 d a y s . o f d e s i c c a t i o n f o llo w e d by 4 d a y s . o f a b s o r p t i o n e x ­
c e p t f o r e a r l y p r e - d i a p a u s e s a m p le s i n w h ic h d e s i c c a t i o n tim e s w ere
s h o rte r.
The a g e i n d a y s o f e a c h s a m p le i s c o i n c i d e n t w i t h t h e end
o f th e a b s o rp tio n p e rio d .
—12—
SERIES I
SERIES II
Whole Eggs
Whole Eggs
I
I
Desiccation
V
Desiccation
Absorption o f Val. C
Absorption of Val. C1^
I
I
D is section
Homogenization
^
Shell
V
I'
Frozen
Frozen
V
Embryo
4/
Frozen
^
Yolk
V
Frozen
From t h i s p o i n t o n , w h o le e g g s and eg g f r a c t i o n s a m p le s
w e re s e p a r a t e l y s u b j e c t e d t o t h e f o ll o w i n g s t e p s :
Ly oph ilization
I
I
Homogenization
3 Aliquots
Z
LSC (BPE)
Protein Assay (BPE)
V
Protein Extraction
LSC
F ig u r e I .
M a jo r s t e p s i n t h e p r o c e d u r e f o r d e te r m in in g t h e p r o t e i n
c o n te n t and v a l i n e - C ^ a c t i v i t y o f e x t r a c t e d p r o t e i n i n A. e l l i o t t i
w h o le e g g s and egg f r a c t i o n s .
A b b r e v i a t i o n s : V a l. c l 4 - u n i f o r m l y
l a b e l e d L - v a l i n e - C l ^ , L S C - I iq u id s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g , B P E -b e fo re
p ro te in e x tr a c tio n .
-1 3 I n s e r i e s I , w h o le egg s a m p le s u s e d v a r i e d fro m 13 t o 34 e g g s .
Em bryos i n t h e d i a p a u s e a n d p o s t - d i a p a u s e p e r i o d s w e re c a t e g o r i z e d
u s in g s t a g i n g c r i t e r i a f o r t h i s s p e c i e s e s t a b l i s h e d by Van Horn ( 1 9 6 6 a ) .
A f t e r t h e a b s o r p t i o n p e r i o d and s t a g i n g w e re c o m p le te d , t h e e g g s w e re
h o m o g en iz ed f o r t h r e e m in u te s i n d i s t i l l e d w a t e r a t 4°C an d t h e n ,
f r o z e n a t -2 0 ° C .
I n S e r i e s I I , s a m p le s c o n ta i n e d 41 t o 94 e g g s .
When t h e ab ­
s o r p t i o n p e r i o d was c o m p le te d , t h e e g g s w e re p l a c e d i n d i s t i l l e d w a t e r
fo r d is s e c tin g .
Em bryos .and egg s h e l l s w e re rem oved s e p a r a t e l y fro m
t h e d i s s e c t i n g medium w i t h a s l i t t l e w a t e r a s p o s s i b l e .
They w e r e ,
r i n s e d b r i e f l y i n d i s t i l l e d w a t e r an d p l a c e d i n s e p a r a t e c o n t a i n e r s .
The r e m a in in g m a t e r i a l
( d i s s e c t i n g m edium , y o l k and r i n s e w a t e r )
fo rm e d t h e y o l k f r a c t i o n .
I n t h e f i r s t t h r e e p r e - d i a p a u s e sa m p le s
t h e em bryos w e re l e f t i n t h e y o l k f r a c t i o n b e c a u s e o f t h e i r s m a ll s i z e ;
t h e y o l k a n d s h e l l s o f o n ly 20 e g g s w e re s e p a r a t e d i n t h e s e s a m p le s .
I n l a t e p o s t - d i a p a u s e e g g s t h e y o l k m ass h a d b e e n e n g u lf e d by t h e
em hryos b u t was rem oved t o m a i n ta i n s e p a r a t e f r a c t i o n s .'
S i x t e e n w h o le egg s a m p le s f o r S e r i e s I and 4 5 .eg g f r a c t i o n sam ples,
f o r S e r i e s I I w e re p r e p a r e d .
lo n g .a s 2 y e a r s .
Some s a m p le s w e re s t o r e d a t - 2 0 ° C f o r a s
F o r e a s i e r h a n d li n g and t o o b t a i n t h e d r y w e i g h t s ,
a l l sa m p le s, w e re l y o p h i l i z e d p r i o r t o a n a l y s i s .
V ery l i t t l e
d iffe r­
e n c e was n o t e d i n t h e e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f p r o t e i n fro m f r e s h .
and s t o r e d m a t e r i a l .
—1 4 Two a d d i t i o n a l p o s t - d i a p a u s e w h o le egg s a m p le s w e re a n a ly z e d to
c h e c k t h e p o s s i b i l i t y t h a t m ic r o o rg a n is m s m ig h t c o n ta m in a te t h e i n c u b a ­
t i o n medium and a f f e c t t h e r e s u l t s .
Two mgs e a c h o f P e n i c i l l i n G, M yco-
s t a t i n an d s t r e p t o m y c i n s u l f a t e w e re a d d e d t o t h e i n c u b a t i o n medium o f
one s a m p le .
T h e se b a c t e r i o s t a t i c an d f u n g i c i d a l a g e n ts e l i m i n a t e d t h e
p o s s i b i l i t y o f p r o t e i n s y n t h e s i s by m ic r o o rg a n is m s i n t h e m edium .
In
t h e o t h e r s a m p le , 2 mgs o f c h lo r a m p h e n ic o l, a b r o a d s p e c tr u m b a c t e r i c i d e
and p r o t e i n s y n t h e s i s i n h i b i t o r , w e re ad d e d t o t h e m edium .
In c o rp o ra tio n
o f valine-C"*"^ i n t o p r o t e i n by b o th s a m p le s i n d i c a t e d t h a t m ic ro o rg a n is m s
w e re n o t r e s p o n s i b l e f o r t h i s p r o t e i n s y n t h e s i s and t h a t c h lo r a m p h e n ic o l
i n t h e i n c u b a t i o n m edium d id n o t s t o p p r o t e i n s y n t h e s i s .
The a n t i b i o t ­
i c s p r o b a b ly d i d n o t p e n e t r a t e t h e s h e l l s o f t h e s e e g g s ..
B i u r e t A ssay
C o lo rim e tric q u a n ti ta t iv e a n a ly s is o f th e p r o te in c o n c e n tra tio n o f
e a c h l y o p h i l i z e d sa m p le w as m ade.
One l a r g e a l i q u o t w as d i v id e d i n t o
t h r e e p a r t s f o r t h e d e t e r m i n a t i o n o f p r o t e i n c o n c e n t r a t i o n , u p ta k e o f
v a l i n e - C - ^ and i n c o r p o r a t i o n o f v a l i n e - C " ^ i n t o p r o t e i n .
d a r d c u rv e was d e v is e d u s i n g b o v in e se ru m a lb u m in .
A b iu re t s ta n ­
L in e a r ity in a c c o r­
d a n c e w i t h B e e r 's Law w as e s t a b l i s h e d i n t h e r a n g e o f 0 .1 t o 7 .0 mgs o f
p r o t e i n b y r e a d i n g t h e a b s o r b a n c e a t 540 mp on a B au sch and Lomb S p e c tr o n i c 20 C o l o r im e t e r .
The b i u r e t r e a g e n t u s e d was m o d if ie d from t h a t
d e s c r i b e d by G o r n a ll a t a l .
(19 4 9 ) b y t h e a d d i t i o n o f e t h y l e t h e r a s
u s e d b y K a rn a v a r an d N a i r ( 1 9 6 9 ).
i n t h e sam e m an n er a s t h e s a m p le s .
The p r o t e i n s t a n d a r d s w e re t r e a t e d
-1 5 A l a t g e a l i q u o t ■o f l y o p h i l i z e d m a t e r i a l fro m e a c h s a m p le was
h o m o g en iz ed i n d i s t i l l e d w a t e r i n a Ten B ro e c k g ro u n d g l a s s t i s s u e
g rin d e r.
F i n a l v o lu m es o f h o m o g e n a te s w e re fro m 5 t o 10 m l.
a s s a y a l i q u o t s o f I t o 3 m l w e re t a k e n fro m t h e h o m o g e n a te s .
B iu re t
W henever
t h e am ount o f sa m p le m a t e r i a l was s u f f i c i e n t , 3 m l o f t h e h o m o g en ate
w e re ta k e n .,a n d d i v i d e d i n t o 3 a l i q u o t s f o r t r i p l i c a t e
a n a ly s is .
m ix t u r e o f h o m o g e n a te - b iu r e t r e a g e n t - e t h y l e t h e r was u s e d .
A 1 :4 :1 .
A f t e r a d d in g
e t h e r f o r l i p i d e x t r a c t i o n t h e m ix t u r e was s h a k e n f o r 15 s e c o n d s a n d ■
c e n t r i f u g e d f o r 10 m in u te s a t 4 ,0 0 0 rpm .
t h e b i u r e t medium becom es c lo u d y .
W ith o u t t h e e t h e r e x t r a c t i o n
W ith t h e l i p i d s i n t h e e t h e r l a y e r ,
t h e a q u e o u s l a y e r was t r a n s f e r r e d t o a c u v e t t e f o r a c o l o r i m e t e r r e a d i n g
30 m in u te s a f t e r t h e i n i t i a l m ix in g .
P r o te in E x tra c tio n
P r o t e i n was e x t r a c t e d from t h e r e m a in in g h o m o g en a te by a p r o c e d u r e
s i m i l a r t o t h a t o f W annem acher et_ a l .
( 1 9 6 5 ).
An e q u a l volum e o f c o ld
20 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d was a d d e d t o t h e h o m o g e n a te .
The p r e c i p i t a t e
fo rm ed w as s e p a r a t e d fro m t h e s u p e r n a t a n t f l u i d by c e n t r i f u g a t i o n i n an
I n t e r n a t i o n a l HN c e n t r i f u g e a t 4 ,0 0 0 rpm a t 4°C .
Two m ore e x t r a c t i o n s
w i t h 8 m l o f c o ld 10 % t r i c h l o r o a c e t i c a c i d f o llo w e d .
To rem ove r e s i ­
d u a l a c i d , a s w e l l a s some o f t h e l i p i d , t h e p r e c i p i t a t e was e x t r a c t e d
w i t h 8 m l o f a 95 % e t h a n o l s o l u t i o n s a t u r a t e d w i t h so d iu m a c e t a t e
(W annem acher, 1965 and Lowry eh a l . , 1 9 5 1 ) .
A d d i t i o n a l l i p i d ex ­
t r a c t i o n s w e re p e rf o r m e d w i t h 8 m l o f 3 :1 e t h a n o l - e t h y l e t h e r and 8 m l
—16—
o f a n h y d ro u s e t h y l e t h e r .
c o n v e c t io n h o o d .
E x c e s s e t h e r was rem oved by d r y in g i n a
The p r e c i p i t a t e w as t h e n p l a c e d o v e r a n h y d ro u s
c a lc iu m s u l f a t e i n a d e s i c c a t o r f o r 24 t o 48 h o u r s and w e ig h e d .
L i q u id S c i n t i l l a t i o n C o u n tin g
R a d i o a c t i v i t y i n t h e s a m p le s was m o n ito r e d w i t h a m odel 6804
N u c le a r C h ic a g o l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t e r .
B la n k s w e re c o u n te d t o
d e te r m in e b a c k g ro u n d a c t i v i t y .
The d r y p r o t e i n p r e c i p i t a t e s w e re v e r y i n s o l u b l e .
C o n s e q u e n tly ,
th e y w e re g ro u n d t o a f i n e c o n s i s t e n c y i n a Ten B ro e c k gound g l a s s
t is s u e g r in d e r w ith e th y l e th e r as th e s o lv e n t.
The r e s u l t a n t s l u r r y
was t r a n s f e r r e d t o a s c i n t i l l a t i o n v i a l c o n t a i n i n g a C a b - O - S il g e l
s c i n t i l l a t i o n m edium .
T h is medium c o n ta i n e d 3 4 .3 5 g o f C a b - O - S il,
4 g o f PPO a n d 0 .2 5 0 g o f P0P0P p e r l i t e r o f t o l u e n e
1959 and J a c k s o n , p e r s o n a l c o m m u n ic a tio n ).
( O tt e t a l . ,
The e t h e r was e v a p o r a te d
i n a c o n v e c t io n h o o d a n d t h e t h i x o t r o p i c g e l medium was s h a k e n to
e v e n ly s u s p e n d t h e p r o t e i n f o r c o u n ti n g .
tim e s o f I t o 10 m in u t e s .
Sam ples w e re c o u n te d f o r
An e r r o r o f l e s s th a n f i v e p e r c e n t was
o b t a i n e d f o r a l l s a m p le s a c c o r d in g t o a s t a n d a r d c h a r t com posed by
A r o n o f f (1 9 5 6 ) d e p i c t i n g c o u n tin g tim e i n r e l a t i o n t o p e r c e n ta g e e r r o r .
A C a b - O - S il q u e n c h in g c u rv e was p r e p a r e d a f t e r Wang an d W i l l i s
T h is a llo w e d t h e c a l c u l a t i o n o f t h e s p e c i f i c a c t i v i t y
p e r m in u te p e r mg) o f t h e valin e-C ^ ^ l a b e l e d p r o t e i n .
( 1 9 6 5 ).
(d is in te g r a tio n s
—17—
S in c e a l l s a m p le s d i d n o t a b s o r b t h e same am ount o f t r a c e r p e r
e g g , i t was n e c e s s a r y t o m e a su re t h e u p ta k e o f v a l i n e - C - ^ .
For th e
f i r s t m e a s u re m e n t, a 10 y a l a l i q u o t o f t h e i n c u b a t i o n medium i n w h ich
w h o le e g g s w e re im m ersed f o r 4 d a y s , was ta k e n b e f o r e and a f t e r a b ­
s o r p t i o n an d c o u n te d i n t h e l i q u i d s c i n t i l l a t i o n
c o u n te r.
The d i f f e r ­
e n c e i n c o u n ts r e p r e s e n t e d t h e am ount a b s o r b e d by w h o le e g g s .
In th e
s e c o n d s e t o f m e a s u r e m e n ts , t h e u p ta k e o f v a l i n e - C - ^ was d e te r m in e d
f o r t h e d i f f e r e n t egg f r a c t i o n s a s w e l l a s t h e w h o le eg g s a m p le s .
A l i q u o t s o f t h e c ru d e l y o p h i l i z e d m a t e r i a l w e re t a k e n fro m e a c h sa m p le
and h o m o g e n iz e d i n 0 .5 ml o f d i s t i l l e d w a t e r .
The h o m o g e n a te s w e re
c o u n te d i n a p -d io x a p /e s c i n t i l l a t i o n medium c o n t a i n i n g 6 g o f PPO,
0 .5 6 8 g o f POPOP and 120 g o f n a p h th a l e n e p e r l i t e r o f p - d io x a n e
(B ush and H a n se n , 1 9 6 5 ) .
A n o th e r q u e n c h in g c u rv e w as p r e p a r e d f o r
t h i s s c i n t i l l a t i o n m edium .
The s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e e x t r a c t e d
p r o t e i n t h e n was d i v i d e d by t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e u n e x t r a c t e d
m a te r ia l to o b ta in .p e rc e n ta g e in c o r p o r a tio n .
T h is c a l c u l a t i o n a llo w s
s a m p le s t o b e com pared e v e n th o u g h t h e y a b s o rb e d d i f f e r e n t l e v e l s o f
v a lin e -C ^ .
D is c E l e c t r o p h o r e s i s
P r o t e i n fro m t h e s e p a r a t e em bryo f r a c t i o n s and y o l k f r a c t i o n s was
s u b j e c t e d t o d i s c e l e c t r o p h o r e s i s on p o ly a c r y la m id e g e l s u s in g a m eth o d
m o d if ie d fro m D a v is
fro m i t s
( 1 9 6 4 ).
The name o f t h i s t e c h n i q u e was d e r iv e d
d e p e n d e n c e on d i s c o n t i n u i t i e s i n t h e e l e c t r o p h o r e t i c m a t r ix
—18—
a n d , c o i n c i d e n t a l l y , fro m t h e d i s c o i d s h a p e o f t h e b a n d s o f s e p a r a t e d
io n s
( O m s te in , 1 9 6 4 ).
The p o ly a c r y la m id e g e l colum ns w e re form ed i n
c y l i n d r i c a l g l a s s tu b e s 65 mm lo n g w i t h an i n n e r d i a m e te r o f 5 .5 mm.
The g e l was com posed o f t h r e e l a y e r s ;
I ) u p p e rm o s t:
a la r g e p o re
( 3 .7 5 % a c r y la m id e ) sa m p le g e l 7 mm i n l e n g t h c o n t a i n i n g t h e p r o t e i n
i o n s ; 2) m id d le :
a l a r g e p o r e ( 3 .7 5 % a c r y la m id e ) s p a c e r g e l 7 mm i n
l e n g t h ; and 3) b o tto m :
45 mm i n l e n g t h .
a s m a ll p o re
(7 % a c r y la m id e ) s e p a r a t i o n g e l
The s e p a r a t i o n g e l was c h e m ic a lly p o ly m e r iz e d w i t h ;
ammonium p e r s u l f a t e a s t h e c a t a l y s t a n d t h e l a r g e p o r e g e l s w ere
p h o to p o ly m e r iz e d .
The l a r g e p o r e s p a c e r g e l was e l i m i n a t e d i n m ost
g e l s s i n c e i t o f f e r e d no im p ro v em en t i n t h e r e s o l u t i o n o f p r o t e i n
ban d s. An e i g h t - p o s i t i o n p l e x i g l a s s e l e c t r o p h o r e s i s c e l l
( T h u r s to n ,
1966) was b u i l t by t h e I n s t r u m e n t S e r v i c e Shop a t M ontana S t a t e
U n iv e rs ity .
The c e l l c o n s i s t e d o f s e p a r a t e u p p e r a n d lo w e r b u f f e r
r e s e r v o i r s , e a c h c o n t a i n i n g a p l a t in u m e l e c t r o d e .
p la c e d v e r t i c a l l y
The g e l s w ere
(sa m p le g e l u p ) i n d o u b le O - r in g s e q u i d i s t a n t fro m
t h e p l a t in u m e l e c t r o d e . o f t h e u p p e r r e s e r v o i r .
W h e n .th e b u f f e r ( T r i s -
g I y c i n e , pH 8 .3 ) was .added t h e u p p e r e n d o f t h e g e l was i n c o n t a c t ,
w i t h t h e b u f f e r i n t h e u p p e r r e s e r v o i r an d t h e lo w e r e n d o f t h e g e l
was i n c o n t a c t w i t h t h e b u f f e r i n t h e lo w e r r e s e r v o i r .
a p p l i e d a t 3 -4 m i l l i am p eres p e r tu b e a t 2 5 0 .t o 350 V.
C u r r e n t was
The p o l a r i t y
was s e t s o t h a t t h e p o s i t i v e p o le was t h e e l e c t r o d e i n t h e b o tto m
-1 9 re s e rv o ir.
T h e r e f o r e , a l l p r o t e i n i o n s w h ic h w e re n e g a t i v e l y c h a rg e d
a t pH 8 .3 m i g r a te d downward i n t h e d i r e c t i o n o f t h e s e p a r a t i o n g e l .
F iv e d ro p s o f 0 .0 0 1 % a q u e o u s B rom phenol B lu e w e re a d d e d t o t h e u p p e r
r e s e r v o i r a s a t r a c k i n g dye a t t h e s t a r t o f e l e c t r o p h o r e s i s .
A fte r
a b o u t 75 m in u te s o f e l e c t r o p h o r e s i s t h e t r a c k i n g dye b a n d h a d m ig r a te d
t o a p o i n t I cm fro m t h e lo w e r e n d o f t h e s e p a r a t i o n g e l an d e l e c t r o ­
p h o r e s i s was s to p p e d .
s ta in in g .
The g e l s w e re t h e n rem oved fro m t h e tu b e s f o r
A s e p a ra te c e l l ,
t h a t accom m odated l a r g e r t u b e s w h ich w e re
c o n s t r i c t e d a t t h e b o tto m , was u s e d f o r d e s t a i n i n g .
The p r o t e i n ,
l i p o p r o t e i n an d p o l y s a c c a r i d e - c o n t a i n i n g p r o t e i n p a t t e r n s o f em bryos
and y o l k i n t h e p r e - d i a p a u s e , d ia p a u s e and p o s t- r d ia p a u s e p e r i o d s o f
d e v e lo p m e n t w e re s t u d i e d .
I n d i v i d u a l p a t t e r n s w i t h i n any one p e r i o d
d i s p l a y e d o n ly m in o r d i f f e r e n c e s and w e re n o t s t u d i e d .
I t s h o u ld b e
n o t e d t h a t s e v e r a l em bryos o r y o l k s fro m e g g s i n d i f f e r e n t s t a g e s o f
d e v e lo p m e n t w e re p o o l e d .
S e v e r a l g e l s fro m a t l e a s t tw o s e p a r a t e
e l e c t r o p h o r e t i c r u n s w e re s t u d i e d t o d e te r m in e p a t t e r n s f o r e a c h o f
t h e t h r e e m a jo r d e v e lo p m e n ta l p e r i o d s .
F o r e a c h g e l 3 . t o 6 mg o f l y o p h i l i z e d em bryo o r y o l k f r a c t i o n s
w e re p r o c e s s e d .
The m a t e r i a l was h o m o g e n iz e d i n , 40 % s u c r o s e i n . a Ten
B ro e c k g ro u n d g l a s s t i s s u e g r i n d e r a f t e r N i e ls e n and M i l l s
( 1 9 6 8 ).
it
was th e n c e n t r i f u g e d a t 1 2 ,0 0 0 rpm f o r 10 m in u te s a t 4 °C .
The s u p e r ­
n a t a n t s o l u t i o n was c a r e f u l l y rem oved and' m ixed w i t h 2 v olum es o f t h e
sa m p le g e l m inus t h e s u c r o s e s o l u t i o n o f D a v is (19 6 .4 ),
-2 0 O ver f i f t y p e r c e n t o f t h e y o l k m a t e r i a l was i n s o l u b l e i n 40 %
su c ro se .
T h is i n s o l u b l e m a t e r i a l w as a l s o a n a ly z e d e l e c t r o p h o r e t i c a l l y .
I t was d i s s o l v e d i n 0 .6 M KCl w i t h t h e a i d o f a c y c lo - m ix e r and c e n t r i ­
fu g e d a t 1 2 ,0 0 0 rpm f o r 10 m in u te s a t 4°C .
re m a in e d a f t e r t h i s c e n t r i f u g a t i o n .
A re s id u e o f about 5 %
S u c ro s e was a d d e d t o t h e s u p e r ­
n a t a n t s o l u t i o n , t o a c o n c e n t r a t i o n o f a b o u t 40 % t o f a c i l i t a t e p o ly ­
m e riz a tio n .
Two volum es, o f sa m p le g e l w e re ad d ed t o t h e s u p e r n a t a n t
s o l u t i o n a s d e s c r i b e d a b o v e and t h e m a t e r i a l was d i v i d e d among 3 g e l
tu b e s f o r e l e c t r o p h o r e s i s .
One g e l was u s e d . f o r g e n e r a l p r o t e i n s t a i n ­
i n g and t h e o t h e r s w e re s t a i n e d f o r l i p o p r o t e i n an d p o l y s a c c h a r i d e c o n ta in in g p r o te i n .
P ro te in C h a ra c te riz a tio n
G e n e ral p r o te in s ta i n in g .
P r o t e i n b a n d s w e re d i s c e r n e d by s t a i n i n g g e l s f o r I . h o u r - i n
a s o l u t i o n o f I % Amido Schw arz i n 7 % a c e t i c a c i d .
G e ls w e re d e s t a i n e d
by l e a c h i n g o r e l e c t r o p h o r e s i s i n 7 % a c e t i c a c i d .
P e rio d ic a c id - S c h if f r e a c tio n .
T h is r e a c t i o n i s w e l l known f o r t h e d e t e c t i o n o f p o l y ­
s a c c h a rid e s .
PAS- p o s i t i v e p r o t e i n b a n d s w e re d e m o n s tr a te d by th e
m eth o d o f H o tc h k is s a s d e s c r i b e d b y G u rr ( 1 9 5 8 ).
