Mata Kuliah
: Pengembangan Metode Transformasi In Planta pada
Berbagai Tanaman dan Analisa Kejadian Gene Targeting
pada Buckwheat (Fagopyrum esculentum)
Pokok Bahasan 2
: Pengembangan metode transformasi in planta yang
sederhana dan efisient pada padi dengan bantuan
Agrobacterium tumefaciens
Sub Pokok Bahasan
: 2.1 Pendahuluan
2.2 Bahan dan Metode
2.2.1 Strain A.tumefaciens dan binary vector
2.2.2 Transformasi
2.2.3 Deteksi A.tumefaciens pada tanaman tertransformasi
2.2.4 Sampling biji padi transformant
2.2.5 Penentuan ketahanan terhadap hygromycin pada
transformant
2.2.6 Uji histokimia terhadap aktifitas β-glucuronidase
(GUS)
2.2.7 Mengisolasi DNA tanaman
2.2.8 Analisa PCR
2.2.9 Plasmid rescue
2.3 Hasil dan Pembahasan
2.3.1 Transformasi dengan bantuan mutan A.tumefaciens
strain M-21
2.3.2 Deteksi A.tumefaciens yang digunakan dalam
transformasi pada transformant
2.3.3 Deteksi transgen dengan PCR pada transformant yang
ditransformasi dengan strain mutan M-21
2.3.4 Transformasi dengan strain LBA4404 yang mengandung
binari vektor pIG121-Hm
2.3.5 Rescue dan Analisis terhadap plasmid dari transformant
yang ditransformasi dengan strain LBA4404
mengandung binari vektor pBI-res
TIK :
- Mahasiswa memahami tentang metode transformasi in planta pada tanaman padi
Waktu : 2 x 50menit
2.1 Pendahuluan
Sejak terobosan yang dilakukan oleh Hiei dan kelompok risetnya diawal tahun
1990an, metode transformasi dengan bantuan A.tumefaciens pada padi telah berkembang
pesat dan telah menjadi metode rutin diberbagai laboratorium di dunia.1-5 Pada dasarnya
metode ini sama dengan metode yang umum dilakukan pada tanaman dikotil.
Pertama-tama A.tumefaciens diinokulasikan pada jaringan sel yang mengandung sel-sel
embryonic yang sedang aktif membelah seperti misalnya kalus dalam system kultur
jaringan. Kemudian A.tumefaciens dihilangkan dengan antibiotika dan sel-sel yang
tertransformasi diseleksi dengan media mengandung antibiotika. Terakhir tanaman
ditumbuhkan dengan media yang sesuai. Walaupun telah digunakan secara luas metode
ini memiliki sejumlah kelemahan yaitu memerlukan kondisi yang steril, memakan
banyak waktu, sering terjadi variasi somaklonal saat penumbuhan secara in vitro dan
tidak semua tanaman dapat diregenerasi dengan metode ini.
Disisi lain transformasi in planta dapat mengatasi kelemahan-kelemahan tersebut.6
Berbeda dengan metode transformasi diatas, transformasi in planta tidak memerlukan
kultur secara in vitro yang mana hal ini merupakan suatu kelebihannya. Sejauh yang kami
ketahui, belum pernah ada dilaporkan sebelumnya metode transformasi in planta pada
padi.
Sebelumnya di laboratorium kami telah dikembangkan metode transformasi in planta
yang sederhana dan efisien pada tanaman buckwheat (Fagopyrum esculentum M.),
mulberry (Morus alba L.) dan kenaf (Hibiscus cannabinus L.).7-9 Walaupun ketiga
metode tersebut memiliki kemiripan, beberapa modifikasi diperlukan agar sesuai dengan
keadaan dan jenis tanamannya. Untuk buckwheat, apical meristem pada bibit tanaman
diinokulasi dengan A.tumefaciens, sedangkan untuk mulberry dipilih meristem pada
axillary buds dari tanaman muda. Untuk kenaf baik apical meristem maupun meristem
pada axillary buds diinokulasi dengan A.tumefaciens. Sementara itu teknik in planta pada
padi yang dilaporkan disini menggunakan embryonic apical meristem dari biji padi yang
telah direndam untuk diinokulasi dengan A.tumefaciens.
