流式细胞术在周期与凋亡
检测中的应用
中山医学院药理学教研室
黄奕俊
2011.11
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流式细胞术的应用
Cell surface receptors
Cell DNA
Cytokines
Activation
HIV
Apoptosis
Immune function
Cell signaling
Organ transplantation
Stem cell
Autoimmune
Cell adhesion
Cell viability
Intracellular receptors
Intracellular signal transduction
Dendritic cells
Leukemia Lymphoma
Quantitative cell fluorescence
0
5000
10000
15000
细胞DNA流式分析原理
某些荧光染料（ PI、 EB、HOs、DAPI、
7-AAD、AO等）与细胞内DNA碱基结合，在
特定波长激光激发下发射出荧光，荧光强度与
DNA含量成正比。流式细胞仪通过测定细胞的
荧光强度推算出细胞的DNA含量。
Our bullets
—Dyes
Preparation protocol
取对数生长期细胞，胰酶适度消化，800rpm离心 15 min。
PBS洗2次，加0.5mL PBS吹匀，务必吹散。
用5mL注射器将细胞吸起，打入5mL 70%（预冷）乙醇中，4℃固定
过夜（可长至4周）。
取0.2mL（100万细胞/mL），加入含RNaseA（50µg/mL）和PI
（65µg/mL）的染色液0.4mL，室温避光染色60min。
用300目（孔径40~50微米）尼龙网过滤，上机检测。
细胞周期：
G0/G1(diploidy)→S→G2/M(tetraploidy)
各期细胞分布（比例）的变化提示
细胞DNA含量和增值特性的变化。
300
225
150
0
75
Counts
DNA Analysis
0
200
400
2N
600
800
4N
PI Fluorescence
1000
DNA index（D.I.）：
(G0)G1s / (G0)G1n
s = sample cells，n = control cells
indicating the degree of DNA
content abnormality
300
225
DNA index 1.21
150
Aneuploid peak
0
75
Counts
DNA Analysis
0
200
400
600
PI Fluorescence
800
1000
周期细分（cell cycle compartments）：
G0 (G1Q)→G1T→G1A→G1B→S→G2/M
Proliferative fraction：
= S-phase fraction = SPF
相比目测确定水平门方式，利用去叠合
程序（Deconvolution program）拟合DNA
histogram是更为客观和准确的做法：
MultiCycle for BC machines
ModFit for BD machines
C1
C1+DrugA
C1+DrugB
C2+Ir+DrugB
使用去叠合程序进行拟合计算，
理想的计数低限为200个细胞/通道，
一般计数不少于5万个细胞。
要注意的问题：
单独SPF数据不能完全正确反映增殖速率，
应结合增值曲线或BrdU等数据联合分析。
为什么？
最可靠的细胞增殖测定方法依次是：
1…
2…
3…SPF测定+ BrdU/EdU掺入测定
其它一些周期相关的DNA含量测定应用：
mutation detected by the widening of G0/G1
Detecting mitotic cells
细胞凋亡的检测
凋亡（apoptosis）是指在形态学上发生封闭性内
部降解的一种主动的细胞死亡过程，由于其发生发展
的严格有序性、受调性和精巧性，故在功能学上又被
称为程序性细胞死亡（programmed cell death），是
机体细胞在一定条件下激活某种自杀机制，按照一定
的调控方式进行的自我清除。
细胞凋亡提出的本质是要区别于细胞坏
死，而且其概念最初是来自它们形态学上的
差异，因此判断细胞死亡形式的首要标准是
细胞的形态学（morphological）变化而非
包括FCM指标在内的其它指标。
Apoptosis Decision Tree
Apoptotic Sample
Cells
Cell Extracts
Flow*
Flow*
Microscopy
ELISA
Tissue
Sections
IHC*
Western Blot* /
Immunoprecipitation
Spectrofluorometry
Gene Expression
M bp
200
100
What can FCM do in apoptosis detection？
Plasma Membrane: light scatter, Annexin-V,
permeability
Cytoplasm: Caspase activation, Redox status
Cytoplasmic organelles: Mitochondrial
membrane potential, lysosomes
Nucleus: DNA content, DNA fragmentation,
sensitivity to denaturation
Apoptotic Sample
Cells
Microscopy
Flow
Unfixed
Fixed
Loss of membrane
asymmetry: Annexin V*
Mitochondrial