The f o ll o w i n g s t e p s
w e re p e rf o r m e d a f t e r e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n :
( I ) t h e g e ls w e re
o x i d i z e d i n 0 .8 % a q u e o u s p e r i o d i c a c i d f o r f i v e m in u te s and w ashed
i n 70 % e t h a n o l ;
a c id ic s o lu tio n
(2 ) t h e g e l s w e re r e d u c e d f o r f i v e m in u te s , i n an
( I g o f KI and I g o f so d iu m t h i o s u l f a t e d i s s o l v e d i n
-2 1 20 m l o f d i s t i l l e d w a t e r , 30 m l o f a b s o l u t e e t h a n o l an d 0 .5 ml o f 2
N HCl) and w ash ed i n 70 % e t h a n o l ;
(3 ) t h e g e ls w e re p l a c e d i n S c h i f f rs
r e a g e n t ( D a v e n p o r t, 1 960) f o r t e n m i n u t e s ; and (4 ) t h e g e l s w e re w ash ed
i n a s o l u t i o n o f 0 .2 g o f p o ta s s iu m m e t a b i s u l f i t e i n 4 5 .5 m l o f d i s ­
t i l l e d w a t e r and 0 .5 m l o f c o n c e n t r a t e d H C l;
P A S - p o s itiv e m a t e r i a l
s ta in e d a ro s e to p u r p le c o lo r i n S c h i f f 's r e a g e n t.
Bands becam e m ore
a p p a r e n t w i t h p r o lo n g e d s u l f i t e w a sh e s and s t o r a g e i n 7 % a c e t i c a c i d .
S in c e s u c r o s e . i s P A S - p o s itiv e an d w as in c l u d e d i n t h e sa m p le g e l
i t w as n e c e s s a r y t o d e te r m in e i t s
to e le c tr o p h o r e s is :
e ffe c t.
C o n tr o l g e l s w e re s u b j e c t e d
( I ) w i t h o u t p r o t e i n ..in th e . sa m p le g e l ;
(2 ) w i t h ­
o u t s u c r o s e i n t h e sa m p le g e l ; and (3 ) w i th o u t, p r o t e i n o r s u c r o s e i n
t h e sa m p le g e l .
PAS t e s t s on t h e s e c o n t r o l s show ed t h a t s u c r o s e i n
th e . s a m p le g e l d o e s n o t i n t e r f e r e b y . e n t e r i n g t h e s e p a r a t i o n g e l .
L ip o p ro te in s ta i n in g .
L i p o id b a n d s w e re v i s u a l i z e d i n t h e g e l s by t h e Sudan B la c k
m ethod a f t e r Wang a n d P a t t o n
( 1 9 6 8 ).
A 0 .5 % s o l u t i o n o f Sudan B lack.
B i n a 3 : 3 : 4 m ix t u r e o f e t h a n o l - e t h y l e n e g l y c o l - w a t e r w as u s e d .
t o d a r k b row n b a n d s a p p e a r e d a f t e r 5 h o u r s o f s t a i n i n g .
Brown
RESULTS AND DISCUSSION
I s o t o p e I n t r o d u c t i o n and Egg W eig h t C hanges
I n m o st i n s e c t b i o c h e m ic a l . t r a c e r s t u d i e s t h e i s o t o p e i s in c l u d e d
i n t h e d i e t , i n j e c t e d i n t o t h e a n im a l o r p u t i n t o an yIn v i t r o medium
(W in te rin g h a m , 1 9 6 2 ; L o c k s h in , 1 9 6 6 ; C h e f u r k a , 1 9 6 5 ).
O b v io u s ly d i e t ­
a r y i n t r o d u c t i o n c a n n o t b e u s e d w i t h t h e c l e i d o i c e g g s o f A. e V l i o t t i
and an i n v i t r o s tu d y c o n n o te s d i s r u p t i o n o f egg s t r u c t u r e w h ich m ig h t
i n t e r f e r e w i t h n o rm a l e m b r y o g e n e s is .
L ik e w is e , i n j e c t i o n o f t h e e g g s
c o u ld r e s u l t i n i n j u r y and r e s u l t a n t wound r e p a i r m ig h t m ask n o rm a l
e v e n ts
(H arv ey a n d W il li a m s , 1961; S te v e n s o n and W y a tt, 1 9 6 2 ).
The
d e s i c c a t i o n - a b s o r p t i o n t e c h n i q u e o f i s o t o p e i n t r o d u c t i o n c ir c u m v e n ts
th e s e d i f f i c u l t i e s . .
The a v e r a g e w e ig h t l o s s . p e r day p e r e g g d u r in g d e s i c c a t i o n and
t h e a v e r a g e w e ig h t g a in p e r egg d u r in g f o u r d ay s o f a b s o r p t i o n a r e
shown i n T a b le I .
P r e - d i a p a u s e e g g s l e s s th a n 20 d a y s o l d h a v e f r a g i l e
s h e l l s a n d l o s e w e ig h t r e a d i l y upon d e s i c c a t i o n .
S h e ll f r a g i l i t y
w e ig h t l o s s upon d e s i c c a t i o n d e c r e a s e s i n e g g s o v e r 20 d a y s o l d .
c h a n g e s a r e t h o u g h t t o b e .d u e t o s e r o s a l c u t i c l e p r o l i f e r a t i o n
1 9 3 7 ; M c F a rla n e , 1 9 6 0 ).
and
T h e se
(S life r,
A l l o f t h e eg g s a m p le s e x h i b i t e d g a in s i n
w e ig h t d u r in g t h e f o u r day a b s o r p t i o n p e r i o d (T a b le I ) .
v a r i a t i o n i n b o t h l o s s an d g a in o f w e ig h t was n o t e d .
C o n s id e r a b le
S in c e u p ta k e o f
v a l i n e - C - ^ was n o t a lw a y s p r o p o r t i o n a l t o t h e w e ig h t g a in d u r in g ab­
s o r p t i o n , i t was n e c e s s a r y t o g a in i n f o r m a t i o n r e g a r d i n g t h e
-2 3 T a b le I .
Changes' i n t h e w e ig h t o f e g g s fro m A.- e l l i o t t i - d u r in g
d e s ic c a tio n and a b s o r p tio n .
A v e ra g e w e ig h t l o s s
p e r day p e r e g g a
Days i n s t a t e a t
th e end o f th e
a b s o rp tio n p e rio d
A v e ra g e w e ig h t g a in
p e r eg g a f t e r f o u r
d ay s o f a b s o r p t i o n
S e rie s I ■ S e rie s I I
S e r i e s :E S e r i e s I I
S e rie s I
S e rie s I I
0 .8 5 mg
1 .1 0
1 .4 6
1 .0 5
1 .2 7
1 .3 3
2 .4 5
2 .3 2
2 .4 2
0 .5 0 mg
1 .0 4
.89
.6 8
1 .6 8
.9 3
1 .5 6
I . 79
1 .7 1
1 .8 9
1 .1 1
1 .8 8
1 .1 8
1 .8 5
1 .6 6
2 .2 1
2 .1 4
2 .5 2
2 .1 4
1 .9 6
0 .8 9
1 .0 8
.9 9
2 .4 8
2 .0 4
0 .8 8
P r e - d i a p a u s e e g g s a t 25'5G
0 .8 2 mg
.9 5
1 .0 8
.3 1
.2 0
.1 8
.1 6
.1 7
.1 3
0 .5 4 mg
.7 0
.7 6
• 60 .
.0 9
.1 2
• 3-5
8 d ay s
15
15
. 26
36 •
42
42
42
52
8 d ay s
15
16
20
28
35
41
D ia p a u se e g g s a t 8 ° G
.0 3
.1 2
.0 8
.0 9
.0 8
.0 2
.0 4
.1 3
.0 8
26
50
76
140
140b ■
26
45
51
HO
P o s t r d i a p a u s e e g g s a t 25'5C
.0 4 ■
.0 8
.1 1 •
.2 3
0 .2 1
.0 4
.0 4
.0 6
.2 1
0 .2 4
I
3
5
10
15
I.
3
5
10
15
a Eggs w e re d e s i c c a t e d u n t i l o n e - t e n t h o f t h e i r o r i g i n a l w e ig h t w as l o s t o r f o r no m ore t h a n f o u r d a y s .
T h is s a m p le was k e p t a t 2 5 ° C, w h e re a s a l l o t h e r d i a p a u s e sa m p le s
w e re s t o r e d a t S0C.
-2 4 c o n c e n tra tio n o f v a li n e - C ^ a v a ila b le f o r in c o r p o r a tio n in to p r o te in
( F ig u r e 2 , T a b le I I ) .
The u s e o f t h i s i n f o r m a t i o n i s
d e s c rib e d in th e
fo llo w in g p a ra g r a p h s .
R a d i o a c t iv e V a lin e U p ta k e M easurem ent
Two m e a s u re m e n ts o f t h e c o n c e n t r a t i o n o f valine-C -*-^ i n t h e s a m p le s
w e re d e s c r i b e d e a r l i e r .
The f i r s t m ea su rem e n t d e te r m in e d t h e am ount
o f v a l i n e - C " ^ a b s o r b e d fro m t h e i n c u b a t i o n medium b y o l d e r e g g s .
T h is
was a c c o m p lis h e d by m o n it o r i n g v a l i n e - C ^ r a d i o a c t i v i t y i n t h e i n c u ­
b a t i o n medium b e f o r e and a f t e r a b s o r p t i o n .
t o b e t h e am ount a b s o r b e d .
The d i f f e r e n c e was assum ed
The e q u a t i o n v-^ y ^ e- ^ , a b s o r b e d p e r . egg
v a l i n e - C l 4 a v a i l a b l e p e r egg
100 ( s e e F i g u r e 2) was u s e d t o c a l c u l a t e t h e p e r c e n ta g e a b s o r p t i o n o f
th e is o to p e .
P r e - d i a p a u s e e g g s w e re h i g h l y v a r i a b l e w i t h r e s p e c t t o
t h e i r a b s o r p t i o n o f t h e i s o t o p e , an o b s e r v a t i o n n o t e d p r e v i o u s l y b y .
Bunde ( 1 9 6 5 ).
S t r u c t u r a l c h a n g e s i n t h e s h e l l c o u ld c a u s e v a r i a b l e
a b s o rp tio n o f v a lin e -C -^ .
Eggs becam e m ore r e s i s t a n t t o d e s i c c a t i o n
a s p r e - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t p r o g r e s s e d , w h i l e s h e l l d ry w e ig h t i n ­
c r e a s e d and s h e l l f r a g i l i t y
d e c re a se d .
T h is may h a v e b e e n due t o t h e
p r o c e s s e s o f p h e n o l i c t a n n i n g and s e r o s a l c u t i c l e d e p o s i t i o n .
p r o c e s s e s h a v e b e e n s t u d i e d i n o t h e r o r t h o p t e r a n s by S l i f e r
M athee (1 9 5 1 ) and M c F a rla n e
T h ese
( 1 9 3 7 ),
(1 9 6 0 ).
D ia p a u s e an d p o s t - d i a p a u s e s a m p le s w e re l e s s v a r i a b l e w i t h r e ­
s p e c t t o t h e a b s o r p t i o n o f v a li n e - C ^ ^ th a n w e re t h e p r e - d i a p a u s e
s a m p le s .
The p e r c e n t a g e o f a b s o r p t i o n w as h ig h an d a p p e a r e d t o i n ­
c re a se in o ld e r eg g s.
The s t r u c t u r e o f t h e s h e l l o f some a c r i d i d e g g s
IOOr
Day Age 10
State
pre di a pa use
diapause
postdiapause
condition of eggs
F ig u r e 2 . P e r c e n t a b s o r p t i o n o f valine-C"*"^ by A. e l l i o t t i
e g g s d u r in g d e v e lo p m e n t.
S e r i e s I w h o le egg s a m p le s —# . S e r i e s I I
egg s a m p le s ( b e f o r e f r a c t i o n i n g ) —O . P e r c e n t a b s o r p t i o n was c a l c u l a t e d
fro m v a l i n e - C l 4 abs.Qrp.t i o n p e r egg % 1 0 0 _
v a l i n e - C 14 a v a i l a b l e p e r egg
-
T a b le I I .
26
-
V aline-C -I-^ u p ta k e m e a su re m e n ts e x p r e s s e d i n d i s i n t e g r a t i o n s
p e r m in u te p e r A. eXViotti, e g g o r egg f r a c t i o n .
W hole egg s a m p le s
Age o f
sa m p le
A v e ra g e
dpm /egg
Egg f r a c t i o n s a m p le s
Age o f
s amp I e
A v erag e
dpm /em bryo
A v e ra g e
d p m /y o lk
A verage
d p m /s h e ll
2 0 ,4 9 3
2 5 ,3 5 8
9 ,8 8 7
1 6 ,4 5 4
3 ,4 1 4
2 ,1 8 0
1 2 ,9 5 0
2 ,3 2 6
3 ,2 7 4
2 ,1 1 0
8 ,2 3 0
618
1 ,4 9 9
1 0 ,1 5 0
716
1 ,5 4 0
1 ,6 1 6
5 ,0 4 3
810
1 ,9 9 1
1 ,4 7 1
3 ,9 2 4
1 7 ,1 1 3
1 1 ,6 2 0
3 2 ,2 0 9
1 3 ,3 6 2
1 0 ,1 8 5
2 2 ,8 4 7
1 6 ,7 6 1
1 9 ,3 6 5
2 4 ,2 4 2
1 8 ,3 2 7
P re -d ia p a u s e eggs a t 2 5 °C
8 days
15
15
26
36
36
42
42
52
1 2 ,5 6 8
2 2 ,4 5 8
2 9 ,8 0 0
2 4 ,5 9 8
6 0 ,4 0 6
7 6 ,5 3 7
3 2 ,0 4 9 .
3 9 ,6 7 5
8 8 ,4 7 6
8 d ay s
15
16
20
28
35
41
437
1 ,0 0 1
1 ,3 3 9
D ia p a u s e e g g s a t 8° C
26
50
76
140
140a
1 7 ,0 3 3
1 ,5 4 4
3 ,0 6 0
9 0 ,8 9 5
3 7 ,9 0 5
26
45
51
36
199
HO
640
476
P o s t - d i a p a u s e e g g s a t 25°C
I
3
5
10
15
a
4 5 ,3 4 1
7 3 ,1 7 0
9 9 ,0 1 3
8 1 ,9 6 7
3 9 ,6 3 9
I
3
5
10
' 15
1 ,2 3 8
3 ,9 2 2
1 ,7 2 8
8 ,5 3 7
5 ,5 7 8
T h is s a m p le was k e p t a t 2 5°C , w h e re a s a l l o t h e r d i a p a u s e sa m p le s
w e re s t o r e d a t 8°C.
-2 7 s u c h a s M. SziffeTent1I d l 1I s 3 h a s b e e n r e p o r t e d t o b e n e a r l y c o m p le te a t
t h e tim e t h e eg g e n t e r s d i a p a u s e
( S l i f e r , 1 9 3 7 ).
I f t h e d e v e lo p m e n t
o f t h e e g g s h e l l i s s i m i l a r i n A. e V t i o t t i t h e d i f f e r e n t i a l a b s o r p t i o n
r a t e o b s e rv e d d u r in g p r e - d i a p a u s e c o u ld b e due t o c h a n g e s i n t h e s h e l l
a t t h i s tim e .
A b s o r p tio n o f a c e t a t e a l s o was fo u n d t o b e m ore c o n s t a n t
d u r in g d i a p a u s e and p o s t - d i a p a u s e i n e g g s o f A., e l l i o t t i .
(B u n d e , 1965) .
The m e a s u re m e n ts d e s c r i b e d ab o v e d e te r m in e d t h e u p ta k e o f v a lin e -C ^ -^
by w h o le e g g s .
D a ta d e r i v e d fro m t h e s e m e a su re m e n ts w e re u s e d t o show
p e r c e n t a g e a b s o r p t i o n o f v a l i n e - C ^ b u t w e re n o t u s e d t o c o r r e c t s a m p le s
fo r v a ria b le is o to p e c o n c e n tra tio n .
E m b ry o s, y o l k and s h e l l s d id n o t t a k e up v a li n e - C ^ ^ i n p r o p o r t i o n
to t h e i r w e ig h ts .
S in c e i t was n e c e s s a r y t o know t h e am ount o f v a l i n e -
a v a i l a b l e f o r i n c o r p o r a t i o n i n t o p r o t e i n i n e a c h eg g f r a c t i o n t o
d e te r m in e m e a n in g f u l i n c o r p o r a t i o i i v a l u e s , a n o th e r s e t o f c o n c e n t r a t i o n
m e a s u re m e n ts was o b t a i n e d .
An a l i q u o t o f t h e c ru d e l y o p h i l i z e d m a te r ­
i a l fro m e a c h w h o le eg g sa m p le and e a c h egg f r a c t i o n s a m p le w as homo­
g e n iz e d and c o u n te d a s d e s c r i b e d e a r l i e r .
T h e se c o u n ts w e re u se d t o
c a l c u l a t e t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f -v a l i n e - C " ^ f o r a l l s a m p le s
II).
(T a b le
T h is i n f o r m a t i o n w as u s e d t o c o r r e c t f o r v a r i a b l e i s o t o p e u p ta k e
and w i l l b e e l a b o r a t e d on i n a l a t e r s e c t i o n .
Dry W e ig h ts o f W hole Eggs and Egg F r a c t i o n Sam ples
The a v e r a g e d ry w e ig h t p e r w h o le egg o r egg f r a c t i o n was d e t e r ­
m in ed f o r a l l s a m p le s a f t e r l y o p h i l i z a t i o n
(T a b le I I I , F i g u r e 3 ) .
The
-
T a b le I I I .
28
-
P e r c e n t d r y w e i g h t s 3 o f w h o le e g g s and e g g f r a c t i o n s fro m
A.- elHottn,.
Age o f
s a m p le s :
Whole, egg
s a m p le s :.
Age o f
s a m p le s
S e rie s I
S e rie s I
S e r i e s I] [... S e r i e s I I
W hole egg*3
s a m p le s :
Egg f r a c t i o n s a m p l e s :
Embryo
S e rie s I I
Y o lk
S h e ll
P r e - d i a p a u s e e g g s a t 25°C
8 d ay s
15
15
26
36
36
42
42
52 -
4 6 .1 7 %
4 5 .3 2
3 9 .3 5
3 6 .3 8
3 7 .8 0
3 4 .4 0
3 4 .9 2
3 7 .1 3
3 0 . p2
8 d ay s
15
16
20
28
35
41
4 4 .6 8 %
4 5 .7 3
4 1 .9 1
4 6 .1 3
3 8 .9 4
3 6 .3 9
3 1 .2 2
4 3 .6 9 %
4 4 .7 7
4 1 .4 2
4 4 .8 1
1 .0 1 % 3 6 .7 2
3 3 .1 5
2 .0 9
2 7 .2 0
2 .7 0
0 .9 9 %
.96
.4 9 .
1 .3 2
1 .2 1
1 .1 5 ■
1 .3 2
3 .8 0
3 .8 8
5 .6 2
3 .7 1
2 5 .0 9
2 2 .8 6
2 6 .1 0
2 1 .6 5
1 .3 3
1 .1 2
1 .1 6
1 .3 3
4 .1 4
4 .0 6
3 .8 6
6 .9 5
8 .8 5
2 3 .4 5
2 2 .2 0
2 2 .2 9
1 9 .0 5
1 9 .1 2
1 .1 6
1 .1 9
1 .1 8
1 .2 0
0 .9 9
D ia p a u s e e g g s a t 8°C
26
50
76
140
140c '
2 9 .8 3
2 9 .7 3
2 7 .1 9
2 7 .8 1
2 5 .9 3
.
26
45
51
HO
3 0 .2 2
2 7 .8 6
3 2 .9 8
2 6 .6 9
P o s t-d ia p a u s e eggs a t 25 °C
I
3
5
10
15
a
2 6 .3 4
2 6 .8 3
2 9 .2 0
2 6 .6 9
3 1 .3 5
I
3
5
10 ,
15
2 8 .7 5
2 7 .4 5
2 7 .3 3
2 7 .2 0
2 8 .9 6
A v e ra g e l y o p h i l i z e d w e ig h t p e r , e g g ___________
A v e ra g e w e t w e ig h t p e r e g g a f t e r a b s o r p t i o n
x
k The d ry w e ig h ts o f t h e e g g f r a c t i o n s w e re summed t o c a l c u l a t e t h e
p e r c e n t d r y w e ig h t- .o f S e r i e s I I w h o le e g g s ,
c
T h is sa m p le was k e p t a t ,2 5 0C, w h e r e a s , a l l . o t h e r d ia p a u s e sa m p le s
w e re s t o r e d a t - S0C.
-2 9 -
---- whole eggs
- - yolk
Day Age
IO
S ta te ---------- prediapause--------------------- 1---------- diapause
♦
postdiapouse
co n dition of eggs
F i g u r e 3. P e r c e n t d ry w e ig h t o f A. e l l i o t t i w h o le e g g s and egg f r a c ­
tio n s .
S e r i e s I w h o le e g g s —# .
S e r i e s I I eg g s (sum o f eg g f r a c t i o n s )
- 0 . S e r i e s I I y o l k f r a c t i o n —^ . S e r i e s I I em bryo f r a c t i o n —^ .
S e r i e s I I s h e l l f r a c t i o n —o . P e r c e n t d ry w e ig h t i s t h e p r o d u c t o f
a v e r a g e l y o p h i l i z e d w e ig h t p e r w h o le eg g o r egg f r a c t i o n x ^QO
a v e ra g e w e t w e ig h t p e r eg g a f t e r a b s o r p t i o n
B roken l i n e s i n t h e lo w e r g ra p h a r e u s e d t o d e n o te tim e p e r i o d s b e ­
tw een s a m p le s t h a t a r e to o g r e a t t o e s t a b l i s h a t r e n d .
—3 0 d ry w e ig h ts o f .em bryo, y o l k and s h e l l f r a c t i o n s o f S e r i e s I I w e re
summed t o o b t a i n t h e w h o le egg v a l u e s .
P e r c e n t a g e d ry w e ig h ts f o r
t h e w h o le egg s a m p le s a n d eg g f r a c t i o n s a m p le s w e re c a l c u l a t e d as
fo llo w s :
a v e r a g e l y o p h i l i z e d w e ig h t p e r e g g o r eg g f r a c t i o n
a v e r a g e w e t w e ig h t p e r egg a f t e r a b s o r p t i o n
P e r c e n t a g e v a l u e s a r e f r e e o f a p p a r e n t c h a n g e s due t o s i z e v a r i a t i o n s
in th e e g g s.
Q u ic k e n d e n (1 9 6 9 ) d e te r m in e d p e r c e n t a g e d ry w e ig h t i n
I t o 7- d a y - o l d p r e - d i a p a u s e A. e I Z i o t t i e g g s t o b e a b o u t 45 %.
T h is
i s i n a g re e m e n t w i t h t h e p e r c e n t a g e d ry w e ig h t v a lu e s o f - 45 and 46 %
fo u n d i n two 8 - d a y - o l d p r e - d i a p a u s e s a m p le s i n t h e p r e s e n t s tu d y .
The
p e r c e n t a g e d r y w e ig h t o f w h o le e g g s show ed t h a t eg g h y d r a t i o n i n c r e a s e s
d u r in g p r e - d i a p a u s e a n d re m a in s h i g h t h r o u g h o u t t h e r e m a in d e r o f em b ry o g e n e s is .
Em bryos e x h i b i t e d a g r a d u a l i n c r e a s e i n d ry w e ig h t th r o u g h o u t t h e
p r e - d i a p a u s e p e r i o d a n d f o r 50 d a y s o f d ia p a u s e d e v e lo p m e n t.
E m bryonic
d ry w e ig h t show s a d e c r e a s e to t h e . e a r l y p r e - d i a p a u s e l e v e l a f t e r H O
d a y s o f e x p o s u re t o 8°C d u r in g d i a p a u s e and r i s e s a g a i n . d u r i n g p o s t ­
d ia p a u s e d e v e lo p m e n t a t 2 5 0C.
d u r in g t h e t r a n s i t i o n
The. m a t e r i a l a c c u m u la te d by t h e em bryo
from p r e - d i a p a u s e t o d ia p a u s e i s a p p a r e n t l y
u t i l i z e d d u r in g p r o lo n g e d c o ld e x p o s u re w h i l e i n t h e d ia p a u s e s t a t e .