Agar transformasi dapat diverifikasi dengan berbagai jenis pembuktian, digunakan
tiga strain A.tumefaciens yang berbeda yaitu: strain avirulen mutan M-21,10 strain
LBA4404 mengandung binary vector pIG121-Hm,11 dan strain LBA4404 mengandung
binary vector (pBI-res) yang dimodifikasi agar dapat direscue T-DNA yang telah
terintegrasi dan DNA yang mengapitnya pada kromosom inang.7 Pada mutan M-21,
hanya gen iaaM, yang terlibat dalam biosintesis indolacetic acid (IAA), yang termutasi
oleh Tn5, sementara gen-gen lainnya termasuk gen untuk biosintesis sitokinin pada
T-DNA tetap utuh. Dengan demikian tanaman tertransformasi dengan strain ini
diharapkan mensintesa sitokinin dalam jumlah banyak sehingga phenotypenya berubah
secara dramatic, dimana hal ini secara kasatmata dapat menjadi indikasi yang baik dari
kejadian transformasi. Transformasi dengan A.tumefaciens LBA4404 mengandung
binary vector pIG121-Hm diharapkan dapat dideteksi dengan perendaman histochemical
untuk aktifitas β-glucuronidasenya dan juga dari ketahanannya terhadap hygromycin B
mengingat pada binary vector pIG121-Hm terdapat gen β-glucuronidase (GUS) dengan
intronnya dan gen ketahanan terhadap hygromycin B pada T-DNAnya. A.tumefaciens
LBA4404 mengandung binary vector pBI-res digunakan untuk memastikan
terintegrasinya transgene (T-DNA) kedalam genom tanaman tertransformasi dengan
merescue kembali transgene dan DNA yang mengapitnya dari genom tanaman
tertransformasi.
2.2 Bahan dan Metode
２．２．１ A. tumefaciens strains and binary vectors
The following A. tumefaciens strains and binary vectors were used in the present
study. The M-21 mutant strain was produced by transposon 5 (Tn5) mutagenesis of A208
virulent strain (C58 chromosome, nopaline type T37 pTi) in my laboratory 43). The
T-DNA construct of M-21 mutant was described previously 41). The mutant had a Tn5
insertion in tryptophan monooxygenase gene (iaaM) in T-DNA region of Ti plasmid,
which is involved in IAA biosynthesis. All other genes including a gene for cytokinin
biosynthesis (ipt) in the T-DNA region of the M-21 mutant are intact. The mutant
retained the ability to integrate its own T-DNA as well as of a binary vector introduced in
its cell to host chromosome but produced no galls on host plants. A. tumefaciens
LBA4404 strain was described previously 44). The following two binary vectors were
introduced to LBA4404 strain by transformation. A binary vector, pIG121-Hm, was
constructed by Ohta et al. 45). The binary vector contains a kanamycin-resistance (nptII)
and a hygromycin-resistance (hpt) genes as well as β-glucuronidase (GUS) gene with an
intron in the N-terminal region. This intron-GUS reporter gene expresses GUS activity in
plant cells but not in the cells of A. tumefaciens 45). Another binary vector, pBI-res, was
constructed by replacing the SmaI/EcoRI segment of the β-glucuronidase gene and
Nos-terminator of pBI121 binary vector with a PvuII/EcoRI segment (2.3 kb) of an
ampicillin resistance (β-lactamase) gene and a replication origin (ori) of pBR322
plasmid. The schematic diagram of T-DNA of pBI-res binary vector is shown in Fig. 2.1
40)
.
２．２．２ Transformation
A. tumefaciens was cultured on either LB medium containing kanamycin (50 µg/ml)
and rifampicin (10 µg/ml) (M-21 mutant) or LB medium containing streptomycin (50
µg/ml), kanamycin (50 µg/ml) and rifampicin (10 µg/ml) (LBA4404 strain with a
pIG121-Hm or a pBI-res) at 28ºC for 2 days. The bacteria were harvested with a loop and
suspended at density of 1.0 x 109 cells/ml in water. The seeds of rice (Oryza sativa L. var.
