Tuula Metso
8/03/2016
VÄITÖSTILAISUUS 24.1.2002, KLO 12.00 HYKS, IHO- JA ALLERGIASAIRAALA
DETECTION OF INTRACELLULAR MARKERS IN AIRWAY INFLAMMATION
- A BIOCHEMICAL AND IMMUNOCYTOCHEMICAL STUDY IN INDUCED SPUTUM
Abstract
Characteristic features in asthma and chronic obstructive pulmonary disease (COPD) are
airflow limitation and bronchial inflammation. During airway inflammation, increased
numbers of activated cells (e.g. eosinophils and neutrophils) associated with inflammation
are found in bronchial mucosa, in bronchoalveolar lavage (BAL) fluid, in sputum, and, in
severe cases, in blood. Both eosinophils and neutrophils contain various mediators in their
intracellular granules. When such cells are activated, various types of harmful mediator are
released into the immediate environment.
Until recently, investigation of airway inflammation has mainly relied on monitoring of
lung function. However, numerous bronchial biopsy and BAL fluid studies have revealed
that airway inflammation can occur in the absence of bronchial hyper-reactivity, if
respiratory disease is mild or clinically well controlled. Cellular and biochemical
accompaniments of airway inflammation have been widely studied by investigation of
BAL fluid and bronchial biopsy samples. However, the invasiveness, inconvenience and
risks of the procedures concerned have limited their use. It has been suggested that
induction of sputum production constitutes a non-invasive safe way of investigating airway
inflammation.
The main aim of the studies described here was to improve detection and diagnosis of
airway inflammation in various respiratory disorders. In seeking to achieve this aim, results
of lung-function tests and findings relating to laboratory parameters were compared and
sensitivities were determined in various groups of patients, especially in patients with early
asthma. Other aims of the studies were to simplify means of inducing sputum production
and to investigate sputum-processing procedures, with a view to improving the clinical
utility of the methods. Effects of treatment on markers of inflammation were evaluated.
The feasibility of inducing sputum production in children was also examined. Since data
concerning the cell-specificities of markers of inflammation were conflicting, the
specificities of some granulocyte markers were studied at cellular level, using
immunocytochemical staining. Various fixation and permeabilization methods were used
Tuula Metso
8/03/2016
in immunocytochemical studies to determine the optimal procedure for detecting
intracellular markers in situ.
Eosinophil peroxidase (EPO) and human neutrophil lipocalin (HNL) can be used as
markers for identification of eosinophils and neutrophils in sputum samples and BAL fluid.
Eosinophil cationic protein (ECP), widely employed as a marker, is not eosinophil-specific.
It can be detected, by means of immunocytochemical methods, in both eosinophils and
neutrophils. Fixation and permeabilization using the commercial reagent Ortho Permeafix
is the best means of detection of antigens in cells in sputum samples and BAL fluid. Use of
the currently recommended method of fixation, involving an organic solvent, is
inappropriate in this connection.
Sputum production can be safely induced in patients suffering from respiratory disorders
and healthy individuals through use of a low-output nebulizer. Use of a simplified assay
method for measuring levels of total granulocyte markers in sputum allows differentiation
between patients with respiratory disorders and healthy individuals. Determination of
levels of total markers using this simplified assay method gives results similar to those
obtained through use of established assay methods for released markers. The results
suggest that the assay method could be used in clinical practice to determine total marker
levels in induced sputum samples.
Treatment of early mild asthma with an inhaled steroid is effective and worthwhile.
Detection of the disease remains problematic, however, since both lung-function and
biochemical tests have low sensitivities. Sputum assays are a useful supplement to
conventional lung-function testing.
Tuula Metso
8/03/2016
VÄITÖSTILAISUUS 24.1.2002, KLO 12.00 HYKS, IHO- JA ALLERGIASAIRAALA
LIMAKALVOTULEHDUKSEN MERKKIAINEET INDUSOIDUSSA YSKÖKSESSÄ
- BIOKEMIALLINEN JA IMMUNOSYTOKEMIALLINEN TUTKIMUS
Yleistä
Keuhkojen limakalvotulehdukseen liittyy useiden tulehdussolujen lisääntymistä limakalvolla. Kun astmatulehdus on aktiivisessa vaiheessa, limakalvosta löytyy runsaasti sekä
eosinofiilisia valkosoluja että syöttösoluja. Kroonisessa keuhkoahtaumataudille (COPD) on
tyypillistä neutrofiilien lisääntyminen. Pitkittynyt yskä, liman eritys, hengenahdistus ja
ajoittainen hengityksen vinkuminen ovat astman kliinisiä oireita. Astmaohjelmassa
arvioitiin, että varsinaisten astmaatikkojen lisäksi väestössä on noin 10 % sellaisia ihmisiä,
joilla esiintyy ajoittain astmankaltaisia oireita mutta keuhkojen toimintakokeet ovat vielä
normaalit. Koska astmadiagnoosi perustuu käytännössä toimintahäiriön osoittamiseen,
jäävät nämä potilaat nykyisin vaille selkeää diagnoosia ja asianmukaista lääkitystä. Aikaviivettä limakalvotulehduksen, ensimmäisten oireiden ja toimintahäiriön kehittymisen
välillä ei toistaiseksi tiedetä. Viitteitä on siitä, että limakalvotulehduksen pitää aiheuttaa
oireita ainakin vuoden ennen kuin keuhkoputkien lisääntynyt supistumisalttius voidaan
osoittaa altistuskokein.