The y o l k d i s p l a y e d a g r a d u a l d e c l i n e i n . p e r c e n t a g e d r y w e ig h t th r o u g h ­
o u t d e v e lo p m e n t w h ic h i s
c o n s i s t e n t w i t h i t s u s e a s a s o u r c e o f e n e rg y
an d a n o b o li c . m a t e r i a l s .
The d ry w e ig h t o f t h e egg s h e l l show ed a
m ark ed i n c r e a s e d u r in g p r e - d i a p a u s e w h ic h l e v e l e d o f f d u r in g d ia p a u s e
-3 1 and d ro p p e d i n p o s t - d i a p a u s e j u s t p r i o r t o h a t c h i n g
( F ig u r e 4 ) .
The
i n c r e a s e d u r in g p r e - d i a p a u s e was p r o b a b ly due t o d e p o s i t i o n o f s e r o s a l
c u t i c l e a s w as m e n tio n e d e a r l i e r i n r e l a t i o n t o t h e d e c r e a s e i n s h e l l
fra g ility
and r e s i s t a n c e t o d e s i c c a t i o n .
w e ig h t o f t h e s h e l l p r i o r t o h a t c h i n g
The d e c r e a s e i n t h e d ry
( p o s t - d i a p a u s e s a m p le , 15 days
o l d : F i g u r e 3) can b e a t t r i b u t e d t o t h e b reak d o w n o f t h e s h e l l ..
S life r
(1 9 3 7 ) n o t e d a d e c r e a s e i n t h e t h i c k n e s s o f t h e i n n e r l a y e r o f t h e
s e r o s a l c u t i c l e d u r in g p o s t - d i a p a u s e i n M. d i f f e r e n t i a t i s and Trow­
b r i d g e and B o d in e (1 9 4 0 ) fo u n d a d e c r e a s e i n th e t o t a l n i t r o g e n o f t h e
s h e l l in t h i s s p e c ie s p r i o r to h a tc h in g .
S life r
(1 9 3 7 ) a t t r i b u t e d t h e
d e c r e a s e i n c u t i c l e t h i c k n e s s t o t h e a c t i o n o f a , h a t c h i n g enzyme .p ro ­
d u c e d by t h e p l e u r o p o d i a .
U rban (1 9 7 0 ) fo u n d t h a t t h e p l e u r o p o d i a o f
A. e l l i o t t i e x h i b i t e d h i g h p r o t e a s e a c t i v i t y i n t h e e m b ry o n ic e x u v i a e ,
e x tr a - e m b r y o n ic , f l u i d an d on t h e i n s i d e o f t h e s h e l l .
I t a p p e ars t h a t
t h e d e c r e a s e i n t h e d ry w e ig h t o f t h e s h e l l o b s e r v e d i n t h e p r e s e n t
s tu d y may h a v e b e e n due t o e n z y m a tic d i g e s t i o n o f p a r t o f t h e s h e l l .
P r o t e i n C o n t e n t ■o f W hole Eggs and Egg F r a c t i o n s
The p r o t e i n . c o n t e n t o f S e r i e s I .an d S e r i e s I I s a m p le s w as d e t e r ­
m ined- t h r o u g h o u t e m b r y o g e n e s is .
b i u r e t m e th o d .
P r o t e i n was a s s a y e d by a .m o d i f ie d
M ost o f t h e v a lu e s a r e a v e r a g e s o f s e v e r a l a n a l y s e s :
2 -6 a n a l y s e s w e re p e rf o r m e d on S e r i e s I w h o le egg s a m p le s and S e r i e s
I I y o l k f r a c t i o n s a m p le s w e re a n a ly z e d i n t r i p l i c a t e ; t h e v a lu e s ob­
t a i n e d f o r d i a p a u s e em bryos a r e t h e a v e r a g e o f 2 -3 a n a l y s e s , e x c e p t
-3 2 -
Day Age
IO
S tate -----------
p re d ia p a u se
d ia p a u se
condition of eggs
F ig u r e 4 .
S h e l l d ry w e ig h t o f A. e l l i o t t i eg g s
p o std iap au se
-3 3 f o r tw o s a m p le s w i t h s i n g l e a n a l y s e s : s i n g l e a n a ly s e s w e re u s e d f o r
S e r i e s IX s h e l l f r a c t i o n s .
The Q t e s t
(Skoog and W e s t, 1963) was u s e d
t o e v a l u a t e t h e v a l i d i t y o f b i u r e t r e a d i n g s from S e r i e s I w h o le egg
s a m p le s .
T h re e r e a d i n g s w e re r e j e c t e d by t h i s c r i t e r i o n .
B i u r e t d e t e r m i n a t i o n s o f t h e p r o t e i n c o n te n t o f S e r i e s I w h o le .
e g g s a r e p r e s e n t e d i n T a b le IV and F i g u r e 5 .
The p r o t e i n c o n te n t s o f
t h e em b ry o , y o l k and s h e l l from S e r i e s I I egg f r a c t i o n s a m p le s w e re
summed t o o b t a i n w h o le e g g v a lu e s
(T a b le V, F ig u r e 6 ) .
The m o st con­
s i s t e n t o b s e r v a t i o n s i n F i g u r e s 5 and 6 a r e t h a t t h e p r o t e i n c o n te n t
o f w h o le e g g s d e c r e a s e d d u r in g t h e . f i r s t 26 d ay s o f d ia p a u s e a t S0C ,
i n c r e a s e d d u r in g t h e n e x t 25 d a y s and d e c r e a s e d a f t e r m ore th a n two
m onths o f c o ld e x p o s u r e .
The S e r i e s I w h o le egg s a m p le s m a in ta in e d
a t 2 5 °C f o r 140 d a y s i n t h e d ia p a u s e s t a t e show ed a s l i g h t l y h i g h e r
p e r c e n t a g e o f p r o t e i n th a n t h e c o m p a ra b le sa m p le m a i n ta i n e d a t S0C
(T a b le I V ) .
The w id e r a n g e o f v a l u e s and t h e l a c k o f a s u f f i c i e n t
num ber o f s a m p le s make i t d i f f i c u l t t o i n t e r p r e t t h e s e r e s u l t s .
p r o t e i n c o n te n t o f em bryo f r a c t i o n s . and y o l k f r a c t i o n s i s
The
re p o rte d
b e lo w a s c o r r o b o r a t i v e i n f o r m a t i o n .
I n o v ip a r o u s a n im a ls t h e y o l k i s
consum ed d u r in g e m b ry o g e n e s is
as a s o u r c e o f e n e rg y an d a n a b o l i c m a t e r i a l s .
I t seem s a p p a r e n t t h a t
t h e p r o t e i n c o n t e n t o f t h e em bryo s h o u ld i n c r e a s e w h i l e t h a t o f t h e
y o l k d e c r e a s e s d u r in g A. e l V i o t t i , e m b r y o g e n e s is .
C hanges w h ic h o c c u r
i n p r o t e i n l e v e l s , e s p e c i a l l y d u r in g t h e d ia p a u s e p e r i o d , h o w e v e r,
-3 4 T a b le IV .
P r o t e i n c o n t e n t o f S e r i e s I w h o le e g g s th r o u g h o u t t h e
e m b ry o g e n e s is o f A. QZZ-Vott1I.
D e s c r i p t i o n o f s a m p le s
Day ag e
S ta g e s
Mean s t a g e
P r o t e i n c o n te n t
No. o f 'e ggs
A v e ra g e
m g/egg
% p ro te in 3
P r e - d i a p a u s e e g g s a t 25°G
8
15
26
36
36
42
42
52
19
■19
18
13
22
25
25
24
18
34
1 .7 8
2 .0 3
1 .7 5
1 .4 0
1 .4 2
1 .6 8
1 .5 8
1 .4 6
5 9 .1 4
7 9 .6 1
5 9 .5 2
4 6 .3 5
5 2 .5 9
5 7 .9 3
5 4 .4 3
5 2 .3 1
1 .2 3
1 .6 3
1 .5 2
1 .3 3
1 .3 8
4 7 .6 9
5 7 .6 0
5 3 .9 0
5 4 .7 3
6 2 .1 6
1 .5 2
1 .5 7
1 .7 7
1 .5 6
1 .4 8
5 4 .0 9
5 7 .9 3
6 2 .1 1
5 7 .1 4
5 2 .8 6
D ia p a u s e e g g s a t 8 0C
26
50
76
140
14 Ob
19
19
19
1 9 -2 3
1 9 -2 3
19
19
19
2 0 .0
1 9 .6
34
24
25
25
27
P o s t - d i a p a u s e e g g s a t 25°C
I
3
5
10
• 15
2 1 -2 3
no d a t a
2 0 -2 5
2 5 -2 6
2 5 -2 7
2 1 .8
2 2 .6
2 5 .5
2 6 .2
25
25
23.
24
25
a P e r c e n t p r o t e i n w as c a l c u l a t e d fro m m& p r o t e i n _ p ^ r eg g ----- x 100.
v
mg d ry w e ig h t p e r egg
T h is s a m p le w as m a i n ta i n e d a t 25°C .
3
CP
CP
I
c
a>
I
2
i
Q.
o>
E
£
I-W W
<D 2
i
I -
Stage
19
Days in 8
15
26
36 42
52
S tate--------------- prediapause--------------------- h
19
19
20 0 196 21.8
22.6
76
50
3
5
140 140
I
-diopa use------------- ----------------------- 1--------- —postdiapause —
condition
F ig u r e 5 .
of eggs
P r o t e i n c o n te n t o f S e r i e s I w h o le e g g s th r o u g h o u t t h e em brya g e n e s is o f
N um erals a b o v e t h e sy m b o ls r e p r e s e n t t h e num ber o f a n a ly s e s on t h a t
d e n o te s two s a m p le s , nc —d e n o te s no c o ld e x p o s u r e .
A. e l l t o t t i .
s a m p le . #
25.5
IO
26.2
15
Table V.
P r o te in co n ten t o f S e r ie s I I egg f r a c t io n sam ples from A. e l t i o t t i
A v e ra g e p r o t e i n c o n t e n t p e r w h o le egg o r eg g f r a c t i o n
D e s c r i p t i o n o f s a m p le s
Day
age
S ta g e s
Mean
s ta g e
No. o f
eggs
Embryo
mg'
p e rc e n t^
S h e ll
Y o lk
mg
p e r c e n t^
Whole e g g s d
mg
p e rc e n t^
mg
23
17
17
12
31
27
51
4 1 .0 3
5 6 .6 3
2 8 .5 7
1 3 .3 4
3 5 .8 4
3 2 .9 4
4 2 .3 2
1 .7 3
1 .5 1
1 .5 2
1 .4 2
1 .4 4
1 .5 2
1 .6 1
6 4 .3 1
5 4 .3 2
5 4 .0 9
5 3 .7 9
5 3 .3 3
5 6 .3 0
5 7 .5 0
30
27
29
35
2 5 .4 9
2 3 .5 8
2 5 .7 5
3 0 .4 5
1 .3 4
1 .4 5
1 .6 3
1 .2 5
5 0 .9 4
5 2 .7 3
5 3 .1 0
5 3 .6 5
52
34
43
33
31
4 5 .5 3
2 6 .6 4
4 0 .1 5
2 9 .6 7
3 3 .8 2
1 .5 0
1 .4 5
1 .4 1
1 .3 9
1 .5 6
5 4 .3 5
5 3 .3 1 ■
5 5 .2 9
5 4 .0 9
6 0 .9 4
p e rc e n t^ 3
P r e - d i a p a u s e e g g s a t 25°C
8
15
16
20
28
35
41
9 -1 2
1 3 -1 6
1 8 -1 9
1 0 .4
1 4 .6
1 8 .9
20
20
20
46
86
48
53
0 .0 4 0
.0 9 0
.1 1 4
5 7 .9 7
5 8 .0 6
4 7 .9 3
1 .7 1 .
1 .4 9
1 .5 0
1 .4 3
1 .3 7
1 .4 0
1 .4 4
6 3 .5 6
5 4 .7 8
5 3 .3 8
5 5 .8 6
5 3 .9 4
5 6 .9 1
5 9 .0 2
D ia p a u se e g g s a t 8°C
26
45
51
HO
19
19
19
19
19
19
19
19
51
47
43
47
.125
.1 7 7
.2 3 9
.1 3 9
3 7 .5 4
4 6 .5 8
4 5 .7 0
4 2 .9 0
1 .1 9
1 .2 5
1 .3 6
1 .0 8
5 4 .1 9
5 5 .8 6
5 6 .1 1 .
5 6 .8 9
P o s t - d i a p a u s e e g g s a t 25°C
I
3
5
10
15
a
19-24.
1 9 -2 4
1 9 -2 4
2 4 -2 6
2 5 -2 7
2 0 .5
2 0 .6
2 1 .1
2 4 .7
2 6 .0
50
48
41
49
50
.1 8 2
.1 6 4
. 212
.3 7 1
.4 6 1
4 4 .8 3
4 1 .0 8
5 1 .3 9
5 7 .8 4
5 8 .9 7
1 .2 7
1 .2 5
1 ,1 8
1 .0 8
1 .0 7
5 5 .2 2 .
5 6 .8 7
5 6 .6 9
6 0 .0 0
6 3 .3 1
The p r o t e i n c o n t e n t s o f e m b ry o , y o l k and s h e l l f r a c t i o n s w e re summed t o o b t a i n w h o le egg
v a lu e s . • ■
a v e r a g e mg p r o t e i n p e r w h o le eg g o r egg f r a c t i o n
b
X 100,
P e rce n t p ro te in
a v e r a g e mg d ry w e ig h t p e r w h o le egg o r egg f r a c t i o n
3
2
o>
Ot
<u
7
5
6
7
C
5
5
O
Q.
Ot
E
5
G
I
6
D
5
I
I
Stage
Days in 8
State
15
146
104
183
36
42
20 28
--------- 1—
prediapause
19
26
19
45
19
51
-diapause
205 206
2U
246
260
1 3
5
IO
15
------------- postdiapause------------------------
condition of eggs
F ig u r e 6 . P r o t e i n c o n te n t o f S e r i e s I I egg f r a c t i o n s a m p le s th r o u g h o u t th e e m b ry o g e n e s is
o f A. e l l i o t t i .
E m bryo, y o l k and s h e l l p r o t e i n w ere summed t o o b t a i n t h e w hole egg p r o t e i n
c o n te n t.
N um erals ab o v e t h e sy m b o ls r e p r e s e n t th e num ber o f a n a ly s e s on th e sa m p le .
u>
-'j
I
-
38
-
may b e o f s p e c i a l i n t e r e s t .
The p r o t e i n c o n t e n t o f t h e em bryo f r a c t i o n s e x h i b i t e d an i n c r e a s e
d u r in g p r e - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t a s shown i n T a b le V an d F ig u r e 7.
A
s l i g h t i n c r e a s e i n e m b ry o n ic p r o t e i n a p p e a r e d d u r in g t h e t r a n s i t i o n
fro m t h e p r e - d i a p a u s e t o t h e d i a p a u s e s t a t e .
Two d i a p a u s e s a m p le s e x ­
p o s e d t o t h e c o ld f o r 45 and 51 d a y s r e s p e c t i v e l y , show ed i n c r e a s e s i n
p r o t e i n c o n t e n t w h ic h c o r r o b o r a t e t h e i n c r e a s e s e e n i n t h e egg a s a
w h o le ( F ig u r e s 5 a n d 6 ) a t a b o u t 50 d a y s o f d ia p a u s e d e v e lo p m e n t.
A f t e r H O d a y s o f c o ld e x p o s u re t h e p r o t e i n c o n te n t h a d d e c r e a s e d a l ­
m o st t o t h e e a r l y d ia p a u s e l e v e l .
T h u s , an i n c r e a s e i n p r o t e i n d u r in g
t h e f i r s t 50 d a y s o f d i a p a u s e , f o llo w e d by a d e c r e a s e d u r in g p r o lo n g e d
c o ld e x p o s u r e , may b e t y p i c a l o f d i a p a u s i n g e m b ry o s.
p o s t - d i a p a u s e s a m p le s d i s p l a y e d l i t t l e
The f i r s t t h r e e
i n c r e a s e i n p r o t e i n w h ic h i s
p r o b a b ly r e l a t e d t o t h e o b s e r v a t i o n t h a t many o f t h e em bryos i n t h e s e
s a m p le s w e re r e t a r d e d a s e v id e n c e d by t h e i r low a v e r a g e m o r p h o lo g ic a l
s ta g e
(Van H o rn , 1 9 6 6 b ) .
P o s t - d i a p a u s e em bryo f r a c t i o n s fro m t h e e g g s
o f two s a m p le s t h a t h a d b e e n rem oved fro m t h e c o ld f o r 10 and 15 d a y s
r e s p e c t i v e l y , h ad h ig h l e v e l s o f p r o t e i n .
V a r i a t i o n i n t h e s i z e o f em bryos may b r i n g a b o u t d i f f e r e n c e s i n
p r o t e i n c o n t e n t b e tw e e n one sa m p le and a n o t h e r .
The u s e o f p e r c e n ta g e
v a lu e s w i l l , e l i m i n a t e v a r i a t i o n due t o d i f f e r e n c e s i n w e ig h t and show
t h e am ount o f p r o t e i n i n r e l a t i o n t o t h e r e s t o f th e . d r y m a t e r i a l o f
t h e em bryo.
The p e r c e n t a g e o f p r o t e i n i n em bryos was c a l c u l a t e d from
-3 9 -
Stoge
19 19
45 51
Daysin
19 20.5 20.6 2LI
S ta te ----------- prediapause---------------1------------diapause------------------------ 1------- postdiapause
condition
of
eggs
F ig u r e 7. P r o t e i n c o n t e n t and p e r c e n t p r o t e i n i n A. e l l i o t t i em bryos
t h r o u g h o u t e m b r y o g e n e s is . A v erag e p r o t e i n p e r em bryo i n mg—A , p e r c e n t
.....................................
a v e r a g e mg p r o t e i n p e r em bryo
em bryo p r o t e i n ( c a l c u l a t e d from a v e r a g e mg d ry w e ig h t p e r embryo X 1 0 0 ) - *
N u m erals ab o v e sy m b o ls-n u m b e r o f a n a l y s e s .
B roken l i n e s - t i m e p e r i o d
to o g r e a t t o e s t a b l i s h a t r e n d .
—40—
a v e r a g e mg p r o t e i n p e r em bryo
a v e r a g e mg d ry w e ig h t p e r em bryo
X 100.
T h ese c a l c u l a t i o n s show t h a t
t h e p e r c e n t a g e o f p r o t e i n i n em bryos d ro p s a b o u t 20 % fro m t h e 3 5 - d a y o ld p r e - d i a p a u s e s a m p le t o t h e 2 6 - d a y - o l d d ia p a u s e s a m p le
( F ig u r e 7 ) .
I t h a s b e e n s t a t e d , h o w e v e r, t h a t t h e a b s o l u t e p r o t e i n c o n te n t a c t u a l l y
i n c r e a s e d d u r in g t h i s tim e .
T h is m eans t h a t t h e r e m u st b e a s u b s t a n ­
t i a l i n c r e a s e , i n t h e n o n - p r o t e i n m a t e r i a l o f t h e em bryo w h ic h m asks
th e in c r e a s e in p r o te in c o n te n t.
The p r o t e i n c o n t e n t o f t h e y o l k d i s p l a y e d a g r a d u a l d e c l i n e t h r o u g h ­
o u t e m b ry o g e n e si s
y o lk
(T a b le IV , F i g u r e 8 ) .
The p e r c e n t a g e o f p r o t e i n i n
( c a l c u l a t e d fro m a v e r a g e mg y o l k d ry w e ig h t x 1 0 0 > was h l Sh in
s a m p le s a t t h e b e g in n i n g and a t t h e en d o f e m b r y o g e n e s is .
A sh a rp i n ­
c r e a s e was n o t e d i n t h e p e r c e n t a g e o f p r o t e i n i n y o l k o f 35 and 4 1 - d a y o ld p r e - d i a p a u s e s a m p le s .
T h is c o u ld mean t h a t t h e r e was a l o s s o f
n o n - p r o t e i n m a t e r i a l fro m t h e y o l k t o t h e em bryo o r t h a t y o l k p r o t e i n ,
was b e in g fo rm e d .
D a ta t o b e p r e s e n t e d l a t e r shows t h a t t h e fo rm e r i s
p r o b a b ly m o st im p o r ta n t w h i l e t h e l a t t e r may b e p a r t l y r e s p o n s i b l e .
The m arked d e c r e a s e . i n t h e p e r c e n t a g e o f p r o t e i n i n t h e em bryo s e e n i n
th e t r a n s i t i o n
fro m l a t e p r e - d i a p a u s e t o d ia p a u s e
( F ig u r e 7) and t h e
i n c r e a s e i n p e r c e n t a g e y o l k p r o t e i n o b s e rv e d s im u l ta n e o u s l y
( F ig u r e 8)
i n d i c a t e s t h a t n o n - p r o t e i n m a t e r i a l w as t r a n s f e r r e d fro m t h e y o lk t o
t h e em bryo a t t h i s t im e .
F ig u re 9 i s
an i d e a l i z e d r e p r e s e n t a t i o n o f
t h e s h i f t i n t h e am ounts, o f p r o t e i n a n d n o n - p r o t e i n m a t e r i a l i n t h e
em bryo th r o u g h o u t d e v e lo p m e n t»
The s h a r p d ro p i n p e r c e n t a g e y o lk
*5
JZ
S
w
Q-
IV) :
O
2 samples
o»
3»
□
I
I
j
♦
GD
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0>
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♦
♦
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I
I
OI
E
Stage
Days in
State —
I
I
I
i
10.4
15
20
28
-prediapause-------
14.6
35
19
41
19
26
19
19
45
51
-diapause —
.
I
percent yolk protein
—
19 20.5 20.6 21.1
24.7
26.0
HO
I
3
5
IO
15
----- 1--------------postdiapause--------------------
condition of eggs
F ig u r e 8 . P r o t e i n c o n te n t o f t h e y o l k f r a c t i o n and s h e l l f r a c t i o n th ro u g h o u t th e em bryog e n e s i s o f A. e l l i o t t i .
A v e ra g e mg p r o t e i n p e r y o l k —Q , a v e ra g e jug p r o t e i n p e r s h e l l —C ,
,,
^
,
a v e ra g e mg y o lk p r o t e i n p e r egg
y i n r n _A
p e r c e n t y o l k p r o t e i n ( c a l c u l a t e d from a v e r a ge mg y o lk d ry w e ig h t p e r egg
*
N um erals above sy m b o ls r e p r e s e n t t h e num ber o f a n a ly s e s on t h a t s a m p le .
I—i
i
to
I
predia pa use
d ia p a u s e
postdia pause
F ig u r e 9 . An i d e a l i z e d r e p r e s e n t a t i o n o f t h e am ount o f p r o t e i n and n o n - p r o t e i n
m a t e r i a l i n A. e X I v o t t i em bryos th r o u g h o u t e m b r y o g e n e s is .
—4 3 p r o te i n o b se rv e d i n th e t r a n s i t i o n
s t a t e was f o llo w e d by l i t t l e
d e v e lo p m e n t.
fro m p r e - d i a p a u s e t o t h e d ia p a u s e
f l u c t u a t i o n u n t i l 15 d a y s o f p o s t - d i a p a u s e
The p e r c e n t a g e o f y o l k p r o t e i n i n c r e a s e d a t t h a t tim e .
S h e ll p r o te i n c o n te n t a p p e are d to b e q u ite v a r i a b le
F ig u re 8 ) .
(T a b le IV ,
I t s h o u ld b e n o t e d t h a t t h e h i g h l y i n s o l u b l e n a t u r e o f t h e
s h e l l p r o t e i n was n o t c o n d u c iv e t o a c c u r a t e p r o t e i n a s s a y by th e
b i u r e t m ethod and s i n c e t h e s h e l l f r a c t i o n y i e l d e d a r e l a t i v e l y s m a ll
am ount o f m a t e r i a l o n ly s i n g l e a n a l y s e s w e re p o s s i b l e .
A p o s s ib le
t r e n d to w a rd an i n c r e a s e i n p r o t e i n c o n t e n t was n o t e d i n l a t e p r e ­
d i a p a u s e s a m p le s .