Koshihikari) were sterilized with ethanol and sodium hypochlorite and imbibed at 20ºC
for 2 days. Water was replaced once during soak. After 2 days of soak, the embryo region
of seed turned to white. At this stage, neither shoots nor roots appeared yet. To inoculate
A. tumefaciens onto embryonic apical meristem in the imbibed seed, a site of husk where
a shoot emerged later was pricked at a point in 1 - 1.5 mm depth with a needle ( 0.71
mm; Taiki Home Craft, Tokyo) that had been dipped in the inoculum of A. tumefaciens.
The inoculated seeds were placed on the filter papers on vermiculite wetted by water in
flasks covered with aluminum foil and incubated at 23ºC in the dark for 9 days, during
which 70 to 75% of inoculated seeds germinated to seedlings. Then the seedlings were
immersed, at room temperature, in water solution (1000 ppm) of cefotaxime (Hoechst
Marion Roussel, Tokyo) for 1 h. Finally, 30 seedlings were planted in two pots (15
seedlings/pot ( 24 cm)) containing soil prepared for rice plants (Zennou, Tokyo) and
grown to maturation (T0) under nonsterile conditions and allowed to pollinate naturally to
set the seeds (T1). For control plants, either LBA4404 strain without a binary vector or
water was used for inoculation.
２．２．３ Detection of A. tumefaciens used for transformation in transformed
plants.
Young leaves at shoot apices of mature rice plants (T0 and T1) were aseptically
homogenized with autoclaved water using a mortar and pestle. The homogenates were
inoculated onto LB-medium with either kanamycin (50 µg/ml) and rifampicin (l0 µg/ml)
for M-21 mutant or streptomycin (50 µg/ml), kanamycin (50 µg/ml) and rifampicin (10
µg/ml) for LBA4404 strain harboring a pIG121-Hm or a pBI-res binary vector. The
inoculated media were incubated at 28ºC for 3 days. No colonies appeared with any
homogenates, indicating the absence of A. tumefaciens used for transformation in the
shoot apices of transformants. The lower parts of the plants (T0) were not examined for
the presence of A. tumefaciens for the reason that the lower part of the plants were
assumed not to contribute to production of germ cells, namely pollens and eggs, for the
following generation. The genomic DNA for PCR and Southern hybridization analyses
was also isolated from young leaves at shoot apices of rice plants.
２．２．４ Sampling of seeds
For the experiment that produced the results shown in Fig. 2.2, seeds from one
nontransformed plant and one transformed (T0) plant that were grown separately were
used. In the other experiments, owing to the limitation of space, each rice plant was not
grown separately to prevent cross-pollination, but 15 plants were grown together in a
large (ø25 cm) pot. Consequently, some cross-pollination likely occurred to set seeds.
Thus, the seeds from all 30 transformed plants were pooled, from which seeds were
randomly selected.
２．２．５ Determining hygromycin resistance of transformants
The seeds were hulled and sterilized with ethanol and sodium hypochlorite (1%).
The sterilized seeds were rinsed three times in water and germinated in hygromycin B
water solution (20 µg/ml) (2 - 3 mm depth) at 28ºC, for 16 hrs light and 8 hrs dark, under
sterile conditions. Resistance was scored 6 days later.
２．２．６ Histochemical assay of β-glucuronidase (GUS) activity
Expression of GUS in rice cells was assayed by the method of Kapila et al. 46). The
whole plant bodies of 10 days old seedlings were stained.
２．２．７ Isolation of DNA
Rice genomic DNA was extracted from young leaves at shoot apices of rice plants
by the procedure described by Chen et al. 47).
２．２．８ PCR analysis
The nested PCR for detection of transgene in the genome of transformants (T1)
generated by a M-21 mutant of A. tumefaciens was carried out as follows. Instead of PCR
consisting of one round of reactions, nested PCR was used to obtain reproducible results.