membrane potential:
MitoScreen (JC-1)*
Caspase inhibitors:
FAM-VAD-FMK
Cleaved markers:
Active Caspase-3*,
Cleaved PARP*
TUNEL / DNA
fragmentation:
APO-Direct / BRDU
凋亡：DNA loss→subG1(apoptotic peak)
提示凋亡细胞的出现
要注意的问题：
以PI单染法进行凋亡细胞定量是最经济的方法，但
其漏检和错检率都很高。漏检主要发生在S期和G2/M期
的凋亡细胞，这些细胞即使有DNA含量降低，但其存有
的DNA含量仍不低于二倍体细胞，因而不会出现subG1。
错检的原因主要是细胞碎片和小颗粒也表现出低荧光。
C3+DrugC
这是啥？
要注意的问题：
单细胞悬液的准备容易引起subG1假阳
性和假阴性，容易引起细胞粘连。考虑降
低胰酶的浓度，注意分散细胞时操作的柔
和性，注意全程上清液的收集。
AnnexinⅤ磷脂结合蛋白作为探针识别
细胞膜表面磷脂酰丝氨酸（PS）
ß-TG不同时间（0、6、12、18、24h)诱导HL-60细胞凋亡
Q：同样是PI染色，subG1（AP）和AV-PI
检测有什么不同？为什么？
线粒体膜电位（mitochondrial
transmembrane potential，MTP）
被认为是多数凋亡模型中胞内发生
的早期重要事件
Mitocapture、JC-1，聚集在MTP正常的
线粒体膜上形成polymer，被488nm光激发后
发出橙色荧光。当MTP丢失时染料分子从线
粒体膜上解离下来，以monomer游离于胞浆，
被488nm光激发后发出绿色荧光。
A: PMN + medium alone (3 h)
B: PMN + medium alone (6 h)
E: PMN +ONO-AE-248（3 h）
F: PMN +ONO-AE-248（6 h）
C: PMN + medium alone (9 h)
G: PMN +ONO-AE-248（9 h）
D: PMN + medium alone (18 h)
H: PMN +ONO-AE-248（18 h）
MTP是电势能指标，必须是细胞在活性
状态下被染色→不能固定细胞→表抗可同标，
内抗不能同标。
细胞核内DNA断裂标记分析（TUNEL法，ISNT法）
细胞凋亡过程中细胞核内的DNA出现断裂，断裂点暴露出DNA
分子的残端，用末端转移酶（TdT）或者缺口连接酶都可以标记上
可以识别的化学物质。标记DAN断裂的3’—羧基末端，常采用由
DNA聚合酶I催化的原位缺口转移（in situ nick translation，ISNT）
或用TdT介导的dUTP原位缺口末端标记（terminal deoxynucleotidyl
transferase mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）技术。
ISNT和TUNEI法均可进行间接或直接标记。
直接法：标记物常为异硫氰酸荧光素FITC—dUTP。
间接法：标记物通常是生物素化脱氧三磷酸尿苷(biotin—dUTP)或
地高辛Dig—dUTP等；间接标记还需链霉亲合素 FITC或抗Dig—
FITC，使标记反应倍增，其灵敏度较高，但比直接标记复杂。
注意：TUNEL法不能区分DNA断端的性质，
因此无法单独鉴别坏死和凋亡
APO2.7是一种分子量为38Kda的线粒
体膜蛋白，仅表达在凋亡细胞的线粒体膜
表面，2.7A6A3单抗能与之识别，是细胞凋
亡的早期信号。用经Digitonin透膜的细胞
与APO2.7的单抗反应后FCM检测，就可反
应细胞凋亡的状态。
细胞凋亡分子检测
效应蛋白的活性和降解：Western Blot、FCM
信号通路蛋白磷酸化水平：Western Blot、FCM
信号通路蛋白激酶活性：
Co-IP+Western Blot、FCM？
蛋白编码基因表达水平：Northern Blot、RT-PCR
FCM analysis of proteins
Cells：
Intracellular staining of proteins or
in combination with surface markers
Cell lysates：Cytometric Bead Array（CBA）
JC-1 Staining in Control and Apoptotic Cells
Jurkat T Cells
Mouse Thymocytes
Control
JC-1 (Fl-2)
Control
R1
R1
R1
R2
R2
R2
Staurosporine
Camptothecin
Fas mAb
R1
R1
R1
R2
R2
R2
JC-1 (Fl-1)
Comparison of Active Caspase-3 and JC-1
JC-1
95%
5%
40%
64%
36%
PE (Fl-2)
JC-1 (Fl-1)
Jurkat T cells
JC-1 (Fl-2)
1%
Cell Count
Camptothecin
4 µM, 4 h
Control
Active Caspase-3
Caspase-Signaling & Mitochondrial Depolarization
1%
JC-1
95%
5%
38%
40%
64%
36%
PE (Fl-2)
Jurkat T cells
JC-1 (Fl-1)
JC-1 (Fl-2)
1%
Cell Count
Camptothecin
4 µM, 4 h
Control
Active Caspase-3 Cleaved PARP
Why and how can FCM replace or
complement western blotting?