T h is s u g g e s t i o n i s s u p p o r t e d by t h e o b s e r v a t i o n
t h a t s h e l l d ry w e ig h ts i n c r e a s e d d u r in g p r e - d i a p a u s e
( T a b le I I I ,
F ig u re 3 ).
As p r e v i o u s l y m e n tio n e d , i t i s g e n e r a l l y a c c e p t e d t h a t t o t a l
n i t r o g e n re m a in s c o n s t a n t th r o u g h o u t e m b ry o g e n e s is i n t h e i n s e c t e g g .
T o t a l n i t r o g e n i n w h o le e g g s was d e te r m in e d i n t h e p r e s e n t s tu d y by
a m ic r o - K je l d a h l t e c h n i q u e
(R a b a t and M a y er, 1 9 6 1 ).
W ith t h e num ber o f
d e t e r m i n a t i o n s i n p a r e n t h e s e s t h e a v e r a g e v a lu e s f o r p r e - d i a p a u s e ,
d ia p a u s e and p o s t - d i a p a u s e w h o le e g g s r e s p e c t i v e l y , a r e
8 .6 6 an d (2 ) 8 .4 8 % n i t r o g e n .
(4 ) 8 .3 8 ,
(2)
T h is i n d i c a t e s t h a t t o t a l n i t r o g e n was
p r o b a b ly c o n s t a n t a t a b o u t 8 .5 % o f t h e w h o le eg g w e ig h t th ro u g h o u t
d e v e lo p m e n t.
I t has been re p o r te d t h a t p r o te in i s n o t u t i l i z e d to a g re a t e x te n t
f o r e n e rg y i n Bombyx mori o r M. d - i f f e r e n t i a l i s
( W illia m s , 1 9 6 7 ).
As
-4 4 m e n tio n e d e a r l i e r , Ludw ig and R o t h s t e i n
(1952) c o u ld f i n d no e v id e n c e
t h a t p r o t e i n was a n e n e rg y s o u r c e i n P. japon iaa and u r i c a c i d
p r o d u c t i o n d u r in g t h e e m b ry o g e n e s is o f M. d i f f e r e n t i a l ' s c o rr e s p o n d e d
t o o n ly 6 .6 % o f t h e e g g p r o t e i n
( B o d in e , 1 9 4 6 ).
The p r e s e n t s tu d y a l s o
i n d i c a t e s t h a t p r o t e i n i s n o t u t i l i z e d t o a g r e a t e x t e n t a s an e n e rg y
so u rc e b u t i s tr a n s f e r r e d f o r a n a b o lic p u rp o se s .
The t o t a l i n c r e a s e i n
e m b ry o n ic p r o t e i n shown i n F i g u r e 7 i s v e ry c l o s e t o t h e am ount o f p r o ­
t e i n l o s t by t h e y o l k d u r in g t h e sam e p e r i o d
( F ig u r e 8 ) .
S e v e ra l s tu d ie s
h a v e d e m o n s tr a te d t h e t r a n s f e r o f y o l k m a t e r i a l t o t h e em b ry o .
Trow­
b r i d g e and B o d in e (1 9 4 0 ) fo u n d t h a t t h e t r a n s f e r o f n i t r o g e n from t h e
y o l k t o t h e em bryo was q u a n t i t a t i v e an d c l o s e l y p a r a l l e l e d t h e g ro w th
c u rv e o f M. d i f f e r e n t i a l i s .
p a tte rn
The t r a n s f e r o f Cu and Fe f o llo w e d t h e sam e .
(B o d in e and W o lk in , 1 9 3 4 ; B o d in e and F i t z g e r a l d , 1 9 4 8 ).
T h e se
w o r k e rs fo u n d p ro n o u n c e d i n c r e a s e s i n t h e t r a n s f e r o f t h e s e m a t e r i a l s
d u r in g p r e - d i a p a u s e and e s p e c i a l l y p o s t - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t i n M.
d i f f e r e n t i a l i s w h i l e t r a n s f e r d u r in g d ia p a u s e was n e g l i g i b l e .
The i n c r e a s e i n y o l k p r o t e i n i n 45 and 5 1 - d a y - o ld d ia p a u s e s a m p le s
a n d , a s r e p o r t e d e a r l i e r , t h e i n c r e a s e i n em bryo p r o t e i n a t t h e same
tim e i n d i c a t e s t h a t t h e em bryo a n d /o r y o l k was s y n t h e s i z i n g a s i g n i f i ­
c a n t am ount o f p r o t e i n a t t h i s s t a g e o f d e v e lo p m e n t.
E v id e n c e t o b e
p r e s e n t e d l a t e r w i l l show t h a t m o st o f t h e p r o t e i n s y n t h e s i s a t t h i s
tim e o c c u r r e d i n t h e y o l k
( F ig u r e 1 1 ) .
-4 5 R e p o r ts o f s y n t h e s i s d u r in g i n s e c t d ia p a u s e h a v e b e e n c r i t i c i z e d
b e c a u s e o f t h e p o s s i b l e i n j u r y r e s p o n s e w i t h t h e i n j e c t i o n te c h n iq u e s
used f o r is o to p e in tr o d u c tio n .
H arv ey and W illia m s
(1 9 6 1 ) and S te v e n s o n
and W y att (1962) fo u n d i n c r e a s e s i n p r o t e i n b i o s y n t h e s i s and Og con­
s u m p tio n due t o s u c h w o u n d in g i n t h e d i a p a u s i n g p u p a e o f Eyaloiphova
oeovopia.
The d e s i c c a t i o n - a b s o r p t i o n t e c h n i q u e o f i s o t o p e i n t r o d u c t i o n
u s e d i n t h e p r e s e n t s tu d y a l s o m ig h t c a u s e some i n j u r y t o t h e e g g s r e ­
s u l t i n g i n s t i m u l a t e d m e t a b o l i c a c t i v i t y w h ic h c o u ld m ask n o rm a l e v e n t s .
The e g g s w e re h a n d le d c a r e f u l l y , h o w e v e r , and d e s i c c a t i o n w as c a r e f u l l y
c o n tro lle d .
The d a t a , t h e r e f o r e , a r e th o u g h t n o t to b e i n f l u e n c e d by
i n j u r y r e s p o n s e phenom ena.
R o em hild (1961) n o t e d t h a t a s m a l l p e r c e n ta g e
( e x a c t v a lu e n o t
known) o f A. e V l i o t t l e g g s l o s e t h e c o n n e c tio n b e tw e e n t h e s e r o s a and
t h e h y d r o p y le d u r in g d i a p a u s e .
He fo u n d t h a t t h i s o c c u r r e d i n b o th
c h i l l e d a n d n o n - c h i l l e d e g g s and r e s u l t e d i n a 50 % i n c r e a s e i n r e s p i r a ­
tio n .
I n t h e p r e s e n t s tu d y one sa m p le o f t w e n t y - f i v e s t a g e - 1 9 eggs
i n c u b a t e d 140 d a y s a t 8°C h a d 24 e g g s w i t h o u t t h e h y d r o p y l a r c o n n e c tio n
and one t h a t h a d c o m p le te d b l a s t o k i n e s i s .
I n a n o t h e r 2 5 -e g g sam p le
o f t h e sam e a g e , w h ic h was m a in ta in e d a t 2 5°C , 22 e g g s h a d l o s t t h e co n ­
n e c t i o n and 3 h a d c o m p le te d b l a s t o k i n e s i s .
No em bryos i n o t h e r d ia p a u s e
s a m p le s c o m p le te d b l a s t o k i n e s i s b u t a few (num ber u n d e te r m in e d ) h a d l o s t
t h e i r h y d r o p y la r c o n n e c t io n .
T h e se em bryos w e re s t i l l i n s t a g e 19 and
no m o r p h o lo g ic a l c h a n g e was e v i d e n t .
I t w i l l b e rem em bered t h a t a l l
e g g s w e re im m ersed i n an a q u e o u s i n c u b a t i o n medium f o r 4 d ay s p r i o r t o
—4 6 s a m p lin g .
The ab o v e o b s e r v a t i o n s s u g g e s t t h a t t h e l o n g e r e g g s a r e i n
t h e d i a p a u s e s t a t e t h e m ore s u s c e p t i b l e th e y a r e t o l o s i n g t h e i r h y d r o p y l a r c o n n e c t io n and t h a t t h i s may b e r e l a t e d t o w a t e r a b s o r p t i o n .
R o em h ild (1 9 6 7 ) r e p o r t e d t h a t t h e f l u i d i n t h e e x t r a - s e r o s a l
c o m p a rtm e n t o f A. QVi-Iottv3 w h ic h s u r r o u n d s t h e h y d r o p y la r c o n n e c t io n ,
h a s a h i g h e r o s m o tic p r e s s u r e t h a n t h e f l u i d i n t h e e p i n e u r a l s i n u s .
He fo u n d an o p p o s i t e r e l a t i o n s h i p b e tw e e n t h e t o t a l s o l i d s o f t h e s e
c o m p a rtm e n ts .
The e p i n e u r a l s i n u s c o n ta i n e d h ig h l e v e l s o f p r o t e i n
w h i l e t h e e x t r a - s e r o s a l c o m p a rtm e n t c o n ta i n e d m ore f r e e am ino a c i d s .
The m arked d e c r e a s e i n y o l k p r o t e i n n o t e d from p r e - d i a p a u s e to d i a ­
p a u s e i n t h e p r e s e n t s tu d y c o u ld b e due t o h y d r o l y s i s an d t r a n s f e r o f
some o f t h e p r o d u c t s t o t h e e x t r a - s e r o s a l c o m p a rtm e n t.,
I f such a
p r o c e s s c o n tin u e d d u r in g d ia p a u s e an d e x t e r n a l c o n t a c t w a t e r was
a v a i l a b l e , t h e a c c u m u la tio n o f s m a l l m o le c u le s i n t h e e x t r a - s e r o s a l
c o m p artm en t c o u ld r e s u l t i n h y d r a t i o n due t o o s m o tic phenom ena.
Hy­
d r a t i o n o c c u r r e d i n t h e p r e s e n t s tu d y when e g g s w e re im m e r s e d .f o r 4
d a y s . i n w a t e r a n d valine-C -*-^ d u r in g i s o t o p e i n t r o d u c t i o n .
Eggs m ig h t
b e s u b j e c t e d t o s i m i l a r c o n d i t i o n s o f im m e rsio n d u r in g r a i n y w e a th e r
in th e f i e l d .
The e f f e c t s o f su c h e n v ir o n m e n ta l c o n d i t i o n s on t h e
e m b ry o n ic p h y s io lo g y s h o u ld n o t b e d i s r e g a r d e d .
F o r e x a m p le , l a t e i n
t h e autum n many e g g s i n t h e f i e l d h a v e b e e n a t s t a g e 19 f o r a t l e a s t
s e v e r a l w eeks.
I f h e a v y r a i n s o c c u r r e d a t t h i s tim e e x c e s s i v e h y d r a t i o n
o f t h e eg g c o u ld r e s u l t i n t h e p r e m a tu r e r u p t u r e o f t h e h y d r o p y la r
-
47
-
c o n n e c tio n and b r i n g a b o u t an i n c r e a s e i n r e s p i r a t o r y .r a t e , y o lk r e ­
s e r v e s th e n m ig h t b e d e p l e t e d b e f o r e t h e warm te m p e r a t u r e s n e c e s s a r y f o r
p o s t - d i a p a u s e m o rp h o g e n e s is a r r i v e d , and r e s u l t i n l i m i t e d s u r v i v a l .
U n d er n a t u r a l c o n d i t i o n s t h e o b l i g a t o r y d ia p a u s e p e r i o d o f A.
e l l i o t t i i s te m p o r a l ly a s s o c i a t e d w i t h c o ld e n v ir o n m e n t.
C e rta in
b i o c h e m ic a l t r a n s f o r m a t i o n s c o u ld i n c r e a s e c o l d - h a r d i n e s s i n d i s ­
p e n s in g e g g s .
S in c e f r e e z i n g p o i n t d e p r e s s i o n i s a c o l l i g a t i v e
p r o p e r t y , h y d r o l y s i s o f a l a r g e m o le c u le i n t o i t s
c o n s titu e n t sub­
u n i t s w o u ld d e p r e s s t h e f r e e z i n g p o i n t i n p r o p o r t i o n t o t h e num ber o f
re s id u e s i t
c o n ta in e d .
S e v e r a l w o rk e rs h a v e r e p o r t e d i n c r e a s e s i n
t h e c o n c e n t r a t i o n o f s m a l l m o le c u le s i n t h e d i a p a u s i n g e g g s o f A.
ellio tti.
Bunde (1 9 6 5 ) fo u n d t h a t t h e f r e e am ino a c i d c o n t e n t i n w h o le e g g s
o f A. e l l i o t t i was h i g h e s t d u r in g t h e d ia p a u s e s t a t e .
H igh l e v e l s o f
t r e h a l o s e and m a n n i to l w e re fo u n d t o b e a s s o c i a t e d w i t h t h e y o l k i n
d i a p a u s i n g e g g s o f t h i s s p e c i e s by Q u ic k e n d en (1 9 6 9 , 1 9 7 0 ) .
He a l s o
r e p o r t e d h i g h l e v e l s o f t r e h a l o s e i n t h e em bryo f r a c t i o n o f d ia p a u s i n g
eggs.
A l a r g e i n c r e a s e i n t h e s i z e o f t h e f a t body o f t h e embryo
d u r in g d ia p a u s e was r e p o r t e d by Van H orn ( 1 9 6 3 ).
The f a t body i s
known t o s e r v e a s a s t o r a g e r e s e r v o i r f o r p r o t e i n a c e o u s an d l i p o i d
m a te ria ls .
R e s u l t s o f Svoboda (1964) show ed i n c r e a s e s i n l i p i d i n
em bryos o f ' A., e l l i o t t i d u r in g d i a p a u s e .
H is d a t a show ed t h a t t h e
w e ig h t o f t h e l i p i d e x t r a c t i n s a m p le s c o n t a i n i n g 200 em bryos i n c r e a s e d
-
48
-
fro m 1 2 .9 to 1 9 .6 mg d u r in g t h e f i r s t two m onths o f d ia p a u s e d e v e lo p ­
m e n t.
I n t h e same s a m p le s t h e w e ig h ts o f th e t r i g l y c e r i d e s i n c r e a s e d
fro m 4 .4 t o 8 .0 mg, a lt h o u g h h e e x p l a i n e d t h a t t h i s
v a r i a t i o n i n egg s i z e o r r e s i d u a l s o l v e n t .
c o u ld b e due t o
He a l s o n o t e d t h a t a f t e r ■
t h i n - l a y e r c h ro m a to g ra p h y b o t h em bryo and y o l k show ed s p o t s c o r r e s ­
p o n d in g t o f r e e f a t t y a c i d s .
The R a te o f P r o t e i n S y n t h e s i s i n W hole Eggs and Egg F r a c t i o n s
I n t h i s s tu d y i t was fo u n d t h a t a 4 -d a y a b s o r p t i o n p e r i o d was
n e c e s s a r y to i n t r o d u c e enough valine-C"*"^ i n t o t h e e g g t o show m e a s u r­
a b le i n c o r p o r a t i o n i n t o p r o t e i n .
The c o n c e n t r a t i o n o f v a l i n e - C ^ i n
e a c h s a m p le d i s p l a y e d c o n s i d e r a b l e v a r i a t i o n
(T a b le I I ) .
H ig h e r c o n c e n t r a t i o n s o f l a b e l e d am ino a c i d s i n f r e e amino a c i d
p o o ls s h o u ld r e s u l t i n h i g h e r i n c o r p o r a t i o n o f th e m , up t o a c e r t a i n
s a tu ra tio n lim it.
I n o r d e r t o q u a n t i t a t i v e l y com pare t h e v a lu e s o f
v a l i n e - C - ^ , i t was n e c e s s a r y to c o r r e c t f o r v a r i a t i o n s i n c o n c e n t r a t i o n
due to v a r i a b l e u p t a k e .
I t h a s b e e n fo u n d t h a t t h e r e l a t i o n s h i p b e tw e e n t h e c o n c e n t r a t i o n
o f a l a b e l e d am ino a c i d w i t h i n a sa m p le and t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f
t h e e x t r a c t e d p r o t e i n i n t h e s a m p le s i s
l i n e a r (Hyden an d L a n g e , 1 9 6 8 ),
A ssum ing t h a t t h i s l i n e a r r e l a t i o n s h i p e x i s t s i n t h e e g g s o f A. eZ.
it
can b e s t a t e d t h a t t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f t h e p r o t e i n i n one s a m p le
can b e com pared w i t h t h a t o f o t h e r s a m p le s by d i v i d i n g t h e s p e c i f i c
a c tiv ity
o f t h e p r o t e i n by t h e c o n c e n t r a t i o n o f t h e l a b e l e d amino a c i d
-4 9 p re s e n t.
The c o n c e n t r a t i o n o f v a l i n e - C ^ i n t h e u n e x t r a c t e d sa m p le m a t e r i a l
i s p r o p o r tio n a l to th e s p e c i f ic a c t i v i t y o f t h i s m a te r ia l.
t r a t i o n m e a s u re m e n ts w e re o b t a i n e d a s d e s c r i b e d e a r l i e r .
and t h e s p e c i f i c a c t i v i t y
Concen­
T h e se d a t a
o f th e e x tr a c te d p r o te in as e x p re sse d in th e
f o ll o w i n g r e l a t i o n s h i p :
s p e c i f i c a c t i v i t y o f th e e x tr a c te d p r o te in
s p e c i f i c a c t i v i t y o f u n e x tra c te d m a te r ia l
in c o rp o ra tio n o f th e is o to p e .
.
„ . n_
Si v e
e p e r c e n ag e
T h is a llo w s a l l s a m p le s t o b e com pared
e v e n th o u g h th e y show ed v a r i a b l e u p ta k e o f v a l i n e - C ^ .
The p e r c e n ta g e
i n c o r p o r a t i o n v a lu e s s h o u ld b e p r o p o r t i o n a l t o t h e r a t e o f p r o t e i n
s y n th e s is b e c a u se o f th e l i n e a r r e l a ti o n s h ip d e s c rib e d above.
P r o t e i n was e x t r a c t e d from a l l s a m p le s by a t e c h n i q u e m o d if ie d
fro m W annem acher et_ a l .
v a lin e -C " ^ .
(1 9 6 5 ) t o d e te r m in e t h e i n c o r p o r a t i o n o f
The am ount o f p r o t e i n e x t r a c t e d p e r e g g o r egg f r a c t i o n
i s p r e s e n t e d i n T a b le V I.
T h e se v a lu e s w e re n o t u s e d t o show t h e p r o ­
t e i n c o n t e n t o f e g g s o r eg g f r a c t i o n s b e c a u s e b i u r e t d e t e r m i n a t i o n s
w e re deem ed m ore e f f i c i e n t .
I n c a s e s w h e re t h e am ount o f p r o t e i n e x t r a c t e d was l e s s th a n t h a t
i n d i c a t e d by b i u r e t t e s t i n g t h e p r o t e i n e x t r a c t i o n was assum ed to b e
i n c o m p le t e .
I n t h i s i n s t a n c e t h e am ount o f p r o t e i n p e r eg g o r egg
f r a c t i o n d e t e c t e d by b i u r e t t e s t i n g was d i v id e d i n t o t h e w e ig h t o f t h e
e x t r a c t e d p r o t e i n t o d e te r m in e t h e e q u i v a l e n t num ber o f e g g s , e m b ry o s ,
y o lk s o r s h e l l s i n t h e e x t r a c t e d p r o t e i n .
T h is e n a b le d t h e c a l c u l a t i o n
-5 0 T a b le V I.
The am ount o f p r o t e i n e x t r a c t e d fro m w h o le eg g and egg
f r a c t i o n s a m p le s o f A. eVl'lott-i.
S e r i e s ]C w h o le e g g sa m p le s
S e r i e s I I egg f r a c t i o n sa m p le s
E x tra c te d
p ro te in
Dayage
A v erag e
m g/w hole egg
Day
ag e
E x tra c te d p r o te in
A v erag e
A v erag e
A verage
m g/em bryo m g /y o lk ; U g /s h e ll
P r e -d ia p a u s e eggs a t 2 5 °C
8
15
26
36
36
42
42
52
O-67J
1.38°
.6 0 b
I . 39b
1 .7 6
2 .0 5
0 . 82b
2 .0 3
8
15
16
20
28
35
41
0 .2 8 8
.1 0 6
.1 7 5
23
17
12
78
31
1 .9 1
2 .0 0
2 .0 0
1 .9 4
1 .9 5
2 .0 4
2 .0 0
108
1 .4 7
1 .4 3
1 .6 4
1 .2 6
103
101
99
91
1 .1 0
1 .5 0
1 .5 9
1 .4 6
1 .3 4
94
101
66
D ia p a u s e e g g s a t 8 ° C
26
50
76
140
140a
1 .5 4
2 .0 1
1 .9 5
1 .6 4
1 .6 5
26
45
51
.1 9 0
.2 3 0
.3 0 9
HO
.226
P o s t - d i a p a u s e eg g s a t 25°C
I
3
5
10
15
1 .6 5
1 .6 9
1 .8 0
1 .8 0
1 .8 3
I
3
5
10
15
.2 4 9
,245
.1 8 9
.3 6 2
.4 5 4
89
94
78
T h is sa m p le was m a i n ta i n e d a t 25° C, w h e re a s <a l l o t h e r d ia p a u s e
s a m p le s w e re k e p t a t 8°C.
The o r i g i n a l h o m o g en a te i n t h i s sa m p le was made 0 .3 N i n KOH w h ich
cau sed a lo s s o f p r o te in in th e f i r s t t r i c h l o r o a c e t i c a c id e x tr a c tio n
b u t d id n o t e f f e c t b i u r e t v a lu e s s i n c e a s t a n d a r d c u rv e c o r r e c t e d f o r
KOH was u s e d .
-
51
-
o f dpm p e r egg o r eg g f r a c t i o n s i n c e t h e eg g e q u i v a l e n t o f t h e p r o t e i n
i n t h e c o u n ti n g v i a l was known.
I n c a s e s w h e re t h e w e ig h t o f t h e e x ­
t r a c t e d p r o t e i n was m ore t h a n c o u ld b e a c c o u n te d f o r b y t h e b i u r e t
v a lu e i t was assum ed t h a t p r o t e i n e x t r a c t i o n was c o m p le te b u t t h a t t h e
p r o t e i n was c o n ta m in a te d w i t h some n o n - p r o t e i n m a t e r i a l s .
H ere t h e
a c t i v i t y o f t h e e x t r a c t e d m a t e r i a l was d i v i d e d by t h e egg o r egg f r a c ­
tio n e q u iv a le n t o f th e m a te r ia l b e fo re e x tr a c tio n to o b ta in s p e c i f ic
a c tiv ity
i n p e r eg g o r eg g f r a c t i o n u n i t s .
The d a t a u s e d t o c a l c u l a t e p e r c e n t a g e i n c o r p o r a t i o n i n t h e w h o le
egg s a m p le s o f S e r i e s I a r e p r e s e n t e d i n T a b le V I I .
The e g g s h e l l s
a r e th o u g h t t o a b s o rb o r o t h e r w i s e n o n - s p e c i f i c a l l y b i n d valine-C"*"^
and t h e r e f o r e , t h e i n c o r p o r a t i o n v a lu e s o f w h o le e g g s c a n n o t b e co n ­
s id e re d a c c u ra te .
The a p p a r e n t r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n sa m p le s
o f w h o le e g g s d u r in g p r e - d i a p a u s e r e a c h e d a p e a k a t 36 d ay s o f d e v e lo p ­
m ent a n d d e s c e n d e d t o t h e lo w e s t l e v e l o b s e rv e d d u r in g t h e n e x t 16 d ay s
a t 25°C ( F ig u r e 1 0 ) .
A l l o f t h e e g g s i p t h i s 5 2 - d a y - o l d sa m p le w e re
i n s t a g e 1 9 , t h e m o r p h o lo g ic a l s t a g e m o st c h a r a c t e r i s t i c o f t h e d i a ­
pause s t a t e .
No s t a g i n g d a t a was o b t a i n e d on t h e f i r s t s e v e n p r e ­
d ia p a u s e s a m p le s o f w h o le eg g s o r on t h e s e c o n d p o s t - d i a p a u s e s a m p le .