In the M-21 mutant, a Tn5 is inserted between 1055 bp and 1056 bp of tryptophan
monooxygenase gene (iaaM) in the T-DNA region on Ti plasmid 43). The following
nested PCR primers were designed such that the DNA segment (760 bp) spanning iaaM
and Tn5 would be amplified; primers for the 1st PCR, 5' CGC TTA CAT CTA TGT TGG
CA 3` for forward direction, 5' CAT GTT AGG AGG TAC CAT GG 3' for reverse
direction; primers for the 2nd PCR, 5' TGC CAT CGA CCT TGC ACC AT 3' for forward
direction, 5' AGG TTC CGT TCA GGA CGC TA 3' for reverse direction. In the first
PCR, genomic DNA (about 100 ng) was added to a reaction mixture of 25 µl of final
volume (50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgC12, 200 µM dNTP, 0.2 µM
each primer and 0.63 unit of γTaq polymerase (Takara Syuzou). The PCR was done at
94ºC for 1 minute once, at 94ºC for 30 seconds, at 55ºC for 1 minute, at 72ºC for l minute
for the first 20 cycles and then 72ºC for 7 minutes. For the second PCR, 2 µl of the first
PCR mixture was used as a template, and PCR was done as follows; 94ºC for 1 minute
once, at 94ºC for 30 seconds. at 58ºC for 1 minute, at 72ºC for 45 seconds for first 25
cycles and then 72ºC for 7 minutes. The reaction mixture of 2nd PCR (5 µl) was applied
to agarose gel (1%) electrophoresis and then stained by ethidium bromide to examine the
product. When the product of 2nd PCR using total DNA of the M-21 mutant as a template
was digested with HindIII, the fragments of 490 bp and 270 bp were yielded, as expected
from DNA sequence of the genes. The 760 bp DNA amplified from genomic DNA of
transformants was also digested by HindIII to confirm the identity.
The nested PCR to prepare T-DNA-flanking DNA segment in the plasmid rescued
from genomic DNA of transformant (T0) generated by A. tumefaciens (LBA4404)
harboring a pBI-res binary vector was performed as follows. Two primer sets were
designed to amplify the DNA segment outside of T-DNA region in the rescued plasmid;
primers for the 1st PCR, L-1 primer, 5' GCG TCA TCC CTT ACG TCA GT 3' for
forward direction; L-2 primer, 5' CTG TGA GAT CCA GTT CGA TG 3' for reverse
direction; primers for the 2nd PCR, L-3 primer, 5' TCT TGA TGA GAC CTG CTG CG 3'
for forward direction; L-4 primer, 5' TGG CCG TCG TTT TAC AAC GT 3' for reverse
direction. The positions of primers are shown in Fig. 2.1. In the first PCR, the rescued
plasmid (about 200 ng) was added to a reaction mixture of 25 µl of final volume (50 mM
KCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.3, 1.5 mM MgC12, 200 µM dNTP, 0.2 µM each primer and
0.63 unit of γTaq polymerase (Takara Syuzou). The PCR was done at 94ºC for 1 minute
once, at 94ºC for 1 minute, at 58ºC for 1 minute, at 72ºC for 2 minutes for first 40 cycles
and then 72ºC for 5 minutes. For the second PCR, 1µl of the first PCR mixture was used
as a template, and PCR was done as the first PCR. The product (ca. 1.0 kb) of the second
PCR was recovered from the electrophoresed agarose gel to sequence it. The sequence of
the 2nd PCR product was determined using the forward and reverse primers of the second
PCR with ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied Biosystems).