Limakalvotulehdus voidaan osoittaa joko epäsuorasti tutkimalla syntynyttä keuhkojen
toimintahäiriötä tai suorasti tutkimalla siihen osallistuneita tulehdussoluja tai niiden
tuotteita (ns. tulehdusmerkkiaineita). Keuhkojen tähystystutkimuksen yhteydessä otetut
limakalvokoepalat tai keuhkohuuhtelunäytteet eivät sovellu tulehdussolujen tutkimiseen
rutiinidiagnostiikkassa. Tulehdussoluja on tutkittu myös verestä, mutta tämä on epäherkkä
menetelmä; verieosinofiliaa ei aina ole voimakkaasti oireisessakaan astmassa puhumattakaan lievästä ajoittaisesta taudista. Vuonna 1992 alkoi yskösnäytteen ”uusi” tuleminen, kun
ysköksen indusointia hypertonisella keittosuolaliuoksella sovellettiin astmaatikkojen eosinofiilisen tulehduksen toteamiseksi.. Yskös on peräisin tulehduspaikalta, ja siitä voidaan
mikroskopoida soluja ja mitata aktivoituneiden tulehdussolujen vapauttamia merkkiaineita.
Tutkimuksen hypoteesi ja tavoittet
Väitöskirjatyö on metodologinen ja se keskittyy tutkimaan solunsisäisiä merkkiaineita
biokemiallisin ja immunosytokemiallisin menetelmin indusoidusta yskösnäytteestä.
Päämääränä oli kehittää kliiniseen käyttöön soveltuva laboratoriomenetelmä, jolla lima-
Tuula Metso
8/03/2016
kalvotulehdus voidaan todeta jo ennen kuin se on johtanut keuhkojen toimintahäiriöön.
Mahdollinen ”yskössenkka” olisi kliinikon yksi työväline diagnoosin teossa ja hoidon
seurannassa.
Tulokset
Konsensusmenetelmää yskösnäytteen käsittelylle ei ole, joten metodologisessa osasssa
tutkittiin kuinka näyte tulisi kerätä, käsitellä sekä mikä tulehdusmerkkiaine on sopivin
limakalvotulehduksen osoitin. Valittu käsittelymenetelmä soveltui hyvin kliiniseen käyttöön. Kun menetelmä on toimiva, se erottaa sairaat terveistä sekä eri potilasryhmät (astma,
COPD, infektio) toisistaan. Tulehdusmerkkiaineita tutkittiin eri potilasryhmissä ja
kliinisissä tilanteissa. Tutkimus keskittyi yskökseen, mutta myös muita näytemateriaaleja
(veri, virtsa) käytettin.
Tulehdusmerkkiaineen pitoisuuksia verrattiin myös ysköksen solutuloksiin ja immunosytokemialla saatuihin tuloksiin. Tulehdusmerkkiaineiden spesifisyyttä tutkittiin immunosytokemiallisin menetelmin. Yleisesti käytössä oleva tulehdusmerkkiaine todettiin epäspesifiksi, samoin suositeltu yskössolujen fiksointimenetelmä epäluotettavaksi.
Tutkimuksen kliininen evaluaatio ja näytteen soveltuvuus perusterveydenhuollon käyttöön
testattiin pääkaupunkiseudun terveyskeskuksessa. Työn tulokset olivat erittäin rohkaisevia;
itse yskösnäytteen indusointi onnistui 84% potilaista.
Tutkimuksen merkitys
Hengitysteiden limakalvotulehduksen diagnostiikkaan ei ole juuri ollut keinoja, joita myös
perusterveydenhuollon lääkärit voisivat käyttää arkipäivän työssä. Ysköstutkimus on vanha
tutkimus, jota on viime vuosina käytetty eri keuhkosairauksissa eosinofiilisen ja/tai neutrofiilisen tulehduksen havaitsemiseksi. Pitkittynyttä yskää sairastavan potilaan ysköksen
tutkimisesta on suurta hyötyä: tulehdussolujen määrittäminen ja tulehdusten merkkiaineiden mittaaminen paljastaa tulehduksen luonteen ja ohjaa oikeaan hoitoon. Ysköstutkimusta on jo sovellettu väestötutkimuksiin, mikä lisää tietoa hengitystietulehduksen,
potilaan oireiden ja keuhkofunktiomuutosten välisestä yhteydestä sekä eri interventioiden
tehosta. Ysköstutkimuksessa on vielä kehitettävää, mutta jo nyt se soveltuu terveydenhuollon käyttöön.