The r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n w h o le eg g sa m p le s i n c u b a t e d a t 8°C
a p p e a r e d t o i n c r e a s e g r a d u a l l y d u r in g d ia p a u s e d e v e lo p m e n t.
I t w ill
b e n o t e d t h a t t h e p e r c e n t a g e i n c o r p o r a t i o n i s h i g h e s t i n tw o sa m p le s
t h a t w e re i n d i a p a u s e f o r 140 d a y s .
Of t h e s e two s a m p l e s , th e one w i t h
-5 2 T a b le V I I .
The a p p a r e n t r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s 3 i n S e r i e s I w h o le
egg s a m p le s fro m A. e l V L o t t i m e a su re d a s p e r c e n t i n c o r p o ­
r a tio n o f v a lin e -C -^ .
D e s c rip tio n o f eggs
Day
age
S ta g e s
Mean
s ta g e
No. o f
eggs
A v e ra g e
dpHlEpb
egg
W hole egg s a m p le s
A v e ra g e
i
100 % i n c .
S racx
P r e - d i a p a u s e ieggs a t 25°C
8
15
. 26
36
36
42
42
52
19
18 .
13 I
22
25
25
24
18
34
19
838
2 ,2 7 1
6 ,5 9 1
2 9 ,8 1 6
3 2 ,7 7 8
6 ,6 5 9
6 ,0 2 4
2 ,4 1 6
1 2 ,5 6 8
2 9 ,8 0 0
2 4 ,5 9 8
6 0 ,4 0 6
7 6 ,5 3 7
3 2 ,0 4 9
3 9 ,6 7 5
8 8 ,4 7 6
6 .6 7
7 .6 2
2 8 .2 6
4 9 .3 6
4 2 .8 3
2 0 .7 8
1 5 .1 8
2 .7 3
1 7 ,0 3 3
1 ,5 4 4
3 ,0 6 0
9 0 ,8 9 5
3 7 ,9 0 5
1 2 .4 8
1 9 .1 1
3 5 .4 3
4 6 .5 4
5 1 .2 3
4 5 ,3 4 1
7 3 ,1 7 0
9 4 ,0 1 3
8 1 ,9 6 7
3 9 ,6 3 9
6 0 .2 1
5 6 .3 2
5 2 .1 9
5 8 .0 0
9 3 .3 9
D ia p a u s e e g g s a t 8°C
26
50
76
140
140d
19
19
19
1 9 -2 3
1 9 -2 3
19
19
19
2 0 .0
1 9 .6
34
24
25
25
27
2 ,1 2 5 .
295
1 ,0 8 4
4 2 ,6 6 2
1 9 ,4 1 9
.
P o s t - d i a p a u s e e g g s a t 25°C
I
3
5
10
15
2 1 -2 3
no d a t a
2 0 -2 5
2 5 -2 6
2 5 -2 7
2 1 .8
2 2 .6
2 5 .5
2 6 .2
25
25
23
24
25
2 7 ,2 9 9
4 1 ,2 0 8
5 1 ,6 7 9
4 7 ,5 3 7
3 7 ,0 2 0
B e c a u se o f n o n - s p e c i f i c b i n d i n g o f v a l i n e - C ^ by e g g s h e l l s t h e v a l ­
u e s c a n n o t b e c o n s id e r e d r e p r e s e n t a t i v e o f t h e r e a l r a t e o f p r o t e i n
s y n th e s is .
E P -e x tra c te d p r o te i n
U M -u n e x tra c te d m a t e r i a l
T h is sa m p le was m a i n ta i n e d a t 2 5 ° C, w h e re a s a l l o t h e r d ia p a u s e
s a m p le s w e re a t S0C.
IOO
Daysin 8
15
26
36 42
52
26
50
76
140 140
I
3
5
10
15
S ta te -------------- p rediapause---------------------1----------------------- d iap au se------------------------------ 1-------------- postdiapause---------------------
condition of eggs
F ig u r e 10. P e r c e n t i n c o r p o r a t i o n o f v a li n e - C " ^ i n t o p r o t e i n i n S e r i e s I w h o le egg sa m p le s
th r o u g h o u t t h e em bry© g e n e sis o f A. e l l i o t t i .
B roken l i n e s a r e u s e d w h ere t h e tim e p e r i o d
b e tw e e n s a m p le s i s to o g r e a t t o e s t a b l i s h a t r e n d ,
n c - d e n o t e s no c o ld e x p o s u r e .
-5 4 a s l i g h t l y h i g h e r p e r c e n t a g e o f i n c o r p o r a t i o n was m a i n ta i n e d a t
25°C r a t h e r t h a n a t 8°C .
t o 2 5 0C f o r I ,
P o s t - d i a p a u s e s a m p le s t h a t h a d b e e n r e t u r n e d
3 , 5 a n d 10 d ay s m a i n ta i n e d a h ig h l e v e l o f p r o t e i n s y n ­
t h e s i s w i t h no a p p a r e n t i n c r e a s e u n t i l 15 d a y s a t 2 5 ° C h a d e l a p s e d .
A
s h a r p i n c r e a s e i s n o t e d a t t h i s tim e .
The r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n eg g f r a c t i o n s a m p le s from S e r i e s
I I was s i m i l a r t o d a ta o b t a i n e d from t h e s a m p le s o f w h o le e g g s .
P er­
c e n ta g e i n c o r p o r a t i o n i n t h e e m b ry o n ic f r a c t i o n e x h i b i t e d a p e a k d u r in g
p r e - d i a p a u s e a f t e r 35 d a y s o f d e v e lo p m e n t a t 25°C (T a b le V I I I , F ig u r e 1 1 ) .
At 41 d ay s o f d e v e lo p m e n t a m arked d e c r e a s e i n t h e r a t e o f e m b ry o n ic
p r o te in s y n th e s is a p p e are d .
A s l i g h t i n c r e a s e o c c u r r e d a f t e r 26 d ays
i n d ia p a u s e a t 8°C ; h o w e v e r, t h e u p ta k e o f v a l i n e - C
a c tiv ity
14
o f t h e e x t r a c t e d p r o t e i n w e re s o low t h a t i t
say th a t t h i s in c r e a s e i s v a lid
(T a b le V I I I ) .
and th e s p e c i f i c
is
d i f f i c u l t to
The r e m a in in g f r a c t i o n s
o f d ia p a u s e em bryos show ed v e r y low l e v e l s o f p r o t e i n s y n t h e s i s .
The
g ro w th r a t e o f t h e e m b ry o , a s e v id e n c e d by th e a v e r a g e m o r p h o lo g ic a l
s t a g e s i n F i g u r e 1 1 , r e f l e c t s t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s o f th e
em bryo d u r in g p o s t - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t a t 25°C .
The r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s d e t e c t e d i n y o l k f r a c t i o n s from
S e r i e s I I p e a k e d a t a r a t h e r low l e v e l a f t e r 35 d ay s o f p r e - d i a p a u s e
d e v e lo p m e n t a t 25°C ( F ig u r e 1 1 ) .
A f t e r 41 d ay s a t 25°C t h e a v e ra g e
m o r p h o lo g ic a l s t a g e was 1 8 .9 i n d i c a t i n g t h a t m ost o f t h e e g g s h ad
r e a c h e d s t a g e 19 w h ic h i s c h a r a c t e r i s t i c o f d i a p a u s i n g e g g s .
The
T a b le V III . The r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n S e r ie s I I egg f r a c t i o n sam p les from A. e l l i o t t i m easured a s -p e rc e n t i n c o r p o r a tio n .
S ta g e s
Mean
s ta g e
Y olk f r a c t i o n
Embryo f r a c t i o n
D e s c r ip ti o n o f sam p les
Day
ag e
No. o f
eggs
i E
E pa- S
i uilb X 100 = Z I n c .
S h e ll f r a c t i o n
100 = % I n c .
100 = % I * : -
^ I k EP-
P r e - d ia p a u s e e ggs a t . 25°C
20
20
20
46
8
15
16
20
28
35
41
9 -1 2
13-16
1 8-19
26
45
51
HO
19
19
19
19
I
3
5
10
15
19-24
19-24
1 9-24
24-26
2 5-27
1 0 .4
1 4 .6
1 8 .9
86
19
19
19
19
51
47
43
47
2 0 .5
2 0 .6
2 1 .1
2 4 .7
2 6 .0
50
48
41
49
50
48
53
62
281
55
437
1 ,0 0 1
1,3 3 9
2
6
2
6
36
476
199
640
93
713
278
2 ,1 9 5
3 ,1 7 6
1 ,2 3 8
3 ,9 2 2
1 ,7 2 8
8 ,5 3 7
5 ,5 7 8
14 .1 9
2 8 .0 7
4 .1 1
1,319
975
491
443
262
235
439
2 0 ,493
2 5 ,3 5 8
9 ,8 8 7
1 6 ,4 5 4
3,4 1 4
2 ,1 8 0
1 2 ,950
6 .4 4
3 .8 4
■ 4 .9 7
2 .6 9
7 .6 7
1 0 .7 8
3 .3 9
594
487
709
5 ,0 8 1
95
721
3 ,4 1 8
2,3 2 6
3,2 7 4
2 ,1 1 0
8,2 3 0
618
1,4 9 9
1 0 ,150
25.94
14.87
33.60
61 .7 4
15.37
48.10
33.60
716
1,616
1,5 4 0
5 ,0 4 3
15 .9 2
35.64
5 .5 2
22 .5 5
356
1 ,0 6 8
546
1,977
810
1 ,4 7 1
1 ,9 9 1
3,9 2 4
43.95
72.60
27.42
50 .3 8
43 .2 2
35.69
40 .3 1
43 .8 9
5 8 .1 1
11,484
1 0 ,020
1 1 ,284
1 5 ,469 .
9,5 3 5
2 2 ,8 4 7
1 6 ,7 6 1
19,365
24,242
18,327
50 .2 6
59 .7 8
58.27
6 3 .8 1
52 .0 3
D ia p au se e ggs a t 8:°c
.
5 .5 6
1 .2 6
1 .0 1
.9 4
114
576
85
1,1 3 7
P o s t- d ia p a u s e e ggs a t: 25°C
aE P - e x tr a c te d p r o t e i n
^ U M -u n ex tra cte d m a t e r i a l
7 .5 1
18 .1 8
16.09
2 5 .7 1
5 6 .9 4
7,396
4 ,1 4 7
12,985
6 ,0 8 4
5 ,9 1 8
1 7 ,113
11,620
32,209
13,862
10,185
---------- Cf
Stage
Days in 8
State-------
15
20
10.4
28
----- prediapause
diapause
postdiapause
condition of eggs
F ig u r e 1 1 . P e r c e n t i n c o r p o r a t i o n o f v a li n e - C
i n t o p r o t e i n i n S e r i e s I I egg f r a c t i o n
s a m p le s th r o u g h o u t t h e e m b ry o g e n e s is o f A. e l l i o t t i . E m bryo-A , y o l k —O , s h e l l —D . B roken
l i n e s i n d i c a t e t h a t t h e tim e p e r i o d b e tw e e n s a m p le s i s to o g r e a t t o e s t a b l i s h a t r e n d .
-
57
-
p e r c e n t a g e o f i n c o r p o r a t i o n d e c r e a s e d i n t h e y o lk f r a c t i o n a t t h i s t i m e ,
a lth o u g h n o t a s s h a r p l y as i t d i d i n t h e em bryo f r a c t i o n .
D u rin g t h e
f i r s t 26 d ay s o f d i a p a u s e d e v e lo p m e n t a t 8°C t h e y o l k f r a c t i o n e x h i b i t e d
a h ig h e r r a te o f p r o te in s y n th e tic a c t i v i t y
th a n t h a t n o te d d u r in g p r e ­
d i a p a u s e , and a f t e r 45 d a y s a t 8°C , t h i s r a t e h a d m ore th a n d o u b le d .
A f t e r 51 d a y s a t 8°C , t h e p e r c e n ta g e o f i n c o r p o r a t i o n i n t h e y o lk f r a c ­
t i o n show ed an a b r u p t d e c r e a s e .
The y o l k i n t h e 1 1 0 - d a y - o ld d ia p a u s e
sa m p le h a d an i n c o r p o r a t i o n v a lu e o f 25 %.
The y o l k f r a c t i o n d i s p l a y e d
a h ig h r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s d u r in g p o s t - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t a t
25°C .
The p e r c e n t a g e o f i n c o r p o r a t i o n v a lu e s o b t a i n e d f o r t h e S h e l l
f r a c t i o n e x h i b i t e d w id e v a r i a t i o n d u r in g p r e - d i a p a u s e and d ia p a u s e
d e v e lo p m e n t ( F ig u r e 1 1 ) .
The o l d e s t d ia p a u s e s a m p le s and a l l o f t h e
p o s t - d i a p a u s e s a m p le s show ed m ore c o n s i s t e n t and h i g h i n c o r p o r a t i o n
v a lu e s .
I t w i l l b e r e c a l l e d t h a t t h e s h e l l was t h o u g h t t o b i n d t h e
iso to p e n o n -s p e c ifi c a l l y .
I n t h e f o ll o w i n g d i s c u s s i o n o f i n f o r m a t io n
o b t a i n e d on t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n w h o le e g g s and egg f r a c ­
t i o n s , a t t e m p t s t o d e te r m in e t h e n a t u r e o f t h e a s s o c i a t i o n o f v a lin e - C ^ ^
w ith th e s h e l l w i l l b e d e s c rib e d .
M e asu re m e n ts o f t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s a r e c o m p lic a te d by
t h e s im u lta n e o u s b rea k d o w n o f p r o t e i n a n d r e u t i l i z a t i o n o f breakdow n
p ro d u c ts .
The f o u r - d a y a b s o r p t i o n p e r i o d f o r i s o t o p e i n t r o d u c t i o n u s e d
i n t h e p r e s e n t s tu d y g i v e s am ple tim e f o r s u c h p r o c e s s e s t o r e i n ­
c o rp o ra te th e is o to p e .
H ow ever, t h e c o n tin u o u s s u p p ly o f i s o t o p e t o
-5 8 t h e eg g d u r i n g t h i s t i m e s h o u l d c o u n t e r a c t t h e e f f e c t o f p r o t e i n b r e a k ­
down somew hat and s i n c e " t o t a l " p r o t e i n was e x t r a c t e d t h e r e c y c l i n g
o f t h e i s o t o p e fro m one p r o t e i n m o l e c u l e t o a n o t h e r w o u ld n o t r e s u l t
i n c o m p le te ly f a l l a c i o u s v a lu e s .
Ambiguous r e s u l t s
a l s o may b e o b t a i n e d w i t h t h e u s e o f C ^ - o r
O
H - l a b e l e d am ino a c i d s b e c a u s e o f n o n - s p e c i f i c b i n d i n g o f t h e amino
a c i d s t o p r o t e i n s and o t h e r c e l l u l a r c o n s t i t u e n t s
(H a u ro w itz , 1 9 63).
D e te c tio n te c h n iq u e s used in m o n ito rin g th e r a t e o f p r o te i n s y n th e s is
a r e s u b j e c t t o t h i s phenom enon.
L iq u id s c i n t i l l a t i o n
c o u n tin g i s a
s e n s i t i v e t e c h n i q u e and a l l o w s t h e d e t e c t i o n o f v e r y s m a l l am ounts o f
ra d io a c tiv ity .
F o r e x a m p l e , t h e s p e c i f i c a c t i v i t y o f d i a p a u s e embryos
was o n l y 2 - 6 dpm p e r embryo ( T a b le V I I ) .
W h e th e r s u c h a s m a l l amount
of a c t i v i t y r e p r e s e n ts p r o te in b io s y n th e s is or j u s t n o n - s p e c if ic b in d in g
o f v a line-C -t-^ t o a p r o t e i n i s unknow n, a l t h o u g h i t seem s t h a t n e c e s s a r y
m a i n t e n a n c e f u n c t i o n s c o u l d a c c o u n t f o r a t l e a s t t h a t much i n c o r p o r a t i o n
o f valine-C "*-^ .
R e la tiv e ly h ig h s p e c i f i c a c t i v i t y v a lu e s
s h e ll fra c tio n s
( T a b le V I I ) .
(dpm/s h e 11) w e re fo u n d i n
T h e s e h i g h v a l u e s seem more s i g n i f i c a n t
when one c o n s i d e r s t h a t e a c h s h e l l c o m p r i s e s l e s s t h a n 5 % o f t h e w h o le
eg g d r y w e i g h t
( T a b le I I I ) .
A c r i d i d egg s h e l l s a r e r e p o r t e d t o b e n o n ­
ce l l u l a r w h i l e p r o t e i n s y n t h e s i s h a s a lw a y s b e e n fo u n d t o b e a s s o c i a t e d
w ith c e l l u l a r s tr u c tu r e s .
Although* an i n t e n s i v e s t u d y o f A. eVl-totti-
egg s h e l l s h a s n o t b e e n p e r f o r m e d , g e n e r a l i n f o r m a t i o n a b o u t t h e e g g
-5 9 s h e l l s o f o t h e r a c r i d i d s h a s b e e n p r e s e n t e d by S l i f e r
(1951) and H a r t l e y
( 1 9 3 7 ) , M athee .
(1961).
I t a p p e a r s t h a t t h e o n l y c e l l s t h a t c o u l d r e m a in a s s o c i a t e d w i t h
t h e A. e V H o tti, egg s h e l l a f t e r f r a c t i o n i n g w o u ld b e t h e h y d r o p y l a r
c e l l s and p o s s i b l y f r a g m e n t s o f t h e c e l l u l a r s e r o s a .
As m e n tio n e d
e a r l i e r , i n c r e a s e s i n d r y w e i g h t and p r o t e i n d u r i n g p r e - d i a p a u s e
( F i g u r e s 3 an d 7) p r o b a b l y i n d i c a t e t h e d e p o s i t i o n o f t h e s e r o s a l
c u t i c l e s d u rin g t h i s p e rio d .
The h i g h s p e c i f i c a c t i v i t y i n t h e p r o ­
t e i n f r a c t i o n o f th e s h e l l d u rin g p r e - d i a p a u s e c o u ld be a t t r i b u t e d to
p ro te in sy n th e sis in s e ro s a l c e ll s .
D u r in g d i a p a u s e an d p o s t - d i a p a u s e
no c h a n g e s a r e n o t e d i n t h e d r y w e i g h t o r p r o t e i n c o n t e n t o f t h e s h e l l
o t h e r th a n a d e c re a s e i n dry w e ig h t j u s t b e f o r e h a tc h i n g .
A lth o u g h i t
was o b s e r v e d t h a t t h e s e r o s a no l o n g e r h a s c o n t a c t w i t h m o st o f t h e
s h e l l as i t d id d u rin g p r e - d ia p a u s e , th e s p e c i f i c a c t i v i t y o f th e m ater
i a l i n t h e s h e l l e x t r a c t was s t i l l v e r y h i g h .
H a rtle y
(1961) h a s shown t h a t t h e c h o r i o n s o f n e w l y - l a i d eg g s i n
s e v e n a c r i d i d s p e c i e s a r e c o n s t r u c t e d o f a c o m p l i c a t e d meshwork as
d e sc rib e d in th e in tr o d u c tio n to th e p re s e n t stu d y .
Soon t h e s e r o s a l
c u t i c l e s a r e l a i d down a n d t h e s e l a y e r s become t h e p r i n c i p l e w a l l o f
t h e a c r i d i d egg ( S l i f e r , 1 9 3 7 ; E d n e y , 1 9 5 7 ; and H a r t l e y , 1 9 6 1 ) .
S life r
(1946) h a s shown t h a t w a t e r a b s o r p t i o n o c c u r s t h r o u g h a s p e c i a l i z e d
r e g i o n o f t h e p o s t e r i o r e n d c a l l e d t h e h y d r o p y l e i n t h e e g g o f M.
d iffe re n tia lis.
M athee (1951) s t a t e s t h a t t h i s s t r u c t u r e i s s e c r e t e d
—
60
—
by t h e s p e c i a l i z e d h y d r o p y l a r c e l l s o f t h e s e r o s a i n Loaustana
Ipavdalina.
He f i n d s t h a t c y t o p l a s m i c f i l a m e n t s fro m t h e s e c e l l s f o l l o w
s m a l l p o r e c a n a l s i n t h e w h i t e c u t i c l e w h ic h l e a d d i r e c t l y t o l a r g e r ,
p o re c a n a ls i n th e o u te r o r y e llo w c u t i c l e .
He a l s o d e p i c t s p o r e c a n a l s
i n t h e s e r o s a l c u t i c l e s i n t h e r e m a i n d e r o f t h e egg s h e l l .
I f s u c h an
a r r a n g e m e n t e x i s t s i n A. e l l i o t t i t h e n v a l i n e - C ^ ^ c o u l d b e t r a p p e d i n
th ese c a n a ls.
M athee (1951) d i d n o t f i n d a waxy l a y e r b e tw e e n t h e
w h i t e and y e l l o w p o r t i o n s o f t h e s e r o s a l c u t i c l e i n t h e h y d r o p y l e r e g i o n
in d ic a tin g th a t th is
a re a i s s p e c ia liz e d fo r w ater a b s o rp tio n .
i n t e r e s t i n g to n o te th a t S l i f e r
It is
(19 4 6 ) p r o p o s e d t h a t a wax l a y e r w a s ■
s e c r e t e d o v e r t h e h y d r o p y l e r e g i o n o f M. d i f f e r e n t i a l ' s e g g s t o p r e ­
v e n t d e s ic c a tio n d u rin g d iap a u se .
M a th e e (1951) fo u n d t h a t a p r o t e i n ­
a c e o u s l a y e r was s e c r e t e d by t h e h y d r o p y l e c e l l s o f L. p a rd a lin a and
t h a t i t b e h a v e d l i k e a k e r a t i n membrane i n p r e v e n t i n g d e s i c c a t i o n a t
low h u m i d i t i e s .
At ,250C t h i s p r o t e i n was s e c r e t e d a f t e r 16 t o 18 days
o f d e v e lo p m e n t .
I t w o u ld a p p e a r t h a t s u c h a phenomenon may b e o p e r a t ­
i n g i n e g g s o f A. e l l i o t t i s i n c e r e s i s t a n c e t o d e s i c c a t i o n d e v e lo p s
a f te r a s im ila r p e rio d
( T a b le I I ) .
M athee (1951) a l s o n o t e d t h a t t h e
p r o t e i n d i s s o l v e s o r d is a p p e a rs b e f o r e o r s im u lta n e o u s ly w ith w a te r ab­
so rp tio n .
In th e p r e s e n t s tu d y i n c r e a s e s i n w e ig h t w ere n o te d i n a l l
s a m p le s d u r i n g t h e a b s o r p t i o n p e r i o d , i n d i c a t i n g t h a t t h e r e was no
b a r r i e r to w a te r u p ta k e .
i n A. e l l i o t t i
S ince, t h e h y d r o p y l a r c e l l s a r e few i n num ber
( R o e m h ild , 1961) and t h e amount o f p r o t e i n a c e o u s m a t e r i a l
—6 1 —
s e c r e t e d w o u ld b e v e r y s m a l l i i t seem s u n l i k e l y ' t h a t s u c h a phenomenon
c o u l d b e ■r e s p o n s i b l e f o r m ore t h a n a s m a l l p o r t i o n o f t h e . r a d i o a c t i v i t y
n o t e d i n t h e e x t r a c t e d p r o t e i n fro m t h e s h e l l .
The f o r m a t i o n o f t a n n e d
l i p o p r o t e i n :i n t h e y e l l o w c u t i c l e an d p r o t e i n - c a r b o h y d r a t e c om plexes i n
t h e w h i t e c u t i c l e .c o u ld a c c o u n t ,fo r c o n s i d e r a b l e i n c o r p o r a t i o n o f
v a l i n e - C"*-^ d u r i n g t h e f o r m a t i o n o f t h e s e s t r u c t u r e s i n e a r l y p r e - d i a ­
p ause d ev e lo p m en t;
H ow ever, h i g h p e r c e n t a g e i n c o r p o r a t i o n v a l u e s w e r e
o b s e r v e d t h r o u g h o u t e m b ry o g e n es.is
( T a b le V I I , F i g u r e 9 ) .
The b e s t h y p o ­
t h e s i s , b a s e d on w h a t i s known a b o u t a c r i d i d egg s h e l l s , s u g g e s t s t h a t
m o l e c u l e s may b e t r a p p e d o r bo u n d w i t h i n t h e s e s t r u c t u r e s .