２．２．９ Plasmid rescue
Genomic DNA was extracted from a flag leaf, a leaf just below inflorescence, of a
transformant (T0) at flowering stage generated by A. tumefaciens harboring a pBI-res
binary vector. The DNA was digested with SphI, of which restriction site is not included
in the pBR322 plasmid-derived DNA segment (2.3 kb) containing a replication origin and
ampicillin resistance gene in T-DNA of pBI-res binary vector. The digested DNA was
self-ligated with DNA ligation kit ver.1 (Takara Syuzou, Kusatsu) and transformed to
Escherichia coli (HB 101). The transformed E. coli was screened on LB medium
containing ampicillin (50 µg/ml). The plasmids were isolated from E. coli grown on LB
medium with ampicillin (50 µg/ml). The isolated plasmid was of big size, larger than 8
kb, and hence followed by the procedure to make the plasmid smaller. The plasmid was
again digested with HindIII, which did not split the above pBR322-derived DNA segment
and then self-ligated. The self-ligated DNA was transformed to E. coli, from which the
plasmid was isolated and used for analysis of its construct. The DNA segment flanking
T-DNA in the final rescued plasmid was prepared and sequenced as described above.
2.3 Hasil dan Pembahasan
Transformasi dengan mutan A.tumefaciens strain M-21.
Tanaman tertransformasi (transformant) oleh A.tumefaciens strain M-21 diharapkan
menunjukkan perubahan phenotype akibat terganggunya keseimbangan hormone. Oleh
karena itu kami mentransformasi padi menggunakan mutan M-21 agar dapat
menentukan apakah tanaman padi tertransformasi menunjukkan perubahan phenotype
dan apakah perubahan ini juga diturunkan ke generasi berikutnya. Sebagaimana
ditunjukkan pada Gbr 1, tanaman tertransformasi oleh strain M-21 menunjukkan
perubahan phenotype dimana tanaman menjadi lebih tinggi dari kontrolnya. Belum jelas
halnya apakah perubahan ini disebabkan oleh efek langsung dari dugaan adanya produksi
hormone tumbuh sitokinin yang berlebihan. Akan tetapi, satu hal yang dapat dipastikan
disini bahwa perubahan phenotype ini diturunkan pada generasi berikutnya, dimana
transformant T1 nya juga menunjukkan phenotype yang lebih tinggi dari kontrolnya. Hal
ini dapat menjadi satu indikasi terjadinya transformasi.
Deteksi transgene dengan PCR pada transformants (T1) oleh strain mutan M-21
Segment DNA terbentang antara iaaM dan Tn5 pada T-DNA dari strain M-21 dipilih
sebagai transgene mengingat konstruksi DNA ini hanya terdapat pada strain mutan M-21
dan tidak terdapat pada genom organisme lain (Gbr. 2). Lebih dari itu, data sekuen DNA
di sekitar Tn5 pada mutan M-21 sudah tersedia sehingga memungkinkan untuk
mengkonfirmasi identitas produk PCR dari ukurannya dan dari ukuran pemotongan
dengan enzim restriksi.
Transgene (760 bp) dideteksi pada 9 tanaman (40%) dari 22 tanaman (T1) yang diuji
dan dipilih secara acak, sementara dari 6 tanaman control yang diuji semuanya tidak
menunjukkan keberadaan transgene (Gbr. 3). Konfirmasi dari pemotongan dengan enzim
restriksi HindIII menunjukkan produk PCR berukuran 760 bp terpotong menjadi ukuran
490 bp dan 270 bp dilihat dalam gel elektroporesis seperti yang diharapkan.
Transformasi dengan strain LBA4404 mengandung binary vector pIG121-Hm
Binary vector pIG121-Hm memiliki gen GUS dengan intronnya dan gen ketahanan
terhadap hygromycin pada T-DNAnya. Dengan demikian keberadaan gen-gen tersebut
pada transformants dapat dideteksi dengan histochemical assay untuk gen GUS dan uji
ketahanan terhadap hygromycin.
Dari 30 tanaman (T1) yang diuji 13 diantaranya (43%) menunjukkan reaksi positif
terhadap GUS assay. Sementara itu dari 30 tanaman control yang diuji kesemuanya
menunjukkan reaksi negative terhadap GUS assay (Gbr. 4).
Ketahanan terhadap hygromycin diuji dengan perkecambahan biji dalam larutan
hygromycin B (20 ppm). Dari 17 biji yang diuji 12 biji diantaranya (70%) dapat
berkecambah dalam larutan hygromycin B sedangkan 15 biji padi dari tanaman control
beberapa diantaranya dapat berkecambah dengan tidak normal. Tidak demikian halnya
pada biji-biji padi transformants maupun nontransformants yang dikecambahkan pada air
steril, semuanya dapat berkecambah secara normal (Gbr. 5).