——BD phosflow direct-conjugated
Antibodies
——BD CBA
• Quantification
• Multi-parameters analysis
• Quickness & convenience
Stanford Technology：11 Color Example
Perez & Nolan, Nature Biotechnology,
2002:20, 155-162
Active Caspase-3 CBA Protocol
Analysis of Active Caspase-3 in Jurkat T Cells
104
103
Control
Camptothecin
Active Caspase-3
Standard Curve
102
CBA
10
1
1
10
102
Cell Count
Protein (ng)
Control
Camptothecin
103
104
Control
Camptothecin
32 kDa
17 kDa
Active Caspase-3–PE
Pro/Active Caspase-3 pAb
Classical Flow Cytometry
Western Blot
PARP Cleavage: Apoptosis Marker
Active Caspase-3 CBA
Standard Curves
Control
MCF-7
Camptothecin
Jurkat
Camptothecin
FL3-H
Control
Jurkat
Camptothecin
Data Examples
MCF-7
Camptothecin
10,000 ng
3000 ng
Protein (ng)
FL2-H
Western Blots
Jurkat
Control
MCF-7
Camptothecin
pAb
Camptothecin
Control
mAb C2-10 F21-852
C2-10 F21-852
116 kDa
32 kDa
85 kDa
17 kDa
Pro/Active Caspase-3 pAb
C210: Full Length/Cleaved PARP
F21-852: Cleaved PARP
Median Fluorescence
Intensity (MFI)
Cleaved PARP by CBA and Western Blot in Jurkat Cells
Following Camptothecin Treatment
10000
Hour 1
Hour 2
Hour 3
Hour 4
1000
100
10
1
1
10
100
1000
10000
10
100
1000
10000
10
100
1000
10000
10
100
Protein Lysate (ng)
Hour 1
Hour 2
Hour 3
Lanes: titration of cell lysate on each gel
Hour 4
1000
10000
3 Bead Apoptosis CBA Assay
Y
Y Y
Y
Y Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
Active Caspase-3
Y
Y
Y
Y
Wash
Read on
Y
Flow Cytometer
LYSATE OR
SUPERNATANT
Y
Y
Y
Cleaved PARP
BEADS
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Y
Bcl-2
DETECTOR
ANTIBODY
Y
Y
Y
Y
Cytometric Bead Array Analysis of Cell Lysates
Bcl-2
MCF-7
MFI
U937
Active Caspase-3
Control
Camptothecin
Protein (units)
Cleaved PARP
FCM中需要注意的地方：
1. FCM可以做什么？不可以做什么？
2. FCM是否可以单独使用？需与什么设备共事？
3. FCM需要进行什么准备？
4. 指标和荧光素如何选择？
5. 如何进行收集才是正确的？
6. 如何选择正确的分析方案和工具？
7. 如何判读数据？
整体峰移只能用MFI评价
背景群落应予跟踪
疑似特异峰可以在斜率折点设门
Our weapon：EPICS ALTRA Flow Cytosorter
References
Practical Flow Cytometry (4th ed.)
Howard M. Shapiro, 2003
Flow Cytometry, A Practical Approach (2nd ed.)
M. G. Ormerod, 1994
Flow Cytometry and Sorting (2nd ed.)
M. R. Melamed, 1990
Acknowledgement
赵静、谭文军、薛向军、陈志忠
BECKMAN COULTER公司流式应用工程师
Christopher “Kit” Snow
Principal Staff Scientist Beckman Coulter Inc.