To d e t e r m i n e t h e s t a t e o f t h e a s s o c i a t i o n o f t h e v a l i n e - C ^ i n
t h e s h e l l j e g g s h e l l s w e r e rem oved fro m 50 p o s t - d i a p a u s e e g g s and
p l a c e d i n an i n c u b a t i o n medium c o n t a i n i n g v a l i n e - C ^
fo r 4 days:
P ro­
t e i n , was e x t r a c t e d u s i n g t h e m eth o d s r e p o r t e d e a r l i e r and was m o n i t o r e d
for ra d io a c tiv ity .
The s p e c i f i c a c t i v i t y was a l m o s t i d e n t i c a l t o t h a t
o f t h e s h e l l f r a c t i o n s i n w h ic h w h o le e g g s w e re - i n c u b a t e d i n v iv o
T h i s was s s t r o n g i n d i c a t i o n t h a t t h e i s o t o p e w a s ■n o n - s p e c i f i c a l l y
bound o r t r a p p e d b y . t h e s h e l l .
I n a n o t h e r e x p e r i m e n t t h e s h e l l s w e re
rem oved fro m a g ro u p o f p o s t v d i a p a u s e e g g s and b o i l e d f o r t h r e e m i n u t e s .
Then t h e y w e r e im m ersed f o r two d a y s . i n a s o l u t i o n o f v a l i n e - C - ^ co n ­
t a i n i n g a n t i b i o t i c s t o p r e v e n t p r o t e i n s y n t h e s i s by m i c r o o r g a n i s m s .
P r o t e i n e x t r a c t e d from t h e s e s h e l l s showed t h a t l e s s t h a n 0 , 6 % o f t h e
i s o t o p e o r i g i n a l l y p r e s e n t i n t h e i n c u b a t i o n medium was a s s o c i a t e d w i t h
—6 2 —
th e e x tr a c te d p r o te in .
T h i s low a c t i v i t y may mean t h a t t h e b o i l i n g
d i s r u p t e d c e r t a i n s t r u c t u r a l a l i g n m e n t s o f t h e s h e l l w h ic h w o u ld n o r ­
m ally t r a p v a l i n e .
The same p r o c e d u r e was u s e d t o e x t r a c t p r o t e i n from
s a m p le s o f em bryos and y o l k .
S i m i l a r low a c t i v i t y v a l u e s w e re o b t a i n e d
i n d i c a t i n g t h a t t h e e x t r a c t i o n t e c h n i q u e was good and t h a t o n l y i n s i g ­
n i f i c a n t n o n - s p e c ific b in d in g of v a lin e o ccurred in th e se m a t e r i a ls .
S i n c e t h e v a l u e s f o r t h e s h e l l f r a c t i o n p r o b a b l y do n o t r e p r e s e n t
a t r u e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s , i t seem s c l e a r t h a t t h e w h o le egg
v a l u e s w o u ld b e a f f e c t e d .
I t can b e s e e n , h o w e v e r , t h a t h i g h r a t e s o f
p r o t e i n s y n t h e s i s c o in c i d e n t w ith m ajo r m o rp h o g en etic change a re n o t
m asked by t h i s b i n d i n g phenom enon.
F o r e x a m p le , a s h a r p i n c r e a s e i n
t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s was n o t e d i n w h o le e g g s a t 36 days o f
p r e - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t i n F i g u r e 10 and was a l s o p r e s e n t i n t h e em­
b r y o f r a c t i o n and t o a l e s s e r d e g r e e i n t h e y o l k f r a c t i o n
(F ig u re 1 1 ).
T h e s e f r a c t i o n s w o u ld n o t b e a f f e c t e d by t h e n o n - s p e c i f i c b i n d i n g o f
v a l i n e - C"*-^ by egg s h e l l s .
The m o r p h o l o g i c a l s t a g e s o f t h e embryos i n
t h e s e eg g f r a c t i o n s a m p l e s r a n g e d fro m s t a g e 13 t o 16 and t h e a v e r a g e
s t a g e was 1 4 . 6 .
From s t a g e s 13 to . 16 many o r g a n s , t i s s u e s and c e l l s
a r e d i f f e r e n t i a t i n g i n A. e l l i - o t t i .
Van Horn (1963) o b s e r v e d d i f f e r ­
e n t i a t i o n o f th e e n d o s k e l e ta l e le m en ts a t t h i s tim e , i n c l u d in g th e
a n t e r i o r an d p o s t e r i o r arms o f t h e t e n t o r i u m , t h e m e t a t h o r a c i c apodemes
o f t h e f e m u r , t h e c o x a l apodemes and t h e m a n d i b u l a r a p o d e m e s.
a ls o n o ted th e d i f f e r e n t i a t i o n of th e corpora a l l a t a ,
v e n t r a l h e a d g l a n d s and s a l i v a r y g l a n d s a t t h i s t i m e .
She
co rp o ra c a rd ia c a ,
T racheal
-63d i v e r t i c u l a , o e n o c y te s , n e rv e g a n g l i a , s e n se o rg a n s j M a lp ig h ia n t u b u l e s ,
r e c t a l p a d s a n d s p l a n c h n i c - m u s c u l a t u r e a l s o show d i f f e r e n t i a t i o n d u r i n g
s t a g e s 13 t o 16.
When t h e embryo r e a c h e s s t a g e 19 m o r p h o g e n e t i c a c t i v i t y a p p e a r s t o
cease.
Most e m b ry o s -d o n o t r e a c h t h i s s t a g e o f d e v e lo p m e n t u n t i l a f t e r
40 d ay s i n the, p r e - d i a p a u s e s t a t e
(Van H o rn , 1 9 6 6 a ) .
F i g u r e s 10 and 11
show a m arked d e c l i n e i n p e r c e n t a g e i n c o r p o r a t i o n from 36 t o 42 da y s o f
d e v e lo p m e n t i n p r e - d i a p a u s e f o r t h e w h o le e g g , embryo f r a c t i o n and y o l k
f r a c t i o n sam p les,
A w h o l e ■e g g s a m p le t h a t ha d b e e n a t 25°C f o r 52 d ay s
showed a v e r y low r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s .
A l l o f t h e em bryos i n
t h e s a m p le w e re s t a g e 19 a n d - a p p a r e n t l y w e re i n d i a p a u s e .
I t w o u ld - b e
o f i n t e r e s t ,.to know how l o n g t h i s low l e v e l o f p r o t e i n s y n t h e s i s wouldp e r s i s t i n e g g s n o t - .e xposed t o t h e c o l d .
A l l - s a m p l e s e x c e p t one i n
the. p r e s e n t s t u d y w e r e p l a c e d a t S0C f o r d i a p a u s e d e v e lo p m e n t .
A fter
140 da y s o f d i a p a u s e d e v e lo p m e n t a t 25°C t h i s w h o l e ■egg s a m p le showed
a h i g h r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s s i m i l a r t o a c o m p a r a b le s a m p le w i t h
c o ld e x p o su re .
T h i s may b e b e c a u s e a l l o f the e g g s i n t h e s e s a m p le s
h a d l o s t t h e i r .h y d r o p y l a r c o n n e c t i o n an d i t i s p re s u m e d h a d e l e v a t e d
re sp ira to ry r a te s .
The i n c r e a s e i n r e s p i r a t o r y r a t e r e p o r t e d t o b e
a s s o c i a t e d w i t h t h i s phenomenon (Roem hiTd, 1961) may b e r e l a t e d t o t h e
h i g h r a t e -o f p r o t e i n s y n t h e s i s s e e n i n w h o le e g g s a n d , m ore s p e c i f ­
i c a l l y , th e y o lk f r a c tio n .
—6 4 D isc E l e c t r o p h o r e s is
Changes i n t h e m o rp h o lo g y and p h y s i o l o g y i n em bryos o f A. QVLvott-I
s h o u l d b e r e f l e c t e d i n t h e c o m p o s i t i o n o f e m b ry o n ic p r o t e i n and y o l k
p ro te in .
Such c h a n g e s h a v e b e e n d e t e c t e d i n t h i s s t u d y by e l e c t r o ­
p h o r e t i c m eans.
The num ber and p a t t e r n o f c o n j u g a t e d p r o t e i n b a n d s
w e r e s t u d i e d t o i n d i c a t e w h e t h e r p r o t e i n was com p le x ed w i t h o t h e r m e t a ­
b o lite s.
I n c r e a s e s i n t h e num ber o r s t a i n i n g i n t e n s i t y o f s u c h b a n d s
may i n d i c a t e t h e i m p o r t a n c e o f t h e s e m e t a b o l i t e s d u r i n g d e v e lo p m e n t.
E l e c t r o p h o r e s i s was p e r f o r m e d a s d e s c r i b e d e a r l i e r t o d e t e r m i n e
t h e p a t t e r n o f p r o t e i n b a n d s c h a r a c t e r i s t i c o f 40 % s u c r o s e - s o l u b l e
e m b ry o n ic p r o t e i n , 40 % s u c r o s e - s o l u b l e y o l k p r o t e i n and 0 . 6 N KCls o l u b l e y o lk p r o t e i n d u r in g each m ajo r d e v e lo p m en ta l p e r i o d .
t h a n h a l f o f t h e y o l k was s o l u b l e i n 40 % s u c r o s e .
s o l u b l e i n 0 . 6 N K C l.
L ess
The r e m a i n d e r was
The num ber o f g e l s u s e d t o d e t e r m i n e t h e p a t t e r n s
c h a r a c t e r i s t i c o f p r e - d i a p a u s e , d i a p a u s e and p o s t - d i a p a u s e i s shown
a b o v e e a c h g e l d i a g r a m i n -F ig u re s 1 2 , 13 and 14.
used f o r :
S e p a r a t e g e l s w e re
( I ) g e n e r a l p r o t e i n s t a i n i n g w i t h A m id o -S c h w a rz ; (2) " p o l y ­
s a c c h a r i d e " d e t e c t i o n w i t h t h e p e r i o d i c a c i d - S c h i f f r e a c t i o n ; and (3)
l i p o p r o t e i n s t a i n i n g w i t h Sudan B la c k B .
Only s t r o n g l y p o s i t i v e PAS
bands w i l l be d is c u s s e d s in c e th e s p e c i f i c i t y of t h i s r e a c ti o n i s
q u e stio n a b le .
A s t r o n g r e a c t i o n i s g i v e n by compounds w i t h 1 , 2 -
g l y c o l g r o u p s s u c h a s a l p h a - g l y c e r o p h o s p h a t e , m a n n i t o l and m u sc le
g l y c o g e n , w h i l e s e ru m a lb u m in and c a s e i n a l s o r e a c t
(G u rr, 1958).
8 gels
12 gels
-*#*
- ++
I
ON
Ln
I
////////////Z
- + +
11m m i n
- +++
- + +
- 4 +++, * **
pr edi apaus e
di a p a u s e
postdiapause
F i g u r e 12. The e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f 40 % s u c r o s e - s o l u b l e embryo p r o t e i n d u r i n g t h e
e m b r y o g e n e s is o f A. e l l i o t t i and an i n d i c a t i o n t h a t some o f t h e p r o t e i n b a n d s a r e c o n j u g a t e d
w ith carb o h y d ra te a n d /o r l ip o i d m a te r ia l.
O rig in
— , p e rio d ic a c i d - S c h if f - p o s it i v e —(4),
Sudan B la c k B - p o s i t i v e — ( * ) , t r a c k i n g dye— TB. The number o f ( + ) o r (■*•) sy m bols i n d i c a t e
sta in in g in te n s ity .
The num ber o f g e l s u s e d t o d e t e r m i n e e a c h p a t t e r n i s e n c l o s e d above ea ch
d ia g r a m .
25 gels
12 gels
112 gels
- +
2120-
19 18-L
!67>
1514-
+
ht +
**
13-
I
Ox
OX
++
+ +
12-F
Il - ' / / / / / / /
10
I
- + +
9
8-p
7-
- +
6-
54'
3 -1.
21
I I
prediapause
+ + + ,* * *
+ + +,***
I-+ + ++,****
I- ++++
d ia pa use
postdiapause
F i g u r e 13. The e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f 40 % s u c r o s e - s o l u b l e y o l k p r o t e i n d u r i n g t h e
e m b r y o g e n e s i s o f A. e l l v o t t i . and an i n d i c a t i o n t h a t some o f t h e p r o t e i n b a n d s a r e c o n j u g a t e d
w ith c a rb o h y d ra te a n d /o r l i p o i d m a t e r i a l .
O r i g i n *«=— , p e r i o d i c a c i d - S c h i f f - p o s i t i v e — ( + ) ,
Sudan B la c k B - p o s i t i v e — ( * ) , t r a c k i n g dye— TB. The num ber o f ( + ) o r ( * ) sy m b o ls i n d i c a t e
sta in in g in te n s ity .
The num ber o f g e l s u s e d t o d e t e r m i n e e a c h p a t t e r n i s e n c l o s e d above each
d ia g r a m .
9 gels
12 gels
9 gels
TD-
IO-
8
- +
9-
-+
-
7-
- + +
8-
- +
6-
- 4 ,**
**
5-
-+, **
***
4
+
Wm
- + +■+-
B
L+ + 4 - ,* * * *
- + + +, * * * *
2-
3 -:
I
I ) m/I
M h + ,t*
Li'' i
m m m .
- T
+,***
< ----
prediapause
diapause
postdiapause
F i g u r e 14.
The e l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f 0 . 6 N KC! - s o l u b l e y o l k p r o t e i n d u r i n g t h e
e m b r y o g e n e s i s o f A. e l l i o t t i and an i n d i c a t i o n t h a t some o f t h e p r o t e i n b a n d s a r e con­
ju g a te d w ith carb o h y d ra te a n d /o r l ip o i d m a te r ia l.
O rig in <— , p e r i o d i c a c i d - S c h i f f p o s i t i v e — ( + ), Sudan B la c k E - p o s i t i v e — ( * ) , t r a c k i n g dye— TD. The number o f ( + ) o r
( * ) sy m b o ls i n d i c a t e t h e s t a i n i n g i n t e n s i t y .
The sym bols w i t h ( a ) o r (b) s u p e r s c r i p t s
r e p r e s e n t c a r b o h y d r a t e a n d / o r l i p o i d p o s i t i v e a r e a s i n w h ic h no p r o t e i n was d e t e c t e d .
—6 8 —
Some t e s t s and o b s e r v a t i o n s r e l a t i n g t o t h e s p e c i f i c i t y o f t h i s r e ­
a c tio n w i l l be d isc u s s e d l a t e r .
D i a p a u s i n g em bryos d i s p l a y e d 3 more p r o t e i n b a n d s t h a n d i d p r e ­
d i a p a u s e o r p o s t - d i a p a u s e em bryos
(F ig u re 1 0 ).
The num ber o f i n t e n s e l y
P A S - p o s i t i v e b a n d s i n t h e embryo i n c r e a s e d by one fro m p r e - d i a p a u s e
to d iap au se.
O nly one l i p i d - p o s i t i v e b a n d o f h i g h m o b i l i t y was p r e s e n t
i n p r e - d i a p a u s e and p o s t - d i a p a u s e e m b ry o s .
T h r e e new l i p i d - p o s i t i v e
b a n d s o f low m o b i l i t y w e r e o b s e r v e d i n d i a p a u s e , no n e o f w h ic h c o r r e ­
l a t e d w ith th e f a s t band n o te d above.
T w en ty -tw o p r o t e i n b a n d s w e re d e t e c t e d i n 40 % s u c r o s e - s o l u b l e
y o lk d u rin g d ia p a u se .
in p o s t - d iap au se y o lk
Only 16 w e re fo u n d i n p r e - d i a p a u s e y o l k and 19
(F ig u re 1 3 ).
The t h r e e f a s t e s t b a n d s i n p r e ­
d i a p a u s e and d i a p a u s e y o l k a r e t h o u g h t t o b e i d e n t i c a l w i t h b a n d s 1 4 ,
15 and 16 shown i n t h e p r e - d i a p a u s e embryo g e l d ia g r a m o f F i g u r e 12.
T h e r e w e r e two s t r o n g P A S - p o s i t i v e b a n d s i n 40 % s u c r o s e - s o l u b l e y o l k
d u r i n g p r e - d i a p a u s e , f o u r d u r i n g d i a p a u s e and t h r e e i n p o s t - d i a p a u s e .
F i g u r e 13 shows t h a t t h e num ber o f Sudan B la c k B - p o s i t i v e b a n d s i n ­
c r e a s e d fro m 2 t o 5 d u r i n g t h e t r a n s i t i o n from p r e - d i a p a u s e t o d i a p a u s e
w h ile p o s t-d ia p a u s e y o lk had 6 bands.
The p r o t e i n o f t h e y o l k t h a t was s o l u b l e i n 0 . 6 N KCl e x h i b i t e d
10 p r o t e i n b a n d s i n p r e - d i a p a u s e and 8 i n d i a p a u s e and p o s t - d i a p a u s e
y o lk (F ig u re 1 4 ).
I t a p p e a r s t h a t up t o 3 b a n d s i n b o t h t h e a r e a s o f
low a n d h i g h m o b i l i t y i n 0 . 6 N K C l - s o l u b l e y o l k a l s o a r e p r e s e n t i n 40 %
—
su c ro s e -s o lu b le y o lk .
69
—
The p r o b le m o f d e t e r m i n i n g w h e t h e r t h e b a n d s o f
i n t e r m e d i a t e m o b i l i t y f ro m 0 . 6 N K C l- s o l u b l e y o l k p r o t e i n c o r r e s p o n d •
w i t h c e r t a i n a r e a s i n g e l p a t t e r n s d e r i v e d from 4 0 % s u c r o s e - s o l u b l e
y o lk i s c o m p lic a te d by th e f a c t t h a t th e s e bands a p p a re n tly r e p r e s e n t
m ore t h a n o n e . p r o t e i n .
Wang and P a t t o n (1 9 6 8 ) fo u n d t h a t some p r o t e i n
b a n d s i n th e . l a r v a l hemolymph o f Gi InelloneU a3 A. domestiaus and T.
moI-Hqt w e r e p o s i t i v e f o r a s many a s f i v e d i f f e r e n t c o n j u g a t e d p r o t e i n s .
Some b a n d s w e r e b o t h PAS- and l i p i d - p o s i t i v e i n t h e p r e s e n t s t u d y .
T h i s i s shown by t h e p r e s e n c e o f b o t h . (+) and ( X ) sy m b o ls b e s i d e t h e s e
b a n d s . i n F i g u r e s 1 2 , 13 and 1 4 .
Two h e a v i l y s t a i n e d b a n d s w e re fo u n d
i n t h e 0 , 6 N K C l- s o I u b I e y o l k t h r o u g h o u t d e v e lo p m e n t ( F i g u r e 1 4 ) .
They
a p p a r e n t l y r e p r e s e n t , t h e m a j o r . p r o t e i n s o f t h e y o l k and a r e l i p o p r o t e i n
i n n a t u r e , a l t h o u g h e a c h b a n d a l s o g a v e a p o s i t i v e PAS- r e a c t i o n . . The
s y m b o ls (+a ) and ( -I^) i n F i g u r e 14 r e p r e s e n t a r e a s o f weak PAS and l i p i d
s t a i n i n g i n w h ic h no p r o t e i n . b a n d . w a s d e t e c t e d by Am ido-Schw arz s t a i n i n g .
T h i s may mean t h a t t h e r e was no p r o t e i n p r e s e n t o r t h a t the- amount w a s '
t o o low t o b e d e t e c t e d .
The l a t t e r a p p e a r s t o b e t h e c a s e s i n c e p r o t e i n
b a n d s i n t h e s e a r e a s d i d s t a i n i n g e l s from o t h e r d e v e l o p m e n t a l p e r i o d s .
The a r e a m a rk e d (+a ) i n t h e g e l , d i a g r a m f o r p r e - d i a p a u s e y o l k c o r r e s ­
ponds w ith band 5 o f th e d ia p a u s e g e l.
The g e l d i a g r a m f o r d i a p a u s e
y o l k h a s two l i p i d p o s i t i v e a r e a s m ark e d ( ^ )
d e te c te d .
i n w h ic h no p r o t e i n was
T h e s e a r e a s ,c o r r e s p o n d w i t h b a n d s 2 .and 3 i n t h e g e l d i a g r a m
f o r p r e - d i a p a u s e y o l k and b a n d s I and 2 o f t h e g e l d i a g r a m f o r p o s t ­
d iap au se y o lk .
-7 0 L i p i d - p o s i t i v e a r e a s w e re i n d i c a t e d by t h e a f f i n i t y o f Sudan B la c k
B dye f o r l i p i d m a t e r i a l .
Humason (1967) h a s n o t e d t h a t Sudan B la c k B
i s t h e m o st s e n s i t i v e o f t h e l i p i d d y e s .
The PAS r e a c t i o n a l s o i s
s e n s i t i v e b u t do e s n o t a p p e a r t o b e v e r y s p e c i f i c .
The PAS t e c h n i q u e
u s e d i n t h i s s t u d y was t h e same a s t h a t u s e d by Wang and P a t t o n
(1 9 6 8 ).
They f o u n d l a r g e n um bers o f P A S - p o s i t i v e p r o t e i n b a n d s i n i n s e c t hemolymph f o l l o w i n g e l e c t r o p h o r e s i s .
L a r g e num bers o f P A S - p o s i t i v e b a n d s
a l s o w e r e f o u n d i n t h e p r e s e n t s t u d y , a n d some g e l s w e r e fo u n d t o g i v e
a p o s i t i v e r e a c ti o n f o r every p r o t e i n band.
H a u r o w itz
(1963) h a s
s t a t e d t h a t m o s t , i f n o t a l l , p r o t e i n s c o n t a i n s m a l l am ounts o f c a r b o ­
h y d rate .
W h e th e r t h i s i s t r u e o r n o t , t h e r e a r e s e v e r a l s t r u c t u r e s
o t h e r t h a n t h o s e common t o c a r b o h y d r a t e s t h a t c a n e l i c i t a p o s i t i v e
PAS r e a c t i o n
( B a rk a an d A n d e r s o n , 1 9 6 5 ; G o r m o r i , 1 9 5 2 ) .
The s t r u c t u r e s
o f i n t e r e s t in th e p re s e n t stu d y a re th o se a s s o c ia te d w ith p r o te in s .
B a r k a and A n d e rs o n (1 9 6 5 ) h a v e t h e o r i z e d t h a t c e r t a i n am ino a c i d s i n
p r o t e i n s c o u l d g i v e a p o s i t i v e PAS r e a c t i o n .
To t e s t t h i s , t h e
f o llo w in g p r o t e i n s w ere s u b j e c t e d to e l e c t r o p h o r e s i s i n d i v i d u a l l y in
t h e p r e s e n t . s t u d y ; r i b o n u c l e a s e , D -am ino a c i d o x i d a s e , p e p s i n and
b o v i n e s e ru m a lb u m i n .
Each gave a p o s i t i v e PAS r e a c t i o n a l t h o u g h t h e
bands w ere n o t i n t e n s e l y c o lo r e d and a p p e are d s lo w ly .
I t a l s o was
n o t e d t h a t c e r t a i n P A S - p o s i t i v e b a n d s i n t h e e m b ry o n ic p r o t e i n and y o l k
p r o t e i n a p p e a r e d r a p i d l y and w e re i n t e n s e l y c o l o r e d .
b e e n d e s i g n a t e d by t h r e e o r f o u r
These bands have
(+) sy m b o ls and a r e assum ed t o b e
-7 1 con j u g a t ed. p r o t e i n s c o n t a i n i n g a - s i z e a b l e " p o l y s a c c h a r i d e " m o i e t y .
Weak P A S - p o s i t i v e b a n d s t h a t a p p e a r e d s l o w l y a r e d e s i g n a t e d w i t h one
o r two (+) s y m b o l s .
T h e s e .a re a s a re n o t c o n sid e red to be r e p r e s e n ta ­
t i v e o f p r o t e i n s c o n ju g a te d w ith " p o ly s a c c h a r id e s " i n th e fo llo w in g
d i s c u s s i o n , s i n c e i t h a s b e e n shown t h a t p r o t e i n s n o t t h o u g h t t o b e
c o n j u g a t e d w i t h a s i z e a b l e p r o s t h e t i c g ro u p can g i v e t h i s t y p e o f a
re a c tio n .