Rescue dan Analisis plasmid dari transformant LBA4404 mengandung binary
vector pBI-res
Untuk mengkonfirmasi integrasi T-DNA kedalam genom tanaman tertransformasi,
T-DNA ini harus dapat direscue atau diambil kembali dari genom transformant dimana
selain T-DNA juga akan diperoleh DNA dari genom padi yang mengapit T-DNA di
tempatnya berintegrasi. Untuk keperluan ini genomic DNA diekstrak dari daun bendera
pada transformant (T0) saat phase berbunga dari transformant yang menunjukkan
perubahan phenotype (ukuran tanaman lebih tinggi). Sekuen DNA dari hasil rescue atau
yang diambil kembali dari genom transformant di teliti dan dicari homologinya dengan
genom tanaman padi (nontransformant) dengan bantuan BLAST software. Hasil yang
didapat dari homology search ini menunjukkan T-DNA dari binary vector diapit oleh
chromosomal gene padi dengan accession no. AC084764. Hal ini dapat sebagai bukti
bahwa T-DNA berintegrasi pada genom padi (Gbr. 6).
Dengan demikian pada penelitian ini telah ditunjukkan lima jenis bukti untuk
memverifikasi transformasi pada padi dengan metode in planta yang kami kembangkan.
Adapun kelima bukti tersebut yaitu: satu, transformants (T0) diperoleh dari strain M-21
menunjukkan phenotype berbeda dengan phenotype tanaman control dan perubahan
phenotype ini diwariskan ke generasi berikutnya (T1). Dua, transgene (T-DNA disisipi
Tn5) dapat dideteksi dengan PCR sebanyak 40% dari transformant (T1) yang dipilih
secara acak hasil transformasi dengan strain M-21. Tiga, transformants dari hasil
transformasi dengan strain LBA4404 mengandung binary vector pIG121-Hm mampu
menunjukkan aktivitas gen GUS. Empat, biji padi transformants dari hasil transformasi
dengan strain LBA4404 mengandung binary vector pIG121-Hm menunjukkan ketahanan
terhadap hygromycin B (20 ppm) pada phase perkecambahan. Lima, plasmid
mengandung T-DNA yang telah terintegrasi dan DNA genom padi yang mengapitnya
dapat direscue dari genomic DNA transformant (T0) hasil transformasi dengan strain
LBA4404 mengandung binary vector pBI-res.
Efektifitas transformasi pada penelitian ini kelihatan cukup tinggi bila dibandingkan
dengan penelitian lain (Banks et al. 1993, Birch 1997, Chen et al. 1993, Hiei et al. 1994).
Akan tetapi efektifitas transformasi yang dicapai pada penelitian ini cukup beralasan
mengingat A.tumefaciens adalah bakteri phytopathogenic di alam yang mampu
menginduksi tumor crown gall pada tanaman dengan cara mentransfer T-DNA pada pTi
yang dalam selnya ke dalam genom tanaman, dengan kata lain transformasi tanaman
secara alami. Ketika A.tumefaciens strain A208, yang merupakan induk dari strain M-21,
diinokulasikan pada daun atau batang tanaman cocor bebek (Kalanchoe daigremontiana)
dalam pot dengan cara menusukkan tusuk gigi yang telah dilumuri A.tumefaciens, gall
terbentuk (100%) pada semua tempat inokulasi setelah 6 minggu.10 Efektifitas infeksi,
dalam hal ini adalah transformasi pada tanaman yang diinokulasi, kemungkinan
dipengaruhi oleh factor provisi seperti auxin, sitokinin dan lainnya yang belum
teridentifikasi yang diperlukan dalam pembentukan gall pada waktu yang tepat, dengan
konsentrasi optimal dan dengan kombinasi yang terbaik. Selain itu, sel-sel atau jaringan
dari tanaman utuh pada system in planta memiliki kekuatan terhadap pathogen dan stress,
dan memiliki kapasitas yang besar untuk diferensiasi dan regenerasi serta hal-hal lainnya
dibandingkan dengan sel-sel atau jaringan pada kultur in vitro. System in planta yang
dikembangkan disini memiliki kesamaan dengan infeksi oleh A.tumefaciens pada
tanaman utuh dimana A.tumefaciens diinokulasikan pada meristem dari tanaman utuh,
selanjutnya ditumbuhkan dalam pot hingga dewasa. Dengan demikian transformasi in
planta pada penelitian ini menyerupai proses infeksi oleh A.tumefaciens pada tanaman di
alam. Ini merupakan alasan tingginya efektifitas transformasi dari metode yang kami
kembangkan.