It is
r e c o g n iz e d t h a t s m a ll q u a n t i t i e s o f a p r o t e i n con­
t a i n i n g c a r b o h y d r a t e s may a p p e a r i n t h i s g r o u p .
The g e l s s h o w in g e m b r y o n ic p r o t e i n and y o l k , p r o t e i n ha.d 4 c o r r e s ­
p o n d in g bands d u rin g d ia p a u s e .
They a r e . y o l k b a n d s 1 , 2 , 4
e m b r y o n ic b a n d s I , 2 , 3
T h is i s
and 5 .
and 5 and
c o n s is te n t w ith th e id e a t h a t .
p r o t e i n s . a r e b e i n g s y n t h e s i z e d i n t h e y o l k and t r a n s f e r r e d t o t h e embryo
d u rin g d ia p a u se .
F e l d h e r r (1962) s t u d i e d t h e u t i l i z a t i o n o f y o l k p r o ­
t e i n i n H.\ o e e w p i a t h r o u g h o u t e m b r y o g e n e s i s and s u g g e s t e d t h a t some
p r o t e i n s r e l e a s e d fro m t h e . y o l k w e r e i n c o r p o r a t e d u n m o d i f i e d i n t h e
em bryo.
B a r t h and B a r t h (1 9 5 4 ) h a v e s u g g e s t e d t h a t t h e s t o r a g e pro--
t e i n o f y o l k from f r o g e g g s p r o b a b l y i s n o t b r o k e n down an d t h a t some
p r e f a b r i c a t e d s t r u c t u r a l p r o t e i n s o f t h e y o l k m ay ,b e i n c o r p o r a t e d •
u n c h a n g e d i n t o t h e em bryo.
I n A., etZ-tottii. t h e t r a n s f e r o f i n t a c t p r o ­
t e i n s fro m t h e y o l k t o t h e embryo c o u l d a c c o u n t f o r some o f t h e
i n c r e a s e i n t h e e m b r y o n ic p r o t e i n c o n t e n t o b s e r v e d d u r i n g t h e f i r s t
50 d a y s o f d i a p a u s e d e v e lo p m e n t ( F i g u r e 6 ) .
Two l i n e s o f e v i d e n c e
s u g g e s t t h a t p e p t i d e s o r p r e f o r m e d p r o t e i n may b e t r a n s f e r r e d from t h e
-7 2 —
y o l k t o t h e em bryo.
F irst,
t h e r a t e a t w h ic h valine-C-*-^ was i n c o r ­
p o r a t e d i n d i c a t e s t h a t p r o t e i n s y n t h e s i s i n t h e embryo was low d u r i n g
d i a p a u s e • ( F i g u r e 1 1 ) , a l t h o u g h t h e r e was a m arked i n c r e a s e i n e m b ry o n ic
p r o te in c o n te n t
m e n t.
( F i g u r e 6) d u r i n g t h e f i r s t 50 d a y s o f d i a p a u s e d e v e l o p ­
S e c o n d i a g r e a t e r num ber o f p r o t e i n b a n d s a p p e a r e d i n b o t h
embryo an d y o l k f r a c t i o n s d u r i n g d i a p a u s e and s o m e .o f t h e new y o l k
b a n d s a p p e a r e d t o c o r r e s p o n d -w i t h new embryo b a n d s
( F i g u r e s 12 a n d . 1 3 ) .
The- p r e s e n t s t u d y i n d i c a t e s t h a t u n l a b e l e d y o l k p r o t e i n , i s t r a n s f e r r e d
t o t h e embryo d u r i n g t h e f i r s t 50 d a y s o f d i a p a u s e w h i l e n e w - l a b e l e d
p r o te i n i s b e in g s y n th e s iz e d i n . t h e y o lk .
fo llo w in g o b s e r v a tio n s :
T h i s i s s u p p o r t e d by t h e
(I) th e h ig h r a t e of p r o te in s y n th e s is in th e
y o l k d u r i n g t h e f i r s t 45 da y s o f d i a p a u s e d e v e l o p m e n t ,a n d t h e low r a t e
o f p r o t e i n s y n t h e s i s i n t h e embryo a t . t h i s
tim e ( F i g u r e 1 1 ) ;
(2) t h e
i n c r e a s e i n p r o t e i n c o n t e n t o f w h o l e : e g g s . d u r i n g t h e f i r s t 50 days o f
d i a p a u s e d e v e lo p m e n t ( F i g u r e s 5 and 6) ; (3) t h e i n c r e a s e i n e m b ry o n ic
p r o t e i n c o n t e n t d u r i n g t h e same p e r i o d
( F i g u r e 7 ) ; and (4) t h e a p p e a r ­
a n c e ,of new c o r r e l a t i n g p r o t e i n b a n d s i n b o t h embryo a n d y o l k d u r i n g
d iap au se
( F i g u r e s 12 a n d 1 3 ) .
The l a r g e a m o u n t .o f p r o t e i n n o t e d i n .
t h e f l u i d o f t h e e p i n e u r a l s i n u s i n d i a p a u s i n g A.-. eVlXotti. embryos ,by
R o em hild (1967) i s
consonant w ith t h i s id e a .
F u r t h e r c o m p a r is o n s o f p r o t e i n b a n d s i n t h e g e l s fro m d i f f e r e n t
d e v e lo p m e n ta l p e r i o d s a r e d i f f i c u l t and i n t e r p r e t a t i o n s u n c e r t a i n ,
s in c e g re a t .d iffe re n c e s e x is t in th e g e n e ra l p a tte r n s
fo r p re-d iap a u se .
-7 3 d i a p a u s e a n d p o s t - d i a p a u s e , em bryos and y o l k . '
Not e n ough i s known
a b o u t .;t h e c h a r a c t e r , o r f u n c t i o n o f t h e A m ido-Schw arz s t a i n e d p r o t e i n s
t o r e l a t e them
t o any s p e c i f i c e v e n t .
t e i n s have been p a r t i a l l y
H o w ever, some c o n j u g a t e d p r o ­
c h a ra c te riz e d w ith regard to t h e i r l i p i d or
" p o l y s a c c h a r i d e " c o n t e n t , an d t h e r e f o r e , t h e num ber a n d i n t e n s i t y o f
t h e s e b a n d s may, i n d i c a t e c h a n g e s i n t h e l e v e l s o f -.th e s e m a t e r i a l s i n th e egg.
P r o t e i n - c a r b o h y d r a t e c o m p le x es w e r e s u g g e s t e d t o c o m p r i s e a
m a j o r p o r t i o n o f t h e y o l k i n o o c y t e s o f A. e t t y e t t i - on t h e b a s i s o f
h isto ch em ieal te s t s
( L e o p o ld , 1 9 6 7 ) .
PAS s t a i n i n g o f - e l e c t r o p h o r e t i c -
a l l y s e p a r a t e d y o l k p r o t e i n , i n th e , p r e s e n t -study a l s o s u g g e s t e d t h e
p r e s e n c e o f a c o n s i d e r a b l e amount o f . t h i s m a t e r i a l ; h o w e v e r , l i p o ­
p r o t e i n s may c o m p r i s e a g r e a t e r p o r t i o n o f t h e y o l k .
The l a t t e r
s u g g e s t i o n i s b a s e d on t h e p r e d o m in a n c e o f l i p o p r o t e i n - p o s i t i v e a r e a s
i n t h a t p o r t i o n o f t h e y o l k w h ic h was n o t s o l u b l e i n 40 % s u c r o s e b u t .
was s o l u b l e i n 0 . 6 N K C l.
I t w i l l b e rem em bered t h a t t h i s p o r t i o n
r e p r e s e n t s o y e r 50 % o f t h e y o l k f r a c t i o n .
D ejm al and B ro o k e s (1968)
fo u n d t h a t a b o u t 80 % o f t h e y o l k p r o t e i n o f Leuopphaea maderae was
s o l u b l e i n s a l i n e a t an i o n i c s t r e n g t h o f 0 . 4 o r g r e a t e r .
These p r o ­
t e i n s m i g r a t e d a s .5 b a n d s d u r i n g e l e c t r o p h o r e s i s , a l t h o u g h m o s t , o f t h e
p r o t e i n a p p e a r e d i n one b a n d w h i c h ,w a s i d e n t i f i e d a s l i p o p r o t e i n .
The h y d r o l y s i s o f p r o t e i n - c a r b o h y d r a t e c o m p le x es i n t h e d i a p a u s i n g
egg o f A. e t t i o t t i , h a s b e e n s u g g e s t e d by. Bunde (1965) a s a m echanism
—74—
f o r t h e i n c r e a s e i n f r e e amino c o n t e n t .and by Q u ic k e n d e n (1969) a s an
e x p la n a tio n fo r th e in c re a s e in tr e h a lo s e .
U rban (1 9 7 0 ) h a s n o t e d p r o ­
t e a s e a c t i v i t y i n . t h e s e r o s a a n d y o l k •fro m eg g s o f A. e t l i o t t i d u r i n g
d ia p a u s e t h a t c o u ld a f f e c t th e s e ch an g es.
In th e p r e s e n t stu d y
" p o l y s a c c h a r i d e - p o s i t i v e " ^ p r o t e in b a n d s a p p e a r e d t o i n c r e a s e i n num ber
and q u a n t i t y i n t h e 40 % s u c r o s e - s o l u b l e y o l k f r a c t i o n fro m p r e - d i a ­
pause to d iap au se
(F ig u re 1 1 ).
P a r t i a l h y d r o l y s i s o f t h e s e c om plexes
c o u l d b e r e s p o n s i b l e f o r t h e i n c r e a s e i n t h e num ber o f y o l k p r o t e i n
bands.
N o th in g d e f i n i t e can be a s c e r t a i n e d i n t h i s r e g a r d e x c e p t t h a t
s u c h m o l e c u l e s and t h e enzymes t o d e g r a d e them a r e p r e s e n t .
I t h a s b e e n s u g g e s t e d t h a t c a r b o h y d r a t e s , p r o t e i n s and f a t s a r e
u t i l i z e d i n t h a t o r d e r d u rin g e m b ry o g en esis
(Needham, 1 9 3 1 ) .
The
i m p o r t a n c e o f c a r b o h y d r a t e s o r p r o t e i n s a s an e n e r g y s o u r c e d u r i n g
e m b r y o g e n e s i s i s r a t h e r o b s c u r e f o r A. e l l i o t t i .
Q u ic k e n d e n (1 9 6 9 ,
1970) fo u n d s l i g h t e a r l y and l a t e u t i l i z a t i o n o f g l y c o g e n i n A. e l l i o t t i
b u t c o u l d n o t c o n c l u d e t h a t t h i s m o i e t y was an i m p o r t a n t e n e r g y s o u r c e
f o r em b ry o g en esis.
I n t h e p r e s e n t s t u d y an i n c r e a s e i n t h e p r o t e i n
c o n t e n t o f t h e embryo d u r i n g t h e f i r s t 50 da y s o f d i a p a u s e was f o l l o w ­
e d by d e c r e a s i n g l e v e l s o f p r o t e i n .
T h i s may mean t h a t some p r o t e i n
i s u t i l i z e d by t h e embryo d u r i n g d i a p a u s e , h o w e v e r , t h e a c t u a l u t i l i z ­
a t i o n o f p r o t e i n a s an e n e r g y s o u r c e c a n n o t b e sh o w n .
The i m p o r t a n c e o f f a t s d u r i n g i n s e c t e m b r y o g e n e s i s h a s b e e n n o t e d
by s e v e r a l w o r k e r s .
The amount o f l i p i d d e c r e a s e s by m ore t h a n o n e -
-
75
-
h a l f d u r i n g e m b r y o g e n e s i s i n Bonibyx ( W i l l i a m s , 1967) and i n M.
d iffe re n tia lis
in f a tty
(S l i f e r , 1930) .
S l i f e r a ls o n o ted a g ra d u a l d ecrease
a c id s d u rin g p o s t- d ia p a u s e .
C o n sid e ra b le e v id e n c e has accrued
f o r t h e a c c u m u l a t i o n o f f a t s i n t h e embryo d u r i n g d i a p a u s e i n A.
e tlio tti-.
The o b s e r v a t i o n s o f Van Horn (1963) and t h e d a t a o f Svoboda
(1964) h a v e b e e n d i s c u s s e d i n t h i s r e s p e c t .
K a o c h a r e r n (1958) h a s
n o t e d t h e a c c u m u l a t i o n o f f a t i n t h e embryo o f M. d i f f e v e n t i a l i s d u r i n g
d iap a u se .
R e s u l t s p r e s e n t e d e a r l i e r i n t h e p r e s e n t s t u d y • ( F i g u r e 12)
showed t h a t 3 new l i p o p r o t e i n b a n d s a p p e a r e d i n d i a p a u s e e m b ry o s . ■P r e ­
d i a p a u s e an d p o s t - d i a p a u s e e m b r y o n ic p r o t e i n h a d o n l y one l i p o p r o t e i n
band (F ig u re 1 2 ).
T h r e e new l i p o p r o t e i n band.s a p p e a r e d i n d i a p a u s e
y o l k a n d one a d d i t i o n a l b a n d was fo u n d i n p o s t - d i a p a u s e y o l k .
T h e se
f i n d i n g s c o u l d mean t h a t l i p i d s a c c u m u l a t e i n . t h e embryo d u r i n g d i a ­
p a u s e and w e r e u t i l i z e d d u r i n g p o s t - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t .
Svoboda
(1964) fo u n d t h a t c o n s i d e r a b l e l i p i d m a t e r i a l was u t i l i z e d d u r i n g
p o s t - d i a p a u s e i n e g g s o f A. e l l i o t t i .
and o f o t h e r s
R e s u lts o f th e p r e s e n t stu d y
(S v o b o d a , • 19 6 4 ; B u n d e , 19.65; Q u i c k e n d e n 5 1969) con­
c e r n i n g p o s s i b l e e m b r y o n ic m e t a b o l i t e s i n A. e'LZiott'i e s t a b l i s h no
d e f i n i t e sequence o f u t i l i z a t i o n
fo r c a rb o h y d ra te s, p ro te in s or f a t s ,
b u t i t a p p e a r s t h a t l i p i d s a r e t h e m o st i m p o r t a n t e n e r g y s o u r c e ,
e s p e c i a l l y d u rin g p o s t- d ia p a u s e .
SUMMARY
P r o t e i n s i n t h e e g g o f A. e tX V o ttt w e re s t u d i e d ' t h r o u g h o u t
em b ry o g en esis.
eg g f r a c t i o n s
Q u a n t i t a t i v e a n a l y s e s w e r e made on w h o le e g g s and
(em b ry o , y o l k and s h e l l ) .
A q u a l i t a t i v e stu d y of
e m b r y o n i c .p r o te i n and y o lk p r o t e i n d u r in g em bryogenesis in v o lv e d th e
e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f t h e s e p r o t e i n s and a p a r t i a l c h a r a c t e r ­
i z a t i o n o f ,those, c o n j u g a t e d w i t h c a r b o h y d r a t e o r l i p o i d m a t e r i a l .
The
m a j o r f i n d i n g s and c o n c l u s i o n s a r e e n u m e r a t e d b e l o w .
1.
The p r o t e i n c o n t e n t . o f t h e embryo i n c r e a s e d g r a d u a l l y d u r i n g p r e ­
d i a p a u s e d e v e lo p m e n t an d t h e p e r c e n t a g e o f p r o t e i n i n th e - e m b r y o was
h i g h u n t i l a d e c l i n e was n o t e d a f t e r 41 da y s o f p r e - d i a p a u s e d e v e l o p ­
m ent a t 25°G.
2.
An i n c r e a s e i n t h e p r o t e i n c o n t e n t o f w h o le e g g s , a n d embryos was
fo u n d d u r i n g t h e f i r s t 50 d ay s o f d i a p a u s e d e v e lo p m e n t a t 8°C.
3.
A m arked d e c r e a s e i n t h e p e r c e n t a g e o f p r o t e i n i n embryos and a
c o n c u r r e n t i n c r e a s e i n p r o t e i n c o n t e n t was o b s e r v e d d u r i n g t h e t r a n s ­
i t i o n fro m p r e - d i a p a u s e t o d i a p a u s e d e v e l o p m e n t .
T his i n d ic a te d t h a t
an i n c r e a s e i n t h e a m o u n t .o f n o n - p r o t e i n m a t e r i a l i n t h e embryos o c ­
c u r r e d a t - t h a t ,time.,
A d e c r e a s e i n t h e p r o t e i n c o n t e n t o f w hole -e g g s -
a n d t h e y o l k f r a c t i o n o b s e r v e d a t -t h i s t i m e s u g g e s t s t h e h y d r o l y s i s o f
p r o t e i n - c a r b o h y d r a t e c o m p le x es an d t h e t r a n s f e r o f t h e p r o d u c t s fo t h e
em bryo.
The t r a n s f e r o f i n t a c t p r o t e i n s fro m t h e y o l k t o t h e embryo
was i n d i c a t e d b y the- o b s e r v a n c e o f 4 b a n d s i n t h e e l e c t r o p h o r e t i c a l l y
-
77-
s e p a r a t e d p r o t e i n o f b o t h em bryos and y o l k t h a t h a d i d e n t i c a l m o b i l i t e s .
4.
The p r o t e i n c o n t e n t o f w h o le e g g s and t h e embryo f r a c t i o n d e ­
c r e a s e d g r a d u a l l y a f t e r 50 days o f d i a p a u s e d e v e lo p m e n t .
T h i s may mean
t h a t some p r o t e i n i s u t i l i z e d as an e n e r g y s o u r c e a t t h i s t i m e .
The
p r o t e i n c o n t e n t o f em bryos i n c r e a s e d s h a r p l y a f t e r 10 d a y s o f p o s t ­
d i a p a u s e d e v e lo p m e n t a t 25°C.
M ost o f t h e s e embryos h a d c o m p le te d
b l a s t o k i n e s i s and t h e r e f o r e , may h a v e re su m e d m i t o t i c a c t i v i t y a t t h i s
t im e a s n o t e d p r e v i o u s l y by R o e m h ild ( u n p u b l i s h e d r e s e a r c h d a t a ) .
5.
The r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s d u r i n g p r e - d i a p a u s e was h i g h e s t i n
w h o le e g g s an d em bryos a t a b o u t 35 d a y s o f d e v e lo p m e n t .
Van Horn (1963)
h a s fo u n d t h a t many t i s s u e s and o r g a n s a r e d i f f e r e n t i a t i n g a t t h i s t i m e .
6.
Embryos e x h i b i t e d a low r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s d u r i n g d i a p a u s e
d e v e lo p m e n t w h i l e t h e y o l k f r a c t i o n y i e l d e d h i g h v a l u e s .
Whole egg
s a m p le s d i s p l a y e d a g r a d u a l , b u t - m a r k e d i n c r e a s e d u r i n g t h i s p e r i o d .
I t was s u g g e s t e d t h a t t h e l o s s o f t h e h y d r o p y l a r c o n n e c t i o n i n d i s ­
p e n s i n g e g g s may c a u s e an i n c r e a s e i n t h e r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s .
I.
A h i g h r a t e o f p r o t e i n s y n t h e s i s d u r i n g p o s t - d i a p a u s e d e v e lo p m e n t
was o b s e r v e d i n w h o le e g g s , em bryos and y o l k and a d e f i n i t e i n c r e a s e
occurred a f t e r b la s to k in e s is .
8,
The s h e l l f r a c t i o n i s t h o u g h t t o n o n - s p e c i f i c a l l y b i n d o r t r a p
v a lin e 9.
The e l e c t r o p h o r e t i c s e p a r a t i o n o f e m b ry o n ic p r o t e i n and y o l k
p r o t e i n showed t h a t t h e g r e a t e s t num ber o f p r o t e i n b a n d s w e r e r e s o l v e d
-
in d iap au se m a te r ia l.
78
-
P a r t i a l h y d ro ly s is of y o lk p r o te in re s e rv e s •
w i t h t h e s u b s e q u e n t t r a n s f e r o f some o f t h e p r o d u c t s t o t h e embryo
c o u l d p r o d u c e t h i s phenom enon.
10.
The p r e s e n c e o f - p r o t e i n - c a r b o h y d r a t e . and l i p i d - p r o t e i n c om plexes
was i n d i c a t e d by t h e p r e s e n c e o f -PAS- p o s i t i v e and Sudan B la c k Bp o s i t i v e b a n d s i n e l e c t r o p h o r e t i c a l l y s e p a r a t e d e m b r y o n i c . p r o t e i n and '
y o lk p r o te in .
11 .
New l i p o p r o t e i n b a n d s a p p e a r e d i n e m b ry o n ic p r o t e i n and y o l k
p r o t e i n d u r i n g d i a p a u s e d e v e lo p m e n t .
One a d d i t i o n a l new b a n d p o s i t i v e
f o r l i p o p r o t e i n a p p e a r e d i n p o s t - d i a p a u s e . y o l k s o l u b l e i n 40 % s u c r o s e .
12 .
O ver 50 % o f t h e y o l k was i n s o l u b l e i n 40 % s u c r o s e b u t was d i s ­
s o lv e d i n 0 .0 N K C l.
to be lip o p r o te in .
T h i s m a t e r i a l c o n t a i n e d two m a j o r b a n d s t h o u g h t
LITERATURE•CITED
A g re ll, I.
1 952.
The a e r o b i c an d a n a e r o b i c u t i l i z a t i o n o f m e t a b o l i c
e n e r g y d u r i n g i n s e c t m e t a m o r p h o s i s . A c t a p h y s i o l , s c a n d . 28;
306-335.
A g re ll, I.
1 964. P h y s i o l o g i c a l a n d b i o c h e m i c a l c h a n g e s d u r i n g i n s e c t
d e v e lo p m e n t .
I n : The P h y s i o l o g y o f • I n s e c t a . • Ed.' M. R o c k s t e i n .
JL: 9 1 - 1 4 8 . . A c a d e m i c . P r e s s , New Y o rk .
A n d e r s o n , N. L.
v e g e ta tio n .
1964.
Some r e l a t i o n s h i p s b e tw e e n g r a s s h o p p e r s and
Ann. e n t . S o c . Am. 51_: 7 3 6 -7 4 2 .
A n d e r s o n , N. L. a n d H a s t i n g s , E.
1966.
Some n o t e s on r e a r i n g AulooaTa
e l l l o t t i - ( O r t h o p t . e r a : A c r i d i d a e ) . . Ann. e n t . S o c . Am. 59 :
718-719.
A r o n o f f , S . . 195 6 . T e c h n iq u e s o f R a d i o b i o c h e m i s t r y ,
S t a t e U n iv . P r e s s , Ames, Iow a. .
A s h b e l , R.
p . 61.
Iowa
1 930.
Sul ric a m b io g a s s o s o ,d e l l a nova d i b a c h i . d a s e t a
P r o t o p l a s m a JLL: 9 7 , c i t e d by L e e s , A. D. 1955
The P h y s i o l o g y ' o f D i a p a u s e i n A r t h r o p o d s . p . 9 0 .
C am bridge U n i v .
P r e s s , London.
(Bombyx mori L . ) .
B a r k a , T. a n d A n d e r s o n , P . J :
1965. H is to c h e m is try : T h e o ry , P r a c t i c e
and B i b l i o g r a p h y ,
p . 73. H a r p e r and Row, New Y o rk .
B a r t h , L. G. and B a r t h , L., J .
1 954. The E n e r g e t i c s o f D e v e lo p m e n t:
a s tu d y o f m eta b o lism i n th e f ro g egg.
117 p p . • C o lum bia U n i v .
P r e s s , New Y o r k :
B o d i n e , J . H. ■ 1 929.
F a c t o r s i n f l u e n c i n g t h e r a t e o f r e s p i r a t o r y m e ta ­
b o l i s m o f a d e v e l o p i n g eg g ( O r t h o p t e r a ) . P h y s i o l . Z o o l . J2: 4 5 9 -
482.
B o d i n e , J . H,
1946.
U ric a c id fo rm a tio n in th e d ev e lo p in g e g g .o f th e
g r a s s h o p p e r , Melanoplus d i f f e T e n t i a l i s .
P h y s i o l . Z o o l . JL9J: 5 4 66.
B o d i n e , J . H. and F i t z g e r a l d , L. R.
1 948. T h e - c o p p e r c o n t e n t o f an
eg g and i t s d i s t r i b u t i o n d u r i n g t h e d e v e lo p m e n t o f t h e embryo
( O r t h o p t e r a ) . • J . exp1. Z o o l . 1 0 9 : 1 8 7 - 1 9 5 .
—
80—
B o d i n e , J . H. and W o lk i n , J . E.
1 934.
o f a d e v e l o p i n g egg ( O r t h o p t e r a ) .
I r o n c o n t e n t and o x i d a t i o n r a t e s
P h y s i o l . Z o o l . Tj 4 6 4 - 4 6 9 .
B o e l l , E. J . 193 5 .
R e s p i r a t o r y q u o t i e n t s d u r i n g e m b r y o n ic d e v e lo p m e n t
( O r t h o p t e r a ) . J . c e l l . comp. P h y s i o l . 6 : 3 5 7 - 3 6 6 , c i t e d by A g r e l l ,
I.
1 964. P h y s i o l o g i c a l an d b i o c h e m i c a l c h a n g e s d u r i n g i n s e c t
d e v e l o p m e n t . I n : The P h y s i o l o g y o f I n s e c t s .
Ed. M. R o c k s t e i n .
I:
91-148.
A cadem ic P r e s s , New Y o rk .
B u n d e , D. E.
1 965.
F r e e amino a c i d c o n t e n t and b i o s y n t h e s i s i n eg g s
o f t h e g r a s s h o p p e r Aulooava e l l i o t t i (Thomas) d u r i n g d e v e lo p m e n t .
P h .D . T h e s i s M o n t a n a S t a t e C o l l e g e , Bozeman.
65 p p .
B u n d e , D. E. an d P e p p e r , J . H.
1968.
B i o s y n t h e s i s and o c c u r r e n c e o f
f r e e am ino a c i d s i n e g g s o f t h e g r a s s h o p p e r , Aulooava ell'lott'L.
J . I n s e c t P h y s io l. 14:
1 6 3 5 -1 6 4 9 .
B u r k h o l d e r , J . R.
1 934. A q u a n t i t a t i v e s t u d y o f r e s p i r a t o r y m e t a b o l i s m
i n s i n g l e d e v e l o p i n g e g g s ( O r t h o p t e r a ) . P h y s i o l . Z o o l . _7: 2 4 7 270.
B u s h , E. T. an d H a n s e n , D. L.
1965.
Im provem ent o f l i q u i d s c i n t i l ­
l a t i o n c o u n t i n g e f f i c i e n c i e s by o p t i m i z a t i o n o f s c i n t i l l a t o r
co m p o sitio n .
In:
R a d i o i s o t o p e Sample M e asurem ent T e c h n iq u e s
i n M e d ic i n e and B i o l o g y ,
pp. 395-408.
I n t e r n a t i o n a l Atom ic
E n e rg y A g e n c y , V ie n n a .
C h e f u r k a , W. 1 965.
I n t e r m e d i a r y m e t a b o l i s m o f n i t r o g e n o u s and l i p i d
compounds i n i n s e c t s .
I n : The P h y s i o l o g y o f I n s e c t a .
Ed. M.
Rocks t e i n .
2_: 6 7 0 - 7 5 7 .
Chen, P . S . 1966. Amino a c i d and p r o t e i n m e t a b o l i s m i n i n s e c t d e v e l o p ­
m e n t. ' Adv. I n s e c t P h y s i o l . _3 : 5 3 - 1 3 2 .
D a v e n p o r t , H. A.
1960.
H i s t o l o g i c a l and H i s t o c h e m i c a l T e c h n i c s ,
186. W. B. S a u n d e rs C o . , P h i l a d e l p h i a .
D a v i s , B. J .
121(2):
1964. D i s c e l e c t r o p h o r e s i s .
404-427.
Ann. N. Y. A cad. S c i .
D e jm a l , R. K. and B r o o k e s , V. J ;
1968.
S o l u b i l i t y and e l e c t r o ­
p h o r e tic p r o p e r tie s of o v a r ia l p r o te in of th e c o ck ro ach ,
Leuooiphaea madevae. J . I n s e c t P h y s i o l . 14_(3) : 3 7 1 - 3 8 1 .
p.
-
81
-
Demja n o w s k i , S . Y . , V a s i l y e v a , N. V. a n d K o n ik o v a , A. S. 1 9 5 2 .
I n v e s t i g a t i o n o f t h e p r o t e i n m e t a b o l i s m o f t h e o a k s i l k moth
(Anthevaea 'pevnyi-) w i t h t h e h e l p o f r a d i o a c t i v e m e t h i o n i n e .
B i o c h e m i s t r y , U . S . S . R . JL7: 5 2 9 - 5 3 5 , c i t e d by H a r v e y , W. R.
1 9 6 2 . M e ta b o l is m o f i n s e c t d i a p a u s e .
A. Rev. E n t . _7: 4 7 - 8 0 .
Duke, E. J .
1 966.
Lymph p r o t e i n p a t t e r n s i n t h e d e v e lo p m e n t o f
Comp. Biochem . P h y s i o l .
661-664.
Loeusta mtgvatov-La Tnigvatoviotdes.
17 (2 ):
E d n e y , E. B.
109 p p .
1957.
The W a te r R e l a t i o n s o f T e r r e s t r i a l A r t h r o p o d s .
C am bridge U n i v . P r e s s , London.
F e l d h e r r , A. B.
1 962.
P r o t e i n y o l k u t i l i z a t i o n i n c e c r o p i a moth
em bryo. D i s s . A b s t r . 2_3: 4787.
G i l m o u r , D.
1 965.
The M e ta b o l is m o f I n s e c t s .
F reem an and C o . , San F r a n c i s c o .
195 p p .
G om ori, G.
1952. M i c r o s c o p i c H i s t o c h e m i s t r y ,
C h ic a g o P r e s s , C h ic a g o .
p p . 273.
W. H.
U n iv . of
G o r n a l l , A. G . , B a r d a w i l l , C. J . and D a v i d , M. M. 1 9 4 9 . D e te r m in ­
a t i o n o f s e ru m p r o t e i n s by means o f t h e b i u r e t r e a c t i o n .
J.
b i o l . Chem.
177:
751-766.
G u r r , E.
1 958.
p p . 79-84.
M ethods o f A n a l y t i c a l H i s t o l o g y and H i s t o c h e m i s t r y . L e o n a rd H i l l (Books) L i m i t e d , London.
H a rtle y , J .
1961.
The s h e l l o f a c r i d i d e g g s .
102: 2 4 9 - 2 5 5 .
H a r v e y , W. R.
E n t . _7:
Q. J l . m i c r o s c . S c i .
1 962. M e t a b o l i c a s p e c t s o f i n s e c t d i a p a u s e .
57-80.
A. Rev.
H a r v e y , W. R. and W i l l i a m s , C. M. 1 9 6 1 . The i n j u r y m e t a b o l i s m o f t h e
c e c r o p i a s il k w o r m .
I.
B io lo g ic a l a m p lif ic a tio n o f th e e f f e c ts
of lo c a liz e d in ju ry .
J . I n s e c t P h y s i o l . _7: 8 1 - 9 9 .
H a u r o w i t z , F.
E d itio n .
1963.
The C h e m is t r y and F u n c t i o n o f P r o t e i n s .
455 p p . Academ ic P r e s s , New Y ork;
Humason, G. L.
196 7 . A nim al T i s s u e T e c h n i q u e s .
W. H. Freem an a n d C o . , San F r a n c i s c o .
2nd E d i t i o n ,
2nd
p . 28 8 .
—
82
—
Hyd e n , H. and L a n g e , P . W. 1968. M i c r o e l e c t r o p h o r e t i c d e t e r m i n a t i o n
o f p r o t e i n and p r o t e i n s y n t h e s i s i n t h e 1 0 -9 t o 1 0 -7 r a n g e . J .
C h ro m a t. 3 5 ( 3 ) :
336-351.
R a b a t , E. A. and M a y e r, M. M. 1961.
E x p e r i m e n t a l Immunoc h e m i s t r y .
2nd E d i t i o n ,
p p . 476-483.
C h a r l e s C. Thom as, P u b . , S p r i n g f i e l d , 111.
K a o c h a r e r n . P . 1958.
C y to lo g ic a l changes a s s o c i a te d w ith d iap au se i n
em bryos o f t h e g r a s s h o p p e r Melanoplus d if f e r e n tia l- ts (Thom as).
P h .D . T h e s i s , U n i v . o f W i s c o n s i n .
67 p p .
K a r n a v a r , G. K. and N a i r , K. S. S.
1969.
Changes i n b o d y w e i g h t , f a t ,
g l y c o g e n a n d p r o t e i n d u r i n g d i a p a u s e o f Trogoderma granarium. J .
In se c t P h y sio l.
15:
95-103.
K e i s t e r , M. and B uck, J .
1964.
R e s p i r a t i o n : some e x o g e n o u s and
endogenous e f f e c t s o f r a t e o f r e s p i r a t i o n .
I n : The P h y s i o l o g y
of In se c ta.
Ed. M. R o c k s t e i n . _3: 6 1 7 - 6 5 8 . A cadem ic P r e s s ,
New Y o rk ,
L a in e , I . I .
1966.
T e m p e r a tu r e e f f e c t s on t h e oxy g en c o n s u m p tio n
d u r i n g d e v e lo p m e n t o f Aulooara e l l i o t t i (T hom as). P h .D . T h e s i s ,
M ontana S t a t e U n i v . , Bozeman.
74 p p .
L e e s , A. D. 1 9 5 5 . The P h y s i o l o g y o f D i a p a u s e i n A r t h o p o d s .
C am bridge U n iv . P r e s s , L ondon.
151 p p .
L e o p o l d , R. A.
1967.
A s t u d y on t h e p o s t e m b r y o n i c o v a r i a n d e v e lo p m e n t
and v i t e l l o g e n e s i s o f Aulooara e l l i o t t i (Thomas) ( O r t h o p t e r a ,
A c r i d i d a e ) . P h .D . T h e s i s , M ontana S t a t e U n i v e r s i t y , Bozeman.
96 p p .
L o c k s h i n , R. A.
1966.
I n s e c t e m b ry o g e n e s is : m acro m o lecu lar s y n th e s e s
d u r i n g e a r l y d e v e lo p m e n t .
S c ie n c e 1 5 4 : 775-776.
Low ry, 0 . H . , R o s e b r o u g h , N. J . , F a r r , A. ^L. and R a n d a l l , R. J .
1951.
P r o t e i n m e a s u re m e n t w i t h t h e F o l i n p h e n o l r e a g e n t .
J . b io l.
Chem. 1 9 3 : 2 6 5 - 2 7 5 .
L udw ig, D. and R a m a z z o t t o , L. G. 1 965.
E n e rg y s o u r c e s d u r i n g em b ry o g e n e s i s o f t h e y e l l o w m ealworm, Tenebrio m oldtor.
Ann. e n t . Soc.
Am. 5 8 : 5 4 3 - 5 4 6 .
—83—
L u d w ig , D. an d R o t h s t e i n , F.
1952.
Changes i n t h e d i s t r i b u t i o n o f
n i t r o g e n d u r i n g t h e e m b r y o n ic d e v e lo p m e n t o f t h e J a p a n e s e b e e t l e
(PoprI l l 1La oaponlaa Newman). P h y s i o l . Z o o l . _25: 2 6 3 - 2 6 8 .
M a th e e , J . J .
1951.
The s t r u c t u r e an d p h y s i o l o g y o f t h e egg o f
U nion o f S o u th A f r i c a D e p ' t . o f
A g r i c . , S c i . B u l l . No. 316.
83 p p .
L o o u sta n a p a rd a trLna ( W a l k . ) .
M c F a r l a n e , J . E.
1960.
S t r u c t u r e and f o r m a t i o n o f t h e e g g s h e l l a s
r e l a t e d t o w a t e r a b s o r p t i o n by t h e e g g s o f Aoheta dom estious ( L . ) .
Can. J . Z o o l . 38:
231-241.
M o r i a r t y , F.
1969.
Egg d i a p a u s e an d w a t e r a b s o r p t i o n i n t h e g r a s s ­
h o p p e r ChorthrLppus, brunneus. J . I n s e c t P h y s i o l . JL5_: 2 0 6 9 -2 0 7 4 .
Needham, D. M.
1931.
The c h e m i c a l c h a n g e s d u r i n g t h e m e ta m o r p h o s is
of in se c ts.
In:
C h e m ic a l E m b ry o lo g y . Ed. J . Needham, p p .
1684-1710.
C am bridge U n iv . P r e s s , London.
N i e l s e n , D. J . and M i l l s , R. R.
1 968.
Changes i n t h e e l e c t r o p h o r e t i c
p r o p e r t i e s of. haemolymph and t e r m i n a l o o c y t e p r o t e i n s d u r i n g
v i t e l l o g e n e s i s i n t h e A m e ric an c o c k r o a c h . J . I n s e c t , P h y s i o l .
14 (2 ):
163-170.
O r n s t e i n , L.
1 964. D i s c e l e c t r o p h o r e s i s .
I.
Ann. N. Y. A cad. S c i . 1 2 1 ( 2 ) :
321-349.
B a c k g ro u n d and t h e o r y .
O t t , D. G . , T r u j i l l o , T. T. and F o re m a n , H.
1959.
C ab -O -S il su sp en ­
s i o n s f o r l i q u i d s c i n t i l l a t i o n c o u n t i n g . N u c l e o n i c s 17_(9) :
106-108.
P f a d t , R. E.
1 949.
F o o d - p l a n t s , d i s t r i b u t i o n , and a b u n d a n c e o f t h e
b i g - h e a d e d g r a s s h o p p e r , Aulpoara e l l t o t t t ( T h o s . ) J . K a n s . e n t .
Soc. 22.= 6 9 - 7 4 .
P r i c e , G. M.
1967. The e f f e c t o f d i f f e r e n t i o n s on t h e i n c o r p o r a t i o n
o f (U -I^C ) v a l i n e i n t o f a t body p r o t e i n o f t h e l a r v a o f t h e b lo w ­
f l y C a ttrLphora e ryth ro o ep h a la .
J . I n s e c t P h y s i o l . 13: 6 9 - 7 9 .
Q u i c k e n d e n , K. L.
1969.
S tu d ie s o f th e c a rb o h y d r a te s i n eggs o f
■Aulooara e ll- L o tti (Thomas) ( O r t h o p t e r a , A c r i d i d a e ) i n r e l a t i o n
t o d e v e l o p m e n t , t e m p e r a t u r e , m a t e r n a l age and c r o w d in g .
T h e s i s , M ontana S t a t e U n i v e r s i t y , Bozeman.
82 p p .
Ph.D .
—
Q u ic k e n den-, K. L.
1970.
84
-
C a rb o h y d ra te s i n t h e eggs o f t h e g r a s s h o p p e r
J. In s e c t P h y sio l. 16;
AuZooava eVLisOtti,, d u r i n g d e v e lo p m e n t .
171-183.
Q u ic k e n d e n , K. L. and R o e m h il d , G. R.
1969. M a t e r n a l a g e and d e n s i t y
e f f e c t s on c a r b o h y d r a t e s p a r t i t i o n e d t o eg g s o f t h e g r a s s h o p p e r ,
Auloaava e l l l o t t l .
J . I n s e c t P h y s i o l . _15: 1 2 1 5 - 1 2 2 3 .
R o e m h ild , G. R.
196 1 .
S t u d i e s on t h e e g g s o f t h e g r a s s h o p p e r s p e c i e s
P h .D . T h e s i s , M ontana S t a t e U n i v e r s i t y ,
Auloaava e l l l o t t l T h o s .
Bozeman.
94 p p .
R o e m h il d , G. R.
1965a.
C y c lic a l tem p eratu re e f f e c t s .o n d iapause
t e r m i n a t i o n o f e g g s o f Auloaavd e l l l o t t i (T h o m a s). J . I n s e c t
P h y s i o l . 11:. 1 6 3 3 - 1 6 3 9 .
R o e m h il d , G. R.
1 9 65b. R e s p i r a t i o n o f t h e eg g s and p a r t s o f eggs
o f Auloaava e l l l o t t i . (T hom as).
P h y s i o l . Z o o l . _38_: 2 1 3 -2 1 8 .
R o e m h ild , G. R.
1967.
C o m p a r t m e n t a ti o n i n t h e e g g s o f Auloaava
e l l l o t t i (T hom as). P h y s i o l . Z o o l . 4^0; 1 8 2 - 1 8 8 .
R o e m h il d , G. R.
1968.
C a t i o n i c e f f e c t s and l e v e l s i n d e v e l o p i n g
e g g s o f t h e g r a s s h o p p e r Auloaava e l l i o t t i , - J . I n s e c t P h y s i o l .
14:
1 0 3 5 -1 0 4 3 .
R o t h s t e i n , F.
1952.
B i o c h e m i c a l c h a n g e s d u r i n g t h e e m b r y o n ic
d e v e lo p m e n t o f t h e J a p a n e s e b e e t l e , P o ip lllla ja p o n lc a Newman.
P h y s i o l . Z o o l . 25_: 1 7 1 - 1 7 8 .
S a c h s , H.
1957.
A s t a b i l i z e d enzyme s y s t e m f o r amino a c i d i n c o r p o ­
ra tio n .
J . b i o l . Chem. 2 2 8 : 2 3 - 3 9 .
S c h e u r e r , R.
1 969.
Haemolymph p r o t e i n s and y o l k f o r m a t i o n i n t h e
c o c k r o a c h , Leuaophaea madevae.
J . I n s e c t P h y s i o l . L5: 1673168 2 .
Shaw, S . L.
1 955. Amino compounds and e t h a n o l a m i n e p h o s p h o r i c a c i d
o f th e g ra s s h o p p e r egg.
ExpI . C e l l R e s. _9: 4 8 9 - 5 0 1 .
S k o o g , D. A. an d W e s t, D. M. 1963.
F u n d a m e n ta ls o f A n a l y t i c a l
C h e m i s t r y , p . 58 . H o l t , R i n e h a r t and W in s t o n , New Y ork.
S l i f e r , E. H.
I p 30.
I n s e c t d e v e lo p m e n t .
I.
F a tty a c id s in th e
g rassh o p p er egg.
P h y s i o l . Z o o l . _3: 5 0 3 - 5 1 8 .
-
85
-
S l i f e r , E. H.
1 937. The o r i g i n and f a t e o f t h e m em branes s u r r o u n d i n g
t h e g r a s s h o p p e r e g g ; t o g e t h e r w i t h some e x p e r i m e n t s on t h e s o u r c e
o f t h e h a t c h i n g enzym e. Q. J l m i c r o s , s c i . _19_: 4 9 3 - 5 1 2 .
S t e v e n s o n , E. and W y n t t , G. R.
1 962.
The m e t a b o l i s m o f s i lkm oth
tissu e s.
I . In co rp o ra tio n of leu c in e in to p r o te in .
A rchs
Biochem . B i o p h y s . 99_: 6 5 - 7 1 .
S v o b o d a , J . A.
1 964.
S t u d i e s on some o f t h e l i p i d s o f t h e egg o f t h e
g r a s s h o p p e r s p e c i e s AuZoaara - e t l i o t t i Thomas. P h .D . T h e s i s ,
M ontana S t a t e C o l l e g e , Bozeman.
71 pp .
S v o b o d a , J . A . , P e p p e r , J . H. and B a k e r , G. L.
196 6 .
On t h e l i p i d s
o f t h e eg g o f t h e g r a s s h o p p e r , Autoaara StZ-LottZ.
J . Insect
P h y s i o l . 12:
1 5 4 0 -1 5 4 5 .
T h u r s t o n , R o b e r t V.
1966.
E l e c t r o p h o r e t i c p a t t e r n s o f b l o o d serum
p r o t e i n s fro m r a i n b o w t r o u t (Satmo g a ir d n e r i) .
J . F i s h . R es.
Bd Can. 2 4 ( 1 0 ) :
2 1 6 9 -2 1 8 8 .
T r o w b r i d g e , C. and B o d i n e , J . H.
1941. N i t r o g e n c o n t e n t . and d i s ­
t r i b u t i o n i n e g g s o f Metanoptus d if - f e r e n tia tis d u r i n g e m b ry o n ic
d e v e lo p m e n t .
B i o l . B u l l . m a r. b i o l . L a b . , W o o d s h o le . 7 9 :
452-458.
U r b a n , R. E.
1970.
H i s t o c h e m i c a l and e l e c t r o p h o r e t i c a n a l y s e s o f
h y d r o l y t i c enzymes d u r i n g t h e e m b r y o g e n e s i s o f Autoaara e ttZ o ttZ ■
(Thomas) ( O r t h o p t e r a , A c r i d i d a e ) . P h .D . T h e s i s , M o n ta n a S t a t e
U n i v e r s i t y , Bozeman.
131 p p .
Van H o rn , S . N.
196 3 .
The e m b r y o g e n e s i s and e m b r y o n ic v a r i a b i l i t y o f
(Thomas) ( A c r i d i d a e , O r t h o p t e r a ) .
P h .D . T h e s i s ,
M ontana S t a t e C o l l e g e , Bozeman.
172 p p .
A u to a a r a e ttZ o ttZ
Van H o rn , S .■ N.
S t u d i e s on t h e embryo g e n e s i s o f Autoaara
I.
E x t e r n a l m orpho­
J . Morph. 1 2 0 ( I ) : 8 3 - 1 1 4 .
1966a.
e ttZ o ttZ ■{Vn.o-m.as) ( O r t h o p t e r a , A c r i d i d a e ) .
g e n e sis.
Van H o rn , S . N. 1 9 66b.
S t u d i e s o f t h e e m b r y o g e n e s i s o f Autocara
e ttZ o ttZ (Thomas) ( O r t h o p t e r a , A c r i d i d a e ) . I I . D e v e lo p m e n ta l
v a r i a b i l i t y and t h e e f f e c t s , o f m a t e r n a l age and e n v i r o n m e n t .
J . M orph. 1 2 0 ( 2 ) :
115-134.
—8 6 —
V i n s o n , S . B. and L e w i s , W. J . 1 969.
E le c tro p h o r e tic stu d y of p r o te in
c h a n g e s b e tw e e n s e v e r a l d e v e l o p m e n t a l s t a g e s o f t h r e e s p e c i e s o f
H e l i o t h i s ( L e p i d o p t e r a : N o c t u i d a e ) . Comp. Biochem . P h y s i o l . 2 8 :
215-220.
Wang, C. H. and W i l l i s , D. L.
1965.
R a d i o t r a c e r M e th o d o lo g y i n
B io lo g ic a l S cien ce.
382 p p .
P r e n t i c e - H a l l I n c . , Englew ood C l i f f s ,
New J e r s e y .
W annem acher, R. W ., J r . , B a n k s , W. L . , J r . and W unner, W. H. 1965.
Use o f a s i n g l e t i s s u e e x t r a c t t o d e t e r m i n e c e l l u l a r p r o t e i n ,
n u c l e i c a c i d c o n c e n t r a t i o n and r a t e o f amino a c i d i n c o r p o r a t i o n .
A n a l y t . Biochem . _11: 3 2 0 - 3 2 6 .
W illia m s, J .
1967. Y o lk u t i l i z a t i o n .
I n : The B i o c h e m i s t r y o f
Animal. D e v e lo p m e n t.
Ed. R. W eber.
V o l. I I .
p p . 3 4 1 -3 8 2 .
A cadem ic P r e s s , New Y ork.
W in t e r i n g h a m , F. P . W. 1962.
R a d io a c tiv e t r a c e r te c h n iq u e s in in s e c t
b io c h e m istry .
In:
R a d i o i s o t o p e s and R a d i a t i o n i n Entom ology
(Symposium P r o c e e d i n g s ) ,
pp. 113-134.
I n t e r n a t i o n a l A tom ic
E n e rg y A g e n c y , V ie n n a .
W y a t t , G. R.
1 958.
The m e t a b o l i c c o n t r o l o f i n s e c t d e v e lo p m e n t .
In:
A Symposium on t h e C h e m ic a l B a s i s o f D e v e lo p m e n t,
p p . 8 0 7 -8 1 2 .
E d s . W. D. M cElroy and B. G l a s s .
J o h n s H opkins P r e s s , B a l t i m o r e .
UNIVERSITY LIBRARIES
D378
R566
c o p .2
R o b i n s o n , R i c h a r d W.
The d i s t r i b u t i o n .
r a t e o f s y n th e s i s and
c h a ra c te riz a tio n of
n r o t e i n f r o m __
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