Daftar Pustaka
1. Chan, M. T., Chang, M. H., Ho, S. L., Tong, W. F., and Yu, S. M.:
Agrobacterium-mediated production of transgenic rice plants expressing a chimeric
α-amylase promoter/-glucuronidase gene. Plant Mol. Biol. 22, 491-506, 1993.
2. Hiei, Y., Ohta, S., Komari, T. and Kumashiro, T. (1994). Efficient transformation of
rice (Oriza sativa) mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the
boundaries of the T-DNA. The Plant Journal 6: 271-282
3. Park, S. H., Prinson, S. R., and Smith, R. H.: T-DNA integration into genomic DNA
of rice following Agrobacterium inoculation of isolated shoot apices. Plant Mol. Biol.
32, l135-1148, 1996.
4. Terada, R., Asano, H., and Iida, S.: A Large-scale Agrobacterium-mediated
transformation procedure with a strong positive-negative selection for gene targeting
in rice (Oryza sativa L.). Plant Cell Rep. 22, 653-659, 2004.
5. Cheng, M.. Lowe, B. A.. Spencer, T. M.. Ye, X., and Armstrong, C. L.: Factors
influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species.
In Vitro Cell Dev. Biol. Plant. 40, 31-15, 2004.
6. Birch, R. G..: Plant transformation-problems and strategies for practical application
Ann. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Mol. 48, 297-326, 1997.
7. Kojima, M., Arai, Y., Iwase, N., Shiratori, K., Shioiri, H., and Nozue, M.:
Development of a simple and efficient method for transformation of buckwheat plants
(Fagopyrum esculentum) using Agrobacterium tumefaciens. Biosci. Biotechnol.
Biochem. 64, 845-847, 2000.
8. Ping, L. X., Nogawa, M., Nozue, M., Makita, M., Takeda, M., Bao, L., and Kojima,
M.: In planta transformation of mulberry trees (Morus alba L.) by Agrobacterium
tumefaciens. J. Insect Biotechnol. Sericol. 72, 177-1 84, 2003.
9. Kojima, M., Shioiri, H., Nogawa. M., Nozue, M., Matsumoto, D., Wada, A., Saiki,
Y., and Kiguchi, K.: In planta transformation of kenaf plants (Hibiscus cannabinus
var. aokawa no. 3) by Agrobacterium tumefaciens. J. Biosci. Bioeng. 98, 136-139,
2004.
10. Majumder, P., Yoshida, H., Shioiri, H., Nozue, M., and Kojima, M.: M-31 mutant
(virA::Tn5) of Agrobacterium tumefaciens is capable of transferring its T-DNA into
the nucleus of host cell, but incapable of integrating it into the chromosome. J.
Biosci. Bioeng. 90, 345-352, 2000.
11. Hoekema, A., Hirsch, P. R., Hooykaas, P. J. J., and Schilperoort, R. A.: A binary plant
vector strategy based on separation of vir- and T-DNA of the Agrobacterium
tumefaciens Ti-plasmid. Nature. 303, 179-180, 1983.
Banks S.W., Gossett D.R., Lucas M.C., Millhollen E.P., LaCell M.G.: Agrobacterium
mediated transformation of kenaf (Hibiscus cannabinus L.) with the β-glucuronidase
(GUS) gene. Plant Molecular Biology Reporter 11, 101-104, 1993